JPH08509698A

JPH08509698A - 蛋白質複合体、それを含む組成物及びその医薬としての用途

Info

Publication number: JPH08509698A
Application number: JP6518710A
Authority: JP
Inventors: ナカチアン，レイモンド; セベリン，エウゲニ，エス．; セベリン，セルゲイ，イー．; キセーレフ，ヴセヴォロド
Original assignee: イントロメドリミテッド; アンドレアニ，ジャン−サビエ
Priority date: 1993-02-18
Filing date: 1994-02-18
Publication date: 1996-10-15
Also published as: FR2701710A1; FR2701710B1; CA2155953A1; WO1994019021A1; EP0684841A1

Abstract

(57)【要約】適当な標的細胞、より詳しくはガン細胞に特異的な親和性を有する蛋白質複合体、及びその抗ガン剤（細胞溶解性の性質））としての用途。非特異的部分と特別な型の標的細胞に特異的な親和性を有する部分の前記蛋白質複合体は、特別な型の標的細胞にそのような特異的な親和性を有する部分がα−フェトプロテインであり、前記複合体の非特異的部分が動物トキシン、植物トキシン、細胞溶解性酵素及び低分子量抗ガン有効成分から選ばれる細胞毒性物質を含む群から選択されることを特徴とする。

Description

【発明の詳細な説明】蛋白質複合体、それを含む組成物及びその医薬としての用途本発明は、適当な標的細胞、より詳しくはガン細胞に特異的な親和性を有する蛋白質複合体、及びその抗ガン剤（細胞溶解性の性質）としての用途に関する。特異的な生物学的部位への活性分子の輸送は、１００年以上も前にエーリッヒ（Erlich）により示唆された。使用される分子は、その活性が標的の器官または細胞への接触の際にのみ現れるとき、より効果的であり、明瞭な副作用は少なくなる。これは、癌腫学において重要であり、そこでは毒性の又は高度に抗原性の物質が投与される。この分野での最大の発展が、非−特異的部分と特別な型の細胞に特に親和性を有する部分を両方とも有する分子で得られた。モノクローナル抗体（ｍｃａ）の開発以来、バイオテクノロジーの目的の１つがイムノトキシン（immunotoxin）、すなわち１つの型の細胞に特異的なｍｃａの合成であり、それは前記細胞を破壊することのできる作用薬（agent）と結合される。一般に、ｍｃａは標的細胞の表面に存在する抗原に特異性を有するために合成され、その結果該ｍｃａは標的細胞に結合し、そしてそれが前記細胞に組み込まれると、その毒性な複合体を細胞内へと輸送するであろう。毒性な複合体は、通常リシン（ricin）またはリシンのサブユニットＡである。サブユニットＢは細胞表面に広く存在するガラクトース残基に結合し、一方サブユニットＡは酵素的にリボソームを不活性化する。単一のリシン分子は細胞中の全てのリボソームを不活性化することができると見積もられている。侵入された細胞は次いで、新たなタンパク質が製造できないために死ぬ。リシンの他に、他の作用薬をイムノトキシンに組み入れでもよい；特に細菌又は植物トキシン（又はその活性フラグメント）、放射性原子、および抗ガン化学療法に使用される作用薬に言及することができる。全ての場合において、かくして形成されたイムノトキシンは、活性物質（トキシン又は抗ガン剤）を病理学的領域に向けさせ、それにより標的細胞を除去する結果となる。特異的なトキシン／抗体複合体は、非常に活性なイムノトキシンを形成するが、それらはインビボでのその用途を制限する非特異的な毒性も有する。さらに、トキシンフラグメントは、目的の標的を認識することのできる部位を欠き、一般にイムノトキシンとして使用される。そのようなハイブリッド分子は、例えば脱グリコシル化されたリシン−Ａ鎖を含み、従って高度の特異性を示す。しかしながら、その活性は完全なリシンを含むイムノトキシンのそれよりも低く、この活性はエンドサイトーシスが起こる強さに依存する。実際、イムノトキシンの標的細胞への移動は、実質的にイムノトキシンの抗体成分により認識される表面抗原に依存する。これは、非常に多くの場合において、エンドサイトーシスを導かないイムノトキシンの作用における重要な工程である：結果として、イムノトキシンの細胞内移動は、それゆえ起こらない。そのような場合には、従って、該治療は失敗の結果となる。さらに、多くの抗原性標識は、細胞の表面に存在し、細胞外の培地にも分泌される。結果的に、イムノトキシンの有効性は、表面抗原と分泌される抗原との間の競合の効果を考慮すると、非常に減弱される。抗腫瘍治療の特別な場合において、腫瘍特異的抗原と結合した細胞毒性物質からなるイムノトキシンを用いて得た結果は、理論から希望される結論と同じでないことが判った。実際、この理論は、これらの抗体が細胞毒性分子を細胞内に導くことを仮定した。しかしながら、細胞毒性分子の有効性がより少なくなるか又は抗体の親和性がより少なくなるか、或いはその両方であることは明らかである。さらに、細胞毒性物質の標的細胞への浸透は、しばしば非常に問題のあることがわかり、従って、細胞毒性効果は非常に減弱される。