JPH059068B2 - - Google Patents
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- JPH059068B2 JPH059068B2 JP59137230A JP13723084A JPH059068B2 JP H059068 B2 JPH059068 B2 JP H059068B2 JP 59137230 A JP59137230 A JP 59137230A JP 13723084 A JP13723084 A JP 13723084A JP H059068 B2 JPH059068 B2 JP H059068B2
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- arg
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
- C07K5/08—Tripeptides
- C07K5/0821—Tripeptides with the first amino acid being heterocyclic, e.g. His, Pro, Trp
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- C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
- C07K5/08—Tripeptides
- C07K5/0802—Tripeptides with the first amino acid being neutral
- C07K5/0804—Tripeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
- C07K5/0806—Tripeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing 0 or 1 carbon atoms, i.e. Gly, Ala
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- C07K5/0804—Tripeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
- C07K5/0808—Tripeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing 2 to 4 carbon atoms, e.g. Val, Ile, Leu
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
- C12Q1/37—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving peptidase or proteinase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2334/00—O-linked chromogens for determinations of hydrolase enzymes, e.g. glycosidases, phosphatases, esterases
- C12Q2334/10—O-linked chromogens for determinations of hydrolase enzymes, e.g. glycosidases, phosphatases, esterases p-Nitrophenol derivatives
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- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
- G01N2333/914—Hydrolases (3)
- G01N2333/948—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- G01N2333/95—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99)
- G01N2333/964—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue
- G01N2333/96425—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals
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- G01N2333/96433—Serine endopeptidases (3.4.21)
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- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
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Description
本発明は尿中カリクレインに対する新規発色
性、かつ螢光性基質に関する。本発明の基質は従
来報告されている基質に比してきわめて選択性が
よく、かつ高感度で尿中カリクレインを測定する
ことができる。 カリクレインは血漿中のキニノーゲンに作用し
て生理活性ペプタイドであるキニンを遊離する酵
素である。そして遊離されたキニンを介して発現
されるカリクレインの生物学的作用は、例えば血
管拡張作用、血圧降下作用等である。 ヒト尿中カリクレインは当初膵臓由来と想定さ
れていたが、最近、膵臓由来と考えられるように
なり、腎臓機能における役割との関係が注目さ
れ、特に腎血流量の調節および血圧の調整に関与
しているといわれている。従つてカリクレインの
生合成低下や分秘低下は、重篤な疾患を惹起す
る。例えば、本態性高血圧症、腎性高血圧症の患
