JPH0586234B2

JPH0586234B2 -

Info

Publication number: JPH0586234B2
Application number: JP59273492A
Authority: JP
Inventors: Katsukyo Sakurai; Yoshio Ueno
Original assignee: Seikagaku Corp
Current assignee: Seikagaku Corp
Priority date: 1984-12-26
Filing date: 1984-12-26
Publication date: 1993-12-10
Also published as: JPS61154567A

Description

【発明の詳細な説明】

［産業上の利用分野］本発明は、架橋グリコサミノグリカン複合体に
関し、更に詳しくは、人工臓器の製造材料として
有用な、架橋グリコサミノグリカンと、コラーゲ
ン又はゼラチンとからなる複合体に関するもので
ある。［従来技術及びその問題点］従来より、ギリコサミノグリカン（以下
「GAG」という）をコラーゲン（以下「CO」と
いう）又はゼラチン（以下「GE」という）と接
触させると、複合体が形成されることが知られて
いる。特に、GAGとCOとの複合体は、生体の結
合組織を構成する形の典型的なものである。しかしながら、生体から純粋に取り出された
GAGを単にCO又はその水溶性誘導蛋白質である
GEと混合したのみでは、硝子体にみられる透明
で高粘弾性のヒアルロン酸（以下「HA」とい
う）−CO複合体及び結合組織の基質の代替物を得
ることはできず、このようにして得られる複合体
は、人工臓器の製造材料として充分なものとはい
えない。その原因は、GAG水溶液とCO水溶液を
混合したときに、すぐに繊維状の共沈殿物を生じ
てしまうためと報告されている（Podrajky.V.，
et al.；Bioch.Biophys.Acta，229，690（1971））。また、人工皮膚等の製造材料としては、三次元
的構造を有することが好ましいが、以上のように
して得られる複合体は、二次元的構造を有するた
め、かかる製造材料としては適さない。 GAGの中でも高分子量で水溶液中で三次元的
製造を有するHAは、HAとCOの混合比や混合方
法によつては、高粘弾性で水溶液のHA−CO複
合体を形成するが、その三次元的構造が不充分で
あるため、厳格な製造条件が要求され、人工臓器
の製造材料として、決して充分なものとはいえな
い。そこで、本発明者らは、人工臓器の製造材料と
して優れた特性を有するものを得ることを目的と
して鋭意研究を重ねた結果、架橋GAGをCO又は
GEと接触させることにより、本発明の目的を達
成できることを見出し、本発明を完成するに至つ
た。［発明の構成］本発明の複合体は、HA、コンドロイチン硫酸
（以下「ChS」という）（Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，
Ｆ，Ｈ）、ヘパリン（以下「Hep」という）、ヘパ
ラン硫酸（以下「HS」という）、ケラタン硫酸
（以下「KS」という）及びケラタンポリ硫酸（以
下KPSという）からなる群から選ばれたGAG又
はその塩を多官能性エポキシ化合物又は臭化シア
ンで架橋させた架橋GAGと、CO又はGFとから
なることを特徴とするものである。本発明において、多官能性エポキシ化合物と
は、エポキシ基を少なくとも１個有する化合物で
あつて、その他に、エポキシ基を含めて、GAG
を架橋するに適した官能基を１個以上有する化合
物という。かかる化合物としては、例えば、ハロメチルオ
