JPH0597875A

JPH0597875A - 中枢神経系障害の治療に有用な天然給源からの高純度ホスフアチジルイノシトール及びその製造方法

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Publication number: JPH0597875A
Application number: JP4083127A
Authority: JP
Inventors: Enrico Ferrari; フエツラリエンリコ; Pier Giuseppe Pagella; ジユセツペパジエツラピエル; Stefano Maiorana; マイオラナステフアノ; Mario Brufani; ブルフアニマリオ
Original assignee: Mediolanum Farmaceutici SpA
Current assignee: Mediolanum Farmaceutici SpA
Priority date: 1991-06-07
Filing date: 1992-03-05
Publication date: 1993-04-20
Also published as: EP0516914A2; ITMI911578A0; US5214180A; EP0516914A3; CA2059701A1; ITMI911578A1; IT1248012B

Abstract

(57)【要約】【構成】ａ）少なくとも１０重量％のホスファチジル
イノシトールを含む植物由来の粗材料を、そのイノシト
ールのヒドロキシ基に保護基を付与する試薬で処理し、
ｂ）このように保護基の付与されたホスファチジルイノ
シトールを溶剤抽出によるか又はシリカゲルを用いたク
ロマトグラフィーによりその反応混合物から分離し、
ｃ）ホスファチジル基を変性させない条件下で該保護基
を除去する、ことからなる神経系障害の治療に適する高
純度ホスファチジルイノシトールの製造方法、及び中枢
神経系障害の治療に適する薬剤組成物の製造のための９
８％を越える純度のホスファチジルイノシトールの使
用。【効果】本発明の高純度ホスファチジルイノシトール
は中枢神経系の抗抑欝性の強い刺激活性を有し、またこ
の活性は長期処置で持続する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は中枢神経系障害の治療に
有用な天然給源からの高純度ホスファチジルイノシトー
ル及びその製造方法に関する。

【０００２】

【従来技術】従来、純粋なホスファチジルイノシトール
は、溶剤抽出や、シリカゲル−アルミナクロマトグラフ
カラム又はイオン交換樹脂（ジエチルアミノエチルセル
ロ−スなど）クロマトグラフカラムを通す繰返精製プロ
セスを包含する各種の技術の組み合わせにより得られて
いた。これらの操作は長い分離時間を必要とし、商業規
模の精製を行うことを許容しない複雑な溶剤混合物の使
用を必要とする。

【０００３】他の技術（特願昭６３−３３３８９号を参
照）は、ジエチルアミノエチルセルロース、ジエチルア
ミノエチルセファロース、ＱＡＥセファデックス（ＱＡ
ＥＳｅｐｈａｄｅｘ）のようなイオン交換樹脂を用い，
これにホスファチジルイノシトールを吸収させることに
より複雑なホスファチド混合物からホスファチジルイノ
シトールを分離することを含んでいる。これに続いて、
ホスファチジルイノシトールに対するよりもアニオン交
換樹脂により高い親和性を有する塩水緩衝剤を含む溶剤
又は溶剤混合物をカラムに通すパーコレーションをさら
に行う。この技術は、２つの欠点を有する。即ち、第１
に、少量の生成物を精製するのに非常に多量の樹脂を必
要とし、第２に、分離力が非常に小さい。

【０００４】トルエン中で自己消化されるイーストから
出発し、クロロホルム−メタノール混合物の助けにより
ホスホリピドの連続抽出を行うホスファチジルイノシト
ールのその他の製造方法が公知である。この方法は、多
量の有機溶剤を用い、また所望の生成物の収率は非常に
低い。

【０００５】欧州特許ＥＰ第０２８８５６９号は、生物
学的物質から出発するホスファチジルイノシトールの製
造を開示しており、塩水中でその均質化を行い、さら
に、遠心分離、超遠心分離及びアルカリ性又は中性のプ
ロテアーゼの使用又はゲルクロマトグラフィーの使用に
よる一連の分離段階を行うようにしている。この方法は
非常に低いホスファチジルイノシトール含量を有する生
物学的生成物から出発しているので非常に低い生成物収
率となる欠点を有している。

【０００６】次に他の公知の方法を示す： ◎動物由来又は植物由来の粗原料から出発するか又は微
生物から出発する１，２−ジアシル−３−グリセロホス
ファチジルイノシトールのような混合酸の製造（特願昭
６３−１５７９９３号）； ◎リパ−ゼを用いるホスホリピドの精製で、６０〜７０
％の純度の生成物を得る（特開昭６２−４８３９０
号）。

【０００７】各種の合成方法も公知であり、その１つは
Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、３３、６４１〜６４６（１９
９０）（ＪＫＦ）に報告されている。しかしながら、そ
のような方法により純粋なホスファチジルイノシトール
を得るには、非常に多くの段階を必要とし、収率は低
く、そして多くの場合、ラセミ化合物を分割して所望の
生成物を得る必要がある。これらの理由から、生成物は
商業的用途にほとんど適さない。

【０００８】一方、抑欝障害のような中枢神経系の治療
に、三環式抗抑欝剤、特に、イミプラミンが広く使用さ
れることが公知である（Ｌ．Ｓ．Ｇｏｏｄｍａｎ＆
Ａ．Ｇｉｌｍａｎ、ＴｈｅＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉ
ｃａｌＢａｓｉｓｏｆＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、第
３版、第１９８〜２０４頁）。これらの薬剤は強い抗抑
欝活性を有している。しかしながら、これらは、高い毒
性、多くの反対兆候並びに望ましくない副作用などの重
大な欠点を呈する。

【０００９】これらは、例えば、他の多くの薬剤、例え
ばＭＡＯＩ（モノアミノオキシダーゼ抑制剤）、経口抗
凝血薬、鎮痛薬、血液拡張薬を妨害する；心筋梗塞の予
後でのその使用は止めた方がよく、低血圧、高血圧、頻
脈、動悸、不整脈、錯乱状態、協調欠如、振せん及び他
の神経学的な障害、血液学的障害、胃腸障害及び内分泌
障害をもたらすことがある。望ましくない副作用を考慮
すると、より信頼のある薬剤の必要が感じられる。

