JPH0595784A - 新規微生物細胞溶解酵素、その製造方法及び新規ストレ プトマイセス属微生物 - Google Patents
新規微生物細胞溶解酵素、その製造方法及び新規ストレ プトマイセス属微生物Info
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- JPH0595784A JPH0595784A JP3258181A JP25818191A JPH0595784A JP H0595784 A JPH0595784 A JP H0595784A JP 3258181 A JP3258181 A JP 3258181A JP 25818191 A JP25818191 A JP 25818191A JP H0595784 A JPH0595784 A JP H0595784A
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 本発明は、ストレプトマイセス属微生物由来
の微生物細胞溶解酵素、その製造方法及び該酵素を生産
する新規株ストレプトマイセスsp.15001株に関する。 【効果】 本発明によれば、酵母、糸状菌、細菌と広い
溶菌スペクトルを有し、特に細菌に対して高い溶菌活性
を示す酵素を提供できる。
の微生物細胞溶解酵素、その製造方法及び該酵素を生産
する新規株ストレプトマイセスsp.15001株に関する。 【効果】 本発明によれば、酵母、糸状菌、細菌と広い
溶菌スペクトルを有し、特に細菌に対して高い溶菌活性
を示す酵素を提供できる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、新規微生物細胞溶解酵
素、その製造方法及び該酵素の生産菌に関する。
素、その製造方法及び該酵素の生産菌に関する。
【０００２】
【従来の技術】微生物細胞溶解酵素は動植物体をはじめ
として多くの微生物が産生することが知られている。こ
れらの酵素は細胞壁構造の解明やプロトプラスト化やプ
ラスミドの抽出に利用されたり、菌体成分の抽出や食品
の殺菌剤、洗剤、医療への応用が期待されている。
として多くの微生物が産生することが知られている。こ
れらの酵素は細胞壁構造の解明やプロトプラスト化やプ
ラスミドの抽出に利用されたり、菌体成分の抽出や食品
の殺菌剤、洗剤、医療への応用が期待されている。
【０００３】微生物起源のもののうち、ストレプトマイ
セス属に属する菌株の産生する微生物細胞溶解酵素は多
く知られており、例えば特開昭61-135583号、特開昭53-
38687号、特開昭49-124280号、特開昭48-23988号、特開
昭55-68289号などに記載されている。
セス属に属する菌株の産生する微生物細胞溶解酵素は多
く知られており、例えば特開昭61-135583号、特開昭53-
38687号、特開昭49-124280号、特開昭48-23988号、特開
昭55-68289号などに記載されている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】前述した従来のストレ
プトマイセス属微生物由来の微生物細胞溶解酵素は、酵
母のみあるいは細菌のみに対して溶菌活性を有するもの
がほとんどであり、特開昭55-68289号については酵母、
糸状菌、細菌、放線菌と広い溶菌活性を有するものの、
エシェリキア・コリやスタフィロコッカス・アウレウス
などに対しては活性がなく、実用上欠点を有していた。
また市販品としても微生物細胞溶解酵素として多くのも
のが知られているが、単独では溶菌活性が弱く複数の酵
素を組み合わせる必要があるものが多かった。
プトマイセス属微生物由来の微生物細胞溶解酵素は、酵
母のみあるいは細菌のみに対して溶菌活性を有するもの
がほとんどであり、特開昭55-68289号については酵母、
糸状菌、細菌、放線菌と広い溶菌活性を有するものの、
エシェリキア・コリやスタフィロコッカス・アウレウス
などに対しては活性がなく、実用上欠点を有していた。
また市販品としても微生物細胞溶解酵素として多くのも
のが知られているが、単独では溶菌活性が弱く複数の酵
素を組み合わせる必要があるものが多かった。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、西表島の
マングローブ泥湿地の堆積物から広い溶菌スペクトルを
もつ酵素の生産能を有する菌株を分離し、その菌株の同
定及び培養条件、培養物からの微生物細胞溶解酵素の製
造法、更にこの酵素の性質を鋭意追究した結果、本発明
を完成するに至った。
マングローブ泥湿地の堆積物から広い溶菌スペクトルを
もつ酵素の生産能を有する菌株を分離し、その菌株の同
定及び培養条件、培養物からの微生物細胞溶解酵素の製
造法、更にこの酵素の性質を鋭意追究した結果、本発明
