JPH0597A

JPH0597A - 新規抗ｔｃｆ−ｉｉモノクローナル抗体及びそれを用いるｔｃｆ−ｉｉの測定方法

Info

Publication number: JPH0597A
Application number: JP3177236A
Authority: JP
Inventors: Nobuyuki Shima; 伸行島; Kanji Too; 侃二東尾; Koji Itagaki; 康治板垣; Fumiko Ogaki; 文子大垣
Original assignee: Snow Brand Milk Products Co Ltd
Current assignee: Snow Brand Milk Products Co Ltd
Priority date: 1991-06-21
Filing date: 1991-06-21
Publication date: 1993-01-08
Also published as: KR930000539A; CA2071622A1; EP0519728A2; EP0519728A3

Abstract

(57)【要約】（修正有）【目的】ヒト線維芽細胞の生産する抗腫瘍性蛋白質Ｔ
ＣＦ−IIに対し特異的親和性を示すモノクローナル抗体
及びそれを用いるＴＣＦ−IIの測定方法。【構成】次の性質を示す、ＴＣＦ−IIに対するモノク
ローナル抗体 (i) 分子量約１５００００(ii) 抗体サブクラス
ＩｇＧ₁ (iii) Ｌ鎖Ｎ末端アミノ酸配列次の
（１）〜（３）のいずれか及びこのモノクローナル抗体を用いてＴＣＦ−IIを測定
する方法。【効果】モノクローナル抗体は、ＴＣＦ−IIの精製に
用いられる。また、この抗体を使用して血漿中のＴＣＦ
−II含量を測定することによって肝疾患の病状を診断す
ることができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はヒト抗腫瘍性蛋白質ＴＣ
Ｆ−IIに対する新規なモノクローナル抗体およびこの抗
体を用いたＴＣＦ−IIの測定方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】ヒト細胞由来の線維芽細胞が生産する腫
瘍細胞障害性因子としてβインターフェロンが広く知ら
れている。また線維芽細胞が生産する物質としては特開
昭５８─１４６２９３号公報、特開昭６１─３３１２０
号公報、特開昭６１─１８７２号公報、特開昭６２─１
０３０２１号公報、特開昭６４─１０９９８号公報にそ
れぞれ開示されている。本発明者らはヒト線維芽細胞由
来の抗腫瘍性蛋白質を研究する過程において、これまで
報告されたこれらの蛋白質と全く異なる新規な抗腫瘍性
物質を発見し、さらにこの蛋白質をコードするｃＤＮＡ
のクローニングに成功し、その全アミノ酸配列を確定す
るとともに、有用性を確認した。この新規な抗腫瘍性蛋
白質とその遺伝子はＷＯ９０／１０６５１として開示さ
れている。この新規抗腫瘍性蛋白質はＴＣＦ−IIと命名
されている。ＴＣＦ−IIのｃＤＮＡ配列から推定される
全アミノ酸配列を配列表の配列番号４に示した。

【０００３】このＴＣＦ−IIは強い抗腫瘍活性と正常細
胞の増殖活性を合わせもち、さらに肝臓実質細胞の増殖
因子であるＨＧＦの多様なファミリーの一種であること
が確認された。ＴＣＦ−IIはＳＤＳ電気泳動による分子
量測定では７８０００±２０００または７４０００±２
０００の分子量を示し、還元した場合５２０００±２０
００の共通のバンドであるＡ鎖と３００００±２０００
または２６０００±２０００の２本のバンド（Ｂ鎖、Ｃ
鎖）を示す。ＴＣＦ−IIに対する抗体はモノクロナー
ル、ポリクロナールともこれまで得られていない。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明者らはＴＣＦ─
IIの有用性に注目し、抗腫瘍剤としての利用や疾病の診
断のマーカーとしての利用を検討してきた。しかしこれ
まではＴＣＦ−IIの定量の手段として、癌細胞に対する
殺細胞効果を利用したバイオアッセイ方法のみであっ
た。このような微量物質の定量は現在はイムノアッセイ
法が測定の主流となってきており、このような測定のた
めに使用可能な抗体の供給が望まれていた。また、ＴＣ
Ｆ─IIの精製は古典的なゲル濾過や吸着クロマトの繰り
返しにより行われていたが、抗体を用いたアフィニティ
ークロマトにより精製回収の効率を向上させることが可
能である。本発明は、ＴＣＦ−IIに対して特異的で高い
親和性を有するモノクローナル抗体の提供とこれらを用
いたＴＣＦ−IIの測定方法を提供することを課題とす
る。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明に係る抗体とこれ
を得る方法は以下の手段による。本発明のモノクローナ
ル抗体はＴＣＦ−IIを免疫原として通常のモノクローナ
ル抗体を製造する方法に準じて実施することが可能であ
る。抗原としてのＴＣＦ−IIは先に示したＷＯ９０／１
０６５１に開示された方法によって得ることが可能であ
る。また同公報に記載された遺伝子配列に基づいて、微
生物や他の細胞により遺伝子組み換え操作により生産さ
れたものであっても差し支えない。またＴＣＦ−IIのア
ミノ酸配列に基づく合成ペプチドや、ＴＣＦ−IIの部分
分解ペプチドも使用可能である。さらに、これらの抗原
は必ずしも高度に精製されたものでなくとも抗原として
使用することが可能である。これらの抗原により哺乳動
物を免疫するかあるいはインビトロ法により免疫した細
胞を、哺乳動物の骨髄腫細胞（ミエローマ）などと融合
させ、ハイブリドーマを作成し、このハイブリドーマよ
りＴＣＦ−IIを認識する抗体を産生するクローンを選択
し、このクローンを培養することにより目的とする抗体
を得ることができる。