者の尿カリクレインは健常人のそれと比較して著
明に低下しており、また原発性アルドステロン症
やバーター症候群患者では高く、腎不全患者では
低いことが知られている。 このように高血圧症をはじめ、各種疾患におい
て尿中カリクレインを定量することは、症患の診
断にとつて極めて有用である。 ヒト尿中カリクレインの活性側定法は現在まで
に数多くの報告がなされているが、操作の繁雑
さ、尿中阻害物質の影響など問題点が多かつた。
近年、合成基質の開発に伴い、多少改善されつつ
あるが、例えば、TAME（Tos（トシル）−Arg−
OMe）、BAEE（Bz（ベンゾイル）−Arg−OEt）、
TLME（Tos−Lys−OMe）などの合成基質に対
するカリクレインの加水分解活性を測定する方法
は、操作が簡単であり、再現性も高いが、基質の
特異性や感度が低い等の問題があつた。更に尿中
カリクレイン測定用基質として、Ｈ−Ｄ−Val−
Leu−Arg−PNA（Ｓ−2266：Kabi）〔Claeson，
G.et al.，Haemo−stasis7，62（1978）〕が開発さ
れ、同様に、遊離すると螢光を発するアミノメチ
ルクマリン（AMC）を結合させた螢光ペプチド
Ｈ−Pro−Phe−Arg−MCA（メチルクマリンア
ミド）〔Morita，T.et al.，J.Biochem.82，1495
（1977）〕も開発された。 一方、酵素測定用合成基質は酵素に対する高感
度および特異性、水または生物学的試験液に対す
る良好な溶解性、および分解物の易検出性の４点
を満足する事が重要である。 このうちでも測定しようとする酵素に対する高
い特異性は特に重要である。 一般に尿中のカリクレインを発色性基質を利用
して測定しようとする場合、尿中に存在すると予
測されるカリクレイン以外の蛋白質分解酵素であ
るプラスミン、トロンビン、ウロキナーゼ等と交
差反応を起すと、正確な測定が期しがたい。 従来、開発されて来た最良の尿中カリクレイン
測定用基質としては、上記のＳ−2266があげられ
るが、基質特異性および反応性において必ずしも
満足できるものではない。 すなわちＳ−2266は異状尿にしばしば認められ
るα−トロンビンやプラスミンを測り込む危験性
があり、また、尿中に排泄されるウロキナーゼに
よる水解を補正しなければならない欠点を有して
いる。 さらに、Ｓ−2266のごとく生成するｐ−ニトロ
アニリンの黄色を比色する方法は尿の色調による
影響を逸がれることができない。 また、螢光法でも同じく尿中の螢光物質をさし
引くためブランクテストを行つて補正する必要が
ある。 本発明者等は、かかる点を改良すべく、新規な
尿中カリクレイン測定用基質の開発研究を行つた
結果、上記の欠点を著しく改良し、前述の４条件
を満足させる優れた性質を持つた基質を見出し
た。 すなわち、従来開発され、基質に用いられてい
る発色基ｐ−ニトロアニリド（略号PAN）の代
りに３−カルボキシ−４−ヒドロキシアニリド
（略号CHA）を用いることにより、目的とする尿
中カリクレイン以外の酵素、例えば、プラスミ
ン、トロンビン、ウロキナーゼの酵素に対する反
応性を抑制し、従来基質と比して、著しく、選択
性の改良された尿中カリクレイン測定用基質の開
発に成功した。 本発明による新規な発色性、または螢光性基質
は、次の一般式 （式中A1は Pro、PGlu、Val、Ala、Leu、PheまたはLys である） で表わされ、特に発色基として、３−カルボキシ
−４−ヒドロキシ−アニリドを有することを特徴
とする。本基質は、発色基にヒドロキシル基、カ
ルボキシル基という極めて親水性の基を持つため
に水に対する卓越した溶解特性を持つている。代
表的な用途としては、式〔〕で表わされる基質
を尿中カリクレイン測定用基質として用い、生成
する３−カルボキシ−４−ヒドロキシ−アニリン
をペンタシアノアミンフエロエート法や適当なカ
プラーと酸化縮合させた着色物質に導き、これを
比色定量する場合があげられる。また、励起
328nm、螢光540nmにて螢光分析法により定量す
ることにより尿カリクレイン活性を特異的に測定
することもできる。 本基質の特徴は前述したごとくその尿中カリク
レインに対する優れた基質特異性にある。基質特
異性については、本発明の新規基質PS−2103、
Ｈ−Ｄ−Ala−Phe−Arg−CHAを、参考の為に
合成した上記規基質と同じアミノ酸配列でPNA
を発色基としてPS−2103N、Ｈ−Ｄ−Ala−Phe
−Arg−PNAおよびＳ−2266と、蛋白質分解酵
素である尿中カリクレイン（HUK）、トロンビ
ン（TH）、プラスミン（PL）、ウロキナーゼ
（UK）等における相対反応性をPS−2103N、Ｈ
−Ｄ−Ala−Phe−Arg−PNAを100として示す
と第１表のごとくなり、プラスミン、トロンビ
ン、ウロキナーゼに対する反応性がCHA系の新
規基質の場合には著しく低く、例えば、プラスミ
ンは４％、トロンビン７％、UK0％しか反応せ
ず、また、Ｓ−2266のプラスミン54％、トロンビ
ン138％、UK217％と比較して、著しく選択性が
改良されていることと、ウロキナーゼとは新規基
質は反応しないことがわかる。 これ等の事実は本発明化合物が尿中カリクレイ
ン用基質として極めて優れていることを示してい
る。
性、かつ螢光性基質に関する。本発明の基質は従
来報告されている基質に比してきわめて選択性が
よく、かつ高感度で尿中カリクレインを測定する
ことができる。 カリクレインは血漿中のキニノーゲンに作用し
て生理活性ペプタイドであるキニンを遊離する酵
素である。そして遊離されたキニンを介して発現
されるカリクレインの生物学的作用は、例えば血
管拡張作用、血圧降下作用等である。 ヒト尿中カリクレインは当初膵臓由来と想定さ
れていたが、最近、膵臓由来と考えられるように
なり、腎臓機能における役割との関係が注目さ
れ、特に腎血流量の調節および血圧の調整に関与
しているといわれている。従つてカリクレインの
生合成低下や分秘低下は、重篤な疾患を惹起す
る。例えば、本態性高血圧症、腎性高血圧症の患
者の尿カリクレインは健常人のそれと比較して著