さらに、抗体とそのような細胞毒性分子の間の結合により得られる多くの生成物は、溶解性又は種々の不適合性の理由のために薬物として使用することができない。数ある困難の中で、細胞毒性物質の選択は、しばしば問題となる。実際、この物質は一度結合されると相対的に非毒性となり、その作用部位に輸送された後により多く毒性となるべきであり、その作用部位で細胞内酵素が腫瘍細胞内に毒性物質を放出する。結果として本出願人により示された目的は、治療目的で、特定の標的（ガン細胞）上でのみ作用することができ、エンドサイトーシスを促進（細胞膜を通って物質輸送の刺激）することができる組成物を利用できるようにすることである。本発明の主題は、非特異的部分及び特別な型の標的細胞に特別な親和性を有する部分を含む型の蛋白質複合体であって、特別な型の標的細胞に特別な親和性を有する該部分（標的細胞への特異的な輸送のための物質とも称する）はα−フェトプロテイン（α−foetoprotein）であること、及び前記複合体の非−特異的部分が動物トキシン、植物トキシン、細胞溶解性酵素及び低分子量抗ガン有効成分から選ばれ、及びカルボキシフォスファミド（carboxyp hosphamide）、アムボクロリン（amboclorine）、ドキソルビシン（doxorubicin ）、ブレオマイシン（bleomycin）、シスプラチン（cisplatin）、ビンブラスチン（vinblastine）、カリケマイシン（calichemicine）及びメトトレキセート（ methotrexate）から選択される細胞毒性物質、或いは蛋白質を発現するヌクレオチド配列及びアンチセンスヌクレオチド配列のようなガン細胞の代謝を修飾する物質を含む群から選択されることを特徴とする。意外にも、そのような複合体は、α−フェトプロテインの性質のいくつかを保持し、特に、非特異的部分（細胞毒性物質、ヌクレオチド配列）の浸透を刺激するエンドサイトーシスのメカニズムによりその細胞表面のα−フェトプロテインのレセプターを有する細胞に容易に取り込まれ、リンパ腫、肝ガン、神経芽細胞腫、メラノーマ、星状細胞腫（astrocytoma）、奇形芽腫及び胚性の、卵巣の、畢丸のまたは仙骨前方の型の癌腫の様なガン細胞株に対してのみ活性である。同じく意外にも、非特異的部分（細胞毒性物質、酵素、抗ガン有効成分）及び α−フェトプロテインがその有効性を保持するという事実のみならず、複合体が複合体化されていない非特異的部分を用いて得られたものより有意により高い標的細胞に対する活性を有する。本発明の他の主題は、薬学的組成物であり、それらは有効成分として少なくとも１種の本発明の蛋白質複合体及び少なくとも１種の薬学的に許容される賦形剤を含むことを特徴とする。 α−フェトプロテイン−抗ガン有効成分から選ばれる細胞毒性物質蛋白質複合体は、特にガンの治療、とりわけ白血病、リンパ腫、肝ガン、神経芽細胞腫、メラノーマ及び星状細胞腫の治療に使用するための薬物の調製に使用することができる。 α−フェトプロテイン−ビンブラスチン、α−フェトプロテイン−ドキソルビシン及びα−フェトプロテイン−カリケマイシン複合体は、慢性骨髄性白血病に使用する目的の薬物の調製に特に好ましく使用することができる。上述の取り決め（arrangement）に加えて、本発明はまた他の取り決めを含み、それは本発明の主題を形成する方法を実行した実施例を参照した以下の記載から現れるであろう。しかしながら、これら実施例は単に本発明の例示のために与えられ、その制限を構成するものではないと理解されるべきである。実施例１：α−フェトプロテインの産生ａ）調製：ミリグラムのオーダーのα−フェトプロテインの量を、免疫アフィニティの技術によって調製する。（１）従って、第１のステップは、マウスを免疫化し、その後、単一のステップで大量のα−フェトプロテインを精製するのに使用されるであろうモノクローナル抗体を調製するために十分純粋な状態で、且つ十分な量のこの蛋白質を調製することからなる。 α−フェトプロテインは、ヒト膳帯血又は培養の癌細胞（肝癌、奇形芽腫）から調製できる。産生方法は、実際、この蛋白質を、それに付随している他の蛋白質から、標準的で、それ自体が公知の方法、例えば、イオン交換、アフィニティー、ゲルでの排除又は疎水相互作用によるクロマトグラフィー、プレパラティブ電気泳動、透析及び限外濾過等の方法に従って、分離することからなる。第１のステップにおいて、出発物質である、全血又は細胞懸濁液を遠心し、次いで無機塩及び低分子量分子を除去するために、透析又は限外濾過を行う。そして、総蛋白質をクロマトグラフィーそしてプレパラティブ電気泳動によって精製し、いかなる外来蛋白質、特にアルブミンによる混入を避ける。より正確には、１０ｍｌのヒト胎児臍帯血清（妊娠１２週）を、ｐＨ７．０バッファー溶液（６．５ｍＭビス−トリスプロパン（bis-tris propane））に対して、再生されたカットオフ限界が６０００−８０００ダルトンのセルロース膜を通じて、２４時間透析する。透析した血清を、その後、直径２６ｍｍ、長さ７０ｃｍの、同じバッファー中のシパクロンブルー（Cibacron Blue）２−セルマシア）上にのせる。この操作の目的は、ゲルに結合したままのアルブミンの大部分を除去することである。溶出した蛋白質を集め、その後、モノＱ（Mono Q）カラム（ファルマシアＦＰＬＣシステム）上で、クロマトグラフィーを行う。