JPH06104079B2 - 新規な酵素活性測定用基質 - Google Patents
新規な酵素活性測定用基質Info
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- JPH06104079B2 JPH06104079B2 JP63173789A JP17378988A JPH06104079B2 JP H06104079 B2 JPH06104079 B2 JP H06104079B2 JP 63173789 A JP63173789 A JP 63173789A JP 17378988 A JP17378988 A JP 17378988A JP H06104079 B2 JPH06104079 B2 JP H06104079B2
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- Japan
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- cha
- hcl
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
- C07K5/08—Tripeptides
- C07K5/0821—Tripeptides with the first amino acid being heterocyclic, e.g. His, Pro, Trp
- C07K5/0825—Tripeptides with the first amino acid being heterocyclic, e.g. His, Pro, Trp and Glp-amino acid; Derivatives thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
- C07K5/08—Tripeptides
- C07K5/0819—Tripeptides with the first amino acid being acidic
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- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
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Description
【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、トリプシンなどの酵素活性測定用の新規発色
性且つ蛍光性基質に関する。本発明の基質は、従来報告
されている基質に比して、極めて選択性よく例えばトリ
プシン定量を行う事が出来、トリプシンが形成、阻害又
は消費される反応の研究、又はそれ等に関与する因子、
例えばトリプシノーゲン及びトリプシンインヒビターの
測定にも利用できる。また医療分野においては、膵炎の
診断薬として有用である。
性且つ蛍光性基質に関する。本発明の基質は、従来報告
されている基質に比して、極めて選択性よく例えばトリ
プシン定量を行う事が出来、トリプシンが形成、阻害又
は消費される反応の研究、又はそれ等に関与する因子、
例えばトリプシノーゲン及びトリプシンインヒビターの
測定にも利用できる。また医療分野においては、膵炎の
診断薬として有用である。
従来の技術 トリプシンなどの酵素を定量する方法としては、酵素と
反応する基質を利用して酵素を測定する方法がこれまで
多く開発されてきた。
反応する基質を利用して酵素を測定する方法がこれまで
多く開発されてきた。
例えば、トリプシン測定用基質として古くはゼラチン，
ヘモグロビン等の蛋白質が用いられていたが、膵炎や十
二指腸液では他の蛋白質分解酵素（キモトリプシン等）
が共存するため、この基質を用いてトリプシンを測定す
る方法は適さない。トリプシンが、蛋白質分解作用の他
にアミダーゼ，エステラーゼ作用を有していることがBe
rgmann等［J.Biol,Chem.,130 81〜86（1939）］によつ
て報告されて以来、アルギニンのアミド結合又はエステ
ル結合に基づいた測定法として多くの合成基質（例え
ば、Bz−Ｌ−Arg−OEt,Tos−Ｌ−Arg−OMe,Bz−DL−Arg
−PNA,Tos−Ｌ−Arg−PNA等）が利用されてきたが、基
質の特異性や感度が低い問題があつた。更に、トリプシ
ン測定用基質としてＺ−Val−Gly−Arg−PNA（CHR−TR
Y,Pentapharm社,United States Patent No.4278762,pat
ented on Jul.14.1981）が開発された。
ヘモグロビン等の蛋白質が用いられていたが、膵炎や十
二指腸液では他の蛋白質分解酵素（キモトリプシン等）
が共存するため、この基質を用いてトリプシンを測定す
る方法は適さない。トリプシンが、蛋白質分解作用の他
にアミダーゼ，エステラーゼ作用を有していることがBe
rgmann等［J.Biol,Chem.,130 81〜86（1939）］によつ
て報告されて以来、アルギニンのアミド結合又はエステ
ル結合に基づいた測定法として多くの合成基質（例え
ば、Bz−Ｌ−Arg−OEt,Tos−Ｌ−Arg−OMe,Bz−DL−Arg
−PNA,Tos−Ｌ−Arg−PNA等）が利用されてきたが、基
質の特異性や感度が低い問題があつた。更に、トリプシ
ン測定用基質としてＺ−Val−Gly−Arg−PNA（CHR−TR
Y,Pentapharm社,United States Patent No.4278762,pat
ented on Jul.14.1981）が開発された。
発明が解決しようとする課題 一般に、酵素測定用合成基質は、酵素に対する高感度及
び特異性、水或は緩衝液に対する良好な溶解性及び分解
物の易検出性の４点を満足する事が重要である。
び特異性、水或は緩衝液に対する良好な溶解性及び分解
物の易検出性の４点を満足する事が重要である。
このうちでも、測定しようとする酵素に対する高い特異
