JPS6228666A - 生物学的試料中の抗原及び抗体検出法及び検出用支持体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はヒト患者からの生物学的試料、たとえば血清ま
たは尿中の抗原および抗体の検出に関する。本明細書に
おいて、抗原および該抗原に対する抗体は特定の結合対
と称する。

非常に多くの抗原及び抗体が、該特定結合対の第１メン
バーが第２メンバーとの反応により免疫複合体を形成す
ることによって検出される免疫検定法により検出できる
ようになった。そのような検定法のいくつかは上記対の
第２メンバーと、物質（たとえば過酸化物）に作用を及
ぼして呈色試薬（たとえば、酸性媒体中のテトラメチル
ベンジジンすなわち“’ＴＭＢ”）中で呈色変化を生ぜ
しめる酵素（たとえば西洋わさびペルオキシダーゼ、す
なわち“ＨＲＰ””）との結合物を使用する。そのよう
な結、金物は一般に、硫酸塩および／またはリン酸塩を
含有する緩衝液中で使用直前に安定化させる。

普通検出される抗原の１つはヒト絨毛性ゴナドトロピン
（“ｈＣＧ”）、すなわち妊娠中血中及び尿中に確認し
得る量存在するようになるホルモンである。ｈＣＧのα
鎖はいくつかの他の受精ホルモンのα鎖と同じなのでふ
つう検出されるのは、抗β−ｈＣＧ抗体を使用してβ鎖
である。そのような妊娠経験は多くの米国特許、たとえ
ばシュルス（Ｓｃｈｕｒｒｓ）らの米国特許第３，６５
４，０９０号であって、本明細書で９考文献として記載
されている。

−ｉに、本発明は上記タイプの免疫検定の改良に関する
。

１つの改良点は、アルカリ性ｐＨ２すなわち７．０〜９
．５でのＴＭＢの使用であって、これにより呈色試薬の
安定性が増加し、呈色がすぐれ、固体支持体（たとえば
ポリスチレン製反応試験管）を染色して陽性反応の永久
記録を可能にする。

もう１つの改良点は、上記特定結合対の１つのメンバー
とＨＲＰのような酵素とをｇ−ＭＢＳ−ＳＡＴＡ結合（
下記に詳述）により結合させることであって、該結合に
より酵素安定性および反応体特異性が増大する。

もう１つの改良点は、被覆された支持体（一般に管）で
あって、該被覆はポリクローナル抗体とモノクローナル
抗体の混合物であるものを使用することであって、好ま
しくは３以上の異なるモノクローナル抗体が存在し、ポ
リクローナル：モノクローナル抗体の蛋白質比５：１〜
８：１、もつとも好ましくは約７：１である。

本発明の改良により、ヒト血清または尿をスクリーニン
グしてβ−ｈＣＧを検定するためのスピード、簡便性、
感度および正確さを備えた系を提供できる。この検出系
は長期間安定であるため、家庭用の妊娠検出キットとし
て市販でき、あるいは臨床検査室や医院で使用できる。

本発明の他のＲ様及び利点は下記具体例と特許請求の範
囲から明らかとなろう。

本発明のβ−ｈＣＧ試験は下記の通りである。

装−一」」 β−ｈＣＧ試験装置は４つの構成要素を含む＝１、内面
をポリクローナル抗−β−ｈＣＧ抗体とモノクローナル
抗−β−ｈＣＧ抗体の混合物で被覆したポリスチレン製
の試験管： ２、Ｎ−Ｗ−マレインイミドブチルオキシーサクシンイ
ミド（ｇ−ＭＢＳ＞−Ｎ−ザクシンイミジル−Ｓ−アセ
チル−チオアセテート（ＳＡＴＡ）結合； ３、約ｐ＋４８．０に維持したアルカリ性緩衝溶液中テ
トラメチルベンジン（ＴＭＢ）指示色素：および４、過
酸化物。

