JPH0587814A - リウマチ診断方法及びリウマチ診断薬並びにアガラクト シルＩｇＧの定量方法 - Google Patents
リウマチ診断方法及びリウマチ診断薬並びにアガラクト シルＩｇＧの定量方法Info
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- JPH0587814A JPH0587814A JP3252388A JP25238891A JPH0587814A JP H0587814 A JPH0587814 A JP H0587814A JP 3252388 A JP3252388 A JP 3252388A JP 25238891 A JP25238891 A JP 25238891A JP H0587814 A JPH0587814 A JP H0587814A
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Landscapes
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- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【目的】 リウマチの診断を正確に行える技術を提案す
ることである。 【構成】 ヒト血清中に存在するアガラクトシルＩｇＧ
量を抗ヒトＩｇＧ抗体とレクチンとによりサンドイッチ
して測定することにより診断するリウマチ診断方法。
ることである。 【構成】 ヒト血清中に存在するアガラクトシルＩｇＧ
量を抗ヒトＩｇＧ抗体とレクチンとによりサンドイッチ
して測定することにより診断するリウマチ診断方法。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、アガラクトシルＩｇＧ
量を測定することによるリウマチ診断に関するものであ
る。
量を測定することによるリウマチ診断に関するものであ
る。
【０００２】
【発明の背景】慢性関節リウマチ患者の血清中にはリウ
マチ因子と言われる自己免疫抗体が存在し、これはヒト
免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）のＦｃ部位を抗原として認
識することが知られている。ところで、最近、リウマチ
患者の血清中のＩｇＧのＦｃ部位に存在する糖鎖につい
て詳細な分析が加えられ、その結果、該糖鎖は健常人の
血清中のＩｇＧのＦｃ部位における糖鎖に比較してガラ
クトース含有量が有意に減少していることが報告されて
いる。すなわち、健常人血清中のＩｇＧのＦｃ部位にお
ける糖部分は互いに構造の異なる複数の糖鎖から構成さ
れており、種類間の存在比率は個体間でほぼ一定である
ことが明らかにされた。ところが、リウマチ患者の血清
中のＩｇＧのＦｃ部位における糖部分を調べて見ると、
構造の異なる複数の種類の糖鎖から構成されており、種
類間の比率は健常人の場合と同様に個体間でほぼ一定と
なるが、全体にガラクトースの含有量が著しく減少して
いることが判明した。さらに具体的に述べると、健常人
血清中のＩｇＧのＦｃ部位の糖部分にはガラクトースを
各々２分子、１分子及び０分子含む三種類の糖鎖が約
２：２：１の比率で存在するが、リウマチ患者血清中の
ＩｇＧのＦｃ部位の糖部分ではガラクトースを２分子含
む種類の糖鎖が著しく減少し、全体にガラクトースを欠
損した糖鎖が大幅に増加していることが報告されてい
る。従って、この事実に基づけば、リウマチ患者血清中
のＩｇＧのＦｃ部位の糖部分には糖鎖についての構造異
常が起きており、この構造異常を把握することが可能と
なれば、それはリウマチ因子のマーカーとして使用する
ことができる。そして、血清中のＩｇＧのＦｃ部位の糖
部分におけるガラクトース欠損を把握する測定がリウマ
チの診断に有用となるが、この測定を容易とする為には
該被測定対象物のモデル物質としてガラクトースを欠損
した糖鎖を持つＩｇＧ、いわゆるアガラクトシルＩｇＧ
が用意されることが望まれる。このようなアガラクトシ
ルＩｇＧが用意されると、そのモノクロナール抗体を用
意することが出来、これを使用してリウマチの診断をよ
り容易に行うことができるようになる。又、該アガラク
トシルＩｇＧを使用して血清中のリウマチ因子を直接測
定することにより、リウマチを診断することができる。
マチ因子と言われる自己免疫抗体が存在し、これはヒト
免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）のＦｃ部位を抗原として認
識することが知られている。ところで、最近、リウマチ
患者の血清中のＩｇＧのＦｃ部位に存在する糖鎖につい
て詳細な分析が加えられ、その結果、該糖鎖は健常人の