性は、特に重要であり、従来開発されて来た最良のトリ
プシン測定用基質としては、上記のCHR−TRYがあげられ
るが、基質特異性の点に於いて必ずしも満足出来るもの
ではない。
性は、特に重要であり、従来開発されて来た最良のトリ
プシン測定用基質としては、上記のCHR−TRYがあげられ
るが、基質特異性の点に於いて必ずしも満足出来るもの
ではない。
即ち、CHR−TRYは、蛋白質分解酵素のうちトリプシン以
外にトロンビン，プラスミン，第Xa因子と可成り反応す
る事が解つている。
外にトロンビン，プラスミン，第Xa因子と可成り反応す
る事が解つている。
更に、CHR−TRYの如き基質を用いてトリプシンを測定す
る場合には、該基質とトリプシンとを反応させて生成す
る発色性化合物ｐ−ニトロアニリンを定量してトリプシ
ンを測定するものであるが、生成するｐ−ニトロアニリ
ンの黄色を比色する際には、生体試料中の夾雑物の影響
を免がれる事は出来ない。
る場合には、該基質とトリプシンとを反応させて生成す
る発色性化合物ｐ−ニトロアニリンを定量してトリプシ
ンを測定するものであるが、生成するｐ−ニトロアニリ
ンの黄色を比色する際には、生体試料中の夾雑物の影響
を免がれる事は出来ない。
しかして、本発明の目的はトリプシンなどの酵素を簡単
で迅速に測定でき、尚且つ前述の４条件を満足する酵素
活性測定用基質を提供することである。
で迅速に測定でき、尚且つ前述の４条件を満足する酵素
活性測定用基質を提供することである。
課題を解決するための手段 本発明者等は、新規なトリプシンなどの酵素活性測定用
基質の開発研究を行つた結果、上記の問題点を解決でき
る優れた性質を有する基質を見出した。
基質の開発研究を行つた結果、上記の問題点を解決でき
る優れた性質を有する基質を見出した。
本発明による新規な酵素活性測定用基質は、次の一般式 ［式中、 A1はＬもしくはＤのPro Glu又はＬもしくはＤのGlu（O
R）（ORはグルタミン酸のγ位のカルボキシ基に結合す
る基であり、Ｒは水素原子又は１〜８個の炭素原子を有
する脂肪族炭化水素残基である）； A2はGly,Pro,Pip,Ala,Val,But,NVal又はNLeuである。〕 で表わされる。本発明の酵素活性測定用基質は、特に発
色基として、３−カルボキシ−４−ヒドロキシ−アニリ
ドを用いる事を特徴とする。本基質は、発色基にヒドロ
キシル基、カルボキシル基と言う極めて親水性の高い基
を持つために卓越した水に対する溶解特性を持つてい
る。
R）（ORはグルタミン酸のγ位のカルボキシ基に結合す
る基であり、Ｒは水素原子又は１〜８個の炭素原子を有
する脂肪族炭化水素残基である）； A2はGly,Pro,Pip,Ala,Val,But,NVal又はNLeuである。〕 で表わされる。本発明の酵素活性測定用基質は、特に発
色基として、３−カルボキシ−４−ヒドロキシ−アニリ
ドを用いる事を特徴とする。本基質は、発色基にヒドロ
キシル基、カルボキシル基と言う極めて親水性の高い基
を持つために卓越した水に対する溶解特性を持つてい
る。
本明細書において使用する略号の意味は以下の通りであ
る。
る。
Arg ＝アルギニン Gly ＝グリシン Pro ＝プロリン PiP ＝ピペコリン酸 Ala ＝アラニン Val ＝バリン But ＝２−アミノ酪酸 NVal ＝ノルバリン NLeu ＝ノルロイシン Glu ＝グルタミン酸 Pyro Glu ＝ピログルタミン酸 Arg(NO2)＝δ−グアニジノ基がニトロ基で保護されたアルギニン Ｚ ＝ベンジルオキシカルボニル BOC ＝ｔ−ブチルオキシカルボニル Bz ＝ベンジル Tos ＝ｐ−トルエンスルホニル DMF ＝ジメチルホルムアミド MeOH ＝メタノール NEM ＝Ｎ−エチルモルホリン −SDP ＝4,6−ジメチルピリミジン−２−チオ −OSu ＝サクシミドオキシ -OtBu ＝ｔ−ブトキシ -OnPr ＝ｎ−プロピルオキシ -OiPr ＝ｉ−プロピルオキシ −PNA ＝ｐ−ニトロアニリド −CHA ＝３−カルボキシ−４−ヒドロキシアニリド TLC ＝薄層クロマトグラフイー GPC ＝ゲル濾過クロマトグラフイー AcOH ＝酢酸 BuOH ＝ｎ−ブタノール AcOEt ＝酢酸エチル 上記式〔Ｉ〕において、A1はＬもしくはＤのPyro Glu又
はＬもしくはＤのGlu（OR）である。ここでORはグルタ
ミン酸のγ位のカルボキシ基に結合する基であり、Ｒは
水素原子又は１〜８個の炭素原子を有する脂肪族炭化水
素残基（この場合、ORはエステルを形成する）を示す。
かかる脂肪族炭化水素残基としては、例えばメチル，エ
チル,i−プロピル,n−プロピル,n−ブチル,t−ブチル，
ペンチル，ヘキシル，オクチルなどの炭素数１〜８のア
ルキル基；シクロブチル，シクロペンチル，シクロヘキ
シル，シクロヘプチル，シクロオクチルなどの炭素数３
〜８のシクロアルキル基等が挙げられる。なかでもメチ
ル，エチル,i−プロピル,n−プロピルなどの炭素数１〜
４のアルキル基が好ましい。
はＬもしくはＤのGlu（OR）である。ここでORはグルタ
ミン酸のγ位のカルボキシ基に結合する基であり、Ｒは
水素原子又は１〜８個の炭素原子を有する脂肪族炭化水
素残基（この場合、ORはエステルを形成する）を示す。
かかる脂肪族炭化水素残基としては、例えばメチル，エ
チル,i−プロピル,n−プロピル,n−ブチル,t−ブチル，
ペンチル，ヘキシル，オクチルなどの炭素数１〜８のア
ルキル基；シクロブチル，シクロペンチル，シクロヘキ
シル，シクロヘプチル，シクロオクチルなどの炭素数３
〜８のシクロアルキル基等が挙げられる。なかでもメチ
ル，エチル,i−プロピル,n−プロピルなどの炭素数１〜
４のアルキル基が好ましい。
A2はGly,Pro,Pip,Ala,Val,But,NVal又はNLeuである。
上記式［Ｉ］におけるアミノ酸残基は、こわりのない限
りＬ体である。
りＬ体である。
本発明の基質は酸付加塩であつてもよく、かかる酸付加
塩としては、例えば塩酸塩，臭化水素酸塩，リン酸塩，
硫酸塩，硝酸塩などの無機酸塩；コハク酸塩，クエン酸
塩，乳酸塩，リンゴ酸塩，ベンゼンスルホン酸塩などの