【０００６】ハイブリドーマの作成にあたっては哺乳動
物を使用する場合、どのような系も使用可能であるがマ
ウスやラットなどの小動物を使用した例が一般的であ
る。免疫は、ＴＣＦ−IIを生理食塩水などにより適当な
濃度に希釈し、この溶液を静脈内や腹腔内に投与し、こ
れに必要に応じて免疫アジュバントを併用投与し、動物
に２〜２０日ごとに２〜５回投与する。このようにして
免疫された動物を最終免疫後３日目に解剖し、脾臓を摘
出し、脾細胞を免疫細胞として使用する。

【０００７】免疫細胞と細胞融合するマウス由来の形質
細胞腫細胞としては、例えばｐ３／ｘ６３−Ａｇ８、ｐ
３−Ｕ１，ＮＳ−１，ＭＰＣ−１１，ＳＰ２／０，Ｆ
Ｏ，Ｐ３×６３Ａｇ８．６５３，Ｓ１９４などが例示で
きる。またラット由来の細胞としてはＲ−２１０などの
細胞株を例示できる。ヒト型の抗体を生産する場合には
Ｂリンパ球をインビトロ法により免疫し、ヒトミエロー
マ細胞やＥＢウィルスにより形質転換した細胞株を親株
として使用することによりヒト型の抗体を生産すること
ができる。

【０００８】免疫細胞と形質細胞腫細胞株の融合は公知
の方法、たとえばKoehler とMilsteinらの方法(Koehle
r,G.,et. al. Nature, vol.256,495-497,1975)が一般的
であるが電気パルスを使用した電気パルス法なども使用
可能である。免疫細胞と形質細胞腫細胞は通常行われて
いる細胞数の比に混合し、通常細胞培養に用いられるＦ
ＣＳ含有培地にポリエチレングリコールを添加して融合
処理を行い、ＨＡＴ選択培地で培養を行い、融合細胞を
選別する。

【０００９】ＴＣＦ−II抗体生産株を選別するためには
ＥＬＩＳＡ法、プラーク法、オクタロニー法、凝集法な
ど通常の抗体検出に使用されている方法を用いて選別す
ることができる。精製ＴＣＦ−IIを用いたＥＬＩＳＡ法
が比較的容易で且つ精度良く目的とする抗体生産株を選
別できる。

【００１０】このようにして選別されたハイブリドーマ
は通常の培養方法により継代培養可能であり、必要に応
じて凍結保存できる。ハイブリドーマは常法により培養
するかまたは、哺乳動物の腹腔内に移植し、腹水として
培養液を回収する。回収した培養液は塩析法、ゲル濾過
法、アフィニティークロマトグラフィーなどの通常の方
法により精製できる。

