JPH0595797A - 基本媒体用ペルオキシダーゼ指示薬を用いる分析方法及び分析具 - Google Patents

基本媒体用ペルオキシダーゼ指示薬を用いる分析方法及び分析具

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JPH0595797A
JPH0595797A JP4089261A JP8926192A JPH0595797A JP H0595797 A JPH0595797 A JP H0595797A JP 4089261 A JP4089261 A JP 4089261A JP 8926192 A JP8926192 A JP 8926192A JP H0595797 A JPH0595797 A JP H0595797A
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Marvin A Genshaw
マービン・エー・ゲンシヤー
Michael J Pugia
マイケル・ジエー・プジア
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Abstract

(57)【要約】 【構成】 ペルオキシドを、フェニレンジアミン及びナ
フト−ルと共に、ｐＨ１０〜１４で、検出されるべき過
酸化活性物質を含有する水性媒体に加えて、分析系に検
出可能な色の変化をもたらす、水性試料中の過酸化活性
物質検出のための分析方法及び分析具。加えて、アルカ
リオキシダ−ゼ及びペルオキシダ−ゼを、フェニレンジ
アミン及びナフト−ルと共に、検出されるべきアルカリ
オキシダ−ゼ基質を含有する水性媒体に加えることによ
り、該基質を検出するための分析方法。 【効果】 アスコルビン酸の妨害による疑似的なマイナ
スの分析結果を得ることのない分析具及び方法が得られ
る。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、試料中の過酸化活性物
質の存在又は濃度を検出するための組成物、分析具及び
方法に関する。より詳細には、本発明は、尿のような液
体試料中の過酸化活性物質、たとえば潜血を、還元妨害
性指示薬組成物を用いて分析する、新規な、かつ改良さ
れた方法に関する。この指示薬組成物は、乾式又は湿式
分析において、過酸化活性物質を含有する試料と接触さ
せた場合に検出可能な又は測定可能な応答をする。
【０００２】
【従来の技術】ペルオキシダーゼは、過酸化物によるフ
ェノール及びアミンのような種々の化合物の酸化を触媒
する酵素である。さらに、特定の化合物はペルオキシダ
ーゼ酵素と同様に作用することから、プソイドペルオキ
シダーゼと名付けられて来た。プソイドペルオキシダー
ゼは、ヒドロペルオキシドから酸素を放出させて電子を
電子供与種から受け取ることのできる酸化物を生成す
る。したがって、プソイドペルオキシダーゼは、それら
がペルオキシドと可酸化性化合物との間との反応を触媒
したり又はそれに関与するという点で酵素に似ている。
プソイドペルオキシダーゼには、ヘモグロビン及びその
誘導体も含まれ、過酸化活性物質とも呼ばれる。例え
ば、ヘモグロビンのような過酸化活性物質及びその誘導
体は、ヒドロペルオキシド及び可酸化性染料との間の反
応を触媒する。そのような反応において、過酸化活性物
質はペルオキシダーゼ酵素に似ており、可酸化性染料と
ペルオキシドとの間の相互作用を触媒するか又はそれに
関与する。ペルオキシドから過酸化活性物質に移動した
酸素は、可酸化性染料から電子を受け取ることが可能な
酸化物を生成する。その結果、反応は色の変化のような
検出可能な応答を提供し、その場合、応答の強さが過酸
化活性物質の存在又は濃度の指標となる。
【０００３】過酸化活性物質の分析は上述の色原体相互
作用に基づいており、指示薬染料の色の変化の度合い及
び強度は試料中の過酸化活性物質の濃度に関係してい
る。過酸化活性物質の分析は、尿，糞便又は胃腸の内容
物のような体液試料中のしばしば「潜血」と呼ばれる低
濃度の血液を検出及び測定するのに特に有用である。肉
眼では確認できない潜血の検出は、胃、腸及び尿路の出
血の診断に重要である。出血は、その器官に例えば腫
瘍，癌又は炎症があることによりひきおこされる。現
在、試料中の潜血の存在を検知する多くの方法は、ヘモ
グロビンのプソイドペルオキシダーゼ活性に基づくもの
である。
【０００４】筋組織の赤い呼吸色素であるミオグロビン
も、また別の過酸化活性物質である。ミオグロビンは、
その構成及び化学反応において極めてヘモグロビンと類
似している。ミオグロビンは筋細胞からある種の損傷を
した場合に遊離され、そのような場合、ミオグロビンは
血漿中に入って全身を循環し、尿に排泄される。さら
に、ある種の遺伝的な筋障害では筋からミオグロビンが
失なわれ、続いて尿中に現われる。ミオグロビンはまた
心筋梗塞の後にも尿中に検出される。他の過酸化活性物
質は、白血球及び細菌中にも存在し、一般に、この過酸
化活性物質の検出は腎臓及び尿路の疾患及び感染症の診
断に特に重要である。したがって、尿及び他の試料中の
過酸化活性物質に関する正確で完全な分析が検査室及び
家庭用において得られなければならない。これらの分析
においては、この過酸化活性物質の検出及び測定を可能
にしなければならず、それによって正しい診断が下され
正しい医療が実施され、監視されかつ継続されねばなら
ない。
【０００５】この過酸化活性物質の分析方法が、尿又は