有機酸塩等が挙げられる。
塩としては、例えば塩酸塩，臭化水素酸塩，リン酸塩，
硫酸塩，硝酸塩などの無機酸塩；コハク酸塩，クエン酸
塩，乳酸塩，リンゴ酸塩，ベンゼンスルホン酸塩などの
有機酸塩等が挙げられる。
上記式［Ｉ］で表わされる本発明の基質は、ペプチド化
学においてよく知られる方法により合成される。
学においてよく知られる方法により合成される。
即ち、本発明の基質合成は、最初、発色基となる３−カ
ルボキシ−４−ヒドロキシ−アニリンをアルギニンに結
合させ、次いで遂次的にアミノ酸をカツプリングしてい
く方法により合成することが出来る。或いは、Ｎ−末端
ジペプチドフラグメント自体をあらかじめ合成し、それ
に発色基が結合したアルギニンを結合する事によつて合
成することも可能である。
ルボキシ−４−ヒドロキシ−アニリンをアルギニンに結
合させ、次いで遂次的にアミノ酸をカツプリングしてい
く方法により合成することが出来る。或いは、Ｎ−末端
ジペプチドフラグメント自体をあらかじめ合成し、それ
に発色基が結合したアルギニンを結合する事によつて合
成することも可能である。
上記のカツプリングあるいは結合反応を行なうに際して
は、反応を行なうアミノ基，ジペプチドフラグメントな
どの分子中に存在する、反応に直接関与しないアミノ
酸，カルボキシル基は、ペプチド合成で通常使用される
保護基で保護する。
は、反応を行なうアミノ基，ジペプチドフラグメントな
どの分子中に存在する、反応に直接関与しないアミノ
酸，カルボキシル基は、ペプチド合成で通常使用される
保護基で保護する。
アミノ保護基としては、カルボベンゾキシ,t−ブチルオ
キシカルボニル，又はそれらに関連する基、例えば、ｐ
−メトキシ、ｐ−ニトロ又はｐ−メトキシフエニルアゾ
ールカルボベンゾキシ等を用いるのが有利である。カル
ボキシ保護基としては、ベンジル、ｔ−ブチルなどによ
るエステル基が有利である。アルギニンを反応に用いる
に際しては、アルギニンのδ−グアニジノ基を保護す
る。アルギニンのδ−グアニジノ基の保護には、ニトロ
基やプロトン化を用いるのが有利である。
キシカルボニル，又はそれらに関連する基、例えば、ｐ
−メトキシ、ｐ−ニトロ又はｐ−メトキシフエニルアゾ
ールカルボベンゾキシ等を用いるのが有利である。カル
ボキシ保護基としては、ベンジル、ｔ−ブチルなどによ
るエステル基が有利である。アルギニンを反応に用いる
に際しては、アルギニンのδ−グアニジノ基を保護す
る。アルギニンのδ−グアニジノ基の保護には、ニトロ
基やプロトン化を用いるのが有利である。
以上に述べた保護基は、反応後、それ自体公知の方法に
よつて脱離することができる。
よつて脱離することができる。
２個のアミノ酸のカツプリング，ジペプチドフラグメン
トとアミノ酸のカツプリング,3−カルボキシ−４−ヒド
ロキシ−アニリンとアルギニンの結合反応等は、ペプチ
ド合成に通常使用される活性エステル化法、混合酸無水
物法あるいはカルボジイミド法により行うことができ
る。
トとアミノ酸のカツプリング,3−カルボキシ−４−ヒド
ロキシ−アニリンとアルギニンの結合反応等は、ペプチ
ド合成に通常使用される活性エステル化法、混合酸無水
物法あるいはカルボジイミド法により行うことができ
る。
活性エステル化法は、ａ−カルボキシル基の活性化によ
り行われる。例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシニツクイミ
ド,P−ニトロフエノール，トリクロロフエノール,4,6−
ジメチルピリミジル−２−チオールを用いた活性エステ
ル化法が有利である。
り行われる。例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシニツクイミ
ド,P−ニトロフエノール，トリクロロフエノール,4,6−
ジメチルピリミジル−２−チオールを用いた活性エステ
ル化法が有利である。
混合酸無水物法では、炭酸モノアルキルエステル塩化
物，例えば、イソブチルクロロホルメートを用いるのが
有利である。
物，例えば、イソブチルクロロホルメートを用いるのが
有利である。
カルボジイミド法では、カルボジイミド、例えばN,N′
−ジシクロヘキシルカルボジイミド（D.C.C.）の存在下
で行うのが有利である。
−ジシクロヘキシルカルボジイミド（D.C.C.）の存在下
で行うのが有利である。
上記式〔Ｉ〕のGlu（OR）の場合のグルタミン酸のγ位
のカルボキシ基のエステル化は、対応するアルコールと
の脱水縮合、例えば酸触媒下にｉ−プロパノールなどと
の脱水縮合により行うことができる。
のカルボキシ基のエステル化は、対応するアルコールと
の脱水縮合、例えば酸触媒下にｉ−プロパノールなどと
の脱水縮合により行うことができる。
発明の効果 本発明の酵素活性測定用基質の特徴は、特にトリプシン
に対する優れた基質特異性を有する点にある。例えば、
本発明の新規基質PS−1245 H−Pyro Glu−Ala−Arg−CH
A及び従来の基質CHR−TRY（Pentapharm社，参考例）
と、蛋白質分解酵素であるトリプシン（Try），トロン
ビン（TH），プラスミン（PL），第Xa因子（FXa）等と
の相対反応性を、CHR−TRYを100として示すと、第１表
の如くなり、トロンビン，プラスミン，第Xa因子等に対
する反応性が、本発明の新規基質の場合には著しく低
く、例えば、トロンビンは12％，プラスミン36％，第Xa
因子19％しか反応せず、他方トリプシンに対しては278
％と極めて高い反応性を示す。従つて本発明の新規基質
は特にトリプシンに対して優れた基質特異性を有する事
が判る。
に対する優れた基質特異性を有する点にある。例えば、
本発明の新規基質PS−1245 H−Pyro Glu−Ala−Arg−CH
A及び従来の基質CHR−TRY（Pentapharm社，参考例）
と、蛋白質分解酵素であるトリプシン（Try），トロン
ビン（TH），プラスミン（PL），第Xa因子（FXa）等と
の相対反応性を、CHR−TRYを100として示すと、第１表
の如くなり、トロンビン，プラスミン，第Xa因子等に対