明に低下しており、また原発性アルドステロン症
やバーター症候群患者では高く、腎不全患者では
低いことが知られている。 このように高血圧症をはじめ、各種疾患におい
て尿中カリクレインを定量することは、症患の診
断にとつて極めて有用である。 ヒト尿中カリクレインの活性側定法は現在まで
に数多くの報告がなされているが、操作の繁雑
さ、尿中阻害物質の影響など問題点が多かつた。
近年、合成基質の開発に伴い、多少改善されつつ
あるが、例えば、TAME（Tos（トシル）−Arg−
OMe）、BAEE（Bz（ベンゾイル）−Arg−OEt）、
TLME（Tos−Lys−OMe）などの合成基質に対
するカリクレインの加水分解活性を測定する方法
は、操作が簡単であり、再現性も高いが、基質の
特異性や感度が低い等の問題があつた。更に尿中
カリクレイン測定用基質として、Ｈ−Ｄ−Val−
Leu−Arg−PNA（Ｓ−2266：Kabi）〔Claeson，
G.et al.，Haemo−stasis7，62（1978）〕が開発さ
れ、同様に、遊離すると螢光を発するアミノメチ
ルクマリン（AMC）を結合させた螢光ペプチド
Ｈ−Pro−Phe−Arg−MCA（メチルクマリンア
ミド）〔Morita，T.et al.，J.Biochem.82，1495
（1977）〕も開発された。 一方、酵素測定用合成基質は酵素に対する高感
度および特異性、水または生物学的試験液に対す
る良好な溶解性、および分解物の易検出性の４点
を満足する事が重要である。 このうちでも測定しようとする酵素に対する高
い特異性は特に重要である。 一般に尿中のカリクレインを発色性基質を利用
して測定しようとする場合、尿中に存在すると予
測されるカリクレイン以外の蛋白質分解酵素であ
るプラスミン、トロンビン、ウロキナーゼ等と交
差反応を起すと、正確な測定が期しがたい。 従来、開発されて来た最良の尿中カリクレイン
測定用基質としては、上記のＳ−2266があげられ
るが、基質特異性および反応性において必ずしも
満足できるものではない。 すなわちＳ−2266は異状尿にしばしば認められ
るα−トロンビンやプラスミンを測り込む危験性
があり、また、尿中に排泄されるウロキナーゼに
よる水解を補正しなければならない欠点を有して
いる。 さらに、Ｓ−2266のごとく生成するｐ−ニトロ
アニリンの黄色を比色する方法は尿の色調による
影響を逸がれることができない。 また、螢光法でも同じく尿中の螢光物質をさし
引くためブランクテストを行つて補正する必要が
ある。 本発明者等は、かかる点を改良すべく、新規な
尿中カリクレイン測定用基質の開発研究を行つた
結果、上記の欠点を著しく改良し、前述の４条件
を満足させる優れた性質を持つた基質を見出し
た。 すなわち、従来開発され、基質に用いられてい
る発色基ｐ−ニトロアニリド（略号PAN）の代
りに３−カルボキシ−４−ヒドロキシアニリド
（略号CHA）を用いることにより、目的とする尿
中カリクレイン以外の酵素、例えば、プラスミ
ン、トロンビン、ウロキナーゼの酵素に対する反
応性を抑制し、従来基質と比して、著しく、選択
性の改良された尿中カリクレイン測定用基質の開
発に成功した。 本発明による新規な発色性、または螢光性基質
は、次の一般式 （式中A1は Pro、PGlu、Val、Ala、Leu、PheまたはLys である） で表わされ、特に発色基として、３−カルボキシ
−４−ヒドロキシ−アニリドを有することを特徴
とする。本基質は、発色基にヒドロキシル基、カ
ルボキシル基という極めて親水性の基を持つため
に水に対する卓越した溶解特性を持つている。代
表的な用途としては、式〔〕で表わされる基質
を尿中カリクレイン測定用基質として用い、生成
する３−カルボキシ−４−ヒドロキシ−アニリン
をペンタシアノアミンフエロエート法や適当なカ
プラーと酸化縮合させた着色物質に導き、これを
比色定量する場合があげられる。また、励起
328nm、螢光540nmにて螢光分析法により定量す
ることにより尿カリクレイン活性を特異的に測定
することもできる。 本基質の特徴は前述したごとくその尿中カリク
レインに対する優れた基質特異性にある。基質特
異性については、本発明の新規基質PS−2103、
Ｈ−Ｄ−Ala−Phe−Arg−CHAを、参考の為に
合成した上記規基質と同じアミノ酸配列でPNA
を発色基としてPS−2103N、Ｈ−Ｄ−Ala−Phe
−Arg−PNAおよびＳ−2266と、蛋白質分解酵
素である尿中カリクレイン（HUK）、トロンビ
ン（TH）、プラスミン（PL）、ウロキナーゼ
（UK）等における相対反応性をPS−2103N、Ｈ
−Ｄ−Ala−Phe−Arg−PNAを100として示す
と第１表のごとくなり、プラスミン、トロンビ
ン、ウロキナーゼに対する反応性がCHA系の新
規基質の場合には著しく低く、例えば、プラスミ
ンは４％、トロンビン７％、UK0％しか反応せ
ず、また、Ｓ−2266のプラスミン54％、トロンビ
ン138％、UK217％と比較して、著しく選択性が
改良されていることと、ウロキナーゼとは新規基
質は反応しないことがわかる。 これ等の事実は本発明化合物が尿中カリクレイ
ン用基質として極めて優れていることを示してい
る。
【表】
初期基質濃度So＝0.4m mole。かつこ内は測
定OD値 測定波長はＳ−2266とPS−2103Nは405nm、
PS−2103は700nmである。 本発明の化合物の用途は、既に述べた通り尿中
カリクレイン活性測定用の基質であるが、その場
合、当該基質をPH8.5〜9.0間の緩衝液中の尿中カ
リクレインに作用させ、生成する３−カルボキシ
−４−ヒドロキシアニリンを適当な着色物に導
き、これを比色定量することにより尿中カリクレ
イン活性を測定するが、このほかに励起328nm、
螢光540nmにて螢光分析法により定量することも
できる。 着色物に導く方法としては、ペンタアミンフエ
ロエート法やカプラーと酸化縮合させる法があ
る。カプラーとしては、酸性側での発色の場合は
アニリン系化合物、例えばＮ，Ｎ−ジエチルアニ
リン、またアルカリ側では、フエノール、ナフト