【００１１】得られた抗体はＴＣＦ−IIに特異的に反応
し、ＴＣＦ−IIの測定や精製に使用できる。ＴＣＦ−II
の測定に使用する場合は、抗体をアイソトープや酵素に
よりラベルすることにより、ラジオイムノアッセイ（Ｒ
ＩＡ）やエンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ）として知
られている測定系のＴＣＦ−II特異抗体として使用する
ことができる。とくに本発明により得られる抗体はその
抗原認識部位がそれぞれ異なった抗体を得ることができ
るため、サンドイッチイムノアッセイに使用することが
できるという特徴を有する。この測定系を用いることに
より、血液、尿などの生体試料や、培養液などのＴＣＦ
−II活性を容易に測定ができる。

【００１２】精製に用いる場合は、免疫沈降法や、アフ
ィゲル１０（バイオラッド社製）などの担体に固定化し
てアフィニティークロマトグラフィを行うことによりＴ
ＣＦ−IIを容易に精製できる。

【００１３】

【実施例】以下に実施例を示しさらに本発明を詳細に説
明する。実施例１抗原用ＴＣＦ−IIの精製ＷＯ９０／１０６５１公報に開示された方法及び東尾ら
の方法（Higashio,K.et.al. B.B.R.C.,vol.170,397-40
4,1990) に準じて細胞を培養し精製ＴＣＦ−IIを得た。
ヒト線維芽細胞ＩＭＲ−９０（ＡＴＣＣＣＣＬ１８
６）を５％子牛血清を含むＤＭＥＭ１００ｍｌをいれた
ローラーボトルに３×１０⁶個移植し、０．５〜２回転
／分の回転速度で回転させながら７日間培養を続けた。
総細胞数が１×１０⁷個になったところでトリプシンに
より細胞を剥離し細胞をボトル底面に集め、５〜９メッ
シュのセラミック１００ｇ（東芝セラミック社製）を滅
菌して投入し、２４時間静置して培養した。その後上記
培養液を５００ｍｌ加え、培養を継続した。７〜１０日
ごとに培地を全量回収し、新鮮培地を補給した。このよ
うにして２ケ月間の生産を継続し、ローラーボトル一本
あたり４ｌの培養液を回収した。

【００１４】このようにして得た培養液当たりの比活性
は３２ｕ／ｍｌであった。培養液７５ｌを特開表９０／
１０６５１（ＷＯ９０／１０６５１）に記載される方法
に従って旭化成ＵＦモジュール（ＭＷ６０００カッ
ト）処理によりＵＦ濃縮し、ＣＭセファデックスＣ−５
０（ファルマシア社製）、ＣｏｎＡセファロース（ファ
ルマシア社製）、ＭｏｎｏＳカラム（ファルマシア社
製）、ヘパリンセファロース（ファルマシア社製）によ
る５段階のクロマト精製を行い、比活性５２４８０００
ｕ／ｍｇの精製ＴＣＦ−IIを得た。

【００１５】実施例２抗ＴＣＦ−II抗体産生ハイブリドーマの調製実施例１で得た精製ＴＣＦ−IIを１０μｇ／１００μｌ
の濃度にＰＢＳに溶解し、この溶液を２週おきにＢＡＬ
Ｂ／ｃマウスに投与し免疫を行った。初回および２回目
の免疫においては等量のフロインドコンプリートアジュ
バントの混合物を投与した。最終の免疫後から３日目に
脾臓を摘出し、Ｂリンパ球を分離し、マウスミエローマ
細胞Ｐ３ｘ６３−ＡＧ８．６５３とをKoehler とMilste
inらの方法(Koehler,G.,et. al. Nature, vol.256,495-
497,1975) に従って細胞融合させた。ついで融合細胞を
選択するためにＨＡＴ培地で培養継代を繰り返しセレク
ションをおこなった。次にセレクションされた細胞がＴ
ＣＦ−II特異的抗体を産生しているか否かを調べるため
にＴＣＦ−IIをマイクロプレートに固相化し、ソリッド
フェーズＥＬＩＳＡ法を用いて、ハイブリドーマ培養上
清中のＴＣＦ−II特異的抗体の測定を行った。次いで抗
体産生が認められたハイブリドーマを限界希釈法によ
り、クローニングを５〜６回繰り返し行い、その都度上
記ＥＬＩＳＡ法により抗体産生量をチェックした。かく
して得られた抗体生産株の抗体生産量の高いクローンを
選別した。