を完成するに至った。
【０００６】本発明の微生物であるストレプトマイセス
sp. 15001株は、以下のような性質を有している。 (ａ) 形態 胞子形成菌糸の分枝法は単純分枝であるが疑似輪生糸を
形成する。形態は直状〜曲状。
sp. 15001株は、以下のような性質を有している。 (ａ) 形態 胞子形成菌糸の分枝法は単純分枝であるが疑似輪生糸を
形成する。形態は直状〜曲状。
【０００７】胞子は10個以上長鎖に連鎖し、表面は平滑
で楕円状、大きさは1.１〜1.３×1.１〜2.２μｍ程度。
鞭毛胞子、胞子のう、菌核、分生子殻、不定型の粘塊は
形成しない。基生菌糸は分裂しない。まれに基生菌糸上
にも胞子着生が認められた。胞子柄は基生菌糸上から着
生しているのが観察されたが、気菌糸上からの着生もあ
るものと考えられた。
で楕円状、大きさは1.１〜1.３×1.１〜2.２μｍ程度。
鞭毛胞子、胞子のう、菌核、分生子殻、不定型の粘塊は
形成しない。基生菌糸は分裂しない。まれに基生菌糸上
にも胞子着生が認められた。胞子柄は基生菌糸上から着
生しているのが観察されたが、気菌糸上からの着生もあ
るものと考えられた。
【０００８】(ｂ) 各培地における生育状態
【０００９】
【表１】
【００１０】(ｃ) 生理的性質
【００１１】
【表２】 (ｄ) 各炭素源の同化性
【００１２】
【表３】
【００１３】(ｅ) 細胞壁 Hasegawaらの開発した簡易法 (J. Gen. Appl. Microbio
l., 29, 319 (1983))により全菌体のジアミノピメリン
酸の有無とその異性体、糖組成の測定を行なったとこ
ろ、細胞壁タイプＩ、全菌体糖タイプ N.C.であった。
(ａ) 〜 (ｅ) の結果から本発明の微生物はバージェイ
ズ・マニュアル・オブ・システマティック・バクテリオ
ロジー 第４版 (1989) によってストレプトマイセス属
に属する株と同定された。
l., 29, 319 (1983))により全菌体のジアミノピメリン
酸の有無とその異性体、糖組成の測定を行なったとこ
ろ、細胞壁タイプＩ、全菌体糖タイプ N.C.であった。
(ａ) 〜 (ｅ) の結果から本発明の微生物はバージェイ
ズ・マニュアル・オブ・システマティック・バクテリオ
ロジー 第４版 (1989) によってストレプトマイセス属
に属する株と同定された。
【００１４】本菌株は、ストレプトマイセスsp.15001株
と命名され、微工研菌寄第 12545号（FERM P-12545）と
して工業技術院微生物工業技術研究所に寄託されてい
る。本発明は、また、ストレプトマイセス属に属し、後
述する酵素化学的性質を有する本発明の微生物細胞溶解
酵素を生産する能力を有する微生物を培地に培養し、該
酵素を生産蓄積せしめ、これを採種することを特徴とす
る微生物細胞溶解酵素の製造方法をも提供するものであ
る。
と命名され、微工研菌寄第 12545号（FERM P-12545）と
して工業技術院微生物工業技術研究所に寄託されてい
る。本発明は、また、ストレプトマイセス属に属し、後
述する酵素化学的性質を有する本発明の微生物細胞溶解
酵素を生産する能力を有する微生物を培地に培養し、該
酵素を生産蓄積せしめ、これを採種することを特徴とす
る微生物細胞溶解酵素の製造方法をも提供するものであ
る。
【００１５】かかる本発明の製造方法に用いられる微生
物としては、例えば前述したストレプトマイセスsp.150
01株が挙げられる。本発明の製造方法においては、通
常、表４に示した海水を含む培地を基本培地とするが、
海水を用いない場合は人工海水を用いてもよい。培地の
pHは６〜７、培養温度は25〜30℃、培養時間は 120〜16
8 時間が望ましい。またあらかじめ約48時間前培養した
ものを接種するのが好ましい。
物としては、例えば前述したストレプトマイセスsp.150
01株が挙げられる。本発明の製造方法においては、通
常、表４に示した海水を含む培地を基本培地とするが、
海水を用いない場合は人工海水を用いてもよい。培地の
pHは６〜７、培養温度は25〜30℃、培養時間は 120〜16
8 時間が望ましい。またあらかじめ約48時間前培養した
ものを接種するのが好ましい。
【００１６】培養液は遠心分離、濾過などにより除菌し
た後、限外濾過あるいは透析により脱塩処理を施し、凍
結乾燥して粗酵素粉末を得た。脱塩処理により溶菌活性
の上昇がみられた。また塩析、イオン交換体による方法
などで適宜精製して用いることも可能である。
た後、限外濾過あるいは透析により脱塩処理を施し、凍
結乾燥して粗酵素粉末を得た。脱塩処理により溶菌活性
の上昇がみられた。また塩析、イオン交換体による方法
などで適宜精製して用いることも可能である。
【００１７】
【表４】基本培地組成 海水 900ml 水道水 100ml ポリペプトン 5ｇ 酵母エキス ３ｇ 溶菌酵素の溶菌活性の測定は、次の方法により行なっ