ール、チモール、ｏ−クレゾール、ｏ−エチルフ
エノール等が用いられる。また、酸化縮合の酸化
剤として、過酸化水素、過硫酸塩等、種々のもの
が用いられるが、メタ過ヨウ素酸が好適である。 ３−カルボキシ−４−ヒドロキシアニリンを適
当な着色物に導くことにより、極大吸収波長が
560〜770nm中に分布するが、呈色の温度による
変動は極めて少く安定で、尿中カリクレイン活性
測定に適している。さらに発色感度を比べてみて
も、ｐ−ニトロアニリンの場合、一般測定波長
405nmにてε＝10.600であるのに対し、ペンタア
ミンフエロエート法ではλ＝700nmでε＝21500、
酸化縮合による発色においてはｏ−エチルフエノ
ールの場合λ＝645nmでε＝29000、２，６−キ
シレノールの場合λ＝615nmでε＝21600で極め
て吸光度が大きく、この点においても測定上極め
て有利である。 また、本発明の特徴の一つとして、尿中の夾雑
物による測定上の影響をほとんど受けないことに
あるが、これは、ｐ−ニトロアニリド系化合物に
於ては、560nm以下の波長で測定するのに対し
て、本発明では、560nm以上の波長で測定するた
め、尿中の夾雑物の影響を受けず、基質本来の高
特異性と併せて、正確な測定結果が得られる。 以上の通り、本発明の化合物は、尿中カリクレ
イン活性測定用基質として従来のものに比べて、
非常に優れていることが明らかである。 式〔〕で表わされる本発明の化合物はペプチ
ド化学においてよく知られる方法により合成する
ことができる。 α−アミノ保護基としては、カルボベンゾキシ
またはｔ−ブチルオキシカルボニルまたはそれに
関連する基、例えばｐ−メトキシ、ｐ−ニトロ、
又はｐ−メトキシフエニルアゾールカルボンゾキ
シ等を用いるのが有利である。 アルギニンのδ−グアニジル基の保護には、ニ
トロ基やプロトン化を用いるのが有利である。２
個のアミノ酸のカツプリングまたはジペプチドと
アミノ酸のカツプリングは、α−カルボキシル基
の活性化により行われる。例えば、Ｎ−ヒドロキ
シサクシニツクイミド、ｐ−ニトロフエノール、
トリクロロフエノール、４，６−ジメチルピリミ
ジル−２−チオール等を用いることができる。前
述のエステル誘導体への活性化はカルボジイミ
ド、例えば、Ｎ，Ｎ−ジシクロヘキシルカルボジ
イミド（DCC）の存在下で行うのが有利である。 基質合成は、最初発色基をアルギニル基に結合
させ、遂次的にカツプリングしていく方法による
ことができるが、Ｎ−末端ジペプチドフラグメン
ト自体を合成し、それを次いで発色基を有するア
ルギニル基に結合することも可能である。 本発明を以下実施例により詳細に説明するが、
本発明はこれら実施例に限定されるものではな
い。 略号 Arg＝アルギニン Phe＝フエニールアラニン Pro＝プロリン PGlu＝ピログルタミル酸 Val＝バリン Ala＝アラニン Leu＝ロイシン Lys＝リジン Ｚ＝ベンジルオキシカルボニル BOC＝ｔ−ブチルオキシカルボニル DMF＝ジメチルホルムアミド MeOH＝メタノール NEM＝Ｎ−エチルモルホリン −PNA＝ｐ−ニトロアニリド −CHA＝３−カルボキシ−４−ヒドロキシア
ニリド TLC＝薄層クロマトグラフイー AcOH＝酢酸 BuOH＝ブタノール AcOEt＝酢酸エチル （注 アミノ酸は特にことわらなければＬ−体を
示す） 薄層クロマトグラフイー TLC分析はシリカゲルF254（メルク製）プレー
トを使用。 溶媒は Rf1 CHCl3：MeOH：AcOH：H2O＝80：
40：2.5：５ Rf2 ｎ−BuOH：AcOH：H2O＝４：１：
１ Rf3 ｎ−BuOH：AcOH：H2O＝４：１：
５ ゲル濾過には、東洋曹達工業株式会社のポリ
ビニールゲル、トヨパールHW40F（商品名）を
使用した。 実施例 １ Ｈ−Ｄ−Pro−Phe−Arg−CHAの合成 BOC−Arg（NO2）−CHA BOC−Arg（NO2）−OH50.3ｇ（0.158mole）
をDMF160mlに溶解し、NEM20.5ml
（0.158mole）を加え、これに−20℃にてイソ
ブチルクロロフオルメート21.2ml（0.158mole）
を滴下し、10分間反応させる。反応後、５−ア
ミノサルチル酸・塩酸塩30.0ｇ（0.158mole）
とNEM61.6ml（0.474mole）のDMF250ml溶液
を上記反応液に−15〜−10℃にて滴下する。滴
下後、同温度にて３時間反応させ、さらに室温
（15〜20℃）にて18時間反応させる。反応後、
DMFを減圧留去し、残渣をAcOEt950mlに溶
解し、冷５％塩酸300mlで４回、飽和食塩水300
mlで２回洗浄後、無水硫酸マグネシウムおよび
活性炭にて脱色乾燥する。乾燥後、硫酸マグネ
シウムおよび活性炭を濾別して冷却静置し、析
出結晶を濾取するとBOC−Arg（NO2）−
CHA46.2ｇ（64.3％）を得る。 Rf1＝0.11 m.p. 208℃（分解） 〔α〕20 D −8.4（ｃ＝１，MeOH） 元素分析 C18H26N6O8.1/4H2O Ｃ Ｈ Ｎ 測定値 47.16 5.75 18.30 計算値 47.11 5.82 18.31 BOC−Phe−Arg（NO2）−CHA BOC−Arg（NO2）−CHA45.4ｇ（0.1mole）
を2N HCl／AcOH300ml（0.6mole）と少量の
MeOHに溶解して、室温にて２時間反応を行
う。反応終了後、乾燥エーテル300mlを加える
と結晶化する。34.9ｇ（89.4％）のHCl・Ｈ−
Arg（NO2）−CHAを得る。 Rf3＝0.31 m.p. 193〜206℃ 〔α〕20 D ＋37.4（ｃ＝１，MeOH） 31.3ｇ（0.08mole）のHCl・Ｈ−Arg（NO2）
−CHAを1.5N-NEM／DMF160mlに溶解し、
０〜５℃にてBOC−Phe−SDP（ジメチルメル
カプトピリミジン）31.0ｇ（0.08mole）を加
え、18時間室温にて反応させる。反応後、
AcOEt1600mlにて希釈し、冷５％塩酸400mlで
２回、飽和食塩水400mlで２回洗浄すると結晶
が析出する。析出結晶を濾取、乾燥すると粗製