【００１６】実施例３モノクローナル抗体の生産実施例２で得た抗体生産株をそれぞれ１×１０⁶を予め
プリスタン（アルドリッチケミカル社製）を接種してお
いたＢａｌｂ／ｃ系マウスに腹腔内に移植した。移植２
週間後、蓄積した腹水を採取し、本発明のモノクローナ
ル抗体を含む腹水を得た。この腹水より、アフィゲルプ
ロテインＡセファロースクロマト（バイオラッド社製）
を用いてマニュアルに従い精製抗体を得た。即ち、腹水
を等量のバインディングバッファー（バイオラッド製）
で希釈し、プロテインＡカラムにチャージした後、充分
量のバインディングバッファーで洗浄した。ＩｇＧの溶
出はエリューションバッファー（バイオラッド製）で行
った。得られた溶出液を水で透析した後、凍結乾燥を行
った。得られた精製抗体をＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動に
より純度検定を行ったところ分子量約１５００００の位
置に均一なバンドを認めた。

【００１７】実施例４ＴＣＦ−IIに対して高親和性を有するモノクロナール抗
体の選択実施例３で得た抗体をＰＢＳに溶解し、ローリー法によ
り蛋白定量を行った。ついで各抗体を蛋白濃度を一定に
してＰＢＳに溶解し、この溶液を段階希釈法により希釈
し、実施例２に記載したソリッドフェーズＥＬＩＳＡ法
により高い希釈段階までＴＣＦ−IIと反応するモノクロ
ナール抗体を選別した。その結果Ｐ５Ａ８、Ｐ２Ｄ６、
Ｐ１Ｃ８の３抗体を選択した。各抗体の生産株をそれぞ
れＰ５Ａ８株、Ｐ２Ｄ６株、Ｐ１Ｃ８株と命名しそれぞ
れの株を工業技術院微生物工業研究所に、微工研菌寄第
１２２６３号、微工研菌寄第１２２６４号、微工研菌寄
第１２２６５号として寄託した。

【００１８】実施例５抗体のサブクラスの検定実施例４で選択した抗体のサブクラスをフナコシ製イム
ノグロブリンサブクラス分析キットを用いて検定した。
検定はキットに指示されているプロトコールに従った。
検定結果を下記表１に示した。各抗体はともにＩｇＧ₁
のみに陽性となった。３抗体ともＩｇＧ₁サブクラスに
属することが明らかとなった。

【００１９】

【表１】

【００２０】実施例６抗体のＮ末端アミノ酸配列の特定抗体は特異な構造を有する二本鎖の蛋白質であることは
良く知られている。分子量の大きな重鎖（Ｈ鎖）と分子
量の小さな軽鎖（Ｌ鎖）からなっておりそれぞれのＮ末
端アミノ酸配列により抗体を特定することが可能であ
る。各抗体のＮ末端アミノ酸配列を以下のようにして決
定した。実施例４で選択した精製抗体を２μｇ／μｌの
濃度でＳＤＳ−ＰＡＧＥ用緩衝液（１ｍＭＥＤＴＡ，
２５％ＳＤＳ，０．０１％ＢＰＢ，１０％メルカプトエ
タノール，１０％グリセロールを含む１０ｍＭトリス塩
酸緩衝液，ｐＨ８．０）で１５０μｌ調製した。これを
１００°Ｃで３分間加熱した後１５０００ｒｐｍで３分
間遠心し、上清を得た。この上清を１０％ＳＤＳポリア
クリルアミドゲルで電気泳動を行った。ついでゲルから
ＰＶＤＦ膜（ポリビニリデンジフルオライド）への抗体
のＨ鎖およびＬ鎖の電気的転写をウエスタンブロッティ
ングにより行った。転写の完了したＰＶＤＦ膜をクマシ
ー染色を行い、目的とするＨ鎖、Ｌ鎖の相当バンドを切
り取った。切り取った膜を直接気相プロテインシーケン
サー（ＡＢＩ社製）に導入し、カップリング、クリベー
ジ、コンバージョン反応を装置のプロトコールに従って
自動的に進め、得られたフェニルチオヒダントイン（Ｐ
ＴＨ）アミノ酸を２０％アセトニトリルに溶解し、逆相
高圧液体クロマトグラフ（ＡＢＩ社製、Ｃ−１８カラム
装着）に注入し、その保持時間を標準ＰＴＨ−アミノ酸
の保持時間と比較することにより各ＰＴＨ−アミノ酸を
同定した。３抗体ともＨ鎖はＮ末端アミノ酸がブロック
されているため、本方法では同定できなかった。しかし
Ｌ鎖アミノ酸はそれぞれの抗体が下記の配列を有してい
ることが確認できた。