他の試料中の過酸化活性物質の迅速で経済的かつ正確な
測定のための湿式分析及び乾式試薬片の両方に適してい
ることは有利である。浸漬−読み取り式乾式試験片を基
本とする方法は、容易に自動化できかつ再現可能で正確
な結果を提供するので、特に有用であることが証明され
た。過酸化活性物質の分析に用いられるいくつかの試験
片は、ベンチジン染料のような指示色原体；ヒドロペル
オキシド；及び緩衝剤を含む指示薬組成物で含浸された
好適なキャリアマトリックスの小さな正方形のパッドか
らなる単一のテスト域を有している。尿中の過酸化活性
物質の分析は、比色試験片を、良く撹拌した、遠心分離
していない尿試料に浸し、次いでこの試験片のテスト域
に現われた色を、テストストリップ保持器中に備えてい
る標準化したカラーチャートと比較することにより実施
される。このような潜血検査は、尿路の出血状態をその
進行の初期から検知することが重要であることから、通
常の身体検査のときに尿試料を検査する多項目分析用試
薬片中に含まれる。
【０００６】上述の過酸化活性物質試験はアスコルビン
酸の存在によって複雑になっている。というのはこのイ
オンが、酸化された指示薬に電子を移動させうる強い還
元剤であって誤った負の結果を与えるからである。指示
薬組成物中にある種の金属イオン錯体、たとえばＦｅ−
ＨＥＤＴＡなどを含むと実質的にアルコルビン酸の妨害
を取り除くことができるが、金属イオン錯体はまた、ペ
ルオキシダーゼ活性を示すので、それによりある条件下
では、ペルオキシドと可酸化性染料との間の色形成反応
を触媒して、金属イオン錯体に媒介された、さらなる染
料の酸化に起因する誤った正の、又は誤って高い分析値
を示すこともある。
【０００７】先行技術には、液体中の過酸化活性物質を
分析する場合に用いることのできる乾式及び湿式化学に
関する多くの参考例が知られている。例えば、酸性媒体
中での過酸化活性物質の湿式化学分析は、R. M. Henry
らのClinical Chemistry Principles and Techniques第
２刷，Harper&Row社，1124〜1125頁(1974)に見られる。
この湿式分析の方法は、緩衝剤として氷酢酸を、指示染
料としてジフェニルアミンを及び過酸化水素を用いてい
る。過酸化活性物質を分析する好ましい方法においては
乾式試験片を採用している。これは、試験片方式が連続
的に試薬を調製しないで済み、またそれに伴なう分析具
も不要であって、使いやすいからである。
【０００８】米国特許第４５８７２２０号明細書におい
ては、過酸化活性物質の分析においてアスコルビン酸及
びアスコルビン酸イオンの妨害を取り除く為に、キレー
トを形成した第二鉄イオンを用いることが開示されてい
る。この方法は、まず、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）
エチレンジアミン三酢酸の第二鉄キレートのような第二
鉄キレートを、試験具のキャリアマトリックスに含浸さ
せることにより達成される。次いで、乾燥の後、指示染
料をこのキャリアマトリックスに含浸させる。この二段
階試験具の製造方法により、保管期間内に誤まった正の
分析結果を与えることなく十分な安定性を示し、アスコ
ルビン酸により妨害されない試験片を提供する。
【０００９】ヤマモトらは、Int. J. Biol. Macromol.4
(1982)116 〜120 頁に、高いｐＨ域において自動酸化に
よってアスコルビン酸濃度を減少させることについて述
べている。
【００１０】ヨーロッパ特許出願第０２５３５４８号公
報には、水と混和する非極性溶媒、水、キレート剤、安
定剤、有機ペルオキシド及びテトラメチレンベンチジン
誘導体又はテトラメチル−ｐ−フェニレンジアミンのよ
うな指示薬により、好ましいｐＨ域１０〜１１において
潜血を測定する液体組成物を記載している。
【００１１】本発明では、ｐＨ１０〜１４（好ましくは
１２〜１４）で作用する組み合わせ指示薬系を採用する
ことによって、アスコルビン酸の自動酸化及び／又は金
属によって触媒される酸化が速い速度で起き、それによ
りアスコルビン酸の妨害を減少させるのに役立ってい
る。
【００１２】係属中の米国出願第４６８，６６５号にお
いては、Ｍｎイオンのキレート化のためのポルフィリン
と酸素により酸化されたとき検出可能な反応を提供する
酸化還元指示薬の使用からなるマンガンの分析を開示し
ている。好適な酸化還元指示薬は、フェニレンジアミン
を顕色剤(developer) として、ナフトールをカプラーと
して含む。ペルオキシドはこの分析には含まず、分析さ
れる血液試料中でのペルオキシダーゼに起因する潜在的
妨害を減じて分析される。
【００１３】
【課題を解決するための手段】本発明は、試料を、ペル
オキシド及びフェニレンジアミンとナフトールからなる
試薬組成物と、ｐＨ１０〜１４で接触させることにより
試料中の過酸化活性物質を分析する方法であり、このフ
ェニレンジアミンとナフトールは分析の条件の下で、ペ
ルオキシドと接触することにより活性化された過酸化活
性物質から電子が移動することにより結合して色原体を
形成する。
【００１４】ペルオキシド、フェニレンジアミン、ナフ
トール及び水性試料と接触させた際にこの試薬をｐＨ１
０〜１４に保つのに好適な緩衝剤からなる試薬系も、本
発明の範囲内に含まれる。
【００１５】この試薬系は、例えば、ろ紙のような吸水
性材料又はポリマー材の細片、層もしくは膜のような非
吸水性材料あるいはそれらの組み合わせた好適なキャリ