する反応性が、本発明の新規基質の場合には著しく低
く、例えば、トロンビンは12％，プラスミン36％，第Xa
因子19％しか反応せず、他方トリプシンに対しては278
％と極めて高い反応性を示す。従つて本発明の新規基質
は特にトリプシンに対して優れた基質特異性を有する事
が判る。
本発明の基質の用途は、既に述べた通りトリプシンなど
の酵素活性測定であるが、その場合当該基質をpH8.0〜1
0.0間の緩衝液中で例えばトリプシンに作用させ生成す
る３−カルボキシ−４−ヒドロキシアニリンを適当な着
色物に導き、これを比色定量することにより例えばトリ
プシン活性を測定できる。あるいは又、励起波長328n
m、蛍光波長540nmにて蛍光分析法により、定量すること
により例えばトリプシン活性を測定する事も可能であ
る。
の酵素活性測定であるが、その場合当該基質をpH8.0〜1
0.0間の緩衝液中で例えばトリプシンに作用させ生成す
る３−カルボキシ−４−ヒドロキシアニリンを適当な着
色物に導き、これを比色定量することにより例えばトリ
プシン活性を測定できる。あるいは又、励起波長328n
m、蛍光波長540nmにて蛍光分析法により、定量すること
により例えばトリプシン活性を測定する事も可能であ
る。
着色物に導く方法としては、ペンタシアノアミンフエロ
エート法やカプラーと酸化縮合させる方法がある。カプ
ラーとしては、酸性側での発色の場合は、アニリン系化
合物、例えば、N,N−ジエチルアニリン、アルカリ側で
は、フエノール，ナフトール,2,6−キシレノール，チモ
ール,o−クレゾール,o−エチルフエノール等が用いられ
る。
エート法やカプラーと酸化縮合させる方法がある。カプ
ラーとしては、酸性側での発色の場合は、アニリン系化
合物、例えば、N,N−ジエチルアニリン、アルカリ側で
は、フエノール，ナフトール,2,6−キシレノール，チモ
ール,o−クレゾール,o−エチルフエノール等が用いられ
る。
酸化縮合の酸化剤として、過酸化水素，過硫酸塩等、種
々のものが用いられるが、メタ過ヨウ素酸が好適であ
る。
々のものが用いられるが、メタ過ヨウ素酸が好適であ
る。
３−カルボキシ−４−ヒドロキシアニリンを適当な着色
物に導くことにより極大吸収波長が560〜770nm中に分布
するが、呈色の温度による変動は極めて少く安定で、ト
リプシンなどの酵素活性測定に適している。更に発色感
度を比べてみても、従来の発色性基質のｐ−ニトロアニ
リンの場合、一般測定波長405nmにて、ε ＝10600であ
るのに対し、上記のペンタシアノアニンフエロエート法
ではλ ＝700nmで、ε ＝21,500、酸化縮合による発
色に於いては、ｏ−エチルフエノールの場合λ ＝645n
mで、ε ＝29,000、2,6−キシレノールの場合λ ＝61
5nmで、ε ＝21,600で極めて吸光度が大きく、この点
に於いても測定上極めて有利である。
物に導くことにより極大吸収波長が560〜770nm中に分布
するが、呈色の温度による変動は極めて少く安定で、ト
リプシンなどの酵素活性測定に適している。更に発色感
度を比べてみても、従来の発色性基質のｐ−ニトロアニ
リンの場合、一般測定波長405nmにて、ε ＝10600であ
るのに対し、上記のペンタシアノアニンフエロエート法
ではλ ＝700nmで、ε ＝21,500、酸化縮合による発
色に於いては、ｏ−エチルフエノールの場合λ ＝645n
mで、ε ＝29,000、2,6−キシレノールの場合λ ＝61
5nmで、ε ＝21,600で極めて吸光度が大きく、この点
に於いても測定上極めて有利である。
本発明の特徴の一つとして、生体試料中の夾雑物による
測定上の影響をほとんど受けないことがあるが、これ
は、従来の基質として用いられているｐ−ニトロアニリ
ド系化合物に於いては、560nm以下の波長で測定するの
に対して、本発明では、560nm以上の波長で測定する
為、試料中の夾雑物の影響を受けず、基質本来の高特異
性と併せて、正確な測定結果が得られる。
測定上の影響をほとんど受けないことがあるが、これ
は、従来の基質として用いられているｐ−ニトロアニリ
ド系化合物に於いては、560nm以下の波長で測定するの
に対して、本発明では、560nm以上の波長で測定する
為、試料中の夾雑物の影響を受けず、基質本来の高特異
性と併せて、正確な測定結果が得られる。
以下の通り本発明の基質は、トリプシンなどの酵素活性
測定用基質として、従来のものに比べて、非常に優れて
いることが明らかである。従つて本発明の基質は医療分
野においては、膵炎の診断薬として極めて有用である。
測定用基質として、従来のものに比べて、非常に優れて
いることが明らかである。従つて本発明の基質は医療分
野においては、膵炎の診断薬として極めて有用である。
実施例 本発明を以下実施例により詳細に説明するが、本発明
は、これら実施例に限定されるものではない。
は、これら実施例に限定されるものではない。
以下の実施例において、アミノ酸は特にことわらなけれ
ばＬ−体を示す。
ばＬ−体を示す。
薄層クロマトグラフイー（TLC）分析は、シリカゲルF
254（メルク製）プレートを使用した。溶媒は、以下に
示す組成の溶媒を使用した。
254（メルク製）プレートを使用した。溶媒は、以下に
示す組成の溶媒を使用した。
Rf1 CHCL3:MeOH:AcOH:H2O＝80:20:5:2.5 Rf2 ｎ−BuOH:ACOH:H2O＝4:1:1 Rf3 ｎ−BuOH:ACOH:H2O＝4:1:2 Rf4 ｎ−BuOH:ACOH:H2O＝4:1:5 ゲル濾過には、東洋曹達工業株式会社のポリビニールゲ
ル、トーヨーパールHW40F（商品名）を使用した。
ル、トーヨーパールHW40F（商品名）を使用した。
実施例１ Ｈ−Pyro Glu−Ala−Arg−CHA・HClの合成 I.BOC−Arg（NO2）−CHA BOC−Arg（NO2）−OH50.3g（0.158mole）をDMF160mlに
溶解し、NEM20.5ml（0.158mole）を加え、これに−20℃
にてイソブチルクロロホルメート21.2ml（0.158mole）
を滴下し、10分間反応させる。反応後、５−アミノサリ