【００２１】Ｐ５Ａ８ Asp-Val-Val-Leu-Thr-Gln-Ser-Pro-Ala-Thr-Leu-Ser-Val-Thr-Pro-Gly-Asp- 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 Ser-Val 18 19

【００２２】Ｐ２Ｄ６ Asp-Ser-Val-Leu-Thr-Gln-Ser-Pro-Ala-Ser-Leu-Ala-Val-Ser-Leu-Gly-Gln- 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 Arg-Ala-Thr-Ile-Ser 18 19 20 21 22

【００２３】Ｐ１Ｃ８ Asp-Ile-Val-Leu-Thr-Gln-Ser-Pro-Val-Thr-Leu-Ser-Val-Thr-Pro-Gly-Gly- 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 Ser-Val 18 19

【００２４】実施例７ＴＣＦ−IIのＥＬＩＳＡによる測定方法実施例４で得たＰ５Ａ８、Ｐ２Ｄ６、Ｐ１Ｃ８の３種の
モノクロナル抗体をそれぞれ固相抗体と標識抗体とした
組み合わせによりサンドイッチＥＬＩＳＡを構築した。
抗体の酵素標識は、石川の方法（Ishikawa,E. et.al.,
J. Immunoassay,vol.4,209-327,1983)の方法に従いペル
オキシダーゼ標識した。固相抗体を１０μｇ／ｍｌの濃
度になるように０．１Ｍ重曹溶液に溶解し、９６穴マイ
クロプレート（ヌンク社製）に各ウエル当たり１００μ
ｌ分注し、室温で一晩放置した。次いでプレートを１％
ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）を含むＰＢＳで満たし、
室温で一時間放置し、ブロッキングを行った。引き続き
プレートを洗浄バッファー（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０
を含むＰＢＳ）で３回洗浄した。

【００２５】各濃度のＴＣＦ−IIを希釈バッファー
（０．１％ＢＳＡ，０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰ
ＢＳ）で調製したサンプルを１００μｌ分注した。３７
°Ｃで３時間放置した後、３回洗浄し、希釈バッファー
で２００〜４００倍に調製した標識抗体を１００μｌ分
注した。その後３７°Ｃで２時間放置し、次いで３回洗
浄し、基質溶液（０．４ｍｇ／ｍｌのオルトフェニレン
ジアミン塩酸、０．００６％過酸化水素を含む０．１Ｍ
クエン酸─リン酸バッファー，ｐＨ４．５）を１００μ
ｌ分注した。３７°Ｃで３０分間暗室に放置した後６Ｎ
硫酸を５０μｌ分注して酵素反応を止め、マイクロプレ
ートフォトメーター（コロナ社）で４９２ｎｍの吸光度
を測定した。

【００２６】固相抗体と標識抗体の組み合わせは下記の
表２に示す組み合わせで行った。各抗体の組み合わせに
よるＴＣＦ−II測定の標準曲線を図１に示した。Ｐ１Ｃ
８−Ｐ２Ｄ６およびＰ５Ａ８−Ｐ２Ｄ６の組み合わせに
よる測定が良好な結果が得られた。またＰ１Ｃ８とＰ５
Ａ８、Ｐ２Ｄ６の抗体はそれぞれ異なったエピトープ認
識性を有していることが明らかとなった。

【００２７】

【表２】

【００２８】実施例８ヒト血漿中のＴＣＦ−II量の測定以下の実施例は実施例７で確認した固相抗体─標識抗体
の組み合わせの内Ｐ１Ｃ８−Ｐ２Ｄ６のセットを用いて
行った。

【００２９】(1) ＴＣＦ−IIのスタンダードカーブと血
漿中のＴＣＦ−II添加回収固相抗体としてＰ１Ｃ８抗体を１０μｇ／ｍｌの濃度に
なるように０．１Ｍ重曹溶液に溶解し、９６穴マイクロ
プレート（ヌンク社製）に各ウエル当たり１００μｌ分
注し、室温で一晩放置した。次いでプレートを新本らの
方法（新本洋士他，雪印乳業研究所報告，８８号，４５
─５１，１９８９）に従いブロックエース（雪印乳業
製）を精製水で２倍に希釈した溶液をウエルに満たし、
室温で一時間放置し、ブロッキングを行った。引き続き
プレートを洗浄バッファー（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０
を含むＰＢＳ）で３回洗浄した。