た。
た。
【００１８】種々の微生物の洗浄菌体に少量の蒸留水を
加えて懸濁し、 100℃で20分加熱し、自己消化酵素を失
活させた後、遠心により熱死細胞を得る。糸状菌は培養
菌体をウルトラ・ディスパーサー (ヤマト Model LK-2
1) にて破砕した後、ホモジナイザー (井内 製) で500
0rpm で細かく磨砕したものに同様の加熱処理をして細
胞壁を得た。
加えて懸濁し、 100℃で20分加熱し、自己消化酵素を失
活させた後、遠心により熱死細胞を得る。糸状菌は培養
菌体をウルトラ・ディスパーサー (ヤマト Model LK-2
1) にて破砕した後、ホモジナイザー (井内 製) で500
0rpm で細かく磨砕したものに同様の加熱処理をして細
胞壁を得た。
【００１９】以上により調製した微生物を50mMトリス塩
酸緩衝液(pH8.５) 1.０mlに懸濁させ、この基質細胞懸
濁液に粗酵素液0.５ml、同緩衝液1.５mlを加え40℃で反
応させ、濁度の減少を570nmで測定した。初発 (対照)
の570nmにおける吸光度は0.６〜0.65とした。被試験菌
細胞もしくは細胞壁懸濁液の初発濁度を30分間で１％減
少させる活性を１単位とした。
酸緩衝液(pH8.５) 1.０mlに懸濁させ、この基質細胞懸
濁液に粗酵素液0.５ml、同緩衝液1.５mlを加え40℃で反
応させ、濁度の減少を570nmで測定した。初発 (対照)
の570nmにおける吸光度は0.６〜0.65とした。被試験菌
細胞もしくは細胞壁懸濁液の初発濁度を30分間で１％減
少させる活性を１単位とした。
【００２０】本菌株が産生する粗酵素の性質は基質とし
てサッカロミセス・セレビシアエ (IFO 0203) を用いて
調べたところ、次のようになった。 １) 基質特異性：本酵素はプロテアーゼ活性、β−１,
３−グルカナーゼ活性、キチナーゼ活性、β−Ｎ−アセ
チルグルコサミニダーゼ活性、アミラーゼ活性及びセル
ラーゼ活性を有する。 ２) 本酵素の至適pHは８〜９付近である。 ３) 本酵素はpH６〜９で安定である。 ４) 本酵素の至適温度は60℃付近である。 ５) 本酵素は40℃までは安定であるが、70℃、10分の加
熱で完全失活する。 ６) 10mMの塩化カルシウム、塩化マグネシウム、硫酸ナ
トリウムにより阻害をうける。
てサッカロミセス・セレビシアエ (IFO 0203) を用いて
調べたところ、次のようになった。 １) 基質特異性：本酵素はプロテアーゼ活性、β−１,
３−グルカナーゼ活性、キチナーゼ活性、β−Ｎ−アセ
チルグルコサミニダーゼ活性、アミラーゼ活性及びセル
ラーゼ活性を有する。 ２) 本酵素の至適pHは８〜９付近である。 ３) 本酵素はpH６〜９で安定である。 ４) 本酵素の至適温度は60℃付近である。 ５) 本酵素は40℃までは安定であるが、70℃、10分の加
熱で完全失活する。 ６) 10mMの塩化カルシウム、塩化マグネシウム、硫酸ナ
トリウムにより阻害をうける。
【００２１】また、0.１mMのロイペプチン (Ac-L-Leu-L
-Leu-L-Argininal・1/2H2SO4・H2O)、ホスホラミドン
(N-(α-ラムノピラノシルオキシ-ヒドロキシホスフェニ
ル)-L-Leu-L-Trp・2Na・2H2O)、アンチパイン (［(S)-1
-カルボキシ-2-フェニルエチル］カルバモイル-L-Arg-L
-Val-Argiminal) 、E-64 (［L-3-トランス-カ ルボキ
シオキシラン-2-カルボニル］-L-Leu-アグマチン・1/2H
2O) 等のプロテ アーゼ阻害剤によっても阻害をうけ
る。 ７) 本酵素は、還元剤である１mM Ｌ−システインに対
して比較的安定であり、１mM ２−メルカプトエタノー
ルに対して安定である。
-Leu-L-Argininal・1/2H2SO4・H2O)、ホスホラミドン
(N-(α-ラムノピラノシルオキシ-ヒドロキシホスフェニ
ル)-L-Leu-L-Trp・2Na・2H2O)、アンチパイン (［(S)-1
-カルボキシ-2-フェニルエチル］カルバモイル-L-Arg-L
-Val-Argiminal) 、E-64 (［L-3-トランス-カ ルボキ
シオキシラン-2-カルボニル］-L-Leu-アグマチン・1/2H
2O) 等のプロテ アーゼ阻害剤によっても阻害をうけ
る。 ７) 本酵素は、還元剤である１mM Ｌ−システインに対
して比較的安定であり、１mM ２−メルカプトエタノー
ルに対して安定である。
【００２２】また溶菌スペクトルを調べたところ、酵
母、糸状菌、細菌と広いスペクトルを有し、特に細菌に
対してはグラム陽性-陰性に関わりなく高い溶菌活性を
有していた。
母、糸状菌、細菌と広いスペクトルを有し、特に細菌に
対してはグラム陽性-陰性に関わりなく高い溶菌活性を
有していた。
【００２３】