【００１０】

【発明が解決しようとする課題】我々は、既知の方法と
比較し、安価な天然産物（大豆レシチン）から出発し、
普通の薬剤や溶剤を用い、数少ないの簡単な段階により
商業的な量で製造できる利点を有するホスファチジルイ
ノシトールの製造方法を見いだした。

【００１１】

【課題を解決するための手段】本発明に従うホスファチ
ジルイノシトールを製造する方法は、ａ）少なくとも１０重量％のホスファチジルイノシトー
ルを含む植物粗材料を、そのイノシトールのヒドロキシ
基に保護基を付与する試薬で処理すること；ｂ）このように保護基の付与されたホスファチジルイノ
シトールを溶剤抽出によるか又はシリカゲルを用いたク
ロマトグラフィーによりその反応混合物から分離するこ
と；ｃ）ホスファチジル基を変性させない条件下でヒドロキ
シ基の保護基を除去すること、を特徴とする。

【００１２】このようにして得られる生成物は、９８％
を越えるホスファチジルイノシント−ル含量を有し、中
枢神経系障害及び特に記憶障害と抑欝障害の治療に効果
的である。発明に従う高純度のホスファチジルイノシト
ールの製造方法の特徴とさらに生成物の化学的及び薬物
学的特徴は、以下の記載によりさらに説明される。

【００１３】本発明に従う方法で用いられる出発材料
（以下の記載においては『粗ホスファチジルイノシトー
ル』ともいう）は、商業的な大豆レシチン又は好ましく
は、少なくとも５０重量％、好ましくは５０〜６０重量
％の含量までホスファチジルイノシトールを富化させた
生成物からなる植物物質である。

【００１４】生成物は次の組成を有する：ホスファチジルイノシトール５０〜６０重量％ホスファチジン酸３０〜４０重量％ホスファチジルエタノ−ルアミン０〜５重量％該生成物は、１２〜１３％のホスファチジルイノシトー
ルを含む商業的な大豆レシチンから、又は約３０％のホ
スファチジルイノシトールを含みホスファチジルコリン
を含まないあらかじめ富化した大豆レシチンから出発し
て得られる。

【００１５】この粗材料を、次に示す段階により５０〜
６０％のホスファチジルイノシトール含量とする： ◎最初に重炭酸ナトリウム、重炭酸カリウム、炭酸ナト
リウム又は炭酸カリウムの存在下で、おそらくクラウン
エーテル（１８−クラウン−６）の存在下、室温で、窒
素雰囲気下でメタノール、ベンゼン又はトルエン中の沃
化メチルにより処理する（これにより粗材料に含まれる
ホスファチジルエタノールアミンがホスファチジルコリ
ンに変換される）； ◎９５％エタノール、無水アルコール、メタノール又は
酢酸エチルのような溶剤による抽出により反応混合物か
らホスファチジルコリンを取り出す； ◎順次行う洗浄、脱水及び濃縮段階で、５０〜６０％の
ホスファチジルイノシトールを含む粗生成物を得る（そ
の後は前記ようにして処理する）。

【００１６】粗ホスファチジルイノシトールを得るもう
１つの方法は、富化した大豆レシチン（ホスファチジル
イノシトール含量約３０％を有する）を、重炭酸カリウ
ムの存在下で、室温で、窒素雰囲気下でクロロホルム中
のＮ−カルボエトキシフタルイミドと反応させることを
含む。この処理により、粗材料に含まれるホスファチジ
ルエタノールアミンはフタロイル−ホスファチジルエタ
ノールアミンに変換される。

【００１７】それに続くエチルアルコールによるか又は
エチルアルコール−アセトン混合物による洗浄により、
該生成物は混合物から取り出され、５０〜６０％のホス
ファチジルイノシトールを有する粗原料が得られる。

【００１８】本発明に従う高純度ホスファチジルイノシ
トールの製造方法においては、粗材料おそらく大豆レシ
チンその物が、以下に示す反応に従って、ヒドロキシ基
を保護する基をイノシトールに付与するための化学薬剤
でまず処理される：

【００１９】

【化１】保護基は、最後に、ホスファチジル基を変化させないま
まとする温和な条件下で除去可能でなければならない。
我々は、この目的に適した保護基付与化合物が、例えば
ジメチル−ｔ−ブチルシリルクロリド、ヘキシルジメチ
ルシリルクロリド、トリメチルシリルクロリド及びアリ
ルブロミドであることを見い出した。反応は有機溶剤
中、室温で、窒素雰囲気下で起こる。溶剤として、無水
ピリジン、アセトニトリル、ＤＭＦ及びＤＭＳＯが用い
ら得れる。

【００２０】このように保護基の付与されたホスファチ
ジルイノシトールは、アセトン又はエチルアルコール−
アセトン混合物を用いる溶剤抽出によるか又はＣＨＣｌ
₃ ：ＣＨ₃ ＯＨの８０：２０〜９０：１０混合物又はエ
チルエーテル：ヘキサンの５０：５０混合物を用いた、
シリカゲルでの迅速濾過によりその反応混合物から分離
される。

【００２１】この処理で得られた保護基の付与されたホ
スファチジルイノシトールは、次に、ホスファチジル基
を変性することなしで保護基を除去してイノシトールの
ヒドロキシ基を復元するように処理される。

【００２２】このことは、室温でテトラヒドロフラン中
のテトラブチルアンモニウムフルオリドを用いるか、室
温で塩基性又は酸性での加水分解によるか、又は沸騰エ
チルアルコール中の、炭素に担持させたパラジウム１０
％の触媒を用いて達成することができる。