【００３０】各濃度のＴＣＦ−IIを希釈バッファー（５
０％ブロックエース，０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰ
ＢＳｐＨ７．３）で調製した。比較のため同じ濃度系列
でヒト血漿にＴＣＦ−IIを添加した試料を調製し、ま
た、ＴＣＦ−IIと構造上のホモロジーの高いと推定され
るプラスミノーゲン（Nakamura et. al.,Nature,vol.34
2,440-443,1989) をＴＣＦ−IIとおなじ濃度になるよう
に上記希釈バッファーで調製した。これらのサンプル５
０μｌと同量の一次反応バッファー（５０％ブロックエ
ース，０．２ＭＮａＣｌ，０．１％Ｔｗｅｅｎ２０，
０．２％ＣＨＡＰＳ，２０ｍＭベンザミジン塩酸塩、１
０ｍＭＥＤＴＡを含むトリス塩酸バッファーｐＨ７．
３）を各ウエルに添加し、３７℃で３時間放置した後、
３回洗浄した。

【００３１】標識抗体の希釈には１／１０ブロックエー
ス、０．１５ＭＮａＣｌ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０、
４％ラット血清、５００μｇ／ｍｌマウスＩｇＧを含む
０．１Ｍリン酸バッファー、ｐＨ７を用いた。標識抗体
としてＰ２Ｄ６ペルオキシダーゼ標識抗体を４００倍に
調製した希釈液を１００μｌ添加した。その後３７°Ｃ
で２時間放置し、次いで３回洗浄し、基質溶液（０．４
ｍｇ／ｍｌのオルトフェニレンジアミン塩酸、０．００
６％過酸化水素を含む０．１Ｍクエン酸─リン酸バッフ
ァー，ｐＨ４．５）を１００μｌ分注した。３７°Ｃで
３０分間暗室に放置した後６Ｎ硫酸を５０μｌ分注して
酵素反応を止めた後マイクロプレートフォトメーター
（コロナ社）で４９２ｎｍの吸光度を測定した。

【００３２】測定結果を図２に示した。血漿中にＴＣＦ
−IIを添加した試料とＴＣＦ−IIの標準曲線は平行とな
り、完全に血漿中のＴＣＦ−IIを回収していることが確
認できた。またプラスミノーゲンはこの測定系において
は全く反応しないことが確認できた。

【００３３】(2) 肝疾患患者血漿中のＴＣＦ−II濃度の
測定上記(1) に記載した系により肝臓疾患患者４５例の血漿
中のＴＣＦ−IIレベルを測定した。肝臓疾患は劇症肝
炎、急性肝炎、慢性肝炎（非活動型、活動型）、代償性
肝炎、非代償性肝硬変及び肝臓癌の疾患を対象とした。
測定結果を図３に示した。また対照として正常人２１名
の測定結果をあわせて示した。正常人と比較して各肝疾
患患者血漿は平均ＴＣＦ−II濃度が高い値を示した。

【００３４】(3) 急性肝炎患者の急性期と回復期におけ
る血漿ＴＣＦ−IIの測定急性肝炎患者８例の急性期と回復期の血漿ＴＣＦ−IIレ
ベルを測定した。測定結果を図４に示した。一例を除
き、回復期にはＴＣＦ−IIレベルが低下しており、ＴＣ
Ｆ−IIレベルを測定することが急性肝炎患者の病態の変
化を表す指標となることが判明した。

【００３５】

【発明の効果】本発明により新規物質であるＴＣＦ−II
に対するモノクローナル抗体を提供することができる。
このモノクローナル抗体はＴＣＦ−II精製あるいは測定
に有用である。また本発明のモノクローナル抗体を用い
たＴＣＦ−IIの測定方法が提供される。その結果、肝疾
患あるいはその病状を微量の試料で的確に診断すること
ができる。

【００３６】

【配列表】配列番号：１配列の長さ：１９配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Asp Val Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Asp Ser Val 19

【００３７】配列番号：2 配列の長さ：22 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Asp Ser Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gln Arg Ala Thr Ile Ser 20 22

【００３８】配列番号：3 配列の長さ：19 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Val Thr Leu Ser Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Gly Ser Val 19