チル酸・塩酸塩30.0g（0.158mole）とNEM61.6ml（0.474
mole）のDMF250ml溶液を上記反応液に−15〜−10℃にて
滴下する。滴下後、同温度にて３時間反応させ、さらに
室温（15〜20℃）にて18時間反応させる。反応後、DMF
を減圧留去し、残渣をAcOEt950mlに溶解し、冷５％塩酸
300mlで４回、飽和食塩水300mlで２回洗浄後、無水硫酸
マグネシウムおよび活性炭にて脱色乾燥する。乾燥後、
硫酸マグネシウムおよび活性炭を濾別して冷却静置し、
析出結晶を濾取、乾燥するとBOC−Arg（NO2）−CHA46.2
g（46.3％）を得る。
溶解し、NEM20.5ml（0.158mole）を加え、これに−20℃
にてイソブチルクロロホルメート21.2ml（0.158mole）
を滴下し、10分間反応させる。反応後、５−アミノサリ
チル酸・塩酸塩30.0g（0.158mole）とNEM61.6ml（0.474
mole）のDMF250ml溶液を上記反応液に−15〜−10℃にて
滴下する。滴下後、同温度にて３時間反応させ、さらに
室温（15〜20℃）にて18時間反応させる。反応後、DMF
を減圧留去し、残渣をAcOEt950mlに溶解し、冷５％塩酸
300mlで４回、飽和食塩水300mlで２回洗浄後、無水硫酸
マグネシウムおよび活性炭にて脱色乾燥する。乾燥後、
硫酸マグネシウムおよび活性炭を濾別して冷却静置し、
析出結晶を濾取、乾燥するとBOC−Arg（NO2）−CHA46.2
g（46.3％）を得る。
Rf1＝0.11,m.p.208℃（分解） ▲［α］20 D▼−8.4°（Ｃ＝1,MeOH） 元素分析 C18H26N6O8・1/4H2O Ｃ Ｈ Ｎ 測定値 47.16％ 5.75％ 18.30％ 計算値 47.11％ 5.82％ 18.31％ II.BOC−Ala−Arg（NO2）−CHA BOC−Arg（NO2）−CHA45.4g（0.1mole）を2NHCl/AcOH30
0ml（0.6mole）と少量のMeOHに溶解して、室温にて２時
間反応を行う。反応終了後、乾燥エーテル300mlを加え
ると結晶化する。34.9g（89.4％）のHCl・Ｈ−Arg（N
O2）−CHAを得る。
0ml（0.6mole）と少量のMeOHに溶解して、室温にて２時
間反応を行う。反応終了後、乾燥エーテル300mlを加え
ると結晶化する。34.9g（89.4％）のHCl・Ｈ−Arg（N
O2）−CHAを得る。
Rf3＝0.31,m.p.193〜206℃ ▲［α］20 D▼＋37.4°（Ｃ＝1,MeOH） 15.9g（0.084mol）のBOC−Ala−OHをDMF84mlに溶解し、
NEM10.9ml（0.084mol）を加え、これに−20℃にてイソ
ブチルクロロホルメート10.9ml（0.084mol）を滴下し10
分間反応する。反応後、HCl・Ｈ−Arg（NO2）−CHA32.8
g（0.084mol）とNEM32.8ml（0.252mol）のDMF84ml溶液
を上記反応液に−15℃〜−10℃にて滴下する。滴下後、
同温室にて23時間反応し、さらに室温（15〜20℃）にて
18時間反応する。反応後、DMFを減圧留去し、残渣をAcO
Et600mlに溶解し、冷５％塩酸200ml×３、飽和食塩水20
0ml×２にて洗浄後、無水硫酸マグネシウムおよび活性
炭にて脱色乾燥する。乾燥後、硫酸マグネシウムと活性
炭を濾別して溶媒を減圧留去し、残渣をMeOH/AcOEt/エ
ーテルより再結晶をすると、31.0g（70.3％）のBOC−Al
a−Arg（NO2）−CHAを得る。
NEM10.9ml（0.084mol）を加え、これに−20℃にてイソ
ブチルクロロホルメート10.9ml（0.084mol）を滴下し10
分間反応する。反応後、HCl・Ｈ−Arg（NO2）−CHA32.8
g（0.084mol）とNEM32.8ml（0.252mol）のDMF84ml溶液
を上記反応液に−15℃〜−10℃にて滴下する。滴下後、
同温室にて23時間反応し、さらに室温（15〜20℃）にて
18時間反応する。反応後、DMFを減圧留去し、残渣をAcO
Et600mlに溶解し、冷５％塩酸200ml×３、飽和食塩水20
0ml×２にて洗浄後、無水硫酸マグネシウムおよび活性
炭にて脱色乾燥する。乾燥後、硫酸マグネシウムと活性
炭を濾別して溶媒を減圧留去し、残渣をMeOH/AcOEt/エ
ーテルより再結晶をすると、31.0g（70.3％）のBOC−Al
a−Arg（NO2）−CHAを得る。
Rf1＝0.12,m.p.201〜212℃ ▲［α］20 D▼−16.0°（Ｃ＝0.5,DMF） 元素分析 C21H31N7O9・1/2H2O 測定値 C:47.25％ H:6.25％ N:18.55％ 計算値 C:47.19％ H:6.03％ N:18.34％ III.Z−Pyro Glu−Ala−Arg（NO2）−CHA BOC−Ala−Arg（NO2）−CHA30.0g（0.057mol）を2N HCl
/AcOH 142.5ml（0.285mol）と少量のMeOHに溶解して、
室温にて２時間反応を行う。反応終了後、乾燥エーテル
1000mlを加え析出結晶を濾取乾燥するとHCl・Ｈ−Ala−
Arg（NO2）−CHA25.0g（95.0％）を得る。
/AcOH 142.5ml（0.285mol）と少量のMeOHに溶解して、
室温にて２時間反応を行う。反応終了後、乾燥エーテル
1000mlを加え析出結晶を濾取乾燥するとHCl・Ｈ−Ala−
Arg（NO2）−CHA25.0g（95.0％）を得る。
Rf2＝0.13,m.p.178〜205℃ ▲［α］20 D▼−9.0°（Ｃ＝0.5,DMF） 2.31g（5.0mmol）のHCl・Ｈ−Ala−Arg（NO2）−CHAを
1.5N NEM/DMF10ml（15.0mmol）に溶解し、０〜５℃にて
Ｚ−Pyro Glu−SDP 1.93g（5.0mmol）を加え、18時間室
温にて反応する。反応後、AcOEt300mlにて反応液を希釈
して、冷５％塩酸100ml×４、飽和食塩水100ml×２にて