アマトリックスに組み込ませてもよい。
【００１６】市販される有用な潜血検査のための尿分析
分析具は、安定で、感度が良く、かつ、アスコルビン酸
の妨害に対して抵抗性がなければならない。本発明の方
法及び分析具は、尿のような液体中の低濃度の過酸化活
性物質を正確に分析しうるものである。本方法及び分析
具に用いられる分析用組成物は、安定でアスコルビン酸
の妨害に抵抗し、試料中の過酸化活性物質の濃度のみに
応答して色の変化を示し、それにより高感度で、かつ信
頼できる分析法を提供する。
【００１７】さらに、本発明の方法及び分析具は、血漿
又は血清，糞便及び胃腸の内容物並びに多くの他の生物
学的液体及び半固体中の過酸化活性物質の存在あるいは
定量的濃度を測定するのに用いることができる。
【００１８】本発明において有用な色原体指示薬は、顕
色剤としてのフェニレンジアミン及びカプラーとしての
ナフトールを含んでいる。一般に、顕色剤は次式のフェ
ニレンジアミン類から選択される。
【００１９】
【化１３】 （式中、−ＮＲ2 は２又は４位にある）
【００２０】
【化１４】 （式中、−ＮＲ2 は４，４´；４，２；２，２´又は
５，５´位にある）
【００２１】
【化１５】 （式中、−ＮＲ2 は１，２；１，４；１，５；１，７；
１，８；２，３；２，６又は２，８にある）
【００２２】式I 〜III のフェニレンジアミンにおいて
ＲはＨ、ＣＨ3 、ＣＨ2 ＣＨ3 、ＣＨ2 ＣＨ2 ＯＨ、Ｃ
6 Ｈ5 又はＣＨ2 ＣＨ2 ＣＨ3 であるか、あるいはそれ
らの組み合わせであり；式中の芳香環は０〜５個のＸ基
により置換されており、Ｘは独立してＨ、Ｃｌ、Ｂｒ、
Ｉ、Ｆ、ＣＮ、ＮＯ2 、ＣＨ3 、ＣＨ2 ＣＨ3 、ＣＨ2
ＣＨ2 ＣＨ3 、ＯＣＨ3 、ＯＣＨ2 ＣＨ3 又はＣ6 Ｈ5
であるか、あるいはそれらのいかなる組み合わせで置換
されていてもよい。
【００２３】本発明に好適な式Ｉ，II及びIII の構造の
フェニレンジアミン類は、
【００２４】構造Ｉのビス−ヒドロキシエチル−１，４
−フェニレンジアミン；１，２−フェニレンジアミン；
１，４−フェニレンジアミン ヒドロクロリド；３−ニ
トロ−１，２−フェニレンジアミン；４−ニトロ−１，
２−フェニレンジアミン；４−メトキシ−１，２−フェ
ニレンジアミン；２−クロロ−１，４−フェニレンジア
ミン スルフェート；２−エトキシ−１，４−フェニレ
ンジアミン；Ｎ，Ｎ−ジメチル−１，４−フェニレンジ
アミン；２，３−ジメチル−１，４−フェニレンジアミ
ン；４，５−ジメチル−１，２−フェニレンジアミン；
Ｎ，Ｎ−ジエチル−１，４−フェニレンジアミン ジヒ
ドロクロリド；Ｎ−フェニル−１，４−フェニレンジア
ミン；Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラメチル−１，４−フ
ェニレンジアミン；Ｎ−メチル−Ｎ′−ヒドロキシエチ
ル−１，４−フェニレンジアミン；及び２，３，５，６
−テトラメチル−１，４−フェニレンジアミンであり、
【００２５】構造IIの３，３′，５，５′−テトラメチ
ル−ベンチジン；２，２′−ジメチル−ビフェニル−
４，４′−ジアミン；３，３′−ジアミノビフェニル
テトラヒドロクロリド；及びＮ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テト
ラメチル−ビフェニル−４，４′−ジアミンであり、
【００２６】構造III のＮ，Ｎ−ジメチル−１，４−ナ
フチルジアミン；１，４−ナフチルジアミン；１，５−
ジアミノナフタレン；１，８−ジアミノナフタレン；
２，３−ジアミノナフタレン；５−クロロ−１，４−ナ
フチルジアミン及び１−エトキシ−２，３−ジアミノナ
フタレンである。
【００２７】カプラーは、式
【化１６】
【００２８】（式中、ＹはＣＨ、Ｓ、Ｏ又はＮであっ
て、芳香環内の特定の位置に限られるわけではないが、
好ましくは芳香環を結合している炭素原子に対しオルト
又はメタのいずれかの位置にある。また、芳香環は０〜
７個のＸ基により置換されており、ＸはＨ、Ｃｌ、Ｂ
ｒ、Ｉ、Ｆ、ＣＮ、ＮＯ2 、ＣＨ3 、ＣＨ2 ＣＨ3 、Ｃ
Ｈ2 ＣＨ2 ＣＨ3 、ＯＣＨ3 、ＯＣＨ2 ＣＨ3 、ＳＯ3
Ｈ、ＣＯ2 Ｈ、ＰＯ3 Ｈ又はＣ6 Ｈ5 であるか、あるい
はそれらのいかなる組み合わせで置換されていてもよ
い。）で示されるナフトールである。
【００２９】本発明で用いられる好適なナフトールは２
−メトキシ−１−ナフトール；２−メチル−１−ナフト
ール；１−ナフトール；２−ナフトール；４−クロロ−
１−ナフトール；１−ブロモ−２−ナフトール；６−ブ
ロモ−２−ナフトール；１，６−ジブロモ−２−ナフト
ール；２，４−ジクロロ−１−ナフトール；６−メチル
−２−ナフトール；１−メトキシ−２−ナフトール；２
−フェニル−１−ナフトール；１−ヒドロキシキノリ
ン；５−ヒドロキシキノリン；３−ヒドロキシ−１−メ
チル−キノリン；６−ヒドロキシキノリン；２−ヒドロ
キシキノリン，８−ヒドロキシキノリン−５−スルホン
酸；１−ナフトール−４−カルボン酸；８−ヒドロキシ
−５−ニトロキノリン；５−クロロ−８−ヒドロキシキ
ノリン及び４−エチル−１−ナフトールである。
【００３０】指示薬組成物中のフェニレンジアミン顕色
剤の濃度は、通常約１mMから約１００mM、好ましくは１
０〜５０mMであって、ナフトールカプラーの濃度は約１
mM〜１００mM、好ましくは１０〜５０mMである。好適な
キャリアマトリックスに含浸した場合には、顕色剤及び