このβ−ｈＣＧ試験装置は２つの形で提供できる。１つ
の形は、臨床検査室や医院で使用するのに適しており、
４つの構成要素は別々に提供される。もう１つの形は、
家庭で使用するのに適しており、凍結乾燥された形の抗
体−ＨＲＰ結合物が被覆されたポリスチレン試験管内に
密封され、過酸化物が試験管内の栓に固定された錠剤の
形で提供されるか別々に包装される。

各構成要素の製造の詳細な説明は次のとおりである。

抗潜Ｍ試ＪＬＬ 清浄なポリスチレン管（１２Ｘ　７５＋ｍ）の内面を被
覆するために、ポリクローナルウサギ抗β−ｈＣＧ抗体
とモノクローナル抗β−ｈＣＧ抗体の蛋白質：蛋白質の
比７：１の混合物を０．１０Ｍ　Ｎ　ａＨＣＯｙ緩衝液
（ｐＨ８，１）中で希釈して最終希釈率１　：５００（
２０Ｍｇ／　ｚｆ）とする。これらのモノクローナル抗
体は標準的なハイブリドーマ技術を使用して得られる５
つの異なるモノクローナル抗体の混合物である。

希釈された抗体溶液／ｘｌをガラスピペットを使用して
試験管に入れ、その後試験管を２０°Ｃで１８−２４時
間インキュベートした０次いで抗体溶液を試験管から吸
引して試験管を脱イオン水中０．１５ＭＮａＣｊ！１．
Ｏｘ１で洗った。トリス緩衝液（ｐＨ８，０）中１％Ｂ
ＳＡ４ｚｊ！を次いで試験管に加え、該試験管を室温で
１８−２４時間インキュベートし、その後、ＢＳＡ溶液
を試験管から吸引し、該試験管を３７°Ｃで１８−２４
時間乾燥させる。被覆した試験管を乾燥剤とともに加熱
密封し、使用迄貯蔵した。

ＨＲＰ−−ｈＣＧ　　　　　　ま七人 ＨＲＰ−抗体結合物は、抗−β−ｈＣＧモノクローナル
抗体のｇ−ＭＢＳ誘導体とＨＲＰの脱アセチル化５ＡＴ
Ａ誘導体を怒作し、次いで該２つの誘導体を反応させて
抗体１分子当りＨＲＰ３分子を含有する結合物を形成す
ることによりつくられる。抗−β−ｈＣＧモノクローナ
ル抗体の９−ＭＢ５誘導体は下記の如く製造される。

標準的ハイブリドーマ技術を使用して製造した抗β−ｈ
ＣＧモノクローナル抗体（分子量１５０，０００）１０
１ｇを０．１Ｍリン酸塩（ｐＨ７，１＞ｉＩ街液に対し
て４℃で一晩一定の攪拌を行ないながら透析後、抗体溶
液を濾過し、抗体濃度を５．Ｏｚｇ／ｚｌに調節した。

次いで２ｚｌの抗体溶液に攪拌しながらＤＭＳＯ中ｇ−
ＭＢＳの貯蔵溶液（ＩＯＪＩＩＦ／屑１＞３７．５ｚｌ
を滴下して加えた。５分後、さらに３７．５ｚｌのｇ−
ＭＢＳ溶液を加え（最終抗体／９−　Ｍ　Ｂ　Ｓモル比
−１：４０）、添加後、混合物全体を５分間攪拌した。

この混合物を次いで平衡化Ｇ−２５脱塩カラムに通し、
続いて透析して遊離の９−ＭＢＳを完全に除去した。ｇ
−ＭＢＳ誘導抗体をＨＲＰの５ＡＴＡ誘導体に加えた。

ＨＲＰの５ＡＴＡ誘導体は次のようにしてつくった。

Ｓ　Ａ　Ｔ　Ａ　（８，９３肩ｇ）を２００１１１のＤ
ＭＳＯに溶解し、この溶液の１１９ｚｆを攪拌しながら
０．０５Ｍリン酸塩ＥＤＴＡ緩街液（４，０ｘｇ／肩１
．ｐＨ７，５）中５０ｚｌ？ＨＲＰの溶液に攪拌しなが
ら加えた。得られた混合物と１０分間反応させて、１モ
ルのＨＲＰ当り１モルのスルフヒドリル基を得た。この
反応混合物を、次いで前以ってリン酸塩ＥＤＴＡ［ｉｊ
液で平衡化しておいたセファデックスＧ−２５脱塩カラ
ム上で脱塩し、茶色のピークを集めて、脱アセチル化し
た。