溶出を、上記と同じバッファー中塩化ナトリウム（０−０．５Ｍ）のグラジエントによって、行う。α−フェトプロテインは、０．３５Ｍ塩化ナトリウムによって溶出される。カットオフ限界が１０，０００ダルトンである、ＰＭ −１０メンブラン（アミコン（Amicon））上の限外濾過による濃縮後、該蛋白質を、再度、直径２５ｍｍ、長さ８０ｃｍの、ｐＨ７．０のリン酸バトグラフィーを行う。カラムを標準化させた後、分子量７０ｋＤａ及び１４０ｋＤａに相当するピークを集める。これら２種のフラクションを合わせ、その後、ポリアクリルアミドゲル上でのプレパラティブ電気泳動にかける：電気泳動は、ＳＤＳなしで行い、濃縮ゲルのゾーンから始める（濃縮ゲル中４％のポリアクリルアミド、および分離ゲル中７．５％）。濃縮ゲル中はトリス（Tris）−ＨＣｌバッファーｐＨ６．７を使用し、分離ゲル中は、トリス−グリシンバッファーｐＨ８．３を使用する。試料を、トリス−ＨＣｌバッファーｐＨ６．７にて１／２に希釈する。バッファーで希釈された試料１部に対して、グリセロール１部を加え、１／１０容量の、トリスＨＣｌバッファーｐＨ６．７中に預けられるべきブロモフェノールブルー溶液を加え、移動の最前線を目に見えるようにする。電気泳動を、１５℃で、３０ｍＡ下、約４時間行う。移動後のゲル上でのα−フェトプロテインの位置を決定するために、胎児血清の電気泳動を、同じ条件下、成人血清に対して、まず、行う。成人血中のα−フェトプロテインの濃度は、非常に低い。このように、２種の電気泳動を比較することによって、胎児血中のアルブミンとトランスフェリン間のα−フェトプロテインに対応するバンドの位置を捜すことができる。ゲルを、一部分クマシーブルーで染色し、α−フェトプロテインに対応する非 −染色部分中のバンドを、精製のこの段階でまだ存在しているアルブミンの混入を避けるために、注意深く切り出す。α−フェトプロテインを含むゲルを、ｐＨ７．０リン酸バッファー中でホモジナイズし、１時間チューブ中で激しく揺り動かす。遠心後、上清を集め、ｐＨ７．０リン酸バッファー中である以外は上記と同様にして、、シパクロンブルールによって保持されていない蛋白質を、集め、上記のように、限外濾過によって、濃縮する。十分な量のα−フェトプロテインが免疫アフィニティによって調製されるような抗体を得るために、マウスを免疫化するのに、これら蛋白質を用いる。（２）この段階で、α−フェトプロテインを、抗−α−フェトプロテイン親和性の低い抗体を産生するために使用する。この産生は、マウスに、フロイントアジュバントの存在下、α−フェトプロテインを注射することによって起こる。その後、これらマウスから膝窩のリンパ神経節（popliteal ly mphatic ganglion）を取り除き、ハイブリドーマを形成するために、これら神経節の細胞をミエローマ細胞と融合する。免疫化の期間は、数ヶ月続く通常の方法とは対照的に、非常に短い期間（１週間）が慎重に選択される。更に、神経節細胞は、ここでは、脾細胞の代わりに、融合を行うために使用される。この方法によって、親和性の低い抗−α−フェトプロテイン抗体のクローンを産生できるようになる。より正確には、２種の約４ヶ月令のＢＡＬＢ／ｃマウスを、フロインドアジュバントを組み合わせた蛋白質（２０μｇ）を、後ろ足に、２日間隔で２回、その後、２日後に３回目のアジュバントを含まない蛋白質５０μｇを注射することによって免疫化する。最後の注射の３日後に、即ち、計９日後で、マウスを犠牲にし、膝窩のリンパ神経節を除去する。それらをホモジナイズし、牛胎児血清を含まないＤＭＥＭ培地で洗浄し、ホモジネートをＳｐ２／ｏミエローマ細胞、との融合を行うのに使用する。これらマウスミエローマ細胞は、通常、ハイブリドーマを産生するのに使用され、ＨＡＴ培地中では生育しないという特性を有する。Ｓｐ２／ｏ細胞を、１０％牛胎児血清を加えたＤＭＥＭ−ハイブリマックス（ Hybrimax）培地上で培養する。融合を、ＰＥＧ３０００の存在下、ＤＭＥＭ培地中Ｆ１胸腺細胞（ＣＢＡ×ＢＡＬＢ／ｃ）から５０％の濃度で行う。ハイブリドーマをＨＡＴ培地中で培養する。クローンは、１０〜１５日で培養物の７５％に現れ、免疫担当細胞を補足したＳｐ２／ｏに相当する。約４０種の異なるクローンが、抗−α−フェトプロテインモノクローナル抗体を産生する。それらの９種は、ＥＬＩＳＡ技術によって正常ヒト血清とは反応せず、５種が転移後の免疫学的分析方法（イムノブロッティング）によって反応しない。２種のクローンが、大量のα−フェトプロテインを分離するために選択される；それらは、他の血清蛋白質と交叉−アフィニティ（cross-affinity）を有していない。その後、１０００万〜５０００万のハイブリドーマ細胞を、それがモノクローナル抗体を産生する腫瘍を発生させるようにするために、マウスに注射する。移植後第１０日と第１７日の間に、抗体を回収するために、腹水液を除去する。フィーによって、ＩＧｇタイプのモノクローナル抗体を精製する。５ｍｌの腹水液を、３０００rpmで２０分間遠心し、トリス−ＨＣｌバッファーｐＨ８．１にて１／２に希釈後、のカラムを１００ｍｌのトリス−ＨＣｌバッファーｐＨ８．１で洗浄し、免疫グロブリンをｐＨ６．０のアセテートバッファー、その後、ｐＨ４．５そして最後にｐＨ３．５で溶出する。