カプラーは通常１００〜１０，０００mg/m2 の量で存在
する。好ましい濃度域は１，０００〜５，０００mg/m2
である。
【００３１】フェニレンジアミン顕色剤及びナフトール
カプラーに加えて、この指示薬組成物はまた、過酸化活
性物質と接触した場合に遊離酸素を放出できるヒドロペ
ルオキシドもまた含んでいる。試料中に存在する過酸化
活性物質はヒドロペルオキシドからの遊離酸素の放出を
触媒して、この遊離酸素を指示染料に移動させ、それに
より顕色剤／カプラーの結合により色の変化を開始させ
る。好適なヒドロペルオキシドは、遊離酸素が過酸化活
性物質の存在しないときには放出されないほどに十分安
定であるべきであり、貯蔵時にあるいは乾式試験片のキ
ャリアマトリックスに含浸させた後に、指示薬組成物か
ら気化又は昇華しないように十分に低い蒸気圧を有して
いるべきである。さらに、この指示薬組成物が尿中潜血
の分析に用いられる場合には、このヒドロペルオキシド
は試料中１０００万分の１部のヘモグロビンをも検出す
る十分な感受性を示さなければならない。好適なヒドロ
ペルオキシドは、クメンヒドロペルオキシド、ｔ−ブチ
ルヒドロペルオキシド、ジイソプロピルベンゼンヒドロ
ペルオキシド、１−ヒドロキシシクロヘキサン−１−ヒ
ドロペルオキシド、２，５−ジメチルヘキサン−２，５
−ジヒドロペルオキシド、パラメタンヒドロペルオキシ
ド、１，４−ジイソプロピルモノヒドロペルオキシド、
ｐ−ｔ−ブチルイソプロピルベンゼンヒドロペルオキシ
ド、２−（α−ヒドロペルオキシイソプロピル）−６−
イソプロピルナフタレン、テトラリンヒドロペルオキシ
ド及びそれらの組み合わせである。尿中潜血の分析にお
いては、その安定性、感受性及び不揮発性のゆえに、
１，４−ジイソプロピルベンゼンジヒドロペルオキシド
（ＤＢＤＨ）が好ましいヒドロペルオキシドである。
【００３２】指示薬組成物中のヒドロペルオキシドの濃
度は通常約１mM〜約１００mMの範囲であり、マトリック
ス中では１００〜１０，０００mg/m2 である。好ましい
濃度範囲は２５〜７５mM及び２，５００〜７，５００mg
/m2 である。特定のヒドロペルオキシドの組成物中の量
は、その特定のヒドロペルオキシドの物理的、化学的性
質、例えば安定性及び分析される過酸化活性物質に対す
る感受性に影響する。
【００３３】本発明は、何ら特定の反応機構により限定
されるものではないが、過酸化活性物質が、ヒドロペル
オキシドによる酸化によって活性化されてフェニレンジ
アミン基質を酸化することのできる種類となり、この基
質は順番にナフトールカプリング剤と結合して色原体を
形成すると信じられている。この色の変化を分光測光学
的に目に見える形で検出又は定量できる。
【００３４】この方法は、ｐＨ域が約１０〜約１４ま
で、好ましくはｐＨ１２〜１４において特に効果的であ
る。湿式でこの分析を０．１N ＮａＯＨ溶液中で行うこ
とにより、好適なｐＨが達成される。この分析系を乾式
試薬片組成物中で用いる時は、ｐＨを所望の範囲に保つ
ために緩衝液を加える。好適な緩衝液群は、グリシン、
Ｎ，Ｎ′−ビス（３−スルホプロピル）エチレンジアミ
ン、３−アミノプロパンスルホン酸、炭酸塩、ピペリジ
ン、リン酸塩、アスパラギン酸、アラニン、３−シクロ
ヘキシルアミノプロパンスルホン酸、トリエチルアミン
のようなアルキルアミン類、グアニジン及びクレアチニ
ンのようなグアニジン誘導体ならびにフェノールを含
む。
【００３５】本発明の分析系はまた、アルカリオキシダ
ーゼ類と共に用いることにも適している。そのような酵
素系は、アミノ酸オキシダーゼ、ガラクトースオキシダ
ーゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、血漿アミンオキシ
ダーゼ、１−トリプトファンペルオキシダーゼ、ウリカ
ーゼ及びキサンチンオキシダーゼを含む。例えばウリカ
ーゼ活性は、本分析法を用いて、尿酸基質がウリカーゼ
が作用しうる状態で存在する場合に測定可能である。逆
に、尿酸はウリカーゼ酵素が存在する場合に測定され
る。このようにして、例えば基質及びアルカリオキシダ
ーゼの存在下で過酸化水素が発生し（反応１）、そして
過酸化水素がペルオキシダーゼ及び結合した指示薬系を
用いて検出される（反応２）。
【００３６】
【化１７】
【００３７】基質、基本媒体中で活性なアルカリオキシ
ダーゼ及びそれらが産生する物質を次に例示した。
【００３８】 基 質 アルカリオキシダーゼ 生 成 物 Ｄ−アラニン Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ ピルビン酸塩 ガラクトース ガラクトースオキシダーゼ ガラクトン酸 Ｌ−チロシン ポリフェニルオキシダーゼ ピルビン酸−４− ヒドロキシフェニル プトレッシン 血漿アミンオキシダーゼ １−ジアミン−４− ブタンアルデヒド Ｌ−トリプトファン １−トリプトファンペル インドール オキシダーゼ 尿酸 ウリカーゼ アラントイン キサンチン キサンチンオキシダーゼ 尿酸
【００３９】
【実施例】本発明を実施する方法を、さらに次の実施例
により説明するが、その際、最大吸収が起きる波長は、
それぞれの指示薬／溶媒系毎に選択した。
【００４０】実施例１ 次の溶液を調製した。 １．ビス−ヒドロキシエチル−１，４−フェニレンジア
ミン１５．６mg／水１０mlの溶液（５mM） ２．２−メチル−１−ナフトール７．９mg／３Ａ級アル
コール１０mlの溶液（５mM）、ｐＨ１０，１１及び１２