【実施例】以下、参考例、実施例及び試験例のより本発
明を更に詳細に説明するが、本発明の範囲はこれらに限
定されるものではない。以下において、特に示さない限
り、溶菌活性の基質は前述の方法により調製したサッカ
ロミセス・セレビシエ (IFO 0203) を凍結乾燥粉末とし
て使用した。 参考例１ 培養時間の検討 あらかじめ三角フラスコで30℃、48時間振とう培養した
培養液を、 200mlの三角フラスコに入った50mlの基本培
地（表４に示す培地）に２％接種し、30℃て24〜216時
間振とう培養し、培養液を15000rpmで30分間遠心分離し
た沈澱で菌体の湿重量を、上清を粗酵素液として前述の
方法により溶菌活性を測定した。
明を更に詳細に説明するが、本発明の範囲はこれらに限
定されるものではない。以下において、特に示さない限
り、溶菌活性の基質は前述の方法により調製したサッカ
ロミセス・セレビシエ (IFO 0203) を凍結乾燥粉末とし
て使用した。 参考例１ 培養時間の検討 あらかじめ三角フラスコで30℃、48時間振とう培養した
培養液を、 200mlの三角フラスコに入った50mlの基本培
地（表４に示す培地）に２％接種し、30℃て24〜216時
間振とう培養し、培養液を15000rpmで30分間遠心分離し
た沈澱で菌体の湿重量を、上清を粗酵素液として前述の
方法により溶菌活性を測定した。
【００２４】その結果、菌体の生育量は72〜96時間で最
大を示し、溶菌活性は 120時間以上で最大となった (図
１) 。以降は 120〜144時間で培養した。 参考例２ 培地のpHの検討 基本培地のpHを５〜９としてその他は参考例１と同様に
して培養を行なったところ、pH６〜７で高活性が得られ
ることがわかった (図２) 。 参考例３ 培地の海水濃度の検討 基本培地の海水濃度を０, 25, 50, 90％とし、その他は
参考例１と同様に培養を行なったところ、海水90％以上
で高活性が得られることがわかった (図３) 。以降は海
水濃度90％とした。 参考例４ 培養温度の検討 培養温度を５〜40℃まで変え、その他は参考例１と同様
に培養したところ、25〜30℃で高活性が得られた (図
４) 。以降は30℃で培養を行なった。
大を示し、溶菌活性は 120時間以上で最大となった (図
１) 。以降は 120〜144時間で培養した。 参考例２ 培地のpHの検討 基本培地のpHを５〜９としてその他は参考例１と同様に
して培養を行なったところ、pH６〜７で高活性が得られ
ることがわかった (図２) 。 参考例３ 培地の海水濃度の検討 基本培地の海水濃度を０, 25, 50, 90％とし、その他は
参考例１と同様に培養を行なったところ、海水90％以上
で高活性が得られることがわかった (図３) 。以降は海
水濃度90％とした。 参考例４ 培養温度の検討 培養温度を５〜40℃まで変え、その他は参考例１と同様
に培養したところ、25〜30℃で高活性が得られた (図
４) 。以降は30℃で培養を行なった。
【００２５】
【実施例１】 （１）粗酵素の調製法 ストレプトマイセスsp.15001株を参考例１〜４で決定し
た培養条件 (基本培地pH６〜７, 30℃, 120〜144時間培
養) に基づいて培養した培養液を遠心分離により除菌し
て粗酵素液としたもの (この粗酵素液も本発明の微生物
細胞溶解酵素として使用できる。) を更に透析膜 (三光
純薬製) を用いて脱塩水に対し一晩４℃で透析し、脱塩
処理を行なったところ、溶菌活性は約２倍にまで上昇し
た。また、限外濾過による脱塩処理を行なっても結果は
同様であり、限外濾過後、滅菌濾過し、凍結乾燥粉末と
しても活性は変わらなかった。収率は１Ｌの培養液から
0.４〜0.５ｇであった。以下の実施例では培養液を除
菌、限外濾過により脱塩濃縮後、滅菌濾過し、凍結乾燥
して粉末としたものを本発明粗酵素として以下の試験に
用いた。特に示さない限り、溶菌反応は粗酵素の終濃度
が0.05％(W/V) となるようにして活性を測定した。 （２）本発明粗酵素の溶菌活性の至適pH及びpH安定性 溶菌活性の測定に用いる緩衝液のpHを変え、その他は全
て同様にして活性を測定したところ、本酵素の至適pHは
８〜９付近であった (図５) 。また、pH安定性を調べる
ため、各pHの緩衝液0.５mlに1.８％(W/V) の粗酵素水溶
液を0.25ml加えて23℃で24時間静置した後、それぞれの
粗酵素液を50mMトリス塩酸緩衝液 (pH8.５) で２倍に希
釈し、このうち0.５mlを粗酵素液としてあとは同様にし
て溶菌活性を測定したところ、本酵素はpH６〜９で安定
であった (図６) 。なお、ここで使用した緩衝液は、50
mMの酢酸緩衝液 (pH４〜６) 、リン酸緩衝液 (pH６〜
７)、トリス塩酸緩衝液 (pH７〜9.５) 、グリシン−水