抗−α−フェトプロテインの低親和性クローンの一つの抗体（１０Ｃ３）を、ｐＨ４．５で溶出し、別のもの（７Ｈ８）をｐＨ３．５で溶出する。次いで、免疫グロブリンを、４℃で、５０％硫酸アンモニウムでの１８時間の沈殿によって濃縮し、３０分間、４０００ｒｐｍで遠心する。遠心ペレットを、最小量のＰＢＳバッファーに再溶解させ、同じバッファーに対して２４時間透析する。こうして、マウスから取り出した腹水液１ｍｌにつき、３〜５ｍｇの抗体が、得られる。このようにして精製した免疫グロブリンを、ゲルメーカーによって推薦されている方法に従って臭化シアンでマシア）に固定化する。（３）抗体を、プロテインＡで活性化されたセファロースＩｇ２及びＩｇ４のフラクションＦｃを読むことによって、α−フェトプロテインの大量調製を、イムノアフィニティクロマトグラフィーによって行う。この一般的な方法によって、相当な量のα−フェトプロテインを高純度で得ることができる。このような条件下で調製すると、この蛋白質は安定であると判る。より正確には、上記記載のようにモノクローナル抗体が結合しているセファロースゲルを用いた、直径２５ｍｍ、長さ５０ｃｍのカラムを調製する。カラムに、５０ｍｌのヒト胎児血清をのせ、ｐＨ３．５〜６．０のグラジエントを形成したリン酸バッファーで溶出する。α−フェトプロテインは、ｐＨ６．０で、約９０％の割合で溶出される。ｂ）α−フェトプロテインと種々の活性分子との複合体化（conjugation） α−フェトプロテインは糖蛋白質である。従って分子の２種のドメイン、即ち、蛋白質性及び糖質性（osidic）が、種々の物質において結合部位として使用できる。化学的に活性のある部位を有するいかなる物質も、原則的には、α−フェトプロテインと結合することができる。簡便な方法としては、蛋白質のアミノ基と活性化されたカルボキシルエステルの間の反応或いはイミダートとの反応によって、チオール残基を含む分子が、α−フェトプロテインに結合することができる。カルボキシル残基を含有する分子は、特に、効果的にカルボジイミド誘導体によって結合される。一般には、糖質性残基の結合は、特に、これが遊離のアミノ残基を含む分子の結合を含むとき、メタ過ヨウ素酸ナトリウム（sodium metaperiodate）を用いた修飾によって行われる。これらの方法は全て、既に、本質的に公知である。このように、紫外線下癌細胞の位置を探し当てる目的で、例えば、細胞毒性分子、遺伝材料（ヌクレトチド配列）、ゲノム複製のインヒビター（例えばアンチセンスＤＮＡ）、酵素又はさらに蛍光剤などの多数の物質を結合することが考えられる。ｃ）複合体化されたα−フェトプロテインの標的表面上にα−フェトプロテインレセプターを有するいかなる細胞も、複合体化されたα−フェトプロテインにおける可能性のある標的である。このレセプターは、正常又は非−胎児の細胞上には、全く存在しない。胎児細胞及び癌細胞のみ、７０種より多い異なる癌中で、その割合が９０％を越える（アール．モロら（R.Moro et al.,），Tumor Biol.，8， 293，1987）。実施例２：本発明による複合体の調製ａ）α−フェトプロテイン−トキシン複合体 − α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）及びジフテリアトキシン（ＤＴ）ＰＢＳ緩衝液に１ｍｇ／ｍｌに濃縮したα−フェトプロテイン溶液１０ｍｌに、ジメチルホルムアミド１６０ｍｌに溶解したＳＰＤＰ（Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオナート）１００ｍｇを添加する。該溶液を、その後、ＰＢＳ緩衝液で平衡化した後、ＰＢＳ緩衝液で透析又はセファデックス〔Sephad により分離する。このようにして修飾したタンパク質を集め、１０，０００ダルトンのカットオフ限界を有するセルロース膜で限外濾過により濃縮する。ジフテリアトキシン１０ｍｇを、ジチオスレイトール５０ｍＭを含有する水溶液に添加し、１時間室温でインキュベートする。その後、このようにして還元したタンパク質を、その後、ＰＢＳ緩衝液中において平衡化したにより精製する。還元したトキシンを、修飾したα−フェトプロテインの存在中に加え、二つのタンパク質の溶液を、１０，０００ダルトンのカットオフ限界を有するセルロース膜上で限外濾過により濃縮する。混合物を、その後、１８時間室温でインキュベートする。得られた生成物を、その後、クロマトグラフィーによァルマシア）で精製する。複合体の最終的な収率は３４％である。 − α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）及びリシンＡ（Ｒ）。 α−フェトプロテイン１ｍｇをＰＢＳ緩衝液１ｍｌに溶解し、ＳＰＤＰ（Ｎ− スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオナート）６ｍｇとエタノール溶液中で混合し、１ｍｇ／ｍｌの割合とする。混合物を３０分間室温で一定に撹拌しながらインキュベートする。このようにして修飾したα−フェトプロテインをｐＨ８．５の０．０５Ｍホウ酸塩緩衝液で透析する。並行して、リシンＡを、α−フェトプロテインの場合と同じ条件及び同じ量で処理する。二つの修飾したタンパク質を、その後、互いに合わせて、１０，０００ダルトンのカットオフ限界を有するセルロース膜上で限外濾過により、最終容量５ｍｌに濃縮し、１８時間室温でインキュベートする。