のBOC−Phe−Arg（NO2）−CHAが得られ、
これをAcOEt／ｎ−ヘキサンより再結晶して
35.1ｇ（72.9％）のBOC−Phe−Arg（NO2）−
CHAを得る。 Rf1＝0.19 m.p. 212.5℃（分解） 〔α〕20 D −5.2（ｃ＝１，DMF） 元素分折 C27H35N7O9H2O Ｃ Ｈ Ｎ 測定値 52.43 5.79 15.64 計算値 52.34 6.02 15.82 BOC−Ｄ−Pro−Phe−Arg（NO2）−CHA BOC−Phe−Arg（NO2）−CHA34.3ｇ
（0.057mole）を2N HCl／AcOH171ml
（0.342mole）と少量のMeOHに溶解して、室
温にて２時間反応を行う。反応終了後、乾燥エ
ーテル２に再沈する。析出結晶を濾取、乾燥
すると30.9ｇ（100％）のHCl・Ｈ−Phe−Arg
（NO2）−CHAを得る。 Rf1＝0.54 m.p. 241℃（分解） 〔α〕20 D −18.0（ｃ＝1.0，DMF） 1.34ｇ（2.5m mole）のHCl・Ｈ−Phe−
Arg（NO2）−CHAを0.75N NEM／DMF10ml
に溶解し、０〜５℃にてBOC−Ｄ−Pro−
SDP0.84ｇ（2.5m mole）を加え、室温にて18
時間反応させる。反応後、AcOEt150mlにて希
釈し、冷５％塩酸50mlにて４回、飽和食塩水50
mlにて２回洗浄して、無水硫酸マグネシウムお
よび活性炭にて脱色、乾燥する。乾燥後、硫酸
マグネシウムと活性炭を濾別し、溶媒を減圧留
去すると粗製のBOC−Ｄ−Pro−Phe−Arg
（NO2）−CHAが得られ、これをAcOEtより再
結晶して1.2ｇ（85.9％）のBOC−Ｄ−Pro−
Phe−Arg（NO2）−CHAを得る。 Rf1＝0.26 m.p. 231.5℃（分解） 〔α〕20 D −2.8（ｃ＝0.5，MeOH） 元素分析 C32H42N8O10 Ｃ Ｈ Ｎ 測定値 54.76 6.06 15.78 計算値 55.01 6.06 16.04 Ｈ−Ｄ−Pro−Phe−Arg−CHA・2HCl BOC−Ｄ−Pro−Phe−Arg（NO2）−
CHA0.90（1.28m mole）を2N HCl／
AcOH3.8mlと少量のMeOHに溶解し、２時間
室温にて反応させる。反応終了後、溶媒を減圧
留去し、残渣をMeOH113mlとH2O37mlおよび
1N HCl2.2mlにけん濁する。パラジウム黒１
ｇを加え、30℃にて６時間水素還元する。還元
終了後、触媒を濾別して、溶媒を減圧留去す
る。残渣を展開溶媒がMeOHのトーヨーパー
ルHW40Fカラムにて精製すると0.66ｇ（95.3
％）のＨ−Ｄ−Pro−Phe−Arg−CHA・2HCl
を得る。 Rf3＝0.30 m.p. 230.0℃ 〔α〕20 D −5.0（ｃ＝0.5，MeOH） 元素分析 C26H34N8O5・3HCl・H2O Ｃ Ｈ Ｎ 測定値 47.01 5.62 16.88 計算値 46.89 5.90 16.82 実施例 ２ Ｈ−Ｄ−Ala−Phe−Arg−CHAの合成 Ｚ−Ｄ−Ala−Phe−Arg（NO2）−CHA HCl・Ｈ−Phe−Arg（NO2）−CHA2.69ｇ
（5m mole）を1.5NNEM／DMF10mlに溶解し、
０〜５℃にてＺ−Ｄ−Ala−SDP1.73ｇ（5m
mole）を加え、室温にて18時間反応させる。
反応後、AcOEt150mlにて希釈し、冷５％塩酸
50mlで３回、飽和食塩水50mlで２回洗浄後、無
水硫酸マグネシウムおよび活性炭にて脱色乾燥
する。乾燥後、硫酸マグネシウムと活性炭を濾
別して、溶媒を減圧留去すると粗製のＺ−Ｄ−
Ala−Phe−Arg（NO2）−CHAを得る。これを
MeOH／AcOEt／ｎ−ヘキサンより再結晶す
ると2.8ｇ（80.0％）のＺ−Ｄ−Ala−Phe−
Arg（NO2）−CHAを得る。 Rf1＝0.19 m.p. 180〜189℃ 〔α〕20 D −5.0（ｃ＝１，DMF） 元素分析 C33H38N8O101/2H2O Ｃ Ｈ Ｎ 測定値 55.08 5.69 15.36 計算値 55.38 5.49 15.66 Ｈ−Ｄ−Ala−Phe−Arg−CHA・2HCl Ｚ−Ｄ−Ala−Phe−Arg（NO2）−CHA2.3ｇ
（3.25m mole）をMeOH113mlとH2O35mlおよ
び1N HCl2.1mlの混合溶媒にけん濁する。パ
ラジウム黒１ｇを加えて、30℃にて４時間水素
還元をする。還元終了後、触媒を濾別して溶媒
を減圧留去する。残渣を展開溶媒がMeOHの
トーヨーパールHW40Fカラムにて精製すると
Ｈ−Ｄ−Ala−Phe−Arg−CHA・2HCl1.5ｇ
（78.2％）を得る。 Rf3＝0.37 m.p. 185〜210℃ 〔α〕20 D −12.0（ｃ＝0.5，MeOH） 元素分析 C25H35N7O6Cl2・3H2O Ｃ Ｈ Ｎ 測定値 45.41 5.88 15.33 計算値 45.88 6.31 14.98 実施例 ３ 同様な方法にて下記の合成を行つた。
定OD値 測定波長はＳ−2266とPS−2103Nは405nm、
PS−2103は700nmである。 本発明の化合物の用途は、既に述べた通り尿中
カリクレイン活性測定用の基質であるが、その場
合、当該基質をPH8.5〜9.0間の緩衝液中の尿中カ
リクレインに作用させ、生成する３−カルボキシ
−４−ヒドロキシアニリンを適当な着色物に導
き、これを比色定量することにより尿中カリクレ
イン活性を測定するが、このほかに励起328nm、
螢光540nmにて螢光分析法により定量することも
できる。 着色物に導く方法としては、ペンタアミンフエ
ロエート法やカプラーと酸化縮合させる法があ
る。カプラーとしては、酸性側での発色の場合は
アニリン系化合物、例えばＮ，Ｎ−ジエチルアニ
リン、またアルカリ側では、フエノール、ナフト
ール、チモール、ｏ−クレゾール、ｏ−エチルフ
エノール等が用いられる。また、酸化縮合の酸化
剤として、過酸化水素、過硫酸塩等、種々のもの
が用いられるが、メタ過ヨウ素酸が好適である。 ３−カルボキシ−４−ヒドロキシアニリンを適