酸化ナトリウム緩衝液 (pH９〜13) である。 （３）本発明粗酵素の溶菌活性の至適温度及び熱安定性 前述の溶菌反応 (pH8.５) を30℃〜80℃の各温度で行な
い、活性を測定したところ、至適温度は60℃付近であっ
た (図７) 。また、トリス塩酸緩衝液 (pH8.５) に溶解
させた粗酵素溶液を30〜80℃の各温度で10, 30分間それ
ぞれ処理した後、溶菌活性を前述の方法で測定したとこ
ろ、40℃までは安定であるが70℃、10分の処理で失活し
た (図８) 。 （４）本発明粗酵素の溶菌活性への金属塩、プロテアー
ゼ阻害剤及び還元剤の影響 溶菌反応液中に金属塩、プロテアーゼ阻害剤及び還元剤
を添加し活性を測定した結果を表５に示す。
た培養条件 (基本培地pH６〜７, 30℃, 120〜144時間培
養) に基づいて培養した培養液を遠心分離により除菌し
て粗酵素液としたもの (この粗酵素液も本発明の微生物
細胞溶解酵素として使用できる。) を更に透析膜 (三光
純薬製) を用いて脱塩水に対し一晩４℃で透析し、脱塩
処理を行なったところ、溶菌活性は約２倍にまで上昇し
た。また、限外濾過による脱塩処理を行なっても結果は
同様であり、限外濾過後、滅菌濾過し、凍結乾燥粉末と
しても活性は変わらなかった。収率は１Ｌの培養液から
0.４〜0.５ｇであった。以下の実施例では培養液を除
菌、限外濾過により脱塩濃縮後、滅菌濾過し、凍結乾燥
して粉末としたものを本発明粗酵素として以下の試験に
用いた。特に示さない限り、溶菌反応は粗酵素の終濃度
が0.05％(W/V) となるようにして活性を測定した。 （２）本発明粗酵素の溶菌活性の至適pH及びpH安定性 溶菌活性の測定に用いる緩衝液のpHを変え、その他は全
て同様にして活性を測定したところ、本酵素の至適pHは
８〜９付近であった (図５) 。また、pH安定性を調べる
ため、各pHの緩衝液0.５mlに1.８％(W/V) の粗酵素水溶
液を0.25ml加えて23℃で24時間静置した後、それぞれの
粗酵素液を50mMトリス塩酸緩衝液 (pH8.５) で２倍に希
釈し、このうち0.５mlを粗酵素液としてあとは同様にし
て溶菌活性を測定したところ、本酵素はpH６〜９で安定
であった (図６) 。なお、ここで使用した緩衝液は、50
mMの酢酸緩衝液 (pH４〜６) 、リン酸緩衝液 (pH６〜
７)、トリス塩酸緩衝液 (pH７〜9.５) 、グリシン−水
酸化ナトリウム緩衝液 (pH９〜13) である。 （３）本発明粗酵素の溶菌活性の至適温度及び熱安定性 前述の溶菌反応 (pH8.５) を30℃〜80℃の各温度で行な
い、活性を測定したところ、至適温度は60℃付近であっ
た (図７) 。また、トリス塩酸緩衝液 (pH8.５) に溶解
させた粗酵素溶液を30〜80℃の各温度で10, 30分間それ
ぞれ処理した後、溶菌活性を前述の方法で測定したとこ
ろ、40℃までは安定であるが70℃、10分の処理で失活し
た (図８) 。 （４）本発明粗酵素の溶菌活性への金属塩、プロテアー
ゼ阻害剤及び還元剤の影響 溶菌反応液中に金属塩、プロテアーゼ阻害剤及び還元剤
を添加し活性を測定した結果を表５に示す。
【００２６】この結果、本酵素の溶菌活性はカルシウ
ム、マグネシウム、ナトリウム、各種プロテアーゼ阻害
剤により阻害をうけるが、還元剤であるＬ-システイン
に対して比較的安定であり、2-メルカプトエタノールに
対して安定である。
ム、マグネシウム、ナトリウム、各種プロテアーゼ阻害
剤により阻害をうけるが、還元剤であるＬ-システイン
に対して比較的安定であり、2-メルカプトエタノールに
対して安定である。
【００２７】
【表５】
【００２８】（５）本発明粗酵素の基質特異性 溶菌反応のメカニズムを解明するため、種々の活性測定
を行なったところ、表６に示すように本酵素はプロテア
ーゼ、β−１, ３−グルカナーゼ、キチナーゼ、β−Ｎ
−アセチルグルコサミニダーゼ、アミラーゼ、セルラー
ゼの各種活性を有していた。
を行なったところ、表６に示すように本酵素はプロテア
ーゼ、β−１, ３−グルカナーゼ、キチナーゼ、β−Ｎ
−アセチルグルコサミニダーゼ、アミラーゼ、セルラー
ゼの各種活性を有していた。
【００２９】なお、各種活性の測定法は次の通りであ
る。 プロテアーゼ活性 １％カゼイン溶液 (0.１Ｍリン酸緩衝液pH７) １mlに0.
１％粗酵素液１mlを加え35℃で反応させ、一定時間後５
％トリクロロ酢酸溶液３mlを加えて反応を停止させた。
30分〜１時間静置後、遠心分離して上清の280nm におけ
る吸光度を測定した。基質と停止液を混合した後、酵素
液を加えたものを対照とし、検量線はＬ−チロシン溶液
を用いた。１分間に１μg のＬ−チロシン相当量を遊離
する活性を１単位 (Ｕ) とした。 β−１, ３−グルカナーゼ活性 1.６％ラミナリン溶液0.25ml、50mMトリス塩酸緩衝液0.