血清中のＩｇＧのＦｃ部位における糖鎖に比較してガラ
クトース含有量が有意に減少していることが報告されて
いる。すなわち、健常人血清中のＩｇＧのＦｃ部位にお
ける糖部分は互いに構造の異なる複数の糖鎖から構成さ
れており、種類間の存在比率は個体間でほぼ一定である
ことが明らかにされた。ところが、リウマチ患者の血清
中のＩｇＧのＦｃ部位における糖部分を調べて見ると、
構造の異なる複数の種類の糖鎖から構成されており、種
類間の比率は健常人の場合と同様に個体間でほぼ一定と
なるが、全体にガラクトースの含有量が著しく減少して
いることが判明した。さらに具体的に述べると、健常人
血清中のＩｇＧのＦｃ部位の糖部分にはガラクトースを
各々２分子、１分子及び０分子含む三種類の糖鎖が約
２：２：１の比率で存在するが、リウマチ患者血清中の
ＩｇＧのＦｃ部位の糖部分ではガラクトースを２分子含
む種類の糖鎖が著しく減少し、全体にガラクトースを欠
損した糖鎖が大幅に増加していることが報告されてい
る。従って、この事実に基づけば、リウマチ患者血清中
のＩｇＧのＦｃ部位の糖部分には糖鎖についての構造異
常が起きており、この構造異常を把握することが可能と
なれば、それはリウマチ因子のマーカーとして使用する
ことができる。そして、血清中のＩｇＧのＦｃ部位の糖
部分におけるガラクトース欠損を把握する測定がリウマ
チの診断に有用となるが、この測定を容易とする為には
該被測定対象物のモデル物質としてガラクトースを欠損
した糖鎖を持つＩｇＧ、いわゆるアガラクトシルＩｇＧ
が用意されることが望まれる。このようなアガラクトシ
ルＩｇＧが用意されると、そのモノクロナール抗体を用
意することが出来、これを使用してリウマチの診断をよ
り容易に行うことができるようになる。又、該アガラク
トシルＩｇＧを使用して血清中のリウマチ因子を直接測
定することにより、リウマチを診断することができる。
【０００３】このような観点に沿っての研究が行われ、
ヒトＩｇＧをβ−ガラクトシダーゼによって処理するこ
とにより得られ、所定の理化学的性状を有するアガラク
トシルＩｇＧが得られたことが報告（特開平３−４８７
００号公報）されている。しかしながら、この提案によ
るアガラクトシルＩｇＧがニトロセルロース膜に固定化
されてなるリウマチ診断薬でリウマチ因子を直接測定す
る診断では、アガラクトシルＩｇＧとリウマチ因子との
反応が充分なものでもなく、診断の正確性の面で問題が
残されている。
ヒトＩｇＧをβ−ガラクトシダーゼによって処理するこ
とにより得られ、所定の理化学的性状を有するアガラク
トシルＩｇＧが得られたことが報告（特開平３−４８７
００号公報）されている。しかしながら、この提案によ
るアガラクトシルＩｇＧがニトロセルロース膜に固定化
されてなるリウマチ診断薬でリウマチ因子を直接測定す
る診断では、アガラクトシルＩｇＧとリウマチ因子との
反応が充分なものでもなく、診断の正確性の面で問題が
残されている。
【０００４】
【発明の開示】本発明の目的は、リウマチの診断を正確
に行える技術を提案することである。この本発明の目的
は、ヒト血清中に存在するアガラクトシルＩｇＧ量を抗
ヒトＩｇＧ抗体とレクチンとによりサンドイッチして測
定することにより診断することを特徴とするリウマチ診
断方法によって達成される。
に行える技術を提案することである。この本発明の目的
は、ヒト血清中に存在するアガラクトシルＩｇＧ量を抗
ヒトＩｇＧ抗体とレクチンとによりサンドイッチして測
定することにより診断することを特徴とするリウマチ診
断方法によって達成される。
【０００５】又、抗ヒトＩｇＧ抗体とレクチンとよりな
り、ヒト血清中に存在するアガラクトシルＩｇＧ量をサ
ンドイッチして測定することを特徴とするリウマチ診断
薬によって達成される。又、ヒトＩｇＧを含む溶液にガ
ラクトース転移酵素とＵＤＰ−Ｇａｌ（ウラシルデオキ
シヌクレオチドリン酸−ガラクトース）を加え、新たに
転移したガラクトースの量を測定することを特徴とする
アガラクトシルＩｇＧの定量方法によって達成される。
り、ヒト血清中に存在するアガラクトシルＩｇＧ量をサ
ンドイッチして測定することを特徴とするリウマチ診断
薬によって達成される。又、ヒトＩｇＧを含む溶液にガ
ラクトース転移酵素とＵＤＰ−Ｇａｌ（ウラシルデオキ
シヌクレオチドリン酸−ガラクトース）を加え、新たに
転移したガラクトースの量を測定することを特徴とする
アガラクトシルＩｇＧの定量方法によって達成される。
【０００６】尚、抗ヒトＩｇＧ抗体はＦｃ部位を含まな
いものであることが好ましく、又、レクチンはリシナス
コミニスアグルチニン（ＲＣＡ）であることが好まし
く、そして前記のような抗ヒトＩｇＧ抗体は担体に固定
化され、レクチンは例えば西洋わさびペルオキシダーゼ