キシラン化合物及びビスエポキシ化合物などが挙
げられる。ハロメチルオキシラン化合物として
は、エピクロルヒドリン、エポブロムヒドリン、
β−メチルエピクロルヒドリン及びβ−メチルエ
ピブロムヒドリンなどを挙げられる。ビスエポキ
シ化合物としては、１，２−ビス（２，３−エポ
キシプロポキシ）エタン、１，４−ビス（２，３
−エポキシプロポキシ）ブタン、１，６−ビス
（２，３−エポキシプロポキシ）ヘキサン及びビ
スフエーノルＡ又はビスフエノールＦのジグリシ
ジルエーテルなどが挙げられる。本発明に用いる架橋GAGのうち、架橋剤とし
て多官能性エポキシ化合物を用いたもの及びその
製造法は、特願昭59−88440号及び同59−132885
号明細書に詳述されている。架橋剤として臭化シアンを用いたものは、例え
ば、GAG水溶液に、PH９〜11の条件下で臭化シ
アンを添加することにより製造することができる
が、高架橋度のもの及びアルカリに弱いGAGで
はGAGの分解を伴う。架橋GAGは、GAG又はその塩と架橋剤とのモ
ル比を変え、架橋度を調節することにより、出発
物質のGAGより高粘弾性で水溶性のもの（以下
「ｓ−架橋GAG」という）から、透明でゲル状の
水不溶性のもの（以下「is−架橋GAG」という）
まで自由に調製することが可能であり、得られた
架橋GAGは、分解酵素に対して優れた抵抗性を
有する。 COとしては、水溶性CO及び不溶性CO並びに
水溶性CO若しくは不溶性COを加工したもの（以
下「加工CO」という）のいずれを用いてもよい
が、水溶性の複合体を得るには、水溶性COを用
いなければならない。架橋GAGと水溶性CO又はGEとの反応は、ｓ
−架橋GAG水溶液又はis−架橋GAG懸濁液を、
激しく攪拌しつつ、これに水溶性CO又はGEの水
溶液を徐々に加えることにより行なうことができ
る。ｓ−架橋GAGを用いた場合には、水溶液CO
又はGEの添加量を調節することにより、水溶液
の架橋GAG複合体（以下「ｓ−複合体」という）
又は水不溶性の架橋GAG複合体（以下「is−複
合体」という）を選択的に得ることができる。is
−架橋GAGを用いた場合には、is−複合体が得
られる。また、グアニジン塩酸水溶液に、ｓ−架
橋GAG又はis−架橋GAGと水溶液CO又はGEの
水溶液とを加えて混合した後、徐々にグアニジン
塩酸を除去すると、均一なｓ−複合体又はis−複
合体を得ることができる。不溶性CO又は加工COと架橋GAGとの反応は、
ｓ−架橋GAG水溶液に、単に不溶性CO又は各
COの懸濁液を加えることにより行なうことがで
き、この場合、is−複合体が得られる。［発明の効果］本発明の複合体は、人工臓器の製造材料として
優れた特性を有する。即ち、ｓ−複合体は、透明かつ高粘弾性で、硝
子体、関節液及び結合組織の基質の代替物の製造
に有用であり、is−複合体は、人工皮膚の製造材
料として有用である。［発明の実施例］以下、調製例及び実施例により本発明を更に詳
細に説明するが、これらは、本発明の範囲を何ら
制限するものではない。調製例１ｓ−架橋HAの調製 HAナトリウム塩（分子量730000）10gを0.2N
水酸化ナトリウム水溶液450mlに冷却しつつ溶解
し、0.45μのミクロフイルターで過した。液
に10N水酸化ナトリウム水溶液40mlを加えて、攪
拌下、エタノール500mlとエピクロルヒドリン6.0
mlを加えた。20℃で24時間反応し、反応液を酢酸
でPH6.4に調整した。エタノール500mlを加えて白
色沈殿物を得、取後、エタノールで充分に洗浄
し、減圧乾燥した。収量 8.9g HAの繰り返し二糖1000個当りの架橋数 8.5 １％生理食塩水溶液における粘度（20℃、ずり