５ＡＴＡ−ＨＲＰ誘導体を脱アセチル化するために、２
．５ｚＭ　Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａを含有するヒドロキシルアミ
ンの５０＋ｍＭ水溶液１００ｘｌをＳ　Ａ　Ｔ　Ａ　−
１−Ｉ　ＲＰ誘導体に加え、混合物を室温で１時間攪拌
した。次いでこの混合物をセファデックスＧ−２５脱塩
カラム（前以ってリン酸塩ＥＤＴＡ緩Ｗｉ液で平衡化し
ておく）で脱塩し、茶色ピークを集めた。これは脱アセ
チル化５ＡＴＡ−ＨＲＰ誘導体を含有する。

脱アセチル化５ＡＴＡ−ＨＲＰ誘導体の１４ｍｇを１６
．５Ｂの９−ＭＢＳ＝抗体誘導体（抗体：酵素のモル比
１：３）といっしょにし、１時間攪拌しつつ室温でイン
キュベートしてＨＲＰ抗体結合物を得た。

この結合物を一晩安定化緩衝液（５０Ｉｌ１Ｍトリス、
ｐＨ７，２；１０ｓ＋Ｍ　Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ　／鉄（Ｉ［
Ｉ　）、１０％Ｄ−マンテトール；および２％庶糖）中
で透析した。透析した結合物を次に安定化ｗｔ街液中の
溶液または凍結乾燥の形で使用に備えて貯蔵した。

アルカリ　、＃万イＴＭ＋３汐 ｆ３０ｍｇのＴＭＢ（塩酸塩の形）；１２０ｚりのジオ
クチルスルホサクシネートおよび２０ｘ１の７０％イソ
プロピルアルコールを室温で攪拌しながらいっしょにし
た。コノ溶液４ｚｆを１０（１＋４ｃｒ）０．１０Ｍ　
トリス（ｐＨ８，１）緩衝液に室温で攪拌しながら滴下
し、溶液のｐＨが約８．０を維持するよう注意した。次
いでこの溶液を０．２ミクロンナルジーン（Ｎａｌｇｅ
ｎｅ）滅菌フィルターを通して一過し、必要時迄コハク
色のびんの中あるいは半透明プラスチックバイアル中で
室温で貯蔵した。

遣１仙１ 過酸化物は溶液の形、たとえばクエン酸緩衝液中の０．
３％Ｈ２Ｏ２または０．２５％過酸化尿素あるいは容易
に溶解する錠剤、たとえば過酸化尿素、ＮａＣ１、砂糖
および錠剤を保持する補助剤を含有する錠剤の形でよい
。

川−一一瀘一 上述のβ−ｈＣＧ試験装置を使用して女性患者の妊娠を
検出するのに使用できる。

患者からの尿または血清標本を抗体塗被試験管に入れ、
等容量の安定化緩衝液中抗体−ＨＲＰ結合物を加えた。

別法として、該結合物をすでに試験管の中に凍結乾燥の
形で存在させておき、上記標本によって溶解させる。

上記混合物を３〜５分間インキュベートさせ、上記試験
管を洗浄溶液および／または水で徹底的にすすぐ。Ｔ　
Ｍ　Ｂ　緩衝液／ｘ１を試験管に加え、次いで過酸化物
を加える。過酸化物が試験管の栓に固定された錠剤の形
である場合、施栓試験を振とうさせて過酸化物錠剤を溶
解させる。

標本がβ−ｈＣＧを含有すると、塗被された試験管表面
と液体の両方が青色に変わり、妊娠陽性を示す。陰性の
場合は塗被された試験管表面に被膜が生じないであろう
。

一−１ β−ｈＣＧ抗原を含有する血清または尿試料を抗体塗被
試験管中で抗体−ＨＲＰ結合物とともにインキュベート
すると、抗原は試験管表面に１組の部分部位で結合し、
結合物に別の結合部位で結合し、ＨＲＰ−標識抗体サン
ドイッチを形成する。