【００２３】このようにして得られた生成物は、９８％
よりも高いホスファチジルイノシトール含量を有し、以
下に示す薬理学的試験により示されるように記憶障害及
び抑欝障害を治療するのに適している。

【００２４】薬理学的試験後記の実施例１に記載したようにして得た化合物（この
化合物を以下ＭＦ−４１４と記載する）を用いて、記憶
障害及び抑欝障害に対する効果を測定する研究を行っ
た。記憶障害については、試験は、３００−３５０ｇの
重さの雄のウイスタ−（Ｗｉｓｔａｒ）（Ｃｈａｒｌｅ
ｓＲｉｖｅｒ，Ｃａｌｃｏ）ラットで行った。ラット
を、８〜２０ｈの間で１２時間の昼／夜サイクルにして
温度２２℃に保った。

【００２５】１．受動的回避試験（Ｐａｓｓｉｖｅａ
ｖｏｉｄａｎｃｅｔｅｓｔ）受動的回避試験は２室に分割したケ−ジ中で行った。ラ
ットをプレキシガラス製の５×１０ｃｍのプラットホ−
ムに乗せておく訓練を行った。ラットが格子床に降りる
（この格子床においてラットは避けることのできないシ
ョック（０．８ｍＡ、２秒間）を受ける）前にそのプラ
ットホームに滞在する時間を測定する。２４時間後、ラ
ットは再度試験を受け、滞在時間を測定する。訓練段階
では中断時間は１２０秒であり、一方、滞在時間は３０
０秒である。それらの結果の統計的評価はマン・ウイッ
トニＵ試験（Ｍａｎｎ−ＷｈｉｔｎｅｙＵｔｅｓ
ｔ）を用いて行った。

【００２６】この一連の実験の結果は、訓練試験３時間
前に投与量１００ｍｇ／ｋｇで経口投与した化合物ＭＦ
−４１４は、受動的回避状況についてスコポラミン（訓
練試験３０分前に皮下投与、０．７５ｍｇ／ｋｇ）によ
り誘発された健忘症作用に有意的に影響を与えることを
証明している。特に、スコポラミン＋ＭＦ−４１４で処
置したグル−プでの回避潜在性は、スコポラミンだけで
処理したグル−プよりも有意的に高かった。結果は図１
に示してあり、対照グル−プ（Ｃ）、スコポラミン処置
グル−プ（Ｓ）及びスコポラミンとＭＦ−４１４（Ｓ＋
ＭＦ−４１４）（ｐ＜０．０５ｖｓ．スコポラミン）で
処置したものについての潜在的回避時間（秒で示してあ
る）を図示してある。

【００２７】２．ＥＥＧ周波数の分光分析装置：ＢｒａｉｎＳｕｒｖｅｙｏｒ−ＢＡＳＩＳＴ
ＲＡＤＥ各ラットに、前頭皮質及び頭頂皮質中での両大脳半球皮
質脳波アセンブリーに関連する６個の電極を、中央領基
準電極及び後頭部接地電極と共に脳定位固定装置によっ
て植え込んだ。植え込みは、クロロペント（ｃｈｌｏｒ
ｏｐｅｎｔ）（３ｍｌ／ｋｇｉ．ｐ．）による麻酔状
態下で行った。

【００２８】植え込みから７２時間後、各ラットについ
てＥＥＧモニタ−を実施した。普通の健康状態の対照を
示す各ラットに対して２日間連続して同じ時間帯（１
４：００〜１７：００）で二重ＥＥＧ試験を実施した。
一定の温度でのインソノライズド（ｉｎｓｏｎｏｒｉｚ
ｅｄ）記録環境への適合時間は３時間（１１．００〜１
４．００）であった。

【００２９】ＥＥＧ信号を、０〜３１Ｈｚの周波数範囲
について下記の６つのバンドに分けて高速フーリエ変換
（ＦＦＴ）により分析した：デルタ：１−３Ｈｚ、シ−タ：３−７Ｈｚ、アルファ：７−１３Ｈｚ（スロ−アルファ：７−９Ｈ
ｚ；ファ−ストアルファ：９−１３Ｈｚ）、ベ−タ：１３−３１Ｈｚ（スロ−ベ−タ：１３−２１Ｈ
ｚ；ファ−ストベ−タ：２１−３１Ｈｚ）。

【００３０】単一分析の時間を、時定数０．３秒、Ｌ
Ｆ：０．５３Ｈｚ、ＨＦ：５０Ｈｚとして８秒に設定し
た。次いでそれぞれのスペクトルエネルギ−値を分析
し、絶対値（ｕＶ₂ ）、主要周波数、各バンドの絶対エ
ネルギ−（ｕＶ₂ ）、全エネルギ−に対する各バンドの
エネルギ−の百分率、各バンドについての主要周波数及
び脳マッピングについて定量化した。タイムスキャニン
グを１時間毎にオンラインで１５分間とった。ＥＥＧ記
録を、１００ｍｇ／１ｋｇのＭＦ−４１４の経口投与の
３時間後に開始した（１１：００で投与、１４：００で
記録）。

【００３１】得られたデ−タを、ＥＥＧ周波数バンドに
基づいて、処置及び時間の関数として、１つのファクタ
−について繰り返された計量についての複式差異分析に
よって分析した。

【００３２】図２は、ＥＥＧ−ＣＳＡ（００．５０−３
２．００Ｈｚ）を示す。Ｃは対照デ−タを示し、ＲはＭ
Ｆ−４１４処置（１００ｍｇ／ｋｇ）についてのデ−タ
を示す。投与後の４〜６時間の間の期間での０〜３１Ｈ
ｚのＥＥＧ周波数範囲に対するＭＦ−４１４の効果の評
価は、図２に示すように、Ｄにより示される遅いリズム
（デルタ）の有意的な減少及び（Ｂにより示される）速
い（ベ−タ）周波数のわずかな増加傾向を示している。