速度1.0sec^-1） 1100センチポアーズ非ニユートン指数 0.60 元素分析値Ｃ：42.0％，Ｈ：4.87％Ｎ：3.29％，Ne：5.81％調製例２ｓ−架橋ChS−Ｃの調製 ChS−Ｃナトリウム塩（分子量53000）3.1gを
0.75N水酸化ナトリウム水溶液に12.5％になるよ
うに溶解し、攪拌下、エタノール１容量を加え、
生じたアメ状沈殿物を分取した。このアメ状沈殿
物にエピクロルヒドリン0.18mlを加えて充分に練
り合わせ、20℃で24時間放置した。反応液に水30
mlを加えて溶解し、酢酸でPH6.0として、エタノ
ール沈殿を行なつた。再度、水に溶解し、エタノ
ール沈殿を行ない減圧乾燥した。収量 2.9ｇ ChS−Ｃの繰り返し二糖１モル当りの架橋度
0.101 ５％水溶液における粘度（20℃、ずり速度
1.0sec^-1） 5550センチポアーズ元素分析値Ｃ：33.31％，Ｈ：3.78％，Ｎ：2.72％，Ｓ：6.35％， Na：9.25％調製例３ is−架橋ChS−Ａの調製 ChS−Ａナトリウム塩（分子量30000）5.0gを
0.4N水酸化ナトリウム水溶液に20％の濃度に溶
解した。エタノール25mlを加えて生じたアメ状沈
殿物を分取した。この沈殿物にエピクロルヒドリ
ン0.75mlを加えて充分に練り合わせ、20℃で24時
間放置した。反応物に水50mlを加え酢酸で中和
後、3000rpmで遠心した。得られた白色沈殿物を
2.0M塩化ナトリウム水溶液50mlで２回、更に水
50mlで３回洗浄し、エタノールを加えて脱水後、
減圧乾燥した。収量 5.0g ChS−Ａの繰り返し二糖１モル当りの架橋度
0.25 元素分析値Ｃ：33.31％，Ｈ：3.77％，Ｎ：2.27％，Ｓ：6.45％， Na：9.22％調製例４各種is−架橋GAGの調製調製例３の方法に準じて以下に示す各種is−架
橋GAGを調製した。 (1) is−架橋ChS−Ｂ ChS−Ｂの繰り返し二糖１モル当りの架橋度
0.28 元素分析値Ｃ：32.8％，Ｈ：3.75％，Ｎ：2.70％，Ｓ：6.61， Na：9.35％ (2) is−架橋ChS−Ｃ ChS−Ｃの繰り返し二糖１モル当りの架橋度
0.170 元素分析値Ｃ：33.51％，Ｈ：4.01％，Ｎ：2.85％，Ｓ：6.22％， Na：9.00％ (3) is−架橋Hep Hepの繰り返し二糖１モル当りの架橋度 0.20 元素分析値Ｃ：22.55％，Ｈ：2.63％，Ｎ：2.32％，Ｓ：13.16％， Na：13.21％ (4) is−架橋HA HAの繰り返し二糖1000個当りの架橋数 40 元素分析値Ｃ：41.66％，Ｈ：4.89％，Ｎ：3.39％，Na：5.77％実施例１各種is−複合体の調製調製例３及び４で得た各種is−架橋GAGを用
いて、溶解性COであるアテロコラーゲンとの複
合体を調製するとともに吸着量を測定した。アテ
ロコラーゲンは株式会社高研より入手し、その
1.1gを1.67mM酢酸に溶解し、GC90のフイルター
を通過させて使用した（５mg／ml）。15mlの試験
管にis−架橋GAGを約５mg取り、1.67mM酢酸10
mlに懸濁させた。これにアテロコラーゲン水溶液
0.5mlを加え、充分に混合（30分）した。この後、
3000rpmで遠心分離し、沈殿物を1.67mM酢酸10
mlで３回洗浄した（1.67mM酢酸洗液を集めCO
の定量を行なつた）。結合COは2Mグアニジン塩
酸水溶液（PH7.0）10mlを加え、40分混合した後、
3000rpmで遠心して溶出した。更に、同緩衝液10
mlで２回溶出させ、全グアニジン塩酸水溶液を集
めCOの定量を行なつた。結果を表１に示す。