このように行う複合体化により生じる生成物を、その３００ゲル上で精製する。複合体は、そのｐＨ８．５の緩衝液中において、二つのタンパク質の分子量の合計に相当する分子量、即ち約１０２，０００ダルトンで回収される。複合体の最終的な収率は４２％である。ｂ）α−フェトプロテイン−酵素複合体 − α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）及びアスパラギナーゼ（ＡｓＰ）。該複合体化を行うためには１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリノエチル）カルボジイミド（ＣＭＣ）を使用する。ヒトＡＦＰ（１：１のＡｓｐ：ＡＦＰモル比）を、２０００のオーダーの倍率の、過剰のＣＭＣに活性化したアスパラギナーゼの溶液にｐＨ５．４で添加する。得られる混合物を１６時間室温でインキュベートし、ＰＢＳで透析する。ｃ）α−フェトプロテイン−低分子量生物活性物質複合体 − α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）及びカルボキシホスファミド（ＣＦＡ）。カルボキシホスファミドは、広く使用されている抗ガン分子であるシクロホスファミドの代謝物である。その代謝物であるカルボキシホスファミドは、その高い負電荷のために、細胞中に浸透できず、従って、低い毒性を示す。仮に、複合体化の手段により、カルボキシホスファミドが細胞内に浸透しても、それは増殖中の細胞中において特に活性であるホスホアミダーゼによりアクロレインとホスホルアミドに開裂される。このようにして得られるホスホラミドは、高度に細胞毒性である。 α−フェトプロティンとカルボキシホスファミドとの間の複合体化は、＋４℃ で、０．０１ＭのＨＣｌ及びＥＤＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド）を２５００：１のＥＤＣ：ＡＦＰ比で含有するピリジン中において行う。さらに、ヘキサメチレンジアミン（ＨＭＤＡ）をインターカレート剤〔intercalating agent〕として使用する。最終的なα−フェトプロテイン−ヘキサメチレンジアミン−ＣＦＡ比は１：１０：１２０である。そこから結果として生成する複合体をＰＢＳで透析し、その後、−７０℃で保存する。複合体の最終的な収率は７２％である。 − α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）及びアムボクロリン〔amboclorine〕（ＡＣ）。式HOOC-(CH₂)₃-C₆H₄-N(CH₂CH₂-Cl)₂のアムボクロリンは、カルボキシホスファミドの場合と同様の方法において、約６５％の収率で、α−フェトプロテインと複合体化できる。 − α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）及びメトトレキセート（ＭＴ）。メトトレキセート（ＭＴ）をｐＨ５．０のピリジン−ＨＣｌ緩衝液に溶解し、 α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）溶液を同じ緩衝液中で調製する。ＥＤＣを添加し、全ての混合物を撹拌する。ＭＴ：ＡＦＰ：ＥＤＣ比は１０：１：２５００とする。３時間撹拌した後、調製物をＰＢＳ緩衝液で透析し、ＰＢＳ中に２０ｍｇ／ｍｌのＡＦＰ濃度となるまで希釈して得る。 α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）及びドキソルビシン（ＤＲ）。ＤＲをｐＨ５．０のピリジン−ＨＣｌ緩衝液に溶解し、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）溶液を同じ緩衝液中で調製する。ＥＤＣ及びアジピン酸を添加する。アジピン酸は該ＡＦＰと該ＤＲとの間のインターカレート剤として作用する；ＤＲ：アジピン酸：ＡＦＰ：ＥＤＣ比は１０：５０：１：２５００である。 − α−フェトプロテインのダウノマイシンとの複合体化。ダウノマイシンは、α−フェトプロテインとの直接的な複合化を許容する遊離のアミノ基を有する。ダウノマイシンをピリジン中に１０％の濃度まで溶解する。α−フェトプロテインのｐＨ５．０の塩酸緩衝液中の溶液を添加した後、アジピン酸をインターカレート剤として添加し、種々の生成物の間の割合は変わり得るが、α−フェトプロテインとＥＤＣとの間の比は今までどおり１対２５００である。複合体についての収率は生成物の間のさまざまな割合に大きく依存し、２２％〜５７％の範囲にわたる。 − α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）及びルボマイシン（ＲＭ）。ＡＦＰ−ＲＭ複合体は、ドキソルビシンの場合に使用した方法によって調製する。 − α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）及びブレオマイシン（ＢＭ）。ＡＦＰ−ＢＭ複合体は、ドキソルビシンの場合に使用したものと類似の方法によって調製する（アジピン酸の添加なし）；ＤＭ：ＡＦＰ：ＥＤＣ比は１００：１：２５００とする。 − α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）及びシスプラチン（ＣＰ）。ＡＦＰを、ｐＨ５．０の０．１Ｍピリジン−ＨＣｌ緩衝液中のシスプラチン及びＥＤＣの溶液に添加する。反応混合物を一夜４℃で又は２時間２０℃で撹拌する。得られる複合体を３回ＰＢＳ緩衝液に対し４℃で２４時間透析する。複合体の試料はフリーザー中で貯蔵してもよい。ＥＤＣ：ＡＦＰモル比は２０００：１未満とすべきでない。 − α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）及びビンブラスチン（ＶＢ）。ビンブラスチンは遊離のアミノ基を有しない；従って、ＡＦＰとの複合体化を行う前にエステル化する必要がある。エステル化は３７℃で０．１ＭのＫＯＨをビンブラスチン溶液に９．５のｐＨとなるまで滴下することにより行う。反応混合物はｐＨ５．０の０．１Ｍピリジン−ＨＣｌ溶液を使用して中和する。このようにして修飾したビンブラスチンをシスプラチンについて上記したものと類似の方法によってＡＦＰと複合体化する；しかし、この方法をビンブラスチンに適用するためには、ビンブラスチンがＡＦＰのアミノ基と相互作用するのでＥＤＣを最後に導入する。 − α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）及びカリケマイシン（ＣＣｈ）。よりよい複合体化条件を得るために、カリケマイシンをジチオスレイトール（１Ｍ以下）の添加により最初に開裂し、ＡＦＰをＳＰＤＰによりｐＨ７．２のＰＢＳ中において４℃で１２時間修飾する。カリケマイシンの、ＥＤＣの及び修飾ＡＦＰの各溶液を互いに混合し、一夜撹拌する。得られる複合体をＰＢＳ緩衝液で２４時間透析する。ＳＰＤＰ：ＡＦＰモル比は所望のカリケマイシン：ＡＦＰモル比に依存し、後者の比率は倍率８より大きくすべきである。実施例３：本発明による種々の複合体の培養中のヒト癌細胞系に対する効果。複合体の作用を以下の系について試験した；リンパ腫ＴＱＯＳ（ＱＯＳ）、リンパ腫ＴＣＥＭ（ＣＥＭ）、リンパ腫ＢＲａｊｉ（Ｒａｊｉ）、リンパ腫ＢＮａｍａｌｖａ（Ｎａｍ）、ヘパトーマＨｅｐＧ２ａ（Ｈｅｐ）、星状細胞腫（Ａｓｔ）、メラノーマＢｒｏ（Ｂｒｏ）、及び神経芽細胞腫ＩＭＲ−３２（ＩＭＲ）。行った全ての試験に共通の試験手順は以下の通りである：細胞を、１０％ウシ胎児血清、ペニシリン（１００単位／ｍｌ）及びストレプトマイシン（１００ｍｇ／ｍｌ）で補足したＲＰＭＩ培地中、９６ウエルを含むプレ且つＣＯ₂を５％含有する雰囲気下で培養する。試験される複合体を５ｍｇ／ｍｌの濃度で添加し、４８から７２時間後に増殖活性を調べる。上記の培養培地は、加えて、各特定培養に適合させてもよい。得られた結果を、細胞毒性物質単独で（コントロール）又は本発明による複合体とともに（テスト）、７２時間インキュベートした後に生存する細胞のパーセントを与える下記の表ＩからＸＩに示す。 − α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）及びジフテリアトキシン（ＤＴ）。結果を下記の表Ｉに表す： − α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）及びリシンＡ（Ｒ）。結果を下記の表ＩＩに示す： − α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）及びカルボキシホスファミド（ＣＦＡ）。Ａ）カルボキシホスファミドと結合したα−フェトプロテインの細胞毒性を０と１２０の間の種々のＨＭＤＡ−α−フェトプロテイン比で測定する。この測定はリンパ芽球様系〔lymphoblastoid line〕に属するＱＯＳ細胞について、コントロール（α−フェトプロテイン（ＡＦＴ）単独、カルボキシホスファミド（ＣＰＡ）及びＨＭＤＡ単独又は複合体中におけるのと同じ割合の混合物として）に関して取り込まれたトリチウム化チミジンの量を測定することにより行う。１．ＨＭＤＡなし（取り込まれたトリチウム化チミジンの％）：２．ＨＭＤＡあり（取り込まれたトリチウム化チミジンの％）ｂ）以下の結果は表Ｉ及びＩＩに示したものと同じ条件下で得られる（生存細胞の％）： − α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）及びアムボクロリン（ＡＣ）。結果を下記の表IVに示す： − α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）及びメトトレキセート（ＭＴ）。ａ）ＱＯＳ細胞（リンパ芽球様系）及び正常ヒトリンパ球について、比較試験を行う。各種の割合でメトトレキセートを含有する複合体を、９６ウェル（培地２００μｌ）を含むボックス中で、ＱＯＳ細胞の培養物及び正常ヒトリンパ球の培養物に添加する。これらの培養物を７２時間インキュベートする。チアゾリルブルー（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロマイド）で着色することにより生存細胞を検出し、カウントする。インキュベーションの終了時に、濃度１ｍｇ／ｍｌのチアゾリルブルー溶液を、各ウェルについて５０μｌの割合となるように添加する。