【００３３】これらの試験は、成体ラットへのホスファ
チジルイノシトールの投与が、薬理学的に起こされた記
憶変化に対して保護作用を有することを示している。特
に、ホスファチジルイノシトールの単一投与が、受動的
回避試験において健忘症スコポラミン作用に対して反対
に働く。そのような作用は、本発明の高純度ホスファチ
ジルイノシトールによりもたらされる記憶強化プロセス
の向上とみなすことができる。

【００３４】記憶に関する機能の変化については、多く
の神経伝達物質及び神経修飾物質が関与する。上記の結
果は、記憶障害とコリン性の機能の病理学的減少との間
に存在する公知の相関性を考慮して少なくとも年老いた
人々に関心がのもたれている（スコポラミンは該不足を
演じる）；しかしながら、上記の結果は、ホスファチジ
ルイノシトールがコリン性の機構を通じてのみその薬学
的活性を発揮することを保証してはいない。アセチルコ
リンとは異なる他の神経メディエイタ−も関与し得る。

【００３５】抑欝障害については、いわゆる『絶望感試
験（ｄｅｓｐａｉｒｔｅｓｔ）』（エス・ノムラら、
ＥｕｒｏｐＪ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、８３（１９
８２）１７１−１７５）を用いた。これは、薬剤の抗抑
欝活性の評価のための広く用いられているスクリ−ニン
グ試験の１つである。

【００３６】比較のために、抑欝状態の治療に長い間用
いられてきた公知の薬剤であるイミプラミンを用いた。
周知の抗不安薬であるジアゼパムも同じ目的で用いた。

【００３７】試験は、インブラインド（ｉｎｂｌｉｎ
ｄ）ではなく完全にランダムな処置のグル−プについて
行った。すべての場合に、薬理学的反応は器機により測
定したので操作者による影響はなかった。

【００３８】実験には、平均体重２０−２２ｇの雄のＣ
Ｄ−１（ＩＣＲ−ＢＲ）チャ−レスリバ−ラット（Ｃｈ
ａｒｌｅｓＲｉｖｅｒｒａｔｓ）を用い、実験は２
つの形式、すなわち、単一処置及び繰り返し処置とし
た。

【００３９】実験用のラットグル−プは下記の通りであ
った： ◎ＦＭ−４１４による単一処置のためのグル−プ、 ◎ＦＭ−４１４による繰り返し処置のためのグル−プ、 ◎イミプラミンによる単一処置のためのグル−プ、 ◎イミプラミンによる繰り返し処置のためのグル−プ、 ◎ジアゼパムによる単一処置のためのグル−プ、 ◎ジアゼパムによる繰り返し処置のためのグル−プ、 ◎プラセボによる単一処置のためのグル−プ、 ◎プラセボによる繰り返し処置のためのグル−プ、 ◎対照グル−プ。

【００４０】それぞれのケ−ジは各処置グル−プのため
の動物を収容し、また投与は以下に示すように胃管（ｇ
ａｓｔｒｉｃｔｕｂｅ）により行った：ａ）単一処置については、試験の２時間前に投与をし
た；ｂ）繰り返し処置については、処置を９時に一回だけ行
った土曜日と日曜日を除き１５日間、１日２回９時と１
７時に行った。この一回だけの週末処置のため月曜日は
試験を行わず、連続した日にのみ試験を行った。薬剤は
ビヒクルとして０．２％のメチルセルロースを用いて投
与し、またプラセボグル−プの動物は０．２％のメチル
セルロースで処置し、対照動物は処置を受けなかった。
イミプラミンの投与量は、単一処置については６０ｍｇ
／ｋｇで、繰り返し処置については、上記の例外を別と
して、１５日間１日２回として１０ｍｇ／ｋｇとした。

【００４１】上記のＭＦ−４１４の結果（ｃｌｏｓｅ
ｓ）は、薄層クロマトグラフィーにより測定した蛍光体
の百分率を考慮し且つ純生成物を１００％に補正して計
算した。

【００４２】試験に用いた装置は、図７に示す１０ｘ２
０ｘ１８ｃｍのプレキシガラス製容器からなっていた。
容器の中にはその中央部分に回転可能なパドルシリンダ
−が装着してある。容器には、このシリンダ−の上のレ
ベルまで水が満たしてあり、そしてラットを温度２６−
２８℃の水に浸漬する。

【００４３】各動物についての試験の期間は６分であ
る。この期間は３分ずつの２つの期間に分けるべきであ
り、第一の期間（０〜３分）では、水に浸漬された動物
は必死に逃げようとしてパドルシリンダーに登ろうとす
るがパドルシリンダーは回転してラットを水から出させ
ない；第二の期間（３〜６分）では、動物は出ようとす
る試みが望みのないものであり且つパドルシリンダ−を
登ろうとする試みを思い止まるように感じるので動物に
抑欝状態が起こる。投与した生成物の活性が、第二の期
間の間の逃げる試みに示されるのはそれが逃げることの
不可能からくる動物の抑欝状態に反対に作用するからで
ある。記録されたパラメ−タは、各３分間のパドルシリ
ンダ−の回転数である。統計的分析は、各処置の場合の
回転数を比較し、タキ−試験（Ｔｕｋｅｙｔｅｓｔ）
に従う交差比較（ｃｒｏｓｓｅｄｃｏｍｐａｒｉｓｏ
ｎ）によりそれらの差異を定量することにより各期間内
で行う。

【００４４】その実験結果を表１〜４及び図３〜６に示
す。表１及び図３は、単一処置についての第一の期間
（０〜３分）のシリンダ−の回転数を示している（Ｆ 1
5.905250 Ｐ＝0.000300 Ｐ＜0.001）。生成物は試験
の２時間前に投与した。表２及び図４は、単一処置につ
いての第二の期間（３〜６分）のシリンダ−の回転数を
示している（Ｆ 15.603659 Ｐ＝0.000300 Ｐ＜0.001
）。