洗浄する。AcOEt層を無水硫酸マグネシウムおよび活性
炭にて脱色乾燥後、減圧留去して残渣をMeOH/AcOEt/エ
ーテルより再結晶すると、。Ｚ−Pyro Glu−Ala−Arg
（NO2）−CHA18.4g（54.9％）を得る。
1.5N NEM/DMF10ml（15.0mmol）に溶解し、０〜５℃にて
Ｚ−Pyro Glu−SDP 1.93g（5.0mmol）を加え、18時間室
温にて反応する。反応後、AcOEt300mlにて反応液を希釈
して、冷５％塩酸100ml×４、飽和食塩水100ml×２にて
洗浄する。AcOEt層を無水硫酸マグネシウムおよび活性
炭にて脱色乾燥後、減圧留去して残渣をMeOH/AcOEt/エ
ーテルより再結晶すると、。Ｚ−Pyro Glu−Ala−Arg
（NO2）−CHA18.4g（54.9％）を得る。
Rf2＝0.71,m.p.237℃（分解） ▲［α］20 D▼−30.0°（Ｃ＝0.5,DMF） 元素分析 C28H32N8O11・H2O 測定値 C:52.05％ H:5.50％ N:16.63％ 計算値 C:51.94％ H:5.41％ N:16.71％ IV.H−Pyro Glu−Ala−Arg−CHA・HCl Ｚ−Pyro Glu−Ala−Arg（NO2）−CHA1.75g（2.6mmol）
をMeOH112.5mlとH2O27.7mlおよび1N−HCl9.8mlの混合溶
媒に懸濁し、パラジウム黒1gを加え、30℃にて６時間接
触還元をする。反応後、触媒を濾別して溶媒を減圧留去
する。残渣を展開溶媒がMeOHのトーヨーパールHW40Fカ
ラムにて精製すると、0.471g（34.4％）のＨ−Pyro Glu
−Ala−Arg−CHA・HClを得る。
をMeOH112.5mlとH2O27.7mlおよび1N−HCl9.8mlの混合溶
媒に懸濁し、パラジウム黒1gを加え、30℃にて６時間接
触還元をする。反応後、触媒を濾別して溶媒を減圧留去
する。残渣を展開溶媒がMeOHのトーヨーパールHW40Fカ
ラムにて精製すると、0.471g（34.4％）のＨ−Pyro Glu
−Ala−Arg−CHA・HClを得る。
Rf4＝0.25 ▲［α］20 D▼−63.0°（Ｃ＝0.46,1NHCl） 元素分析 C21H29N7O7HCl・1/2H2O 測定値 C:46.99％ H:5.86％ N:18.10％ 計算値 C:46.97％ H:5.82％ N:18.25％ 実施例２ Ｈ−Pyro Glu−Pro−Arg−CHA・HClの合成 I.BOC−Pro−Arg（NO2）−CHA Ｈ−Arg（NO2）−CHA・HCl 39.1g（0.1mole）をDMF200m
lに溶解し、NEM39ml（0.3mole）を加える。０〜５℃に
てBOC−Pro−SDP33.7g（0.1mole）を加えて、室温で18
時間反応する。反応後DMFを減圧留去し、残渣をAcOEt10
00mlに溶解して、冷５％塩酸300ml×３、飽和食塩水300
ml×２洗浄後、無水硫酸マグネシウムおよび活性炭にて
脱色乾燥する。乾燥後、硫酸マグネシウムおよび活性炭
を濾別して溶媒を減圧留去し、残渣をMeOH/AcOEt/エー
テルより再結晶すると27.7g（50.3％）のBOC−Pro−Arg
（NO2）−CHAを得る。
lに溶解し、NEM39ml（0.3mole）を加える。０〜５℃に
てBOC−Pro−SDP33.7g（0.1mole）を加えて、室温で18
時間反応する。反応後DMFを減圧留去し、残渣をAcOEt10
00mlに溶解して、冷５％塩酸300ml×３、飽和食塩水300
ml×２洗浄後、無水硫酸マグネシウムおよび活性炭にて
脱色乾燥する。乾燥後、硫酸マグネシウムおよび活性炭
を濾別して溶媒を減圧留去し、残渣をMeOH/AcOEt/エー
テルより再結晶すると27.7g（50.3％）のBOC−Pro−Arg
（NO2）−CHAを得る。
Rf1＝0.16,m.p.116℃（分解） ▲［α］20 D▼−26°（Ｃ＝0.5,DMF） 元素分析 C23H33N7O9・H2O 測定値 C:48.25％ H:6.45％ N:17.55％ 計算値 C:48.50％ H:6.19％ N:17.21％ II.Z−Pyro Glu−Pro−Arg（NO2）−CHA BOC−Pro−Arg（NO2）−CHA26.0g（0.047mol）を2N HCl
/AcOH117.5ml（0.235mol）と少量のMeOHに溶解して、室
温にて２時間反応を行う。反応終了後、乾燥エーテル90
0mlを加え、析出結晶を瀘取乾燥すると、HCl・Ｈ−Pro
−Arg（NO2）−CHA19.8g（93.3％）を得る。
/AcOH117.5ml（0.235mol）と少量のMeOHに溶解して、室
温にて２時間反応を行う。反応終了後、乾燥エーテル90
0mlを加え、析出結晶を瀘取乾燥すると、HCl・Ｈ−Pro
−Arg（NO2）−CHA19.8g（93.3％）を得る。
Rf2＝0.08, m.p. 88−93℃ ▲［α］20 D▼−35.8°（Ｃ＝1,MeOH） 2.25g（5.0mmol）のHCl・Ｈ−Pro−Arg（NO2）−CHAを
1.5N NEM/DMF10ml（15.0mmol）に溶解し、０〜５℃に
て、Ｚ−Pyro Glu−SDP 1.93g（5.0mmol）を加え、18時
間室温にて反応する。反応後、AcOEt300mlにて反応液を
希釈して、冷５％塩酸100ml×４飽和食塩水100ml×２に
て洗浄する。AcOEt層を硫酸マグネシウムおよび活性炭
にて脱色乾燥後、減圧留去して残渣をMeOH/AcOEt/エー
テルより再結晶すると、Ｚ−Pyro Glu−Pro−Arg（N
O2）−CHA1.86g（53.4％）を得る。
1.5N NEM/DMF10ml（15.0mmol）に溶解し、０〜５℃に
て、Ｚ−Pyro Glu−SDP 1.93g（5.0mmol）を加え、18時
間室温にて反応する。反応後、AcOEt300mlにて反応液を
希釈して、冷５％塩酸100ml×４飽和食塩水100ml×２に
て洗浄する。AcOEt層を硫酸マグネシウムおよび活性炭
にて脱色乾燥後、減圧留去して残渣をMeOH/AcOEt/エー