当な着色物に導くことにより、極大吸収波長が
560〜770nm中に分布するが、呈色の温度による
変動は極めて少く安定で、尿中カリクレイン活性
測定に適している。さらに発色感度を比べてみて
も、ｐ−ニトロアニリンの場合、一般測定波長
405nmにてε＝10.600であるのに対し、ペンタア
ミンフエロエート法ではλ＝700nmでε＝21500、
酸化縮合による発色においてはｏ−エチルフエノ
ールの場合λ＝645nmでε＝29000、２，６−キ
シレノールの場合λ＝615nmでε＝21600で極め
て吸光度が大きく、この点においても測定上極め
て有利である。 また、本発明の特徴の一つとして、尿中の夾雑
物による測定上の影響をほとんど受けないことに
あるが、これは、ｐ−ニトロアニリド系化合物に
於ては、560nm以下の波長で測定するのに対し
て、本発明では、560nm以上の波長で測定するた
め、尿中の夾雑物の影響を受けず、基質本来の高
特異性と併せて、正確な測定結果が得られる。 以上の通り、本発明の化合物は、尿中カリクレ
イン活性測定用基質として従来のものに比べて、
非常に優れていることが明らかである。 式〔〕で表わされる本発明の化合物はペプチ
ド化学においてよく知られる方法により合成する
ことができる。 α−アミノ保護基としては、カルボベンゾキシ
またはｔ−ブチルオキシカルボニルまたはそれに
関連する基、例えばｐ−メトキシ、ｐ−ニトロ、
又はｐ−メトキシフエニルアゾールカルボンゾキ
シ等を用いるのが有利である。 アルギニンのδ−グアニジル基の保護には、ニ
トロ基やプロトン化を用いるのが有利である。２
個のアミノ酸のカツプリングまたはジペプチドと
アミノ酸のカツプリングは、α−カルボキシル基
の活性化により行われる。例えば、Ｎ−ヒドロキ
シサクシニツクイミド、ｐ−ニトロフエノール、
トリクロロフエノール、４，６−ジメチルピリミ
ジル−２−チオール等を用いることができる。前
述のエステル誘導体への活性化はカルボジイミ
ド、例えば、Ｎ，Ｎ−ジシクロヘキシルカルボジ
イミド（DCC）の存在下で行うのが有利である。 基質合成は、最初発色基をアルギニル基に結合
させ、遂次的にカツプリングしていく方法による
ことができるが、Ｎ−末端ジペプチドフラグメン
ト自体を合成し、それを次いで発色基を有するア
ルギニル基に結合することも可能である。 本発明を以下実施例により詳細に説明するが、
本発明はこれら実施例に限定されるものではな
い。 略号 Arg＝アルギニン Phe＝フエニールアラニン Pro＝プロリン PGlu＝ピログルタミル酸 Val＝バリン Ala＝アラニン Leu＝ロイシン Lys＝リジン Ｚ＝ベンジルオキシカルボニル BOC＝ｔ−ブチルオキシカルボニル DMF＝ジメチルホルムアミド MeOH＝メタノール NEM＝Ｎ−エチルモルホリン −PNA＝ｐ−ニトロアニリド −CHA＝３−カルボキシ−４−ヒドロキシア
ニリド TLC＝薄層クロマトグラフイー AcOH＝酢酸 BuOH＝ブタノール AcOEt＝酢酸エチル （注 アミノ酸は特にことわらなければＬ−体を
示す） 薄層クロマトグラフイー TLC分析はシリカゲルF254（メルク製）プレー
トを使用。 溶媒は Rf1 CHCl3：MeOH：AcOH：H2O＝80：
40：2.5：５ Rf2 ｎ−BuOH：AcOH：H2O＝４：１：
１ Rf3 ｎ−BuOH：AcOH：H2O＝４：１：
５ ゲル濾過には、東洋曹達工業株式会社のポリ
ビニールゲル、トヨパールHW40F（商品名）を
使用した。 実施例 １ Ｈ−Ｄ−Pro−Phe−Arg−CHAの合成 BOC−Arg（NO2）−CHA BOC−Arg（NO2）−OH50.3ｇ（0.158mole）
をDMF160mlに溶解し、NEM20.5ml
（0.158mole）を加え、これに−20℃にてイソ
ブチルクロロフオルメート21.2ml（0.158mole）
を滴下し、10分間反応させる。反応後、５−ア
ミノサルチル酸・塩酸塩30.0ｇ（0.158mole）
とNEM61.6ml（0.474mole）のDMF250ml溶液
を上記反応液に−15〜−10℃にて滴下する。滴
下後、同温度にて３時間反応させ、さらに室温
（15〜20℃）にて18時間反応させる。反応後、
DMFを減圧留去し、残渣をAcOEt950mlに溶
解し、冷５％塩酸300mlで４回、飽和食塩水300
mlで２回洗浄後、無水硫酸マグネシウムおよび
活性炭にて脱色乾燥する。乾燥後、硫酸マグネ
シウムおよび活性炭を濾別して冷却静置し、析
出結晶を濾取するとBOC−Arg（NO2）−
CHA46.2ｇ（64.3％）を得る。 Rf1＝0.11 m.p. 208℃（分解） 〔α〕20 D −8.4（ｃ＝１，MeOH） 元素分析 C18H26N6O8.1/4H2O Ｃ Ｈ Ｎ 測定値 47.16 5.75 18.30 計算値 47.11 5.82 18.31 BOC−Phe−Arg（NO2）−CHA BOC−Arg（NO2）−CHA45.4ｇ（0.1mole）
を2N HCl／AcOH300ml（0.6mole）と少量の
MeOHに溶解して、室温にて２時間反応を行
う。反応終了後、乾燥エーテル300mlを加える
と結晶化する。34.9ｇ（89.4％）のHCl・Ｈ−
Arg（NO2）−CHAを得る。 Rf3＝0.31 m.p. 193〜206℃ 〔α〕20 D ＋37.4（ｃ＝１，MeOH） 31.3ｇ（0.08mole）のHCl・Ｈ−Arg（NO2）
−CHAを1.5N-NEM／DMF160mlに溶解し、
０〜５℃にてBOC−Phe−SDP（ジメチルメル
カプトピリミジン）31.0ｇ（0.08mole）を加
え、18時間室温にて反応させる。反応後、
AcOEt1600mlにて希釈し、冷５％塩酸400mlで
２回、飽和食塩水400mlで２回洗浄すると結晶
が析出する。析出結晶を濾取、乾燥すると粗製
のBOC−Phe−Arg（NO2）−CHAが得られ、
これをAcOEt／ｎ−ヘキサンより再結晶して
35.1ｇ（72.9％）のBOC−Phe−Arg（NO2）−