【００４５】上記したように、統計的分析は、タキ−試
験（すべてのグル−プ間の交差比較を含む）により多分
解（ｍｕｌｔｉｐｌｅｄｅｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）
を用いて行った。表の見出しには、比較として用いた参
照グループが示してある。表３及び図５は、繰り返し処
置の初めの３分間（０〜３分）でのシリンダ−の回転数
を示している（Ｆ 2.169367 Ｐ＝7.172200 N.S.）。試
験は、処置の１５日目の第１の投与の２時間後に行っ
た。最後に、表４及び図６は、繰り返し処置の第２の期
間（３〜６分）での回転数を示している（Ｆ 6.572904
Ｐ＝0.20400 Ｐ＜0.001 ）。この表でも表題は、統計的
比較として用いた参照グル−プを示している。表と図と
から、次に示す結論が導かれる：ａ）単一処置では、薬理学的に重要な結果が第２の期間
すなわち３〜６分の回転数に表れる（表２及び図４）。
公知の抗抑欝剤であるイミプラミンは薬理学的に公知の
ように作用する、すなわち、これは動物が逃げられない
と悟った時の動物に起こる抑欝状態に反対に作用するよ
うに働く。事実、この期間シリンダ−の回転数は対照に
対して統計的に有意的に増加する。ホスファチジルイノ
シトール（ＭＦ−４１４）もイミプラミンに匹敵する挙
動効果（ｂｅｈａｖｉｏｒａｌｅｆｆｅｃｔ）を示す；
事実、この化合物で処置したグル−プでは、回転数の統
計的に有意的な増加が観察される。

【００４６】使用したＭＦ−４１４投与量は高いようで
ある；しかしながら、我々の実験室で行った死亡率試験
では、経口による３００ｍｇ／ｋｇでのイミプラミン処
置が処置した１０匹の動物のうち５匹の死亡を引き起こ
し、ホスファチジルイノシトールの３０００ｍｇ／ｋｇ
の経口投与量は、１０匹の処置した動物になんら致死作
用を有さないことを考慮すべきである。

【００４７】抗不安薬としてのジアゼパムも、第１の期
間及び第２の期間の両者で回転数の大きな減少をもたら
す。事実として、これは、抗不安薬で処理した動物が逃
げようとする衝動を持たずに水の中でゆっくりと泳ぐと
いう事実に関連する。

【００４８】ｂ）繰り返し処置についても、この場合、
重要な結果が第２の期間（表４及び図４）で得られる。
表４が示すように、繰り返し処置でのイミプラミンは、
その活性を失い、ホスファチジルイノシトール（ＭＦ−
４１４）は、他の処置グル−プに対して統計的に有意的
なように活性を保つ。この結果は、ホスファチジルイノ
シトールが中枢神経系の抗抑欝性の強い刺激活性を有す
ることと、この活性が長期処置で持続することを証明す
る。

【００４９】

【表１】絶望試験単一処置での期間０〜３分の回転数試験経口投与量平均値 ±ＥＳタキー試験対プラセボグループ mg/kg Ｐ＜プラセボ 10 ml 30.7 3.06 イミプラミン 60 31.1 2.27 N.S. ＭＦ−４１４ 400 32.7 3.25 N.S. ジアゼパム 15 8.9 1.73 0.01

【００５０】

【表２】絶望試験単一処置での期間３〜６分の回転数タキー試タキー試験タキー試試験経口投与験対プラ対イミプラ験対MF−グループ量 mg/kg 平均値 ±ＥＳセボＰ＜ミンＰ＜ 414 Ｐ＜プラセボ 10 ml 8.6 1.26 イミプラミン 60 24.0 2.65 0.01 ＭＦ−４１４ 400 14.4 2.11 0.05 N.S. ジアゼパム 15 3.3 0.88 N.S. 0.01 0.01

【００５１】

【表３】絶望試験繰り返し処置での期間０〜３分の回転数試験経口投与量平均値 ±ＥＳタキー試験対プラセボグループ mg/kg Ｐ＜対照 −− 37.7 2.29 プラセボ 10 ml 36.0 3.73 N.S. イミプラミン 10 38.0 2.52 N.S. ＭＦ−４１４ 50 41.6 3.43 N.S. ＭＦ−４１４ 100 48.0 2.59 N.S.

【００５２】

【表４】絶望試験繰り返し処置での期間３〜６分の回転数タキータキータキー試タキー試経口投試験対試験対験対イミ験対MF-4 試験与量平均対照プラボプラミン 14/50mg グループ mg/kg 値 ±ＥＳＰ＜Ｐ＜Ｐ＜Ｐ＜対照 −− 9.5 1.52 − − − − プラセボ 10ml 10.0 2.43 N.S. − − − イミプラミン 10 12.2 1.68 N.S. N.S. − − ＭＦ−４１４ 50 21.7 2.42 0.05 0.05 0.05 − ＭＦ−４１４ 100 21.7 1.73 0.05 0.05 0.05 N.S.

【００５３】さらに、生体の他の機能が精製したホスフ
ァチジルイノシトールにより変調される（ｍｏｄｕｌａ
ｔｅｄ）こともあること、したがって、本発明の生成物
が、例えば、糖尿病と関連する神経病（ｎｅｕｒｏｐａ
ｔｉｅｓ）にさらに薬理学的な効果を発揮することもあ
ることは排除されるものではない。事実、実験的に糖尿
病とされたラットの神経のミオイノシトール不足が公知
となっている（Ｄ．Ａ．Ｇｒｅｅｎら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．
Ｉｎｖｅｓｔ．、５５、１３６２（１９７５））。

【００５４】したがって本発明は、中枢神経系障害の治
療、特に記憶及び抑欝障害での該生成物の使用及び該生
成物を有効成分として含む薬理学的組成物に関する。投
与は１日当たり５０−１０００ｍｇの有効成分の投与量
で行われる。