のような酵素で標識されたものが好ましい。すなわち、
リウマチ患者では血清中のＩｇＧのＦｃ部位に存在する
糖鎖のガラクトース含有量が著しく減少していることか
ら、リウマチ患者血清中のアガラクトシルＩｇＧ量を定
量することで、リウマチの診断を正確に行えるのであ
る。
いものであることが好ましく、又、レクチンはリシナス
コミニスアグルチニン（ＲＣＡ）であることが好まし
く、そして前記のような抗ヒトＩｇＧ抗体は担体に固定
化され、レクチンは例えば西洋わさびペルオキシダーゼ
のような酵素で標識されたものが好ましい。すなわち、
リウマチ患者では血清中のＩｇＧのＦｃ部位に存在する
糖鎖のガラクトース含有量が著しく減少していることか
ら、リウマチ患者血清中のアガラクトシルＩｇＧ量を定
量することで、リウマチの診断を正確に行えるのであ
る。
【０００７】以下、本発明を詳細に説明する。本発明の
抗ヒトＩｇＧ抗体は市販のものを用いることが出来、多
孔質の不溶化担体に化学的及び／又は物理的に直接ある
いは間接的に結合させることができる。固定化手段につ
いては、１９７６年、講談社発行、千畑一郎ほか２名編
「実験と応用 アフィニティクロマトグラフィー」（第
１刷）、１９７５年、講談社発行、山崎 誠ほか２名編
「アフィニティクロマトグラフィー」（第１版）を参考
にできる。尚、結合反応後、抗ヒトＩｇＧ抗体の非特異
反応を排除する目的で、測定すべき特異的反応に関与し
ない蛋白質を担持させることができる。それらの代表的
な例としては、哺乳動物及び鳥類の正常血清蛋白質、ア
ルブミン、スキムミルク、乳酸醗酵物、コラーゲン及び
それらの分解物質等が挙げられる。
抗ヒトＩｇＧ抗体は市販のものを用いることが出来、多
孔質の不溶化担体に化学的及び／又は物理的に直接ある
いは間接的に結合させることができる。固定化手段につ
いては、１９７６年、講談社発行、千畑一郎ほか２名編
「実験と応用 アフィニティクロマトグラフィー」（第
１刷）、１９７５年、講談社発行、山崎 誠ほか２名編
「アフィニティクロマトグラフィー」（第１版）を参考
にできる。尚、結合反応後、抗ヒトＩｇＧ抗体の非特異
反応を排除する目的で、測定すべき特異的反応に関与し
ない蛋白質を担持させることができる。それらの代表的
な例としては、哺乳動物及び鳥類の正常血清蛋白質、ア
ルブミン、スキムミルク、乳酸醗酵物、コラーゲン及び
それらの分解物質等が挙げられる。
【０００８】抗ヒトＩｇＧ抗体が物理的及び／又は化学
的に結合される担体は多孔質なものであることが好まし
く、このような担体の材料としてはケイ藻土、二酸化チ
タン、硫酸バリウム、酸化亜鉛、酸化鉛、微結晶セルロ
ース、ケイ砂、ガラス、シリカゲル、架橋デキストリ
ン、架橋ポリアクリルアミド、アガロース、架橋アガロ
ース、ポリスチレン等の各種の合成樹脂が挙げられる。
そして、このような素材の多孔質担体であれば、抗ヒト
ＩｇＧ抗体が固定化される一次的な形状は粒子（ビー
ズ）状、棒状、プレート状、何れのものであっても差し
支えない。
的に結合される担体は多孔質なものであることが好まし
く、このような担体の材料としてはケイ藻土、二酸化チ
タン、硫酸バリウム、酸化亜鉛、酸化鉛、微結晶セルロ
ース、ケイ砂、ガラス、シリカゲル、架橋デキストリ
ン、架橋ポリアクリルアミド、アガロース、架橋アガロ
ース、ポリスチレン等の各種の合成樹脂が挙げられる。
そして、このような素材の多孔質担体であれば、抗ヒト
ＩｇＧ抗体が固定化される一次的な形状は粒子（ビー
ズ）状、棒状、プレート状、何れのものであっても差し
支えない。
【０００９】又、本発明で用いられるレクチンは、通
常、微粉砕した種実から抽出し、硫酸アンモニウムで沈
澱させた後、糖のアフィニティクロマトにより精製して
得られる。特に、リシナスコミニスアグルチニン（ＲＣ
Ａ）はヒバの種実からβ−Ｄ−ガラクトースのアフィニ
ティカラムにより得られる。そして、このようなレクチ
ンの標識に使用される標識物質としては酵素、酵素基
質、酵素及び酵素前駆体の活性を変化させる物質（酵素
阻害物質、補欠分子族、補酵素）、酵素前駆体、アポ酵
素、螢光物質などが挙げられるが、ペルオキシダーゼ、
特に西洋わさびのペルオキシダーゼが好ましい。そし
て、標識物質のレクチンへの結合は、当業者間で知られ
ている公知の試薬と方法で行うことができ、例えば石川
栄治、河合 忠、宮井潔 編「酵素免疫測定法（第３
版）、医学書院、１９８７年」や日本臨床病理学会編
「臨床病理」臨時増刊特集第５３号「臨床検査の為のイ
ムノアッセイ−技術と応用−、臨床病理刊行会、１９８
３年」などに記載された方法を参考にすることができ
る。
常、微粉砕した種実から抽出し、硫酸アンモニウムで沈
澱させた後、糖のアフィニティクロマトにより精製して
得られる。特に、リシナスコミニスアグルチニン（ＲＣ