の緩衝液（Chemvelope American Scientific Products)
及び、 ３．０．１M 及び１．０M のＮａＯＨ溶液
【００４１】緩衝液とＮａＯＨ溶液は１％の洗剤［エチ
ルカド１８／２５メチルポリオキシエチレン（１５）オ
クタデシルアンモニウムクロリド］を含んでいた。ヒト
血液を容量の９倍の水で希釈して溶血させて、反応混合
液中のヘモグロビン濃度が０．７g ／リットルになるよ
うにした。酸化剤は３Ａアルコール中に過酸化水素又は
ジイソプロピルベンゼンジヒドロペルオキシドを溶解し
た０．０１M 溶液からなる。対照は、ジヒドロペルオキ
シドを含むアルコールの一部を、“酸化剤”として用い
た。
【００４２】フェニレンジアン１００μl を、ナフトー
ル１００μl ，溶血液５０μl ，酸化剤１００μl 及び
緩衝液又はＮａＯＨ溶液７００μl と混合することによ
り、反応を開始させた。５分後にHewlett Packard 社の
８４５０ダイオード・アレイ分光光度計を用いて６８０
nmにおける吸光度を測定した。三回測定を行い、その平
均値を表１に示した。
【００４３】
【表１】
【００４４】表１より、反応性は、０．１N ＮａＯＨ溶
液の場合に最大であり、かつ過酸化水素又はＤＢＤＨを
用いた場合に非常に大きいことが判明した。反応性（溶
血サンプルの吸光度からブランク値を差し引いたもの）
は、空＜Ｈ2 Ｏ2 ＜ＤＢＤＨの順に大きくなった。
【００４５】実施例２ この系の感受性を調べるために、血液を大巾に希釈し
て、本実験を行った。次の溶液を調製した。 １．ビス−ヒドロキシエチル−１，４−フェニレンジア
ミン１５．６mgを１０mlの水に溶解した溶液（５mM） ２．２−メチル−１−ナフトール７，９mgを、３Ａアル
コール１０mlに溶解した溶液（５mM）及び０．１mM Ｎ
ａＯＨ
【００４６】ヒト血液を９倍の水で希釈して血球を溶血
させた。酸化剤は０．１M の過酸化水素及びＤＢＤＨの
３Ａアルコール溶液からなる。
【００４７】フェニレンジアミン１００μl をナフトー
ル１００μl 、溶血液１０μl 、酸化剤１００μl 及び
ＮａＯＨ溶液７００μl と混合することにより反応を開
始させた。５分後、６８０nmにおける吸光度を測定し、
その結果を表２に示した。ブランクのための各実験の標
準偏差は０．０２吸光度単位である。
【００４８】
【表２】
【００４９】表２のデータから、反応混合物で１００，
０００倍に希釈した血液は、酸化剤である過酸化水素に
より、３０，０００倍に希釈した血液は、酸化剤である
ＤＢＤＨにより検出できることが明らかである。過酸化
水素を用いたときに感受性がより大きいのは、過酸化水
素を用いた場合のブランク値の低さに関係している。
【００５０】実施例３ 公知の指示薬系である、１５６mMのテトラメチルベンチ
ジンのアセトニトリル溶液０．２mlを、緩衝液（１２０
mMマロン酸，ｐＨ５．８）、ＤＢＤＨのアセトニトリル
溶液１．０ml及びヘモグロビンを含む水１．０mlと合し
た。５分後、６６０nmで吸光度を測定した。この実験の
結果を表３に示した。
【００５ｌ】
【表３】
【００５２】表３より、ヘモグロビンへの感受性はｐＨ
５．８においてが非常に良いことが判った。しかし、２
５mg／dlのアスコルビン酸の存在下においては、このテ
スト条件において指示薬系は何らの発色反応をも示さな
かった。０．１N ＮａＯＨの存在下では何らの発色もな
かった。８．４mMのＦｅ−ＨＥＤＴＡの存在により、実
際には含まれていないヘモグロビンの存在が示された。
これは、この技術の状態では指示薬系は基本媒体中では
ペルオキシダーゼを検出できず、かつＦｅ−ＨＥＤＴＡ
（アスコルビン酸の妨害を防ぐために用いられた）が、
テトラメチルベンチジンの酸化により偽似の正の応答を
表すことを示している。
【００５３】実施例４ 本発明の組み合わせ指示薬系を、水２．０ml、０．１N
ＮａＯＨ１．０リットル、ビス（ヒドロキシエチル）−
１，４−フェニレンジアミン水溶液及び２−メチル−１
−ナフトールのアセトニトリル溶液１００μl からなる
溶液を調製して試験した。５分後、５６０nmにおいて吸
光度を測定した。結果を表４に示す。
【００５４】
【表４】
【００５５】本発明の指示薬系は、活性化剤を用いるこ
となしに、実施例３のＴＭＢ系に匹敵するかそれより大
きな感受性でヘモグロビンを検出した。２５mg／dlのア
スコルビン酸塩の存在は、ペルオキシダーゼを検出する
ための系の能力にそれほど大きな影響を与えていない。

Claims (17)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 検出されるべき過酸化活性物質を含有す
    る水性媒体を調製し；その媒体に、ペルオキシドをフェ
    ニレンジアミン及びナフトールと共に加え；分析試験の
    条件の下でそれらが結合して色原体を形成し；それによ
    って分析系に検出可能な色の変化をもたらすことからな
    る、水性試料中の過酸化活性物質を検出するための分析
    方法。
  2. 【請求項２】 水性媒体が、ｐＨ値１０〜１４を有す
    る、請求項１記載の分析方法。
  3. 【請求項３】 過酸化活性物質がヘモグロビンである、
    請求項１記載の分析方法。
  4. 【請求項４】 フェニレンジアミンが次式Ｉ： 【化１】 （式中、−ＮＲ2 は２又は４位にある）、式II； 【化２】 （式中、−ＮＲ2 は４，４′；４，２′；２，２′又は