【表】実施例２架橋HAのｓ−複合体の調製 (1) 調製例１で得たｓ−架橋HAを333.3mgずつ、
それぞれ水250mlに溶解した。それぞれの溶液
に、種々の濃度のアテロコラーゲン1.67mM酢
酸溶液50mlを攪拌下加え、20℃で30分放置した
後、3000rpmで30分遠心し、上清を凍結乾燥し
た。凍結乾燥品のウロン酸回収率をカルバゾー
ル−硫酸法によつて測定した。更に、１％にな
るように生理食塩水に溶解し、回転粘度計（(株)
東京計器製Ｅ型粘度計）を用いて粘度を測定し
た。また、HA（分子量800000）の0.428％水溶
液１mlを用いて同様の実験を行なつた。結果を
図１及び図２に示す。図１において、○印及び
●印は、それぞれ、ｓ−架橋HA及びHAを用
いたときの上清におけるウロン酸回収率を表わ
す。図２において、○印及び●印は、それぞ
れ、ｓ−架橋HA及びHAを用いたときの上清
から得られた複合体の生理食塩水溶液の粘度を
表わす。図１及び図２から、ｓ−架橋HAを用いれ
ば、HAを用いた場合に比し、水溶性で高粘弾
性の複合体が収率よく得られることがわかる。 (2) 図１における反応液中の架橋HAの量比が75
％以上の範囲では、水不溶化による複合体の損
失がほとんどなかつたので、該量比が80％とな
るような条件下で架橋HAのｓ−複合体を調製
した。即ち、調製例１で得たｓ−架橋HA1gを水
300mlに溶解し、激しく攪拌しつつ、コラーゲ
ン0.3％を含有する0.0017M酢酸水溶液を徐々
に滴下した。滴下後、20℃で60分放置した後、
3000rpmで30分遠心し、上清を凍結乾燥して架
橋HAとCOとのｓ−複合体を得た。収量 1.19g HA含量 81.3％１％生理食塩水溶液における粘度（20℃、ず
り速度1.0sec^-1） 1000センチポアーズまた、得られたｓ複合体（架橋HA−CO複
合体）を、HA−CO複合体、架橋HAとともに
電気泳動（酢酸セルロース膜、展開液0.2Mギ
酸／ピリジン（PH3.0），0.5mA／cm，50分泳
動）に付したアリユーシヤンブルー染色を行な
つた。結果を図３に示す。図３において、Ａ，
Ｂ，Ｃ及びＤは、それぞれ、HA，HA−CO複
合体、架橋HA及び架橋HA−CO複合体の電気
泳動図を示す。実施例３架橋ChS−Ｃのｓ−複合体の調製 (1) 調製例２で得た架橋ChS−Ｃを500mgずつ、
それぞれ水75mlに溶解した。それぞれの溶液
に、種々の濃度のアテロコラーゲン水溶液50ml
（それぞれ、CO2.5mg，６，33mg，10.2mg，24.9
mg，49.45mg及び100.6mg含有）を攪拌下加え、
20℃で30分放置した後、3000rpmで30分遠心
し、上清を凍結乾燥した。凍結乾燥品のウロン
酸回収率をカルバゾール−硫酸法によつて測定
した。また、ChS−Ｃ（分子量30000）の0.67％
水溶液を用いて同様の実験を行なつた。結果を
図４に示す。図４において、○印及び●印は、
それぞれ、ｓ−架橋ChS−Ｃ及びChS−Ｃを用
いたときの上清におけるウロン酸回収率を表わ
す。図４から、ChS−ＣがCOと反応し、複合
体を形成後、直ちに水不溶化することに対し、
ｓ−架橋ChS−Ｃは、かなりのCOと結合して
も、水溶性を保持していることがわかる。以上のようにして得られた本発明のｓ−複合
体について、実施例２と同様にして、粘度を測
定した。結果を表２に示す。