テルより再結晶すると、Ｚ−Pyro Glu−Pro−Arg（N
O2）−CHA1.86g（53.4％）を得る。
Rf2＝0.69, m.p. 220℃（分解） ▲［α］20 D▼−18°（Ｃ＝0.5,DMF） 元素分析 C31H36N8O11・H2O 測定値 C:52.13％ H:5.40％ N:15.75％ 計算値 C:52.10％ H:5.36％ N:15.68％ III.H−Pyro Glu−Pro−Arg−CHA・HCl Ｚ−Pyro Glu−Pro−Arg（NO2）−CHA0.60g（0.87mmo
l）をMeOH112.5mlとH2O35.8mlおよびIN−HCl1.7mlの混
合溶媒に懸濁し、パラジウム黒1gを加え、30℃にて５時
間接触還元をする。反応後触媒を濾別して溶媒を減圧留
去する。残渣を展開溶媒がMeOHのトーヨーパールHW40F
カラムにて精製すると0.42g（87.5％）のＨ−Pyro Glu
−Pro−Arg−CHA・HClを得る。
l）をMeOH112.5mlとH2O35.8mlおよびIN−HCl1.7mlの混
合溶媒に懸濁し、パラジウム黒1gを加え、30℃にて５時
間接触還元をする。反応後触媒を濾別して溶媒を減圧留
去する。残渣を展開溶媒がMeOHのトーヨーパールHW40F
カラムにて精製すると0.42g（87.5％）のＨ−Pyro Glu
−Pro−Arg−CHA・HClを得る。
Rf3＝0.26, m.p. 155℃（分解） ▲［α］20 D▼−92°（Ｃ＝0.5,MeOH） 元素分析 C23H31N7O7・HCl・H2O 測定値 C:48.33％ H:5.70％ N:17.30％ 計算値 C:48.29％ H:5.99％ N:17.14％ 実施例３ Ｈ−Ｄ−Glu（OtBu）−Gly−Arg−CHA・2HClの合成 I.BOC−Arg−CHA・HCl BOC−Arg−OH・HCl・H2O381.1g（1.16mol）をDMF1392ml
に溶解し、NEM151mlを加え、これに−20℃にてイソブチ
ルクロロホルメート152.3mlを滴下する。10分間反応
後、５−アミノサリチル酸・塩酸塩219.8g（1.16mol）
とNEM301.6mlのDMF928ml溶液を上記反応液に−15〜−10
℃にて滴下する。滴下後、同温度にて３時間反応させ、
さらに室温にて15時間反応させる。反応後、DMFを減圧
留去し、残渣をMeOH464mlとｎ−BuOH332mlに溶解する。
AcOEt3300mlを加え、食塩を飽和させた冷５％塩酸2160m
lにて２回洗浄後、無水硫酸マグネシウムにて乾燥す
る。乾燥後硫酸マグネシウムを濾別して溶媒を減圧留去
すると、BOC−Arg−CHA・HCl464.8g（89.9％）を得る。
に溶解し、NEM151mlを加え、これに−20℃にてイソブチ
ルクロロホルメート152.3mlを滴下する。10分間反応
後、５−アミノサリチル酸・塩酸塩219.8g（1.16mol）
とNEM301.6mlのDMF928ml溶液を上記反応液に−15〜−10
℃にて滴下する。滴下後、同温度にて３時間反応させ、
さらに室温にて15時間反応させる。反応後、DMFを減圧
留去し、残渣をMeOH464mlとｎ−BuOH332mlに溶解する。
AcOEt3300mlを加え、食塩を飽和させた冷５％塩酸2160m
lにて２回洗浄後、無水硫酸マグネシウムにて乾燥す
る。乾燥後硫酸マグネシウムを濾別して溶媒を減圧留去
すると、BOC−Arg−CHA・HCl464.8g（89.9％）を得る。
Rf2＝0.64, m.p. 225.0℃（分解） ▲［α］20 D▼−10.7°（Ｃ＝1,MeOH） 元素分析 C18H28N5O6Cl・H2O Ｃ Ｈ Ｎ 測定値 46.71％ 6.60％ 14.90％ 計算値 46.60％ 6.52％ 15.10％ II.BOC−Gly−Arg−CHA・HCl BOC−Arg−CHA・HCl243.7g（0.55mol）を2NHCl/AcOH109
3mlと少量のMeOHに溶解して、１時間室温にて反応させ
る。反応終了後、イソプロパノール1093mlを加え、AcOE
t中に再沈する。析出結晶を濾取・乾燥するとＨ−Arg−
CHA・2HCl156.2g（74.3％）を得る。
3mlと少量のMeOHに溶解して、１時間室温にて反応させ
る。反応終了後、イソプロパノール1093mlを加え、AcOE
t中に再沈する。析出結晶を濾取・乾燥するとＨ−Arg−
CHA・2HCl156.2g（74.3％）を得る。
Rf4＝0.15, m.p. 240.5℃（分解） ▲［α］20 D▼＋53.5°（Ｃ＝1,H2O） 109.2g（0.27mol）のＨ−Arg−CHA・2HClをDMF290mlに
溶解させ、NEM70.2ml（0.54mol）を加える。これに０〜
５℃にてBOC−Gly−OSu81.7g（0.3mol）を加え、室温に
て18時間反応させる。反応終了後、DMFを減圧留去し、
残渣をMeOH500mlに溶解して、AcOEt8lに再沈する。析出
結晶を濾取、乾燥すると、BOC−Gly−Arg−CHA・HCl13
5.8g（100％）を得る。
溶解させ、NEM70.2ml（0.54mol）を加える。これに０〜
５℃にてBOC−Gly−OSu81.7g（0.3mol）を加え、室温に
て18時間反応させる。反応終了後、DMFを減圧留去し、
残渣をMeOH500mlに溶解して、AcOEt8lに再沈する。析出
結晶を濾取、乾燥すると、BOC−Gly−Arg−CHA・HCl13
5.8g（100％）を得る。
Rf2＝0.46,m.p.214.5℃（分解） ▲［α］20 D▼−22°（Ｃ＝1,MeOH） 元素分析 C20H30N6O7・HCl・H2O Ｃ Ｈ Ｎ 測定値 46.55％ 6.80％ 16.15％ 計算値 46.11％ 6.39％ 16.13％ III.Z−Ｄ−Glu（OtBu）−Gly−Arg−CHA・HCl BOC−Gly−Arg−CHA・HCl125.7g（0.25mol）を少量のMe
OHに溶解後、2N HCl/AcOH500ml（0.10mol）を加え、１
時間室温にて攪拌反応させる。反応終了後、エーテル4.