    ５，５′位にある）又は式III ； 【化３】 （式中、−ＮＲ2 は１，２；１，４；１，５；１，７；
    １，８；２，３；２，６；又は２，８位にある）で示さ
    れることを特徴とし、 その際Ｒ基は独立してＨ、ＣＨ3 、ＣＨ2 ＣＨ3 、ＣＨ
    2 ＣＨ2 ＯＨ、Ｃ6 Ｈ5 又はＣＨ2 ＣＨ2 ＣＨ3 であ
    り、式中の芳香環は０〜５個のＸ基により置換されてお
    り、その際Ｘは独立してＨ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｆ、Ｃ
    Ｎ、ＮＯ2 、ＣＨ3、ＣＨ2 ＣＨ3 、ＣＨ2 ＣＨ2 ＣＨ3
    、ＯＣＨ3、ＯＣＨ2 ＣＨ3 又はＣ6 Ｈ5であり、そし
    てナフトールが、次式： 【化４】 （式中、ＹはＣＨ、Ｓ、Ｏ又はＮであって、芳香環を結
    合している炭素原子に対しオルト又はメタのいずれかの
    位置にあり、そのとき芳香環は各々独立して０〜７個の
    Ｘ基により置換されており、ＸはＨ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、
    Ｆ、ＣＮ、ＮＯ2 、ＣＨ3 、ＣＨ2 ＣＨ3 、ＣＨ2 ＣＨ
    2 ＣＨ3 、ＯＣＨ3 、ＯＣＨ2 ＣＨ3 、ＳＯ3 Ｈ、ＣＯ
    2 Ｈ、ＰＯ3 Ｈ又はＣ6 Ｈ5 である）で示される、請求
    項１記載の分析方法。
  5. 【請求項５】 フェニレンジアミンが、 式Ｉの構造のもの：ビス−ヒドロキシエチル−１，４−
    フェニレンジアミン；１，２−フェニレンジアミン；
    １，４−フェニレンジアミン ヒドロクロリド；３−ニ
    トロ−１，２−フェニレンジアミン；４−ニトロ−１，
    ２−フェニレンジアミン；４−メトキシ−１，２−フェ
    ニレンジアミン；２−クロロ−１，４−フェニレンジア
    ミン スルフェート；２−エトキシ−１，４−フェニレ
    ンジアミン；Ｎ，Ｎ−ジメチル−１，４−フェニレンジ
    アミン；２，３−ジメチル−１，４−フェニレンジアミ
    ン；４，５−ジメチル−１，２−フェニレンジアミン；
    Ｎ，Ｎ−ジエチル−１，４−フェニレンジアミン ジヒ
    ドロクロリド；Ｎ−フェニル−１，４−フェニレンジア
    ミン；Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラメチル−１，４−フ
    ェニレンジアミン；Ｎ−メチル−Ｎ′−ヒドロキシエチ
    ル−１，４−フェニレンジアミン；又は２，３，５，６
    −テトラメチル−１，４−フェニレンジアミン、 式IIの構造のもの：３，３′，５，５′−テトラメチル
    −ベンチジン；２，２′−ジメチル−ビフェニル−４，
    ４′−ジアミン；３，３′−ジアミノビフェニル テト
    ラヒドロクロリド；又はＮ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラメ
    チル−ビフェニル−４，４′−ジアミン、 式III の構造のもの：Ｎ，Ｎ−ジメチル−１，４−ナフ
    チルジアミン；１，４−ナフチルジアミン；１，５−ジ
    アミノナフタレン；１，８−ジアミノナフタレン；２，
    ３−ジアミノナフタレン；５−クロロ−１，４−ナフチ
    ルジアミン又は１−エトキシ−２，３−ジアミノナフタ
    レンであり、そしてナフトールが、２−メトキシ−１−
    ナフトール；２−メチル−１−ナフトール；１−ナフト
    ール；２−ナフトール；４−クロロ−１−ナフトール；
    １−ブロモ−２−ナフトール；６−ブロモ−２−ナフト
    ール；１，６−ジブロモ−２−ナフトール；２，４−ジ
    クロロ−１−ナフトール；６−メチル−２−ナフトー
    ル；１−メトキシ−２−ナフトール；２−フェニル−１
    −ナフトール；１−ヒドロキシキノリン，５−ヒドロキ
    シキノリン；３−ヒドロキシ−１−メチル−キノリン；
    ６−ヒドロキシキノリン；２−ヒドロキシキノリン；８
    −ヒドロキシキノリン−５−スルホン酸；１−ナフトー
    ル−４−カルボン酸；８−ヒドロキシ−５−ニトロキノ
    リン；５−クロロ−８−ヒドロキシキノリン又は４−エ
    チル−１−ナフトールである、請求項４記載の分析方
    法。
  6. 【請求項６】 色を形成する組み合わせが、ビス−ヒド
    ロキシエチル−１，４−フェニレンジアミン及び２−メ
    チル−１−ナフトールからなる、請求項１記載の分析方
    法。
  7. 【請求項７】 ヘモグロビンを含有すると思われる水性
    媒体に、ペルオキシドをフェニレンジアミン及びナフト
    ールと共に加え、それらが分析条件の下で、、ヘモグロ
    ビンが存在する場合に結合して色原体を形成し、それに
    よりこの分析系中に検出可能な色の変化をもたらす段階
    からなり、ｐＨが１０〜１４で、水性試料中のヘモグロ
    ビンを検出するための分析方法。
  8. 【請求項８】 色を形成する組み合わせが、ビス−ヒド
    ロキシエチル−１，４−フェニレンジアミン及び２−メ
    チル−１−ナフトールからなる、請求項７記載の分析方
    法。
  9. 【請求項９】 分析系のｐＨを１０〜１４に保つことの
    できる緩衝液、並びにペルオキシドを、遊離酸素の存在
    下で結合させることのできるフェニレンジアミン及びナ