５ml、0.８％粗酵素液0.25mlからなる反応液を35℃で30
〜60分反応させた後、 100℃、５分の加熱により反応を
停止させ、ソモギ−ネルソン法により還元糖の定量を行
なった。検量線はグルコースを用いて作成し、１分間に
１μg のグルコース相当量を遊離する活性を１単位
(Ｕ) とした。 アミラーゼ (α−グルカナーゼ) 活性 1.６％可溶性デンプン溶液を基質として用い、あとは
と同様にして活性を測定した。 セルラーゼ活性 1.６％カルボキシメチルセルロース (ＣＭＣ) 溶液を基
質とし、あとはと同様にして活性を測定した。 キチナーゼ活性 0.２％エチレングリコールキチン溶液を基質とし、と
同様に反応及び反応停止を行った後、0.５Ｍ炭酸ナトリ
ウム溶液に溶解した1.37mMフェリシアン化カリウム溶液
を２ml加えて15分間 100℃に加熱して還元反応させた
後、420nmにおける吸光度を測定し、対照との差を求め
た。検量線はＮ−アセチルグルコサミンを用いて作成
し、１分間に１μg のＮ−アセチルグルコサミン相当量
を遊離する活性を１単位 (Ｕ) とした。 β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ活性 0.25％ｐ−ニトロフェニル−２−アセトアミド−２−デ
オキシ−β−Ｄ−グルコピラノシド0.５ml、50mMトリス
塩酸緩衝液 (pH７) 2.５ml、0.２％粗酵素液１mlからな
る反応液を35℃で90分間反応させ、飽和炭酸カリウム溶
液１mlを加えて反応を停止させた後、 420nmにおける吸
光度を測定した。１分間に 420nmにおける吸収値が0.01
増加する活性を１単位 (Ｕ) とした。
る。 プロテアーゼ活性 １％カゼイン溶液 (0.１Ｍリン酸緩衝液pH７) １mlに0.
１％粗酵素液１mlを加え35℃で反応させ、一定時間後５
％トリクロロ酢酸溶液３mlを加えて反応を停止させた。
30分〜１時間静置後、遠心分離して上清の280nm におけ
る吸光度を測定した。基質と停止液を混合した後、酵素
液を加えたものを対照とし、検量線はＬ−チロシン溶液
を用いた。１分間に１μg のＬ−チロシン相当量を遊離
する活性を１単位 (Ｕ) とした。 β−１, ３−グルカナーゼ活性 1.６％ラミナリン溶液0.25ml、50mMトリス塩酸緩衝液0.
５ml、0.８％粗酵素液0.25mlからなる反応液を35℃で30
〜60分反応させた後、 100℃、５分の加熱により反応を
停止させ、ソモギ−ネルソン法により還元糖の定量を行
なった。検量線はグルコースを用いて作成し、１分間に
１μg のグルコース相当量を遊離する活性を１単位
(Ｕ) とした。 アミラーゼ (α−グルカナーゼ) 活性 1.６％可溶性デンプン溶液を基質として用い、あとは
と同様にして活性を測定した。 セルラーゼ活性 1.６％カルボキシメチルセルロース (ＣＭＣ) 溶液を基
質とし、あとはと同様にして活性を測定した。 キチナーゼ活性 0.２％エチレングリコールキチン溶液を基質とし、と
同様に反応及び反応停止を行った後、0.５Ｍ炭酸ナトリ
ウム溶液に溶解した1.37mMフェリシアン化カリウム溶液
を２ml加えて15分間 100℃に加熱して還元反応させた
後、420nmにおける吸光度を測定し、対照との差を求め
た。検量線はＮ−アセチルグルコサミンを用いて作成
し、１分間に１μg のＮ−アセチルグルコサミン相当量
を遊離する活性を１単位 (Ｕ) とした。 β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ活性 0.25％ｐ−ニトロフェニル−２−アセトアミド−２−デ
オキシ−β−Ｄ−グルコピラノシド0.５ml、50mMトリス
塩酸緩衝液 (pH７) 2.５ml、0.２％粗酵素液１mlからな
る反応液を35℃で90分間反応させ、飽和炭酸カリウム溶
液１mlを加えて反応を停止させた後、 420nmにおける吸
光度を測定した。１分間に 420nmにおける吸収値が0.01
増加する活性を１単位 (Ｕ) とした。
【００３０】
【表６】
【００３１】以上の結果から、各種活性が溶菌反応に複
合的に作用していることが示唆される。このことで本酵
素が広い溶菌スペクトルを有することが理解できる。ま
たプロテアーゼ活性はアルカリ側でより高い活性を示し
た。プロテアーゼ活性が高いことは、実施例８において
溶菌活性がプロテアーゼ阻害剤による阻害をうけるとい
う結果とよく一致している。 （６）本発明の粗酵素の溶菌スペクトル 本発明粗酵素の溶菌スペクトルを市販品７種と比較した
結果を表９に示す。本酵素が市販品に比べて糸状菌、酵
母、細菌のいずれにも広い溶菌スペクトルを有し、特に
細菌に対してはグラム陰性、陽性を問わず強い活性が認
められた。
合的に作用していることが示唆される。このことで本酵
素が広い溶菌スペクトルを有することが理解できる。ま
たプロテアーゼ活性はアルカリ側でより高い活性を示し
た。プロテアーゼ活性が高いことは、実施例８において
溶菌活性がプロテアーゼ阻害剤による阻害をうけるとい
う結果とよく一致している。 （６）本発明の粗酵素の溶菌スペクトル 本発明粗酵素の溶菌スペクトルを市販品７種と比較した
結果を表９に示す。本酵素が市販品に比べて糸状菌、酵
母、細菌のいずれにも広い溶菌スペクトルを有し、特に
細菌に対してはグラム陰性、陽性を問わず強い活性が認
められた。
【００３２】基質となる微生物の調製法は次の通りであ
る。酵母としてはロドトルラ・ルブラ (IFO 0001) 、サ
ッカロミセス・セレビシエ(IFO 0203) 、シゾサッカロ