いかなる非結合試料成分も洗い去ることはない。

ＨＲＰ標識は過酸化物に作用してＴＭＢを酸化して溶液
中と試験管の壁の上との両方で青い呈色をする。試験管
の壁を呈色させることによって、この試験においては不
完全な洗浄にもとづく偽陽性の危険が最小となる。さら
に、この試験管は試験管の塗被表面に色が安定してはっ
きり残るので試験結果が永久に記録できる。ＴＭＢ溶液
を酸性ｐＨよりむしろ約ｐＨ８，０に維持することは少
なくとも部分的には上記溶液と試験管の壁との両方を着
色するために必要であると確信される。

ｌ＠且葬］− 他の具体例も上記特許請求の範囲の範囲内である・たと
えば、本発明の改良方法はいかなる免疫検定法、たとえ
ば他のホルモン、薬物、トキシンについて種々の比色定
量免疫検定要素（ミクロ滴板なと）中での免疫検定に適
用できる。他の構成要素も通常どおりに変化できる。た
とえば、安定化緩衝液中ＥＤＴＡの代りに他の四イオン
性キレート剤、たとえばエチレングリコールビス（β−
アミノ−エチルエーテル）Ｎ、Ｎ−テトラ酢酸が使用で
きる。

（外５名） 手　　続　　補　　正　　書 昭和６１年１０月ノ３日 １、事件の表示 昭和６１年特許Ｎ第１７８５９９号 ２、発明の名称 生物学的試料汐中の抗原及び抗体検出法及び検出用支持
体 ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 住所 ６、補正の内容 明細書を次のように訂正する。

頁　　　行　　　　　　　　誤　　　　　　　　正８　
　下５．下４　　３７．５ｚ１３７．５／ｊ　（１９６
１１９ｚ１１１９μ！ 以　　上

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. （１）緩衝液を加えてｐＨ７．０ないし９．５としたテ
   トラメチルベンジジンの液体組成物。
2. （２）水溶液である特許請求の範囲第１項の組成物。
3. （３）緩衝液を加えてｐＨ約８．０にした特許請求の範
   囲第１項または第２項の組成物。
4. （４）特定結合対の第一メンバーが、該第一メンバーと
   該結合対の第二メンバーとが反応して免疫複合体を形成
   することによって検出され、そのような免疫複合体の検
   出はテトラメチルベンジジンの液体組成物を反応容器に
   添加することによって行なわれる免疫検定法であって、
   該テトラメチルベンジジンの液体組成物がｐＨ７．０な
   いし９．５に緩衝化されていることを特徴とする検定法
   。
5. （５）あらかじめ決められた抗原に対する抗体からなる
   被覆物を接着してなる固体支持体であって、該被覆物が
   ポリクローナル抗体と少なくとも１つのモノクローナル
   抗体からなることを特徴とする支持体。
6. （６）上記被覆物が上記抗原に対する少なくとも３つの
   異なるモノクローナル抗体からなる特許請求の範囲第５
   項の支持体。
7. （７）上記被覆物がポリクローナル抗体対モノクローナ
   ル抗体の蛋白質対蛋白質比が５：１ないし８：１である
   特許請求の範囲第６項の支持体。
8. （８）上記比が約７：１である特許請求の範囲第７項の
   支持体。
9. （９）特定の結合対の第一メンバーは、該第一メンバー
   と該対の第二メンバーとの反応によって免疫複合体を形
   成することによって検出され、該第二メンバーは酵素と
   結合している免疫検定法であって、上記第二メンバーと
   上記酵素の結合物は、反応の前に、キレート化遷移金属
   を含有し実質的に硫酸塩イオンおよびリン酸塩イオンを
   含まない安定化緩衝液によって安定化されることを特徴
   とする方法。
10. （１０）第二メンバーがｇ−ＭＢＳ−ＳＡＴＡ結合によ
    って上記酵素に結合している特許請求の範囲第９項の検
    定法。