Ａ）はヒバの種実からβ−Ｄ−ガラクトースのアフィニ
ティカラムにより得られる。そして、このようなレクチ
ンの標識に使用される標識物質としては酵素、酵素基
質、酵素及び酵素前駆体の活性を変化させる物質（酵素
阻害物質、補欠分子族、補酵素）、酵素前駆体、アポ酵
素、螢光物質などが挙げられるが、ペルオキシダーゼ、
特に西洋わさびのペルオキシダーゼが好ましい。そし
て、標識物質のレクチンへの結合は、当業者間で知られ
ている公知の試薬と方法で行うことができ、例えば石川
栄治、河合 忠、宮井潔 編「酵素免疫測定法（第３
版）、医学書院、１９８７年」や日本臨床病理学会編
「臨床病理」臨時増刊特集第５３号「臨床検査の為のイ
ムノアッセイ−技術と応用−、臨床病理刊行会、１９８
３年」などに記載された方法を参考にすることができ
る。
【００１０】上記抗ヒトＩｇＧ抗体とレクチンとにより
サンドイッチしてヒト血清中に存在するアガラクトシル
ＩｇＧ量を測定するには、次のようにして行われる。す
なわち、担体に固定化した抗ヒトＩｇＧ抗体にアガラク
トシルＩｇＧを含むリウマチ患者血清中のＩｇＧを反応
させ、Ｂ／Ｆ分離を行った後、標識したレクチン（ＲＣ
Ａ）を反応させる。これを再びＢ／Ｆ分離した後、標識
の信号を適宜な手段により検出する。
サンドイッチしてヒト血清中に存在するアガラクトシル
ＩｇＧ量を測定するには、次のようにして行われる。す
なわち、担体に固定化した抗ヒトＩｇＧ抗体にアガラク
トシルＩｇＧを含むリウマチ患者血清中のＩｇＧを反応
させ、Ｂ／Ｆ分離を行った後、標識したレクチン（ＲＣ
Ａ）を反応させる。これを再びＢ／Ｆ分離した後、標識
の信号を適宜な手段により検出する。
【００１１】標識に起因した信号は、吸光度法（比色
法) 、螢光法または発光法で検出することができ、測定
法としては信号の経時的変化を測定するレート測定法ま
たは一定時間後の信号を測定するエンドポイント測定法
で測定することができる。そして、このようにして測定
されたヒト血清中に存在するアガラクトシルＩｇＧ量の
データより、リウマチ患者であるか否かが判定される。
具体的には、アガラクトシルＩｇＧ量が全ＩｇＧ量に比
較して多い場合にはリウマチ患者であり、アガラクトシ
ルＩｇＧ量が全ＩｇＧ量に比較して少ない場合にはリウ
マチ患者でないと判定される。
法) 、螢光法または発光法で検出することができ、測定
法としては信号の経時的変化を測定するレート測定法ま
たは一定時間後の信号を測定するエンドポイント測定法
で測定することができる。そして、このようにして測定
されたヒト血清中に存在するアガラクトシルＩｇＧ量の
データより、リウマチ患者であるか否かが判定される。
具体的には、アガラクトシルＩｇＧ量が全ＩｇＧ量に比
較して多い場合にはリウマチ患者であり、アガラクトシ
ルＩｇＧ量が全ＩｇＧ量に比較して少ない場合にはリウ
マチ患者でないと判定される。
【００１２】
【実施例】以下、本発明について具体的に説明するが、
本発明はこれによって制限されるものではない。 〔実施例１〕ヒトＩｇＧ（３５ｍｇ／ｍｌ）を０．１Ｍ
のクエン酸緩衝液（ｐＨ５．５）１ｍｌ中でシアリダー
ゼ（０．５ｍｇ／ｍｌ）処理した後、β−ガラクトシダ
ーゼ（２００ｍＵ／ｍｌ）と充分に反応させ、その後
１．５Ｍのグリシン−ＨＣｌ、３ＭのＮａＣｌ（ｐＨ
８．９）の緩衝液で平衡化されたプロテインＡ−セファ
ロースＣＬ−４Ｂに添加した。１．５Ｍのグリシン−Ｈ
Ｃｌ、３ＭのＮａＣｌ（ｐＨ８．９）の緩衝液で充分に
洗浄した後、０．１Ｍのグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ３．
０）でアガラクトシルＩｇＧ試料を回収し、リン酸緩衝
液で透析した。
本発明はこれによって制限されるものではない。 〔実施例１〕ヒトＩｇＧ（３５ｍｇ／ｍｌ）を０．１Ｍ
のクエン酸緩衝液（ｐＨ５．５）１ｍｌ中でシアリダー
ゼ（０．５ｍｇ／ｍｌ）処理した後、β−ガラクトシダ
ーゼ（２００ｍＵ／ｍｌ）と充分に反応させ、その後
１．５Ｍのグリシン−ＨＣｌ、３ＭのＮａＣｌ（ｐＨ
８．９）の緩衝液で平衡化されたプロテインＡ−セファ
ロースＣＬ−４Ｂに添加した。１．５Ｍのグリシン−Ｈ
Ｃｌ、３ＭのＮａＣｌ（ｐＨ８．９）の緩衝液で充分に
洗浄した後、０．１Ｍのグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ３．
０）でアガラクトシルＩｇＧ試料を回収し、リン酸緩衝
液で透析した。
【００１３】次に、ヒトＩｇＧと上記のようにして得ら
れたアガラクトシルＩｇＧを０：１０、１：９、３：
７、５：５、７：３、９：１、１０：０の割合で混合
し、１％ＢＳＡ−ＰＢＳ溶液で希釈して、ヒトＩｇＧと