【００５５】次に、本発明に従うホスファチジルイノシ
トールの製造方法を示すいくつかの例を挙げる。

【００５６】例１３２６ｍｇ（４．８ミリモル）のイミダゾ−ル及び３６
２ｍｇ（２．４ミリモル）のジメチル−ｔ−ブチルシリ
ルクロリドを、窒素雰囲気下で、１２ｍｌのＤＭＦ中の
粗５０％ホスファチジルイノシトール４００ｍｇ（０．
２４ミリモル）の懸濁液に加えた。その混合物を１時間
室温で攪拌した。次にその溶液を１００ｍｌの水に注
ぎ、エチルエーテル（４ｘ５０ｍｌ）で抽出した。その
エーテル抽出物を５０ｍｌの水で洗浄してから、飽和塩
化アンモニウム溶液（２ｘ５０ｍｌ）で洗浄し、次に、
硫酸ナトリウムで乾燥し、さらに、減圧下で濃縮した。

【００５７】残留物を、シリカゲルクロマトグラフカラ
ムに通し、８０：２０のクロロホルム／メチルアルコー
ルで溶離した。２１０ｍｇのホスファチジルイノシトー
ルシリレ−トを７０％の収率で得た。

【００５８】分析は次の通りであった：¹Ｈ−ＮＭＲ
（３００ＭＨｚ、ＣＤＣl₃）δ：０．１(m); ０．８
５(m);１．２５(m); １．５５(m); ２．０(m); ２．
２７(m); ２．７５(m);５．３２(m);ＩＲ（フイル
ム）：３３８０、１７３０、１４６０ cm^-1 ；ＭＳＦ
ＡＢ m/e＝１０６３ジシリル；１１７８トリシリル；マ
トリックス＝３−ニトロベンジルアルコール。

【００５９】このようにして得たシリル化生成物１００
ｍｇ（０．０８ミリモル）を、１０ｍｌのＴＨＦ中のＢ
ｕ₄ ＮＦ１０１ｍｇ（０．３２ミリモル）で室温で、
出発生成物がなくなるまで数時間処理した。

【００６０】薄層クロマトグラフィー：ＣＨＣｌ₃ ／Ｍ
ｅＯＨ８０：２０。

【００６１】反応混合物をエチルエーテルで処理した。
硫酸ナトリウムで乾燥させた後、エーテル溶液を減圧下
で濃縮した。

【００６２】９８％を越えるホスファチジルイノシトー
ル含量の生成物６０ｍｇが８０％の収率で得られた：¹ Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ₆ ）０．９（６Ｈ、ｔ、CH ₃ ）１．２５（３０Ｈ、ｍ、（CH ₂)_n-CH₃) １．５５（２Ｈ、ｍ、 -CH₂-CH ₂-(CH₂)_n-CH₃）２．０５（４Ｈ、ｍ、-C(O)-(CH₂ )_n-CH₂ -CH=CH- 及びCH
=CH-CH ₂-(CH₂)_n-CH-）２．３０（２Ｈ、ｍ、-O-C(O)-CH₂-）２．８０（２Ｈ、ｍ、-CH=CH-CH₂ -CH=CH-) ３．０〜３．７（６Ｈ、ｍ、イノシトール）３．８５及び３．９０（２Ｈ、ｍ、CH ₂-O-P(O)(OH)-O-) ４．１４及び４．３５（２Ｈ、ｍ、CH ₂-O-C(O)-) ５．１（１Ｈ、ｍ、CH-O-C(O)-) ５．３（２Ｈ、ｍ、-CH=CH-CH₂ -CH=CH-) ５．４（２Ｈ、ｍ、-CH=CH-CH₂ -CH=CH-) ＩＲ（ヌジョール）：３３４０、１７３５ cm^-1 。

【００６３】例２無水ピリジン１０ｍｌ中の４００ｍｇ（０．２４ミリモ
ル）の粗ホスファチジルイノシトール（５０％含量）の
溶液に、０．６１ｍｌのトリメチルシリルクロリド
（４．８ミリモル）及び１．２１ｍｌのヘキサメチルジ
シラザン（５．７６ミリモル）を窒素雰囲気下で添加し
た。その混合物を攪拌下で室温に１時間保った。

【００６４】その溶剤を減圧下で蒸発させ、その残留物
をシリカゲルを用いたクロマトグラフィー（溶離剤：Ｃ
ＨＣｌ₃ ／ＣＨ₃ ＯＨ８０：２０）で精製した。２５
０ｍｇのホスファチジルイノシトールペンタシリレ−ト
が８７％の収率で得られた。

【００６５】分析は次の通りであった：¹Ｈ−ＮＭＲ
（２００ＭＨｚ、ＣＤＣl₃）δ：０．１(s); ０．８５
(m);１．２５(m); １．５５(m); ２．００(m); ２．
２５(m); ２．７０(m);３．２０(m); ３．４０(m);
３．５２(m); ５．３０(m); ＩＲ（液体フイルム）： cm^-1 ３４３０（OH）３０００、２９２０、２８５０（CH₂ 、CH）１７４０（C=O) １２５０（P=O)

【００６６】エチルエーテル３０ｍｌ中のその得られた
シリレ−ト生成物２００ｍｇの溶液を、２０ｍｌの０．
１ＮのＨＣｌにより、室温で４時間処理した。そのエー
テル層を水性層から分離し、硫酸マグネシウムで乾燥さ
せてから、減圧下で濃縮させた。９９％より高いホスフ
ァチジルイノシトール含量を有する１２０ｍｇの生成物
が８６％の収率で得られた。