5lに再沈し、析出結晶を濾取・乾燥するとＨ−Gly−Arg
−CHA・2HCl109.8g（100％）を得る。
OHに溶解後、2N HCl/AcOH500ml（0.10mol）を加え、１
時間室温にて攪拌反応させる。反応終了後、エーテル4.
5lに再沈し、析出結晶を濾取・乾燥するとＨ−Gly−Arg
−CHA・2HCl109.8g（100％）を得る。
Rf4＝0.09,m.p.219.5℃（分解） ▲［α］20 D▼−21.0°（Ｃ＝1,AcOH:H2O＝1:1） 4.4g（10mM）のＨ−Gly−Arg−CHA・2HClを0.75NNEM/DM
F20mlに溶解し、０〜５℃に冷却攪拌しながらＺ−Ｄ−G
lu（OtBu）−OSU4.3g（10mM）を加えて、室温にて15時
間反応させる。反応後、溶媒を減圧留去し、残渣をMeOH
に溶解してAcOEt1に再沈する。析出結晶を濾取・乾燥
するとＺ−Ｄ−Glu（OtBu）−Gly−Arg−CHA・HCl6.1g
（84.5％）を得る。
F20mlに溶解し、０〜５℃に冷却攪拌しながらＺ−Ｄ−G
lu（OtBu）−OSU4.3g（10mM）を加えて、室温にて15時
間反応させる。反応後、溶媒を減圧留去し、残渣をMeOH
に溶解してAcOEt1に再沈する。析出結晶を濾取・乾燥
するとＺ−Ｄ−Glu（OtBu）−Gly−Arg−CHA・HCl6.1g
（84.5％）を得る。
Rf2＝0.60,m.p.195.0℃（分解） ▲［α］20 D▼−7.0°（Ｃ＝0.5,MeOH） 元素分析 C32H43N7O10・HCl・1.5H2O Ｃ Ｈ Ｎ 測定値 51.45％ 6.10％ 13.10％ 計算値 51.30％ 6.19％ 13.09％ II.Z−Ｄ−Glu（OtBu）−Gly−Arg−CHA・2HCl Ｚ−Ｄ−Glu（OtBu）−Gly−Arg−CHA5.5g（7.6mole）
をMeOH150mlに溶解し、パラジウム黒1gを加え、30℃に
て５時間接触還元をする。反応後触媒を濾別して、溶媒
を減圧留去する。残渣を５％HCl−MeOH5.5mlとMeOH20ml
に溶解して、エーテルに再沈する。析出物を濾取・乾燥
後、展開溶媒がMeOHのトーヨーパールHW40Fカラムにて
精製すると、3.6g（75.8％）のＨ−Ｄ−Glu（OtBu）−G
ly−Arg−CHA・2HClを得る。
をMeOH150mlに溶解し、パラジウム黒1gを加え、30℃に
て５時間接触還元をする。反応後触媒を濾別して、溶媒
を減圧留去する。残渣を５％HCl−MeOH5.5mlとMeOH20ml
に溶解して、エーテルに再沈する。析出物を濾取・乾燥
後、展開溶媒がMeOHのトーヨーパールHW40Fカラムにて
精製すると、3.6g（75.8％）のＨ−Ｄ−Glu（OtBu）−G
ly−Arg−CHA・2HClを得る。
Rf3＝0.35,m.p.168.5℃（分解） ▲［α］20 D▼−3.0°（Ｃ＝0.5,MeOH） 元素分析 C24H37N7O8・2HCl・1/2H2O Ｃ Ｈ Ｎ 測定値 45.48％ 6.43％ 15.35％ 計算値 45.50％ 6.36％ 15.48％ 実施例４ 実施例1,2あるいは３と同様な方法にて下記の第２表に
示す基質の合成を行つた。基質の物性値も第２表に示し
た。
示す基質の合成を行つた。基質の物性値も第２表に示し
た。
第２表に示した本発明基質の元素分析の結果を第３表に
示した。
示した。
実施例５ 実施例１〜４において新規に合成した基質の特異性を各
酵素と反応させる事により試験した。
酵素と反応させる事により試験した。
（１）基質液:10mmmol/l （２）緩衝液：トリス、NaCl,CaCl2の濃度、及びpH（25
℃）は、酵素により次の通りとした。
℃）は、酵素により次の通りとした。
（３）使用酵素：使用した酵素の起源等は以下の通りで
ある。
ある。
（４）反応停止液（pNA系基質に対して）:10％−酢酸 （５）発色試薬（CHA系基質に対して）：ペンタシアノ
アミンフエロエート 測定法： 緩衝液0.3mlと酵素試薬0.1mlをシリコン処理硬質ガラス
製試験管又は、プラスチツク製試験管に採取し、37℃恒
温槽中にて５分間予加温する。次いで基質液0.1mlを加
えて酵素反応を37℃５分間実施する。正確に５分後、反
応停止液又は、発色試薬2.0mlを加えて酵素反応を停止
後、37℃で10分間放置後405nm又は700nmの吸光度を測定
する。
アミンフエロエート 測定法： 緩衝液0.3mlと酵素試薬0.1mlをシリコン処理硬質ガラス
製試験管又は、プラスチツク製試験管に採取し、37℃恒
温槽中にて５分間予加温する。次いで基質液0.1mlを加
えて酵素反応を37℃５分間実施する。正確に５分後、反
応停止液又は、発色試薬2.0mlを加えて酵素反応を停止
後、37℃で10分間放置後405nm又は700nmの吸光度を測定
する。
測定結果は第４表に示した通りである。
Claims (1)
- 【請求項１】下記式 〔式中、 A1はL-体もしくはD-体のPyro Glu又はL-体もしくはD-体
のGlu（OR）（ORはグルタミン酸のγ位のカルボキシル
基に結合する基であり、Ｒは水素原子又は１〜８個の炭
素原子を有する脂肪族炭化水素残基である）； A2はGly,Pro,Pip,Ala,Val,But,NVal又はNLeuである。〕 の化合物又はその塩で表される事を特徴とする新規なト
リプシン活性測定用基質。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63173789A JPH06104079B2 (ja) | 1988-07-14 | 1988-07-14 | 新規な酵素活性測定用基質 |
| US07/378,850 US5116941A (en) | 1988-07-14 | 1989-07-12 | Peptide substrates for determination of enzyme activity |
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