    フトールと共に、吸着マトリックス材の中に吸着してい
    るものからなる、水性試料中の過酸化活性物質の存在を
    検出する分析具。
  10. 【請求項１０】 フェニレンジアミンが、次式Ｉ： 【化５】 （式中、−ＮＲ2 は２又は４位にある）、式II； 【化６】 （式中、−ＮＲ2 は４，４′；４，２′；２，２′又は
    ５，５′位にある）又は式III ； 【化７】 （式中、−ＮＲ2 は１，２；１，４；１，５；１，７；
    １，８；２，３；２，６；又は２，８位にある）で示さ
    れることを特徴とし、その際Ｒ基は独立してＨ、ＣＨ
    3 、ＣＨ2 ＣＨ3 、ＣＨ2 ＣＨ2 ＯＨ、Ｃ6 Ｈ5又はＣ
    Ｈ2 ＣＨ2 ＣＨ3 であり、式中の芳香環は０〜５個のＸ
    基により置換されており、その際Ｘは独立してＨ、Ｃ
    ｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｆ、ＣＮ、ＮＯ2 、ＣＨ3 、ＣＨ2 ＣＨ
    3 、ＣＨ2 ＣＨ2 ＣＨ3 、ＯＣＨ3 、ＯＣＨ2 ＣＨ3 又
    はＣ6 Ｈ5 であり、そしてナフトールが、次式： 【化８】 （式中、ＹはＣＨ、Ｓ、Ｏ又はＮであって、芳香環を結
    合している炭素原子に対しオルト又はメタのいずれかの
    位置にあり、そのとき芳香環は各々独立して０〜７個の
    Ｘ基により置換されており、ＸはＨ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、
    Ｆ、ＣＮ、ＮＯ2 、ＣＨ3 、ＣＨ2 ＣＨ3 、ＣＨ2 ＣＨ
    2 ＣＨ3 、ＯＣＨ3 、ＯＣＨ2 ＣＨ3 、ＳＯ3 Ｈ、ＣＯ
    2 Ｈ、ＰＯ3 Ｈ又はＣ6 Ｈ5 である）で示される、請求
    項９記載の分析具。
  11. 【請求項１１】 フェニレンジアミンが、 式Ｉの構造のもの：ビス−ヒドロキシエチル−１，４−
    フェニレンジアミン；１，２−フェニレンジアミン；
    １，４−フェニレンジアミン ヒドロクロリド；３−ニ
    トロ−１，２−フェニレンジアミン；４−ニトロ−１，
    ２−フェニレンジアミン；４−メトキシ−１，２−フェ
    ニレンジアミン；２−クロロ−１，４−フェニレンジア
    ミン スルフェート；２−エトキシ−１，４−フェニレ
    ンジアミン；Ｎ，Ｎ−ジメチル−１，４−フェニレンジ
    アミン；２，３−ジメチル−１，４−フェニレンジアミ
    ン；４，５−ジメチル−１，２−フェニレンジアミン；
    Ｎ，Ｎ−ジエチル−１，４−フェニレンジアミン ジヒ
    ドロクロリド；Ｎ−フェニル−１，４−フェニレンジア
    ミン；Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラメチル−１，４−フ
    ェニレンジアミン；Ｎ−メチル−Ｎ′−ヒドロキシエチ
    ル−１，４−フェニレンジアミン；又は２，３，５，６
    −テトラメチル−１，４−フェニレンジアミン、 式IIの構造のもの：３，３′，５，５′−テトラメチル
    −ベンチジン；２，２′−ジメチル−ビフェニル−４，
    ４′−ジアミン；３，３′−ジアミノビフェニル テト
    ラヒドロクロリド；又はＮ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラメ
    チル−ビフェニル−４，４′−ジアミン、 式III の構造のもの：Ｎ，Ｎ−ジメチル−１，４−ナフ
    チルジアミン；１，４−ナフチルジアミン；１，５−ジ
    アミノナフタレン；１，８−ジアミノナフタレン；２，
    ３−ジアミノナフタレン；５−クロロ−１，４−ナフチ
    ルジアミン又は１−エトキシ−２，３−ジアミノナフタ
    レンであり、そしてナフトールが、２−メトキシ−１−
    ナフトール；２−メチル−１−ナフトール；１−ナフト
    ール；２−ナフトール；４−クロロ−１−ナフトール；
    １−ブロモ−２−ナフトール；６−ブロモ−２−ナフト
    ール；１，６−ジブロモ−２−ナフトール；２，４−ジ
    クロロ−１−ナフトール；６−メチル−２−ナフトー
    ル；１−メトキシ−２−ナフトール；２−フェニル−１
    −ナフトール；１−ヒドロキシキノリン，５−ヒドロキ
    シキノリン；３−ヒドロキシ−１−メチル−キノリン；
    ６−ヒドロキシキノリン；２−ヒドロキシキノリン；８
    −ヒドロキシキノリン−５−スルホン酸；１−ナフトー
    ル−４−カルボン酸；８−ヒドロキシ−５−ニトロキノ
    リン；５−クロロ−８−ヒドロキシキノリン又は４−エ
    チル−１−ナフトールである、請求項９記載の分析具。
  12. 【請求項１２】 色を形成する組み合わせが、ビス−ヒ
    ドロキシエチル−１，４−フェニレンジアミン及び２−
    メチル−１−ナフトールからなる、請求項９記載の分析
    具。
  13. 【請求項１３】 検出されるべき物質を含有する水性媒
    体を調製し；その媒体に検出されるべき物質と反応性の
    アルカリオキシダーゼ並びにペルオキシダーゼを、フェ
    ニレンジアミン及びナフトールと共に加え、それらが分
    析条件の下で結合して色原体を形成し、それによりこの
    分析系に検出可能な色の変化をもたらすことからなる、
    水性試料中の物質を検出するための分析方法。