【００６７】¹ Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ₆ ）０．９（６Ｈ、ｔ、CH ₃ ）１．２５（３０Ｈ、ｍ、（CH ₂)_n-CH₃) １．５５（２Ｈ、ｍ、 -CH₂-CH ₂-(CH₂)_n-CH₃）２．０５（４Ｈ、ｍ、-C(O)-(CH₂)_n-CH₂ -CH=CH- 及びCH
=CH-CH ₂-(CH₂)_n-CH-）２．３０（２Ｈ、ｍ、-O-C(O)-CH ₂-）２．８０（２Ｈ、ｍ、-CH=CH-CH₂ -CH=CH-) ３．０〜３．７（６Ｈ、ｍ、イノシトール）３．８５及び３．９０（２Ｈ、ｍ、CH₂-O-P(O)(OH)-O-) ４．１４及び４．３５（２Ｈ、ｍ、CH ₂-O-C(O)-) ５．１（１Ｈ、ｍ、CH-O-C(O)-) ５．３（２Ｈ、ｍ、-CH=CH-CH₂-CH=CH-) ５．４（２Ｈ、ｍ、-CH=CH-CH₂-CH=CH-) ＩＲ（ヌジョール）：３３４０、１７３５ cm^-1 。

【００６８】例３無水アセトニトリル８０ｍｌ中の２ｇの粗（５０％）ホ
スファチジルイノシトール（１．２ミリモル）、３．２
７ｇ（４８ミリモル）のイミダゾ−ル、２６ｇ（２４ミ
リモル）のトリメチルシリルクロリド及び４．６４ｇ
（２８．８ミリモル）のヘキサメチルジシラザンの溶液
を窒素雰囲気下、室温で２時間攪拌し続けた。次に、こ
の混合物を１５０ｍｌのエチルエーテルで希釈してから
水（２ｘ５０ｍｌ）で洗浄し、さらに、飽和塩化ナトリ
ウム溶液（２ｘ５０ｍｌ）で洗浄した。

【００６９】次に有機層を硫酸ナトリウムで乾燥してか
ら減圧下で濃縮した。残留物を、１：１（ｖ／ｖ）エチ
ルアルコール／アセトン混合物（２０ｍｌ）で抽出す
る。ホスファチジルイノシトールの溶液を減圧下で濃縮
し、その残留物を、さらに処理することなしで後続の段
階に用いた。１．０７ｇのペンタシリレ−ト誘導体（重
質油）が７５％の収率で得られた。

【００７０】分析は次の通りであった：¹Ｈ−ＮＭＲ
（２００ＭＨｚ、ＣＤＣl₃）δ：０．１０(s); ０．８
５(m);１．２５(m); １．５５(m); ２．００(m);
２．２５(m); ２．７０(m);３．２０(m); ３．４０
(m); ３．５２(m); ５．３０(m); ＩＲ（液体フイルム）： cm^-1 ３４３０（OH）３０００、２９２０、２８５０（CH₂ 、CH）１７４０（C=O) １２５０（P=O)

【００７１】１０ｍｌのＴＨＦ中のその得られたシリル
化生成物３５０ｍｇ（０．２９３ミリモル）に、ＴＨＦ
中のテトラブチルアンモニウムルフルオリドの１．１Ｍ
溶液３．２ｍｌ（３．５２ミリモル）を加えた。その溶
液を室温で４時間攪拌し、次いで、これを１ＮのＨＣｌ
で酸性としてからエチルエーテルで希釈した。次に、エ
ーテル層を飽和塩化ナトリウム溶液で洗浄してから、硫
酸ナトリウムで乾燥し、減圧下で濃縮した。

【００７２】残留物をエチルアルコール／アセトン混合
物１０ｍｌ中に３０分間懸濁させた。ホスファチジルイ
ノシトールからなる固体残留物を濾過し、次に、４時間
室温で１ｍｍＨｇの圧力下で乾燥した。９８％よりも高
いホスファチジルイノシトール含量を有する２００ｍｇ
の生成物が得られた（８２％の収率）。分析は、例２の
結果と同じ結果を与える。

【００７３】例４４８０ｍｌの無水アセトニトリル中の１６ｇの大豆レシ
チン（ホスファチジルイノシトール含量約１３％）、
６．８ｇ（０．１モル）のイミダゾ−ル、６．３ｍｌ
（０．０５モル）のトリメチルシリルクロリド、１２．
７ｍｌ（０．０６モル）のヘキサメチルジシラザンの懸
濁物を窒素雰囲気下で室温で３時間攪拌した。この混合
物を、６００ｍｌのエチルエーテルで希釈してから、ま
ず水（３ｘ２００ｍｌ）で、次に、飽和塩化ナトリウム
溶液（２ｘ２００ｍｌ）で洗浄した。有機層を硫酸ナト
リウムで乾燥させてから、減圧下で濃縮した。粗生成物
を、１：１ｖ／ｖエチルアルコール／アセトン混合物に
より抽出した。そのシリル化ホスファチジルイノシトー
ルを減圧下で濃縮し、その残留物を、さらに処理するこ
となしで、後続の段階に用いた。ペンタシリル化ホスフ
ァチジルイノシトール１．５２ｇが、５１％の収率で得
られた。この生成物を、例３のように再シリル化した。
９８％よりも多いホスファチジルイノシトールを有する
生成物０．８５ｇが得られた。

【００７４】例５２６０ｍｇ（１１ミリモル）のナトリウム金属を１５ｍ
ｌの無水ＤＭＳＯに溶解させた。この溶液に、３．３４
ｇの粗（５０％）ホスファチジルイノシトール（２ミリ
モル）及び２．７ｍｌ（２０ミリモル）のアリルブロミ
ドを加えた。この混合物を、反応が完結するまで室温で
攪拌下に４時間保った。

【００７５】反応生成物を、溶離剤として５０：５０の
エチルエーテル／ヘキサン混合物をを用いてカラムクロ
マトグラフィーにより精製した。１．４５ｇのペンタア
リル化ホスファチジルイノシトールが、７０％の収率で
得られた。