アガラクトシルＩｇＧの総量の最終濃度を５０μｇ／ｍ
ｌとした。次に、ヤギ由来抗ヒトＩｇＧ・Ｆ（ａｂ’）
2 （ロックランド社）をＰＢＳで希釈して１０μｇ／ｍ
ｌとし、９６穴イムノプレートに１００μｌずつ分注
し、４℃で一晩、物理吸着させた。吸着後、液を捨て、
ＰＢＳで洗浄した後、１％ＢＳＡ−ＰＢＳ溶液を２００
μｌずつ加えて１時間ブロッキングした。液を捨てた
後、１００倍に希釈した。そして、このヒトＩｇＧ溶液
をＰＢＳで１００倍に希釈して１００μｌずつ加え、３
７℃で１時間反応させた。反応終了後、液を捨て、ＰＢ
Ｓで洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼで（ＨＲＰ）
標識したＲＣＡ・ＨＲＰ（Ｅ．Ｙ．ラボラトリーズ）と
１％ＢＳＡ−ＰＢＳ溶液を加え、室温で１時間反応させ
た。又、ＲＣＡ・ＨＲＰに代えて抗ヒトＩｇＧ・ＨＲＰ
と１％ＢＳＡ−ＰＢＳ溶液を加え、同様に室温で反応さ
せた。ＰＢＳで洗浄後、０．０２％Ｈ2 Ｏ2 と３ｍｇ／
ｍｌのｏ−フェニレンジアミン溶液を含むクエン酸−リ
ン酸緩衝液（ｐＨ５．０）を１００μｌずつ加えて発色
させた後、９ＮのＨ2 ＳＯ4 を５０μｌずつ添加し、反
応を停止し、各ウェルにおける４９２ｎｍの吸光度を測
定したので、その結果を図１に示す。これによれば、ア
ガラクトシルＩｇＧ量が少なくなるにつれて、レクチン
との反応が増加し、吸光度は増し、検量線を作成でき
る。
れたアガラクトシルＩｇＧを０：１０、１：９、３：
７、５：５、７：３、９：１、１０：０の割合で混合
し、１％ＢＳＡ−ＰＢＳ溶液で希釈して、ヒトＩｇＧと
アガラクトシルＩｇＧの総量の最終濃度を５０μｇ／ｍ
ｌとした。次に、ヤギ由来抗ヒトＩｇＧ・Ｆ（ａｂ’）
2 （ロックランド社）をＰＢＳで希釈して１０μｇ／ｍ
ｌとし、９６穴イムノプレートに１００μｌずつ分注
し、４℃で一晩、物理吸着させた。吸着後、液を捨て、
ＰＢＳで洗浄した後、１％ＢＳＡ−ＰＢＳ溶液を２００
μｌずつ加えて１時間ブロッキングした。液を捨てた
後、１００倍に希釈した。そして、このヒトＩｇＧ溶液
をＰＢＳで１００倍に希釈して１００μｌずつ加え、３
７℃で１時間反応させた。反応終了後、液を捨て、ＰＢ
Ｓで洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼで（ＨＲＰ）
標識したＲＣＡ・ＨＲＰ（Ｅ．Ｙ．ラボラトリーズ）と
１％ＢＳＡ−ＰＢＳ溶液を加え、室温で１時間反応させ
た。又、ＲＣＡ・ＨＲＰに代えて抗ヒトＩｇＧ・ＨＲＰ
と１％ＢＳＡ−ＰＢＳ溶液を加え、同様に室温で反応さ
せた。ＰＢＳで洗浄後、０．０２％Ｈ2 Ｏ2 と３ｍｇ／
ｍｌのｏ−フェニレンジアミン溶液を含むクエン酸−リ
ン酸緩衝液（ｐＨ５．０）を１００μｌずつ加えて発色
させた後、９ＮのＨ2 ＳＯ4 を５０μｌずつ添加し、反
応を停止し、各ウェルにおける４９２ｎｍの吸光度を測
定したので、その結果を図１に示す。これによれば、ア
ガラクトシルＩｇＧ量が少なくなるにつれて、レクチン
との反応が増加し、吸光度は増し、検量線を作成でき
る。
【００１４】次に、リウマチ患者の血清１２例、健常人
の血清１１例について、上記と同様にして測定した。す
なわち、ヒトＩｇＧ溶液に代えて各々１％ＢＳＡ−ＰＢ
Ｓ溶液で２万倍に希釈したリウマチ患者血清及び健常人
血清を各々１００μｌ添加し、同様に行った。測定結果
は図２に示す通りであり、ＩｇＧ総量は略同じであるも
のの、図１の検量線にも一致する通り、アガラクトシル
ＩｇＧ量の差に基づき、抗ヒトＩｇＧ抗体とレクチンと
によりサンドイッチして測定したリウマチ患者の吸光度
O.D.は健常人の吸光度O.D.に比べて格段に低く、この差
からリウマチ患者であるか否かを判定出来るのである。
の血清１１例について、上記と同様にして測定した。す
なわち、ヒトＩｇＧ溶液に代えて各々１％ＢＳＡ−ＰＢ
Ｓ溶液で２万倍に希釈したリウマチ患者血清及び健常人
血清を各々１００μｌ添加し、同様に行った。測定結果
は図２に示す通りであり、ＩｇＧ総量は略同じであるも
のの、図１の検量線にも一致する通り、アガラクトシル
ＩｇＧ量の差に基づき、抗ヒトＩｇＧ抗体とレクチンと
によりサンドイッチして測定したリウマチ患者の吸光度
O.D.は健常人の吸光度O.D.に比べて格段に低く、この差
からリウマチ患者であるか否かを判定出来るのである。
【００１５】〔実施例２〕 〔抗ＩｇＧポリクローナル抗体Ｆ（ａｂ’）2 のゲルへ
の結合〕カルボジイミドで活性化したトリスアクリルゲ
ルＧＦ−２０００（ピアス化学社）を蒸留水と結合バッ
ファー（０．１Ｍホウ酸塩溶液、ｐＨ８．５）で２回洗
浄する。抗ヒトＩｇＧポリクローナル抗体Ｆ（ａｂ’）
2 ４ｍｇに結合バッファー２ｍｌと洗浄したＧＦ−２０