CHAを得る。 Rf1＝0.19 m.p. 212.5℃（分解） 〔α〕20 D −5.2（ｃ＝１，DMF） 元素分折 C27H35N7O9H2O Ｃ Ｈ Ｎ 測定値 52.43 5.79 15.64 計算値 52.34 6.02 15.82 BOC−Ｄ−Pro−Phe−Arg（NO2）−CHA BOC−Phe−Arg（NO2）−CHA34.3ｇ
（0.057mole）を2N HCl／AcOH171ml
（0.342mole）と少量のMeOHに溶解して、室
温にて２時間反応を行う。反応終了後、乾燥エ
ーテル２に再沈する。析出結晶を濾取、乾燥
すると30.9ｇ（100％）のHCl・Ｈ−Phe−Arg
（NO2）−CHAを得る。 Rf1＝0.54 m.p. 241℃（分解） 〔α〕20 D −18.0（ｃ＝1.0，DMF） 1.34ｇ（2.5m mole）のHCl・Ｈ−Phe−
Arg（NO2）−CHAを0.75N NEM／DMF10ml
に溶解し、０〜５℃にてBOC−Ｄ−Pro−
SDP0.84ｇ（2.5m mole）を加え、室温にて18
時間反応させる。反応後、AcOEt150mlにて希
釈し、冷５％塩酸50mlにて４回、飽和食塩水50
mlにて２回洗浄して、無水硫酸マグネシウムお
よび活性炭にて脱色、乾燥する。乾燥後、硫酸
マグネシウムと活性炭を濾別し、溶媒を減圧留
去すると粗製のBOC−Ｄ−Pro−Phe−Arg
（NO2）−CHAが得られ、これをAcOEtより再
結晶して1.2ｇ（85.9％）のBOC−Ｄ−Pro−
Phe−Arg（NO2）−CHAを得る。 Rf1＝0.26 m.p. 231.5℃（分解） 〔α〕20 D −2.8（ｃ＝0.5，MeOH） 元素分析 C32H42N8O10 Ｃ Ｈ Ｎ 測定値 54.76 6.06 15.78 計算値 55.01 6.06 16.04 Ｈ−Ｄ−Pro−Phe−Arg−CHA・2HCl BOC−Ｄ−Pro−Phe−Arg（NO2）−
CHA0.90（1.28m mole）を2N HCl／
AcOH3.8mlと少量のMeOHに溶解し、２時間
室温にて反応させる。反応終了後、溶媒を減圧
留去し、残渣をMeOH113mlとH2O37mlおよび
1N HCl2.2mlにけん濁する。パラジウム黒１
ｇを加え、30℃にて６時間水素還元する。還元
終了後、触媒を濾別して、溶媒を減圧留去す
る。残渣を展開溶媒がMeOHのトーヨーパー
ルHW40Fカラムにて精製すると0.66ｇ（95.3
％）のＨ−Ｄ−Pro−Phe−Arg−CHA・2HCl
を得る。 Rf3＝0.30 m.p. 230.0℃ 〔α〕20 D −5.0（ｃ＝0.5，MeOH） 元素分析 C26H34N8O5・3HCl・H2O Ｃ Ｈ Ｎ 測定値 47.01 5.62 16.88 計算値 46.89 5.90 16.82 実施例 ２ Ｈ−Ｄ−Ala−Phe−Arg−CHAの合成 Ｚ−Ｄ−Ala−Phe−Arg（NO2）−CHA HCl・Ｈ−Phe−Arg（NO2）−CHA2.69ｇ
（5m mole）を1.5NNEM／DMF10mlに溶解し、
０〜５℃にてＺ−Ｄ−Ala−SDP1.73ｇ（5m
mole）を加え、室温にて18時間反応させる。
反応後、AcOEt150mlにて希釈し、冷５％塩酸
50mlで３回、飽和食塩水50mlで２回洗浄後、無
水硫酸マグネシウムおよび活性炭にて脱色乾燥
する。乾燥後、硫酸マグネシウムと活性炭を濾
別して、溶媒を減圧留去すると粗製のＺ−Ｄ−
Ala−Phe−Arg（NO2）−CHAを得る。これを
MeOH／AcOEt／ｎ−ヘキサンより再結晶す
ると2.8ｇ（80.0％）のＺ−Ｄ−Ala−Phe−
Arg（NO2）−CHAを得る。 Rf1＝0.19 m.p. 180〜189℃ 〔α〕20 D −5.0（ｃ＝１，DMF） 元素分析 C33H38N8O101/2H2O Ｃ Ｈ Ｎ 測定値 55.08 5.69 15.36 計算値 55.38 5.49 15.66 Ｈ−Ｄ−Ala−Phe−Arg−CHA・2HCl Ｚ−Ｄ−Ala−Phe−Arg（NO2）−CHA2.3ｇ
（3.25m mole）をMeOH113mlとH2O35mlおよ
び1N HCl2.1mlの混合溶媒にけん濁する。パ
ラジウム黒１ｇを加えて、30℃にて４時間水素
還元をする。還元終了後、触媒を濾別して溶媒
を減圧留去する。残渣を展開溶媒がMeOHの
トーヨーパールHW40Fカラムにて精製すると
Ｈ−Ｄ−Ala−Phe−Arg−CHA・2HCl1.5ｇ
（78.2％）を得る。 Rf3＝0.37 m.p. 185〜210℃ 〔α〕20 D −12.0（ｃ＝0.5，MeOH） 元素分析 C25H35N7O6Cl2・3H2O Ｃ Ｈ Ｎ 測定値 45.41 5.88 15.33 計算値 45.88 6.31 14.98 実施例 ３ 同様な方法にて下記の合成を行つた。
【表】
【表】
【表】
実施例 ４
新規に合成した基質の特異性を各酵素と反応さ
せることにより試験した。 １） 基質液：2m mole／．H2O ２） 緩衝液：トリス−塩酸緩衝液50m mole／
NaCl150m mole／ を使用し、反応PHは酵素により次の通りとした。 酵 素 PH（25℃） ヒト尿カリクレイン（HUK） 9.0 トロンビン （TH） 8.5 プラスミン （PL） 7.8 ウロキナーゼ （UK） 8.2 ３） 使用酵素
せることにより試験した。 １） 基質液：2m mole／．H2O ２） 緩衝液：トリス−塩酸緩衝液50m mole／
NaCl150m mole／ を使用し、反応PHは酵素により次の通りとした。 酵 素 PH（25℃） ヒト尿カリクレイン（HUK） 9.0 トロンビン （TH） 8.5 プラスミン （PL） 7.8 ウロキナーゼ （UK） 8.2 ３） 使用酵素
【表】
測定法：
緩衝液0.3mlと酵素試薬0.1mlをシリコン処理硬
質ガラス製試験管または、プラスチツク製試験管
に採取し、37℃恒温槽中にて５分間予加温する。
次いで基質液0.1mlを加えて酵素反応を37℃、５
分間実施する。正確に５分後、反応停止液また
は、停止発色試薬2.0mlを加えて酵素反応を停止
後、37℃で10分間放置後405nmまたは700nmの吸