【００７６】ＮＭＲ分析は次ぎの通りであった：¹Ｈ−
ＮＭＲ（９０ＭＨｚ、ＣＤＣl₃）δ：０．８５(m);
１．２５(m);２．０(m); ２．７５(m); ５．３〜５．
６(m); ５．６２〜５．９０(m);６．０〜６．４(m) 。

【００７７】３０ｍｌのエチルアルコールと１ｍｌの水
との混合物中に溶解させた上記のようにして得た１ｇ
（０．９６ミリモル）ペンタアリレ−トの溶液に、６５
ｍｇ（０．３４ミリモル）のパラトルエンスルホン酸と
０．８ｇのパラジウム（炭素に１０％担持させたもの）
を加えた。アリル基がを消失するまで（薄層クロマトグ
ラフィーによりエチルエーテル／ヘキサンの５０：５０
混合物を用いて対照した）、その混合物を数時間還流下
で加熱した。触媒を濾別し、溶液を減圧下で蒸発処理し
た。残留物を塩化メチレンに溶解し、この溶液を飽和重
炭酸ナトリウム溶液で洗浄し、さらに水で洗浄してか
ら、硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧下で濃縮した。得
られる生成物をクロロホルム・メタノール溶離剤を用い
てシリカゲルでクロマトグラフィーにより精製した。ホ
スファチジルイノシトールが９８％を越える生成物０．
６ｇが収率７５％でが得られた。

【００７８】分析は次の通りであった：¹Ｈ−ＮＭＲ
（２００ＭＨｚ、ＣＤＣl₃）δ：０．８５(m); １．２
５(m);１．５５(m); ２．０５(m); ２．３０(m);
２．７５(m); ５．３０(m) 。ＩＲ（ヌジュール）：３
３４０、１７３５ cm^-1

【００７９】

【発明の効果】本発明の高純度ホスファチジルイノシト
ールは中枢神経系の抗抑欝性の強い刺激活性を有し、ま
たこの活性は長期処置で持続する。

【図面の簡単な説明】

【図１】投薬処置と潜在的回避時間との関係を示すグラ
フである。

【図２】ＥＥＧ−ＣＳＡを示すグラフである。

【図３】絶望試験での投薬処置とシリンダーの回転数と
の関係を示すグラフである。

【図４】絶望試験での投薬処置とシリンダーの回転数と
の関係を示すグラフである。

【図５】絶望試験での投薬処置とシリンダーの回転数と
の関係を示すグラフである。

【図６】絶望試験での投薬処置とシリンダーの回転数と
の関係を示すグラフである。

【図７】絶望試験に用いた装置の概略図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者ピエルジユセツペパジエツライタリア国、15050 イソラサンアントニオ（アレツサンドウリア）、フラツイオーネカトウラリヤ（無番地） (72)発明者ステフアノマイオラナイタリア国、20128 ミラン、ヴイーアドンチポツロ６ (72)発明者マリオブルフアニイタリア国、00040 カステルガンドルフオ（ローメ）、ヴイーアアルドモロ 28

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】神経系障害の治療に適する高純度ホスフ
ァチジルイノシトールの製造方法において：ａ）少なくとも１０重量％のホスファチジルイノシトー
ルを含む植物由来の粗材料を、そのイノシトールのヒド
ロキシ基に保護基を付与する試薬で処理し、ｂ）このように保護基の付与されたホスファチジルイノ
シトールを溶剤抽出によるか又はシリカゲルを用いたク
ロマトグラフィーによりその反応混合物から分離し、ｃ）ホスファチジル基を変性させない条件下で該保護基
を除去する、ことを特徴とする高純度ホスファチジルイ
ノシトールの製造方法。
【請求項２】粗出発材料が５０〜６０重量％のホスフ
ァチジルイノシトールを含んでいることを特徴とする請
求項１記載の方法。
【請求項３】イノシトールのヒドロキシ基に保護基を
付与するために用いられる試薬が、ジメチル−ｔ−ブチ
ルシリルクロリド、ヘキシルジメチルシリルクロリド、
トリメチルシリルクロリド及びアリルブロミドからなる
群から選択されることを特徴とする請求項１記載の方
法。
【請求項４】段階（ａ）の反応が、ピリジンアセトニ
トリル、ジメチルホルムアミド及びジメチルスルホキシ
ドからなる群から選択された無水有機溶剤中で、室温
で、窒素雰囲気下で行われることを特徴とする請求項１
記載の方法。
【請求項５】段階（ｂ）の溶剤抽出がエチルアルコー
ルとアセトンとの混合物からなる溶剤を用いて行われる
ことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項６】段階（ｂ）のクロマトグラフィー分離
が、溶離剤として８０：２０〜９０：１０のクロロホル
ムとメタノールとの混合物又は５０：５０のエチルエー
テルとヘキサンとの混合物が用いられることを特徴とす
る請求項１記載の方法。
【請求項７】段階（ｃ）が、室温で、テトラヒドロフ
ラン中のテトラブチルアンモニウムフルオリドの助けに
より行われることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項８】段階（ｃ）が、室温で、酸性又は塩基性
での加水分解により行われることを特徴とする請求項１
記載の方法。
【請求項９】段階（ｃ）が、沸点のエチルアルコール
中の１０％Ｐｄ／Ｃ触媒を用いて行われることを特徴と
する請求項１記載の方法。
【請求項１０】中枢神経系障害の治療に適する９８％
を越える純度のホスファチジルイノシトール。
【請求項１１】中枢神経系障害の治療に適する薬剤組
成物の製造のための９８％を越える純度のホスファチジ
ルイノシトールの使用。
【請求項１２】該中枢神経障害が記憶障害又は抑欝障
害であることを特徴とする請求項１１記載のホスファチ
ジルイノシトールの使用。
【請求項１３】投与が、１日当たり５０〜１０００ｍ
ｇの投与量のホスファチジルイノシトールの経口投与で
あることを特徴とする記憶障害又は抑欝障害の治療のた
めの９８％を越える純度のホスファチジルイノシトール
の使用。