【表】 (2) 表２において、最も粘度の高い複合体が得ら
れる条件、即ち、凍結乾燥品中の架橋ChS−Ｃ
含量が94％となるような条件下で架橋ChS−Ｃ
とCOとのｓ−複合体を調製した。収率 98.4％ ChS−Ｃ含量 94.7％５％生理食塩水溶液における粘度（20℃、ず
る速度1.0sec^-1）4000センチポアーズ実施例４架橋ChS−Ｃのｓ−複合体の調製調製例２で得たｓ−架橋ChS−Ｃを100mgずつ、
それぞれ水100mlに溶解した。それぞれの溶液に、
種々の濃度のGE水溶液100ml（それぞれ、GE10
mg，20mg，40mg，60mg，80mg及び160mg含有）を
攪拌下加え、20℃で30分放置した後、3000rpmで
30分遠心し、上清を凍結乾燥した。また、ChS−Ｃ（分子量30000）を200mgずつ、
それぞれ水100mlに溶解した。それぞれの溶液に、
種々の濃度のGE水溶液100ml（それぞれ、GE10
mg，20mg，40mg，60mg，80mg及び160mg含有）を
攪拌下加え、20℃で30分放置した後、3000rpmで
30分遠心し、上清を凍結乾燥した。凍結乾燥品を５％になるように生理食塩水に溶
解したところ、図５に示す結果を得た。図５にお
いて、○印及び●印は、それぞれ、ｓ−架橋ChS
−Ｃ及びChS−Ｃを用いたときの上清から得られ
た複合体の生理食塩水溶液の粘度を表わす。ChS
−Ｃは、少量のGEの添加により白濁し、水不溶
化したが、ｓ−架橋ChS−Ｃは、かねりCOと結
合しても水溶性を保持していた。応用例 (1) 実施例２(2)で得た架橋HAとCOとのｓ−複
合体（以下「架橋HA−CO複合体」という）
及び実施例３(2)で得た架橋ChS−ＣとCOとの
ｓ−複合体（以下「架橋ChS−CO複合体」と
いう）を、それぞれ1.5％の濃度になるように
水に溶解し、塩化ビニル板上にアプリケーター
を用いて一定の厚さに塗布し、40℃の温風で20
時間加温脱水した。それぞれの膜を剥離して厚
さ0.003cmの膜を調製した。また、対照として、HA（分子量800000）の
1.5％水溶液を同様に処理して厚さ0.003cmの
HA膜を調製した。 (2) ６週令のウイスター系ラツト４匹を一群とし
て、毛刈の後、背部皮膚２cmを切開し、直ちに
切開部をミツヘル縫合器により縫合した。縫合
後、(1)で得た膜の２×２cmの正方形膜を縫合部
にのせ、その上に、生理食塩水で湿らしたガー
ゼをのせてテープで固定した。２週間後、ラツ
トを屠殺し、縫合針を外した後、断面が１cmと
なるように皮膚切片を作成した。(株)東洋ボール
ドウイン製テンシトロン万能試験機RTM−50
を用いて皮膚切片の引張耐力を測定した。結果
を表３に示す。

【表】表３から、本発明の複合体からなる膜は、優
れた治癒促進効果を有することがわかる。

【図面の簡単な説明】

図１は、反応液中の架橋HA又はHAの量比に
よる上清のウロン酸回収率の変化を示す図であ
る。図２は、凍結乾燥品中の架橋HA又はHAの
含量による複合体溶液の粘度の変化を示す図であ
る。図３は、HA、架橋HA及びその複合体の電
気泳動図である。図４は、反応液中の架橋ChS−
Ｃ又はChS−Ｃの量比による上清のウロン酸回収
率の変化を示す図である。図５は、凍結乾燥品中
の架橋ChS−Ｃ又はChS−Ｃの含量による複合体
溶液の粘度の変化を示す図である。

Claims

【特許請求の範囲】

１ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、ヘパリ
ン、ヘパラン硫酸、ケラタン硫酸及びケラタンポ
リ硫酸からなる群から選ばれたグリコサミノグリ
カン又はその塩を多官能性エポキシ化合物又は臭
化シアンで架橋させた架橋グリコサミノグリカン
と、コラーゲン又はゼラチンとからなることを特
徴とする複合体。