００ゲルを入れ、４℃で一晩振盪培養する。ゲルの未反
応活性基は５％ＢＳＡ／結合バッファー２ｍｌと４℃で
一晩培養してブロックする。抗体の結合したゲルを０．
１Ｍクエン酸バッファー、１．４Ｍ塩化ナトリウム（ｐ
Ｈ４．０）と０．１Ｍ炭酸バッファー、１．４Ｍ塩化ナ
トリウム（ｐＨ１１．０）で交互に洗浄し、最後にＰＢ
Ｓで洗浄する。ゲルは５ｍｌのＰＢＳ（０．０５％Ｎａ
Ｎ3 を含む）中で保存した。
の結合〕カルボジイミドで活性化したトリスアクリルゲ
ルＧＦ−２０００（ピアス化学社）を蒸留水と結合バッ
ファー（０．１Ｍホウ酸塩溶液、ｐＨ８．５）で２回洗
浄する。抗ヒトＩｇＧポリクローナル抗体Ｆ（ａｂ’）
2 ４ｍｇに結合バッファー２ｍｌと洗浄したＧＦ−２０
００ゲルを入れ、４℃で一晩振盪培養する。ゲルの未反
応活性基は５％ＢＳＡ／結合バッファー２ｍｌと４℃で
一晩培養してブロックする。抗体の結合したゲルを０．
１Ｍクエン酸バッファー、１．４Ｍ塩化ナトリウム（ｐ
Ｈ４．０）と０．１Ｍ炭酸バッファー、１．４Ｍ塩化ナ
トリウム（ｐＨ１１．０）で交互に洗浄し、最後にＰＢ
Ｓで洗浄する。ゲルは５ｍｌのＰＢＳ（０．０５％Ｎａ
Ｎ3 を含む）中で保存した。
【００１６】〔ＧａｌＴとの反応〕５０μｌの抗ＩｇＧ
抗体が結合したゲル懸濁液と、ヒトＩｇＧをβ−ガラク
トシダーゼで処理することによって得られたアガラクト
シルＩｇＧ（２０，１０，５，１，０．５μｇ）とを合
わせて４℃で一晩振盪培養した。２ｍｌの冷ＣＫＴバッ
ファー（２０ｍＭのカコジル酸ナトリウム、１５０ｍＭ
のＫＣｌ、０．０１％のトライトンＸ−１００）で３回
洗浄した後、上澄液を吸引する。１００μｌのＧａｌＴ
反応液（５μｌの０．５ｍＭ〔3 Ｈ〕ＵＤＰ−Ｇａｌ
液、ニューイングランドヌクレアー社製）、１μｌの
１．０Ｍ二酸化マンガン液、９４μｌのＣＫＴバッファ
ー、１．０Ｕの牛由来ガラクトース転移酵素（シグマ社
製）を加え、３７℃で３０分間インキュベートする。反
応終了後、０．０５％ツィーン−２０を含むＰＢＳ溶液
２ｍｌで５回洗浄した後、最後に２００μｌのＰＢＳに
懸濁した。ゲル懸濁液から１００μｌを取り出し、液体
シンチレーターに懸濁後放射活性の測定を行ったので、
その結果を図３に示す。
抗体が結合したゲル懸濁液と、ヒトＩｇＧをβ−ガラク
トシダーゼで処理することによって得られたアガラクト
シルＩｇＧ（２０，１０，５，１，０．５μｇ）とを合
わせて４℃で一晩振盪培養した。２ｍｌの冷ＣＫＴバッ
ファー（２０ｍＭのカコジル酸ナトリウム、１５０ｍＭ
のＫＣｌ、０．０１％のトライトンＸ−１００）で３回
洗浄した後、上澄液を吸引する。１００μｌのＧａｌＴ
反応液（５μｌの０．５ｍＭ〔3 Ｈ〕ＵＤＰ−Ｇａｌ
液、ニューイングランドヌクレアー社製）、１μｌの
１．０Ｍ二酸化マンガン液、９４μｌのＣＫＴバッファ
ー、１．０Ｕの牛由来ガラクトース転移酵素（シグマ社
製）を加え、３７℃で３０分間インキュベートする。反
応終了後、０．０５％ツィーン−２０を含むＰＢＳ溶液
２ｍｌで５回洗浄した後、最後に２００μｌのＰＢＳに
懸濁した。ゲル懸濁液から１００μｌを取り出し、液体
シンチレーターに懸濁後放射活性の測定を行ったので、
その結果を図３に示す。
【００１７】これによれば、アガラクトシルＩｇＧの定
量が可能なことが判る。
量が可能なことが判る。
【００１８】
【効果】リウマチの診断を正確に行える。
【図１】横軸にヒトＩｇＧ／アガラクトシルヒトＩｇＧ
量を、縦軸に吸光度を示すグラフ。
量を、縦軸に吸光度を示すグラフ。
【図２】リウマチ患者血清と健常人血清の吸光度を示す
グラフ。
グラフ。
【図３】アガラクトシルＩｇＧの定量を示すグラフ。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成３年１２月２日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項６
【補正方法】変更
【補正内容】
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００５
【補正方法】変更
【補正内容】
【０００５】又、抗ヒトＩｇＧ抗体とレクチンとよりな
り、ヒト血液中に存在するアガラクトシルＩｇＧ量をサ
ンドイッチして測定することを特徴とするリウマチ診断
薬によって達成される。又、ヒトＩｇＧを含む溶液にガ
ラクトース転移酵素とＵＤＰ−Ｇａｌ（ウリジン−５’
−二リン酸−ガラクトース）を加え、新たに転移したガ
ラクトースの量を測定することを特徴とするアガラクト
シルＩｇＧの定量方法によって達成される。
り、ヒト血液中に存在するアガラクトシルＩｇＧ量をサ
ンドイッチして測定することを特徴とするリウマチ診断
薬によって達成される。又、ヒトＩｇＧを含む溶液にガ