再びインキュベーションを１６時間行った後、５０００rev／minで遠心分離を５分間行なう。上澄み液を取り除き（正確に測定した１５０μｌ）、１５０μｌのＤＭＳＯを添加する。ホルマザン（formazan）の結晶を完全に溶解させた後、Ｏ．Ｄ．を５４０ｎｍで読み取る。上記複合体を用いることなく培養したコントロールについて、計測値を１００％とする。ｂ）ＡＦＰ−ＭＴ複合体の効果を、他の細胞系についても検討する。結果を下記表Ｖに示す： − α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）及びドキソルビシン（ＤＲ）。ａ）ＱＯＳ細胞（リンパ芽球様系）及び正常ヒトリンパ球について、メトトレキセートを用いた場合と全く同様にして、比較試験を行う。ｂ）ＡＦＰ−ＤＲ複合体の効果を、他の細胞系についても検討した；結果を下記表VIに示す： − α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）及びダウノマイシン（ＤＮ）。カルボキシホスファミドと共に複合化したα−フェトプロテインについて行った場合（試験ａ）と同一の条件下に、同一の細胞について試験を行う。１．インターカレート剤なし：２．インターカレート剤としてアジピン酸を使用： − α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）及びルボマイシン（ＲＭ）。ヒトＴＱＯＳリンパ腫細胞について、ＡＦＰ−ＲＭ複合体により得られた効果を下記表VIIに示す： − α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）及びブレオマイシン（ＢＭ）。結果を下記表VIIIに示す： − α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）及びシスプラチン（ＣＰ）。結果を下記表IXに示す。 − α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）及びビンブラスチン（ＶＢ）。星状細胞腫細胞について得られた結果を下記表Ｘに示す： − α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）及びカリケマイシン（ＣＣｈ）。各種ヒト細胞系について得られた結果を下記表XIに示す：実施例４：各種の白血病細胞の増殖に対する、本発明による各種複合体の抑制効果Ｉ − ヒトの各種白血病に対するＡＦＰ−ＤＲ及びＡＦＰ−ＶＢの効果。ａ）装置及び方法：血液（５−７ｍｌ）を取り出した後、赤血球を沈降させる為に、得られたサンプルを３７℃で３０〜４５分間インキュベートする。血漿を除去し、リンパ球の量を評価する。血漿を、各種抗生物質（ペニシリン、ゲンタマイシン）の存在下に、ＲＰＭＩ培地に移す。リンパ球の量は、２×１０⁶／ｍｌを上回るべきではない。サンプル中に多量の白血病細胞が存在する場合には、ウシの胎児血清を添加する。２４時間、４８時間及び７２時間後に、トリチウム化したチミジンを用いて、プレート上で、標準法によって細胞の増殖活性を測定する。ｂ）患者：患者１：慢性骨髄性白血病、フィラデルフィア染色体＋（９歳児童）患者２：慢性骨髄性白血病、フィラデルフィア染色体−（６９歳女性）患者３：急性白血病（１０歳少女）患者４：原発性リンパ肉腫ｃ）結果：上記４人の患者について、ＡＦＰ−ＤＲ及びＡＦＰ−ＶＢ複合体を用いて得られた結果を下記表XII−XIVに示す。これらの結果は、１：５０ＡＦＰ−ＤＲ複合体を用いて２４時間インキュベートした後には、増殖活性において、３５オーダーの倍率による減少が認められるのに対して、ＤＲ単独では、２０オーダーの倍率による減少が生じるだけであることを示している（全血漿）。リンパ球の場合、抑制効果は、それぞれ４５及び１６のオーダーの倍率（fact or）である。４８時間のインキュベーション後は、該効果は、より一層著しい。ＡＦＰ−ＶＢ複合体の抑制効果は、顕著さが少ないことが判ったが、しかし、試験は、ＶＢの非常に低い濃度について行われた。患者２について行われた試験は、血漿についてのみ行なわれた。複合体の抑制効果は、患者１に対するものよりも、顕著さが少ない；これは、白血病のタイプ、及び患者の年齢及び以前の治療によるものである。患者３及び４についての試験は、全血について、７２時間インキュベート後に行われた。患者３については、複合体の抑制効果は、ＤＲ又はＣＣｈの単独を用いて得られたものに比し、有意に優れたものである。II − マウス白血病に対するＡＦＰ−ＣＣｈ複合体の効果Ｐ３８８又はＬ１２１０白血病を、体重約１８ｇの雄性ＤＢＡマウスに、１０⁷ 個の適当な細胞を注射することにより、感染させた。注射後第２日に、腫瘍が約０．０１ｃｍ³の大きさを有するときに、治療を確立し、該治療は、本発明のＡＦＰ− ＣＣｈ複合体（ＡＦＰ：ＣＣｈ比は１．４）又はカリケマイシン単独（０．６μ ｇ／ｋｇの用量のＣＣｈ）の皮下注射からなるものである。抗ガン調製物を、腫瘍の領域に皮下投与するか、又は静脈内に投与する（一日一回、７日間）。コントロールとして使用される第一群の動物は、調製物を投与されなかった；やはりコントロールとして使用される第二群の動物は、０．９％ＮａＣｌ溶液０．２ｍｌを皮下投与された。各群は、６匹の動物からなる。