ミセス・ポンベ (IFO 0354) 、ハンセヌラ・アノマラ
(IFO 0568) 、キャンディダ・ユティリス (IFO 0639)
、リポミセス・スターキイ (IFO 0678) 、チゴサッカ
ロミセス・バイリー (IFO0722) を用い、表７に示す培
地で30℃で２〜３日振とう培養した。培養液から集菌
し、滅菌水で数回洗った菌体に少量の蒸留水を加えて懸
濁し、 100℃で20分加熱した後、湿菌体を得た。
る。酵母としてはロドトルラ・ルブラ (IFO 0001) 、サ
ッカロミセス・セレビシエ(IFO 0203) 、シゾサッカロ
ミセス・ポンベ (IFO 0354) 、ハンセヌラ・アノマラ
(IFO 0568) 、キャンディダ・ユティリス (IFO 0639)
、リポミセス・スターキイ (IFO 0678) 、チゴサッカ
ロミセス・バイリー (IFO0722) を用い、表７に示す培
地で30℃で２〜３日振とう培養した。培養液から集菌
し、滅菌水で数回洗った菌体に少量の蒸留水を加えて懸
濁し、 100℃で20分加熱した後、湿菌体を得た。
【００３３】細菌としては、シュードモナス・アエルギ
ノーサ (IFO12689)、ビブリオ・パラハエモリティカ
ス、エシェリキア・コリ (IFO 3301) 、サルモネラ・エ
ンテリティディス、スタフィロコッカス・アウレウス
(ATCC 6538)、バチルス・ズブチリス (IFO 13719)、ミ
クロコッカス・ルテウス (生化学工業(株)製) を用い、
表８に示す培地で30℃で１〜２日振とう培養し、酵母と
同様にして加熱死細胞を得た。 糸状菌としてはアスペ
ルギルス・ニガー (OUT 5198) 、アルペルギルス・ソー
ヤ(IFO 4239) 、ムコール・ムセド (IFO 7684) 、ペニ
シリウム・カゼイコラム (AHU 8114) 、ペニシリウム・
グラブラム(AHU 8288) 、リゾプス オリゼ(IFO 5418)
を用いて、表７に示す培地で30℃で２〜７日振とう培養
した。培養液をウルトラ・ディスパンサー (ヤマト Mod
el LK-21) にかけて菌体を破砕した後、すり合わせ型の
ホモジナイザー (井内 製) で5000rpm で更に磨砕し
た。菌体破砕片を酵母と同様に処理して湿細胞壁を集め
た。
ノーサ (IFO12689)、ビブリオ・パラハエモリティカ
ス、エシェリキア・コリ (IFO 3301) 、サルモネラ・エ
ンテリティディス、スタフィロコッカス・アウレウス
(ATCC 6538)、バチルス・ズブチリス (IFO 13719)、ミ
クロコッカス・ルテウス (生化学工業(株)製) を用い、
表８に示す培地で30℃で１〜２日振とう培養し、酵母と
同様にして加熱死細胞を得た。 糸状菌としてはアスペ
ルギルス・ニガー (OUT 5198) 、アルペルギルス・ソー
ヤ(IFO 4239) 、ムコール・ムセド (IFO 7684) 、ペニ
シリウム・カゼイコラム (AHU 8114) 、ペニシリウム・
グラブラム(AHU 8288) 、リゾプス オリゼ(IFO 5418)
を用いて、表７に示す培地で30℃で２〜７日振とう培養
した。培養液をウルトラ・ディスパンサー (ヤマト Mod
el LK-21) にかけて菌体を破砕した後、すり合わせ型の
ホモジナイザー (井内 製) で5000rpm で更に磨砕し
た。菌体破砕片を酵母と同様に処理して湿細胞壁を集め
た。
【００３４】
【表７】 酵母・糸状菌用培地 ポリペプトン 5ｇ K2HPO4 1ｇ 酵母エキス 3ｇ MgSO4・7H2O 0.3ｇ マルツエキス 3ｇ 水 1000ml グルコース 10ｇ pH7.０
【００３５】
【表８】 細菌用培地 ポリペプトン 5ｇ * 人工海水でもよい 酵母エキス 3ｇ 人工海水組成 *海水 900ml NaCl 30ｇ 水道水 100ml KCl 0.7ｇ pH7.0 MgCl2・6H2O 10.8ｇ MgSO4・7H2O 5.4ｇ CaCl2・2H2O 1ｇ 蒸留水 1000ml 市販品としてはザイモリエイス20Ｔ (生化学工業) 、ノ
ボザイム234(ノボ バイオラブ) 、ファンガーゼＩ(ナ
ガセ生化学工業) 、ウスキザイム (協和化成)、キトサ
ナーゼ (和光純薬) 、キチナーゼ (生化学工業) 、ドリ
セラーゼ (協和発酵) 、セルラーゼ (和光純薬) を用い
た。
ボザイム234(ノボ バイオラブ) 、ファンガーゼＩ(ナ
ガセ生化学工業) 、ウスキザイム (協和化成)、キトサ
ナーゼ (和光純薬) 、キチナーゼ (生化学工業) 、ドリ
セラーゼ (協和発酵) 、セルラーゼ (和光純薬) を用い
た。
【００３６】溶菌活性は前述の方法に基づくが、反応は
35℃で行ない、酵素によりpH条件、濃度は異なるものを
用いた。pH５及び６のものは0.１Ｍ酢酸緩衝液、pH7.５
のものは0.１Ｍリン酸緩衝液、pH8.５のものは0.05Ｍト
リス塩酸緩衝液を用いた。
35℃で行ない、酵素によりpH条件、濃度は異なるものを
用いた。pH５及び６のものは0.１Ｍ酢酸緩衝液、pH7.５
のものは0.１Ｍリン酸緩衝液、pH8.５のものは0.05Ｍト
リス塩酸緩衝液を用いた。
【００３７】
【表９】
【００３８】
【００３９】（７）その他の性質 （１）で培養した培養液上清 (粗酵素液) と、キチン分
解能を有する微生物の培養液上清を併用することによ
り、溶菌活性は約1.５倍に増大した。
解能を有する微生物の培養液上清を併用することによ
り、溶菌活性は約1.５倍に増大した。
【００４０】
【発明の効果】本発明によれば、酵母、糸状菌、細菌と
広い溶菌スペクトルを有し、特に細菌に対して高い溶菌