ラクトース転移酵素とＵＤＰ−Ｇａｌ（ウリジン−５’
−二リン酸−ガラクトース）を加え、新たに転移したガ
ラクトースの量を測定することを特徴とするアガラクト
シルＩｇＧの定量方法によって達成される。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１３】次に、ヒトＩｇＧと上記のようにして得ら
れたアガラクトシルＩｇＧを０：１０、１：９、３：
７、５：５、７：３、９：１、１０：０の割合で混合
し、１％ＢＳＡ−ＰＢＳ溶液で希釈して、ヒトＩｇＧと
アガラクトシルＩｇＧの総量の最終濃度を５０μｇ／ｍ
ｌとした。次に、ヤギ由来抗ヒトＩｇＧ・Ｆ（ａｂ’）
２（ロックランド社）をＰＢＳで希釈して１０μｇ／ｍ
ｌとし、９６穴イムノプレートに１００μｌずつ分注
し、４℃で一晩、物理吸着させた。吸着後、液を捨て、
ＰＢＳで洗浄した後、１％ＢＳＡ−ＰＢＳ溶液を２００
μｌずつ加えて１時間ブロッキングした。液を捨てた
後、上記のＩｇＧ溶液をＰＢＳで１００倍に希釈して１
００μｌずつ加え、３７℃で１時間反応させた。反応終
了後、液を捨て、ＰＢＳで洗浄し、西洋ワサビペルオキ
シダーゼで（ＨＲＰ）標識したＲＣＡ・ＨＲＰ（Ｅ．
Ｙ．ラボラトリーズ）と１％ＢＳＡ−ＰＢＳ溶液を加
え、室温で１時間反応させた。又、ＲＣＡ・ＨＲＰに代
えて抗ヒトＩｇＧ・ＨＲＰと１％ＢＳＡ−ＰＢＳ溶液を
加え、同様に室温で反応させた。ＰＢＳで洗浄後、０．
０２％Ｈ２Ｏ２と３ｍｇ／ｍｌのｏ−フェニレンジアミ
ン溶液を含むクエン酸−リン酸緩衝液（ｐＨ５．０）を
１００μｌずつ加えて発色させた後、９ＮのＨ２ＳＯ４
を５０μｌずつ添加し、反応を停止し、各ウェルにおけ
る４９２ｎｍの吸光度を測定したので、その結果を図１
に示す。これによれば、アガラクトシルＩｇＧ量が少な
くなるにつれて、レクチンとの反応が増加し、吸光度は
増し、検量線を作成できる。
れたアガラクトシルＩｇＧを０：１０、１：９、３：
７、５：５、７：３、９：１、１０：０の割合で混合
し、１％ＢＳＡ−ＰＢＳ溶液で希釈して、ヒトＩｇＧと
アガラクトシルＩｇＧの総量の最終濃度を５０μｇ／ｍ
ｌとした。次に、ヤギ由来抗ヒトＩｇＧ・Ｆ（ａｂ’）
２（ロックランド社）をＰＢＳで希釈して１０μｇ／ｍ
ｌとし、９６穴イムノプレートに１００μｌずつ分注
し、４℃で一晩、物理吸着させた。吸着後、液を捨て、
ＰＢＳで洗浄した後、１％ＢＳＡ−ＰＢＳ溶液を２００
μｌずつ加えて１時間ブロッキングした。液を捨てた
後、上記のＩｇＧ溶液をＰＢＳで１００倍に希釈して１
００μｌずつ加え、３７℃で１時間反応させた。反応終
了後、液を捨て、ＰＢＳで洗浄し、西洋ワサビペルオキ
シダーゼで（ＨＲＰ）標識したＲＣＡ・ＨＲＰ（Ｅ．
Ｙ．ラボラトリーズ）と１％ＢＳＡ−ＰＢＳ溶液を加
え、室温で１時間反応させた。又、ＲＣＡ・ＨＲＰに代
えて抗ヒトＩｇＧ・ＨＲＰと１％ＢＳＡ−ＰＢＳ溶液を
加え、同様に室温で反応させた。ＰＢＳで洗浄後、０．
０２％Ｈ２Ｏ２と３ｍｇ／ｍｌのｏ−フェニレンジアミ
ン溶液を含むクエン酸−リン酸緩衝液（ｐＨ５．０）を
１００μｌずつ加えて発色させた後、９ＮのＨ２ＳＯ４
を５０μｌずつ添加し、反応を停止し、各ウェルにおけ
る４９２ｎｍの吸光度を測定したので、その結果を図１
に示す。これによれば、アガラクトシルＩｇＧ量が少な
くなるにつれて、レクチンとの反応が増加し、吸光度は
増し、検量線を作成できる。
Claims (6)
- 【請求項１】 ヒト血清中に存在するアガラクトシルＩ
ｇＧ量を抗ヒトＩｇＧ抗体とレクチンとによりサンドイ
ッチして測定することにより診断することを特徴とする
リウマチ診断方法。 - 【請求項２】 抗ヒトＩｇＧ抗体がＦｃ部位を含まない
ものであることを特徴とする請求項１のリウマチ診断方
法。 - 【請求項３】 レクチンがリシナスコミニスアグルチニ
ン（ＲＣＡ）であることを特徴とする請求項１のリウマ
チ診断方法。 - 【請求項４】 抗ヒトＩｇＧ抗体が担体に固定化され、
レクチンが酵素標識されたものであることを特徴とする
請求項１のリウマチ診断方法。 - 【請求項５】 抗ヒトＩｇＧ抗体とレクチンとよりな
り、ヒト血清中に存在するアガラクトシルＩｇＧ量をサ
ンドイッチして測定することを特徴とするリウマチ診断
薬。 - 【請求項６】 ヒトＩｇＧを含む溶液にガラクトース転
移酵素とウラシルデオキシヌクレオチドリン酸−ガラク
トースを加え、新たに転移したガラクトースの量を測定
することを特徴とするアガラクトシルＩｇＧの定量方