寿命の増加を、次の式により計算する：％ＩＬＳ＝１００・（Ｔ／Ｃ−１）［式中、Ｔは実験グループの平均生存期間（日）を示し、Ｃはコントロール・グループの平均生存期間（日）を示す。］。腫瘍のサイズも、また、モニターされる。腫瘍の体積は、試験中、次の式により計算する：Ｖ＝１／２Ｌ・Ｗ²［式中、Ｌは腫瘍の長さを示し、Ｗは腫瘍の幅を示す。］。結果を、下記の表XV、XVI及びXVII に示す。表XVは、白血病Ｐ３８８及び白血病Ｌ１２１０の双方において、治療された動物における腫瘍体積の有意な減少が観察されることを示している。これら結果は、本発明複合体の価値を確認するものである。表XVIは、本発明複合体の皮下投与の価値を示すものである。白血病Ｌ１２１０に関して、カリケマイシンの単独又は複合体形態の各種濃度の効果を試験した（０．９μｇ〜２４μｇの濃度）；表ＸＶＩは、低濃度の細胞毒性物質を使用することにより、最良の結果が得られることを示している。ＩＩＩ−マウス白血病に対するＡＦＰ−ＶＢ複合体の効果Ｐ３８８又はＬ１２１０白血病を、体重約１８ｇの雄性ＤＢＡマウスに、１０⁷ 個の適当な細胞を注射することにより、感染させた。注射後第２日に、腫瘍が約０．０１ｃｍ³の大きさであるときに、治療を確立し、該治療は、ＶＢ又はＡＦＰ−ＶＢ複合体（２００μｇ／ｋｇの用量のＶＢ、ＡＦＰ：ＶＢ比は１：１０）を、腫瘍の領域に皮下注射することからなる（一日一回、７日間）。コントロールとして使用される第一群の動物は、調製物（preparation）を投与されなかった；やはりコントロールとして使用される第二群の動物は、０．９％ＮａＣｌ溶液０．２ｍｌを皮下投与された。各群は、６匹の動物からなる。寿命の増加を、次の式により計算する：％ＩＬＳ＝１００・（Ｔ／Ｃ−１）［式中、Ｔは試験動物の平均生存期間（日）を示し、Ｃはコントロールの平均生存期間（日）を示す。］。結果を、下記の表XVIIに示す。この表ＸＶＩＩは、上記二つのタイプの白血病が、本発明の複合体及びＶＢ単独の双方により治療されることを示す；しかしながら、％ＩＬＳは、ＡＦＰ−ＶＢ複合体についての方が、ＶＢ単独についてよりも有意に大きい。白血病Ｌ１２１０に関して、ＶＢ単独又はＡＦＰ−ＶＢ複合体の各種濃度の効果を試験した。治療の操作は、上記したのと同様であるが、腹腔内経路と同様に、７．５μｇ〜２００μｇ／ｋｇの濃度を試験した。この表XVIIIは、本発明の複合体で有意により良好な結果が、特に２００μｇ／ｋｇの投与量で、得られることを示している。上記記載から判るように、本発明は、決して、上記に詳述した実施の態様、製造の態様及び用途の態様に限定されるものではなく、むしろ、本発明の文脈と範囲から逸脱することなく、当業者に想起しうる全ての変更を包含するものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＡ６１Ｋ 33/24 8314−4ＣＡ６１Ｋ 33/24 38/00 8517−4ＨＣ０７Ｋ 14/47 Ｃ０７Ｋ 14/47 9455−4ＣＡ６１Ｋ 37/02 (72)発明者セベリン，エウゲニ，エス. ロシア国モスコウコシュトヤンツァストリート 31 アパートメント 83 (72)発明者セベリン，セルゲイ，イー. ロシア国モスコウノボスロボドスカヤストリート 57／65 アパートメント 65 (72)発明者キセーレフ，ヴセヴォロドロシア国モスコウバラクラフスキーアベニュー 16―２アパートメント 292

Claims

【特許請求の範囲】非特異的部分及び特別な型の標的細胞に特別な親和性を有する部分を含む型の蛋白質複合体であって、特別な型の標的細胞に特別な親和性を有する該部分（標的細胞への特異的な輸送のための物質とも称する）は、α−フェトプロテインであることを特徴とし、及び前記複合体の非−特異的部分が動物トキシン、植物トキシン、細胞溶解性酵素及び低分子量抗ガン有効成分から選ばれ、並びにカルボキシフォスファミド（carboxyphosphamide）、アムボクロリン（amboclorine ）、ドキソルビシン（doxorubicin）、ブレオマイシン（bleomycin）、シスプラチン（cisplatin）、ビンブラスチン（vinblastine）、カリケマイシン（calich emicine）及びメトトレキセート（methotrexate）から選ばれる細胞毒性物質、或いはヌクレオチド配列のようなガン細胞の代謝を修飾する物質を含む群から選択されることを特徴とする蛋白質複合体。有効成分として請求項１に記載の複合体の少なくとも１種および薬学的に許容される賦形剤の少なくとも１種を含むことを特徴とする薬学的組成物。ガン細胞の代謝を修飾する物質が、蛋白質を発現するヌクレオチド配列及びアンチセンスヌクレオチド配列から選ばれることを特徴とする請求項２に記載の薬学的組成物。ガンの治療に使用する目的の薬物の調製のための抗ガン有効成分から選ばれるα−フェトプロテイン−細胞毒性物質蛋白質複合体の使用。白血病の治療に使用することを目的とする薬物の調製におけるα−フェトプロテイン−ビンブラスチン蛋白質複合体の使用。白血病の治療に使用することを目的とする薬物の調製におけるα−フェトプロテイン−ドキソルビシン蛋白質複合体の使用。白血病の治療に使用することを目的とする薬物の調製におけるα−フェトプロテイン−カリケマイシン蛋白質複合体の使用。