活性を示す酵素を提供することができ、該酵素は微生物
の細胞壁構造の研究やプロトプラスト化、細胞融合をは
じめとして食品、医薬品、化粧品、洗剤等に広く応用可
能である。
広い溶菌スペクトルを有し、特に細菌に対して高い溶菌
活性を示す酵素を提供することができ、該酵素は微生物
の細胞壁構造の研究やプロトプラスト化、細胞融合をは
じめとして食品、医薬品、化粧品、洗剤等に広く応用可
能である。
【図１】培養時間と培養液上清の溶菌活性に関する図で
ある。
ある。
【図２】培地pHと培養液上清の溶菌活性に関する図であ
る。
る。
【図３】培地中の海水濃度と培養液上清の溶菌活性に関
する図である。
する図である。
【図４】培養温度と培養液上清の溶菌活性に関する図で
ある。
ある。
【図５】本発明粗酵素の溶菌活性に及ぼすpHの影響を示
す図である。
す図である。
【図６】本発明粗酵素の溶菌活性におけるpH安定性を示
す図である。
す図である。
【図７】本発明粗酵素の溶菌活性に及ぼす温度の影響を
示す図である。
示す図である。
【図８】本発明粗酵素の溶菌活性における熱安定性を示
す図である。
す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:465）
Claims (3)
- 【請求項１】 以下の酵素化学的性質を有する微生物細
胞溶解酵素。 基質特異性：カゼインを基質としたプロテアーゼ活性
を有する。ラミナリンを基質としたβ−１, ３−グルカ
ナーゼ活性を有する。エチレングリコールキチンを基質
としたキチナーゼ活性を有する。ｐ−ニトロフェニル−
２−アセトアミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラ
ノシドを基質としたβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダー
ゼ活性を有する。可溶性デンプンを基質としたα−グル
カナーゼ (アミラーゼ) 活性を有する。カルボキシメチ
ルセルロースを基質としたセルラーゼ活性を有する。 至適pH ：８〜９付近 至適温度：60℃付近 安定pH ：６〜９ 安定温度：40℃まで (10分間、pH8.５) 70℃、10分 (pH8.５) で完全失活する。 阻害剤 ：0.１mMロイペプチン、0.１mMホスホラミド
ン、0.１mMアンチパイン、0.１mMＥ−６４、10mM塩化カ
ルシウム、10mM塩化マグネシウム及び10mM硫酸ナトリウ
ムにより阻害されるが、１mMＬ−システインに対して比
較的安定であり、１mM２−メルカプトエタノールに対し
て安定である。 - 【請求項２】 ストレプトマイセス属に属する請求項１
記載の微生物細胞溶解酵素生産菌を培地に培養し、請求
項１記載の微生物細胞溶解酵素を生成蓄積せしめ、これ
を採取することを特徴とする請求項１記載の微生物細胞
溶解酵素の製造方法。 - 【請求項３】 請求項１記載の微生物細胞溶解酵素を生
産する新菌株ストレプトマイセス sp. 15001株。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3258181A JPH0595784A (ja) | 1991-10-04 | 1991-10-04 | 新規微生物細胞溶解酵素、その製造方法及び新規ストレ プトマイセス属微生物 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3258181A JPH0595784A (ja) | 1991-10-04 | 1991-10-04 | 新規微生物細胞溶解酵素、その製造方法及び新規ストレ プトマイセス属微生物 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0595784A true JPH0595784A (ja) | 1993-04-20 |
Family
ID=17316644
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3258181A Pending JPH0595784A (ja) | 1991-10-04 | 1991-10-04 | 新規微生物細胞溶解酵素、その製造方法及び新規ストレ プトマイセス属微生物 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0595784A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1998050512A1 (en) * | 1997-05-06 | 1998-11-12 | The Procter & Gamble Company | Laundry and cleaning compositions containing hexosaminidase enzymes |
-
1991
- 1991-10-04 JP JP3258181A patent/JPH0595784A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1998050512A1 (en) * | 1997-05-06 | 1998-11-12 | The Procter & Gamble Company | Laundry and cleaning compositions containing hexosaminidase enzymes |
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