法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3252388A JPH0587814A (ja) | 1991-09-30 | 1991-09-30 | リウマチ診断方法及びリウマチ診断薬並びにアガラクト シルＩｇＧの定量方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3252388A JPH0587814A (ja) | 1991-09-30 | 1991-09-30 | リウマチ診断方法及びリウマチ診断薬並びにアガラクト シルＩｇＧの定量方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0587814A true JPH0587814A (ja) | 1993-04-06 |
Family
ID=17236633
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3252388A Pending JPH0587814A (ja) | 1991-09-30 | 1991-09-30 | リウマチ診断方法及びリウマチ診断薬並びにアガラクト シルＩｇＧの定量方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0587814A (ja) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1996024845A1 (en) * | 1995-02-10 | 1996-08-15 | Morinaga Milk Industry Co., Ltd. | Reagent for detecting substances and method for diagnosing rheumatoid arthritis |
| WO1998016825A1 (fr) * | 1996-10-15 | 1998-04-23 | Seikagaku Corporation | PROCEDE DE DOSAGE D'UNE AGALACTO-IgG ET TROUSSES DE DOSAGE, POLYPEPTIDES DE LECTINES ET ADN CODANT CEUX-CI |
| WO1999041286A1 (en) * | 1998-02-16 | 1999-08-19 | University College London | DERIVATISED ANTIBODIES WITH EXPOSED CARBOHYDRATE CHAINS CAPABLE OF BINDING TO IMMOBILISED IgG |
| WO2000075313A1 (fr) * | 1999-06-02 | 2000-12-14 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Methode d'evaluation de la polyarthrite rhumatoide |
| WO2007007792A1 (ja) * | 2005-07-12 | 2007-01-18 | Eisai R & D Management Co., Ltd. | 抗体の検出法及び検出キット |
-
1991
- 1991-09-30 JP JP3252388A patent/JPH0587814A/ja active Pending
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1996024845A1 (en) * | 1995-02-10 | 1996-08-15 | Morinaga Milk Industry Co., Ltd. | Reagent for detecting substances and method for diagnosing rheumatoid arthritis |
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| WO1999041286A1 (en) * | 1998-02-16 | 1999-08-19 | University College London | DERIVATISED ANTIBODIES WITH EXPOSED CARBOHYDRATE CHAINS CAPABLE OF BINDING TO IMMOBILISED IgG |
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| WO2007007792A1 (ja) * | 2005-07-12 | 2007-01-18 | Eisai R & D Management Co., Ltd. | 抗体の検出法及び検出キット |
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