【００３９】配列番号:4 配列の長さ:723 配列の型: アミノ酸配列の種類: 蛋白質配列 Met Trp Val Thr Lys Leu Leu Pro Ala Leu Leu Leu Gln His Val Leu 1 5 10 15 Leu His Leu Leu Leu Leu Pro Ile Ala Ile Pro Tyr Ala Glu Gly Gln 20 25 30 Arg Lys Arg Arg Asn Thr Ile His Glu Phe Lys Lys Ser Ala Lys Thr 35 40 45 Thr Leu Ile Lys Ile Asp Pro Ala Leu Lys Ile Lys Thr Lys Lys Val 50 55 60 Asn Thr Ala Asp Gln Cys Ala Asn Arg Cys Thr Arg Asn Lys Gly Leu 65 70 75 80 Pro Phe Thr Cys Lys Ala Phe Val Phe Asp Lys Ala Arg Lys Gln Cys 85 90 95 Leu Trp Phe Pro Phe Asn Ser Met Ser Ser Gly Val Lys Lys Glu Phe 100 105 110 Gly His Glu Phe Asp Leu Tyr Glu Asn Lys Asp Tyr Ile Arg Asn Cys 115 120 125 Ile Ile Gly Lys Gly Arg Ser Tyr Lys Gly Thr Val Ser Ile Thr Lys 130 135 140 Ser Gly Ile Lys Cys Gln Pro Trp Ser Ser Met Ile Pro His Glu His 145 150 155 160 Ser Tyr Arg Gly Lys Asp Leu Gln Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Arg 165 170 175 Gly Glu Glu Gly Gly Pro Trp Cys Phe Thr Ser Asn Pro Glu Val Arg 180 185 190 Tyr Glu Val Cys Asp Ile Pro Gln Cys Ser Glu Val Glu Cys Met Thr 195 200 205 Cys Asn Gly Glu Ser Tyr Arg Gly Leu Met Asp His Thr Glu Ser Gly 210 215 220 Lys Ile Cys Gln Arg Trp Asp His Gln Thr Pro His Arg His Lys Phe 225 230 235 240 Leu Pro Glu Arg Tyr Pro Asp Lys Gly Phe Asp Asp Asn Tyr Cys Arg 245 250 255 Asn Pro Asp Gly Gln Pro Arg Pro Trp Cys Tyr Thr Leu Asp Pro His 260 265 270 Thr Arg Trp Glu Tyr Cys Ala Ile Lys Thr Cys Ala Asp Asn Thr Met 275 280 285 Asn Asp Thr Asp Val Pro Leu Glu Thr Thr Glu Cys Ile Gln Gly Gln 290 295 300 Gly Glu Gly Tyr Arg Gly Thr Val Asn Thr Ile Trp Asn Gly Ile Pro 305 310 315 320 Cys Gln Arg Trp Asp Ser Gln Tyr Pro His Glu His Asp Met Thr Pro 325 330 335 Glu Asn Phe Lys Cys Lys Asp Leu Arg Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro 340 345 350 Asp Gly Ser Glu Ser Pro Trp Cys Phe Thr Thr Asp Pro Asn Ile Arg 355 360 365 Val Gly Tyr Cys Ser Gln Ile Pro Asn Cys Asp Met Ser His Gly Gln 370 375 380 Asp Cys Tyr Arg Gly Asn Gly Lys Asn Tyr Met Gly Asn Leu Ser Gln 385 390 395 400 Thr Arg Ser Gly Leu Thr Cys Ser Met Trp Asp Lys Asn Met Glu Asp 405 410 415 Leu His Arg His Ile Phe Trp Glu Pro Asp Ala Ser Lys Leu Asn Glu 420 425 430 Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asp Asp Ala His Gly Pro Trp Cys Tyr 435 440 445 Thr Gly Asn Pro Leu Ile Pro Trp Asp Tyr Cys Pro Ile Ser Arg Cys 450 455 460 Glu Gly Asp Thr Thr Pro Thr Ile Val Asn Leu Asp His Pro Val Ile 465 470 475 480 Ser Cys Ala Lys Thr Lys Gln Leu Arg Val Val Asn Gly Ile Pro Thr 485 490 495 Arg Thr Asn Ile Gly Trp Met Val Ser Leu Arg Tyr Arg Asn Lys His 500 505 510 Ile Cys Gly Gly Ser Leu Ile Lys Glu Ser Trp Val Leu Thr Ala Arg 515 520 525 Gln Cys Phe Pro Ser Arg Asp Leu Lys Asp Tyr Glu Ala Trp Leu Gly 530 535 540 Ile His Asp Val His Gly Arg Gly Asp Glu Lys Cys Lys Gln Val Leu 545 550 555 560 Asn Val Ser Gln Leu Val Tyr Gly Pro Glu Gly Ser Asp Leu Val Leu 565 570 575 Met Lys Leu Ala Arg Pro Ala Val Leu Asp Asp Phe Val Ser Thr Ile 580 585 590 Asp Leu Pro Asn Tyr Gly Cys Thr Ile Pro Glu Lys Thr Ser Cys Ser 595 600 605 Val Tyr Gly Trp Gly Tyr Thr Gly Leu Ile Asn Tyr Asp Gly Leu Leu 610 615 620 Arg Val Ala His Leu Tyr Ile Met Gly Asn Glu Lys Cys Ser Gln His 625 630 635 640 His Arg Gly Lys Val Thr Leu Asn Glu Ser Glu Ile Cys Ala Gly Ala 645 650 655 Glu Lys Ile Gly Ser Gly Pro Cys Glu Gly Asp Tyr Gly Gly Pro Leu 660 665 670 Val Cys Glu Gln His Lys Met Arg Met Val Leu Gly Val Ile Val Pro 675 680 685 Gly Arg Gly Cys Ala Ile Pro Asn Arg Pro Gly Ile Phe Val Arg Val 690 695 700 Ala Tyr Tyr Ala Lys Trp Ile His Lys Ile Ile Leu Thr Tyr Lys Val 705 710 715 720 Pro Gln Ser 723