  14. 【請求項１４】 検出されるべき物質及びそれと反応す
    るアルカリオキシダーゼが、下に示すものである、請求
    項１３記載の分析方法。物 質 アルカリオキシダーゼ Ｄ−アラニン Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ ガラクトース ガラクトースオキシダーゼ Ｌ−チロシン ポリフェニルオキシダーゼ プトレッシン 血漿アミンオキシダーゼ Ｌ−トリプトファン １−トリプトファンペルオキシ
    ド 尿酸 ウリカーゼ キサンチン キサンチンオキシダーゼ
  15. 【請求項１５】 フェニレンジアミンが次式Ｉ： 【化９】 （式中、−ＮＲ2 は２又は４位にある）、式II； 【化１０】 （式中、−ＮＲ2 は４，４′；４，２′；２，２′又は
    ５，５′位にある）又は式III ； 【化１１】 （式中、−ＮＲ2 は１，２；１，４；１，５；１，７；
    １，８；２，３；２，６；又は２，８にある）で示され
    ることを特徴とし、その際Ｒ基は独立してＨ、ＣＨ3 、
    ＣＨ2 ＣＨ3 、ＣＨ2ＣＨ2 ＯＨ、Ｃ6 Ｈ5又はＣＨ2 Ｃ
    Ｈ2 ＣＨ3 であり、式中の芳香環は０〜５個のＸ基によ
    り置換されており、その際Ｘは独立してＨ、Ｃｌ、Ｂ
    ｒ、Ｉ、Ｆ、ＣＮ、ＮＯ2 、ＣＨ3 、ＣＨ2 ＣＨ3 、Ｃ
    Ｈ2 ＣＨ2 ＣＨ3 、ＯＣＨ3 、ＯＣＨ2 ＣＨ3 又はＣ6
    Ｈ5 であり、そしてナフトールが、次式： 【化１２】 （式中、ＹはＣＨ、Ｓ、Ｏ又はＮであって、芳香環を結
    合している炭素原子に対しオルト又はメタのいずれかの
    位置にあり、そのとき芳香環は各々独立して０〜７個の
    Ｘ基により置換されており、ＸはＨ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、
    Ｆ、ＣＮ、ＮＯ2 、ＣＨ3 、ＣＨ2 ＣＨ3 、ＣＨ2 ＣＨ
    2 ＣＨ3 、ＯＣＨ3 、ＯＣＨ2 ＣＨ3 、ＳＯ3 Ｈ、ＣＯ
    2 Ｈ、ＰＯ3 Ｈ又はＣ6 Ｈ5 である）で示される、請求
    項１３記載の分析方法。
  16. 【請求項１６】 フェニレンジアミンが、 式Ｉの構造のもの：ビス−ヒドロキシエチル−１，４−
    フェニレンジアミン；１，２−フェニレンジアミン；
    １，４−フェニレンジアミン ヒドロクロリド；３−ニ
    トロ−１，２−フェニレンジアミン；４−ニトロ−１，
    ２−フェニレンジアミン；４−メトキシ−１，２−フェ
    ニレンジアミン；２−クロロ−１，４−フェニレンジア
    ミン スルフェート；２−エトキシ−１，４−フェニレ
    ンジアミン；Ｎ，Ｎ−ジメチル−１，４−フェニレンジ
    アミン；２，３−ジメチル−１，４−フェニレンジアミ
    ン；４，５−ジメチル−１，２−フェニレンジアミン；
    Ｎ，Ｎ−ジエチル−１，４−フェニレンジアミン ジヒ
    ドロクロリド；Ｎ−フェニル−１，４−フェニレンジア
    ミン；Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラメチル−１，４−フ
    ェニレンジアミン；Ｎ−メチル−Ｎ′−ヒドロキシエチ
    ル−１，４−フェニレンジアミン；又は２，３，５，６
    −テトラメチル−１，４−フェニレンジアミン、式IIの
    構造のもの：３，３′，５，５′−テトラメチル−ベン
    チジン；２，２′−ジメチル−ビフェニル−４，４′−
    ジアミン；３，３′−ジアミノビフェニル テトラヒド
    ロクロリド；又はＮ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラメチル−
    ビフェニル−４，４′−ジアミン、 式III の構造のもの：Ｎ，Ｎ−ジメチル−１，４−ナフ
    チルジアミン；１，４−ナフチルジアミン；１，５−ジ
    アミノナフタレン；１，８−ジアミノナフタレン；２，
    ３−ジアミノナフタレン；５−クロロ−１，４−ナフチ
    ルジアミン又は１−エトキシ−２，３−ジアミノナフタ
    レンであり、そしてナフトールが、２−メトキシ−１−
    ナフトール；２−メチル−１−ナフトール；１−ナフト
    ール；２−ナフトール；４−クロロ−１−ナフトール；
    １−ブロモ−２−ナフトール；６−ブロモ−２−ナフト
    ール；１，６−ジブロモ−２−ナフトール；２，４−ジ
    クロロ−１−ナフトール；６−メチル−２−ナフトー
    ル；１−メトキシ−２−ナフトール；２−フェニル−１
    −ナフトール；１−ヒドロキシキノリン，５−ヒドロキ
    シキノリン；３−ヒドロキシ−１−メチル−キノリン；
    ６−ヒドロキシキノリン；２−ヒドロキシキノリン；８
    −ヒドロキシキノリン−５−スルホン酸；１−ナフトー
    ル−４−カルボン酸；８−ヒドロキシ−５−ニトロキノ
    リン；５−クロロ−８−ヒドロキシキノリン又は４−エ
    チル−１−ナフトールである、請求項１３記載の分析方
    法。
  17. 【請求項１７】 色を形成する組み合わせが、ビス−ヒ
    ドロキシエチル−１，４−フェニレンジアミン及び２−
    メチル−１−ナフトールからなる、請求項１３記載の分
    析方法。
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