光度を測定する。
質ガラス製試験管または、プラスチツク製試験管
に採取し、37℃恒温槽中にて５分間予加温する。
次いで基質液0.1mlを加えて酵素反応を37℃、５
分間実施する。正確に５分後、反応停止液また
は、停止発色試薬2.0mlを加えて酵素反応を停止
後、37℃で10分間放置後405nmまたは700nmの吸
光度を測定する。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 式 （式中A1は Pro、PGlu、Val、Ala、Leu、PheまたはLys である） の化合物、またはその塩で表わされる尿中カリク
レインに対して、発色性、又は螢光性を有する新
規な尿中カリクレイン測定用基質。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59137230A JPS6117956A (ja) | 1984-07-04 | 1984-07-04 | 新規な尿中カリクレイン測定用基質 |
| US06/749,890 US4650753A (en) | 1984-07-04 | 1985-06-27 | Novel substrates for use in measuring the concentration of kallikrein in urine |
| EP85108241A EP0167980B1 (en) | 1984-07-04 | 1985-07-03 | Novel substrates for use in measuring the concentration of kallikrein in urine |
| DE8585108241T DE3583709D1 (de) | 1984-07-04 | 1985-07-03 | Substrate zur verwendung fuer die bestimmung der konzentration von harnkallikrein. |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59137230A JPS6117956A (ja) | 1984-07-04 | 1984-07-04 | 新規な尿中カリクレイン測定用基質 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6117956A JPS6117956A (ja) | 1986-01-25 |
| JPH059068B2 true JPH059068B2 (ja) | 1993-02-03 |
Family
ID=15193819
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59137230A Granted JPS6117956A (ja) | 1984-07-04 | 1984-07-04 | 新規な尿中カリクレイン測定用基質 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4650753A (ja) |
| EP (1) | EP0167980B1 (ja) |
| JP (1) | JPS6117956A (ja) |
| DE (1) | DE3583709D1 (ja) |
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|---|---|---|---|---|
| JPS62126196A (ja) * | 1985-11-26 | 1987-06-08 | Nitto Boseki Co Ltd | 新規なα１−アンチトリプシン測定用化合物 |
| JPS62126197A (ja) * | 1985-11-26 | 1987-06-08 | Nitto Boseki Co Ltd | 新規な血漿キニノゲナーゼ測定用化合物 |
| US4745181A (en) * | 1986-10-06 | 1988-05-17 | Ciba Corning Diagnostics Corp. | Polysubstituted aryl acridinium esters |
| JPS6420388A (en) * | 1987-07-14 | 1989-01-24 | Nakatsuka Kogyo | Method for expressing grain pattern on fabric |
| US5115099A (en) * | 1988-06-14 | 1992-05-19 | Nitto Boseki Co., Ltd. | Substrates for determination of enzyme activity and intermediates for synthesis of the substrates as well as process for producing the intermediates |
| JPH06104079B2 (ja) * | 1988-07-14 | 1994-12-21 | 日東紡績株式会社 | 新規な酵素活性測定用基質 |
| JP2559928Y2 (ja) * | 1991-10-25 | 1998-01-19 | オークマ株式会社 | 回転軸の防水構造 |
| JP5481662B2 (ja) * | 2006-06-28 | 2014-04-23 | 国立大学法人 熊本大学 | 腎臓・泌尿器疾患の診断方法 |
| DE102019217316A1 (de) | 2019-11-08 | 2021-05-12 | Volkswagen Aktiengesellschaft | Abgasturbolader für Hochleistungsmotorkonzepte |
Family Cites Families (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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