【図面の簡単な説明】

【図１】モノクローナル抗体の組み合わせにより得られ
たＴＣＦ−II測定標準曲線を示す。

【符号の説明】

■─■ 固相抗体Ｐ１Ｃ８−標識抗体Ｐ２Ｄ６〇─〇固相抗体Ｐ５Ａ８−標識抗体Ｐ２Ｄ６ □─□ 固相抗体Ｐ５Ａ８−標識抗体Ｐ１Ｃ８

【図２】血漿へのＴＣＦ−IIの添加回収試験結果と測定
系へのＴＣＦ−II特異性を示す。

【符号の説明】

●─● ＴＣＦ−II添加血漿 ×─× ＴＣＦ−II標準 ◆─◆ プラスミノーゲン

【図３】肝臓疾患患者血漿中のＴＣＦ−II測定結果を示
す。

【符号の説明】

● 慢性肝炎活動型患者を示す。ＦＨ：劇症肝炎、ＡＨ：急性肝炎、ＣＨ：慢性肝炎（非
活動型、活動型）、ｃＬＣ：代償性肝炎、ｄＬＣ：非代償性肝硬変、ＨＣ
Ｃ：肝臓癌

【図４】急性肝炎患者の急性期と回復期におけるＴＣＦ
−IIレベルの変動を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所 // Ａ６１Ｂ 10/00 Ｔ 7831−4ＣＣ１２Ｎ 5/20 15/06 (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ヒト抗腫瘍性蛋白質ＴＣＦ−IIに対し特
異的親和性を示し、分子量約１５００００, サブクラス
ＩｇＧ₁であるモノクロ−ナル抗体。
【請求項２】モノクローナル抗体のＬ鎖のＮ末端が下
記アミノ酸配列(1)〜(3) の何れかで特定される請求項
１記載のモノクローナル抗体。 (1) Asp-Val-Val-Leu-Thr-Gln-Ser-Pro-Ala-Thr-Leu-Ser-Val-Thr-Pro-Gly-Asp- 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 Ser-Val 18 19 (2) Asp-Ser-Val-Leu-Thr-Gln-Ser-Pro-Ala-Ser-Leu-Ala-Val-Ser-Leu-Gly-Gln- 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 Arg-Ala-Thr-Ile-Ser 18 19 20 21 22 (3) Asp-Ile-Val-Leu-Thr-Gln-Ser-Pro-Val-Thr-Leu-Ser-Val-Thr-Pro-Gly-Gly- 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 Ser-Val 18 19
【請求項３】ヒト抗腫瘍性蛋白質ＴＣＦ−IIを請求項
２に記載のモノクロ−ナル抗体を用いて測定することを
特徴とするＴＣＦ−IIの測定方法