【発明の詳細な説明】[Detailed description of the invention]
本発明は安定なペルオキシダーゼ（以下、
「PO」と略称することもある。）含有組成物に関
する。
POは過酸化水素の酸素を賦活してこれを被酸
化性物質に伝達する酵素であり、最近では診断試
薬、特に酵素免疫測定法（以下「EIA」と略称す
ることもある。）における標識用酵素としてその
重要性が増加してきた。しかしながらPOは溶液
状態においては単独の場合にも、また他の成分
（例えば免疫活性物質）と結合している場合にも
不安定で、特に実際に使用する約1μｇ／ml以下
の低濃度の場合には極端に不安定であり、従つて
測定用試薬の品質が維持され難く、安定した結果
が得られない。更にPOの酵素活性は、凍結乾燥
した場合でも著しく低下することがよく知られて
いる。
本発明者らは、かゝる欠点に鑑み、POを安定
化させる方法を得る目的で鋭意研究したところ、
PO、糖または糖アルコールおよび動物血清を含
有せしめた組成物が所期の目的を達成することを
見い出し、これに基づいてさらに研究した結果、
本発明を完成した。
本発明は、ペルオキシダーゼまたはこれと免
疫活性物質との結合体、糖または糖アルコール
および動物血清を含有せしめた組成物である。
本発明に用いられるペルオキシダーゼは、いず
れの由来のものでもよい。たとえば、植物から得
られるものとして、西洋わさび、パイナツプル、
イチジク、甘藷、ソラマメ、トウモロコシなどか
ら得られるペルオキシダーゼが挙げられ、特に西
洋わさびから得られるホースラデイツシユ・パー
オキシダーゼが好ましい。脊椎動物から得られる
ものとして、トリプトフアン・ピロラーゼなどが
挙げられる。微生物から得られるものとして、シ
ユードモナス属菌から得られるチトクロームＣ・
ペルオキシダーゼなどが挙げられる。
POは単独でもよいが、免疫活性物質と結合し
た結合状態のものであつてもよい。該免疫活性物
質としては、抗原、抗体および薬物等のハプテン
があげられる。該抗原としては、ホルモン〔例、
ヒト絨毛性ゴナドトロピン（以下「hCG」と略称
する。）、ヒト胎盤性ラクトーゲン、黄体ホルモ
ン、インスリン、成長ホルモン、副甲状腺ホルモ
ン、甲状腺刺激ホルモン、膵グルカゴン、カルシ
トニン、副腎皮質ホルモン、成長ホルモンなど〕、
タンパク質〔例、IgG，IgM，IgE，IGA，α−
フエトプロテイン、CEA（癌胎児性抗原）、フイ
ブリノーゲン、β2−ミクログロブリン、ミオグロ
ブリン、Ｃ反応性タンパクなど〕、ウイルス抗原
（例、風疹ウイルスHA抗原、センダイウイルス
HA抗原、肝炎ウイルス抗原など）、投与薬剤な
どが挙げられる。
抗体としては、従来既知の方法でウサギ、ラツ
ト、モルモツト、ヒツジ、ヤギ等の哺乳動物やニ
ワトリ、アヒル、ガチヨウ等の鳥類に抗原を免疫
して得られた抗体（例、抗hCG抗体、抗インシユ
リン抗体、抗α−フエトプロテイン抗体、抗膵グ
ルカゴン抗体、抗IgG抗体、抗IgM抗体、抗IgE
抗体など）ならびにMilsteinらの方法〔ネイチユ
ア（Nature）、第256巻（1975年）、第495頁〕で
得られたモノクローナル抗体であればいずれでも
よい。
ハプテンとしては、たとえばステロイド類、ビ
タミン類、カテコールアミン類、抗生物質（例、
ペニシリン類、セフアロポリン類、マクロライド
類、β−アドレナリン作働薬、ジアゼパム類な
ど）などが挙げられる。
POと免疫活性物質との結合の形態としては、
共有結合があげられる。結合方法としては、種々
の公知の方法に従えばよく、たとえば(a)メソツ
ド・エンザイモロジー（Methods Enzymology）
第37巻133頁（1975年）に記載された過ヨウ素酸
架橋法、すなわち、ペルオキシダーゼの糖の部分
を過ヨウ素酸で酸化してアルデヒドとし、これと
免疫活性物質のアミノ基とを架橋結合させる方
法、(b)ペルオキシダーゼと免疫化学的活性物質例
えばタンパクとをグルタルアルデヒドで架橋する
グルタルアルデヒド架橋法、すなわちペルオキシ
ダーゼとタンパクとを同時に加える１段階法〔イ
ムノケミストリー（Immunochemistry）、第６巻
（1969年）、第43頁参照〕とペルオキシダーゼをグ
ルタルアルデヒドで処理し洗浄後タンパクを結合
させる２段階法〔イムノケミストリー、第８巻
（1971年）、第1175頁参照〕、(c)アナリテイカル・
レターズ（Analytical Letters）第15巻147頁
（1982年）、特開昭58−149700号公報に記載の方
法、すなわちＮ−（４−カルボキシシクロヘキシ
ルメチル）マレイミドのＮ−ハイドロキシサクシ
ニイミドエステル等の化合物を用いて、POのア
ミノ基と免疫活性物質のスルフヒドリル基とを架
橋結合させる方法等があげられる。
本発明における糖としては、たとえば単糖類と
して５炭糖のアラビノース、キシロース、リボー
スなどが、６炭糖のグルコース、フラクトース、
マンノース、ガラクトース、ラムノースなどが、
二糖類としてマルトース、セロビオース、トレハ
ロース、ゲンチオビオース、ラクトース、シヨ糖
などが、三糖類としてラフイノース、マルトトリ
オースなどが、多糖類としてデキストリン、シク
ロデキストリン（α−，β−，γ−）、可溶性デ
ンプンなどが、それぞれ挙げられる。
糖アルコールとしては、炭素数５の単糖アルコ
ールとしてキシリツトなどが、炭素数６の単糖ア
ルコールとしてソルビツト、マンニツト、イノシ
トールなどが挙げられる。
なかでも、二糖類が好ましい。
糖または糖アルコールは、それらの混合物でも
よい。
本発明に用いられる動物血清としては、たとえ
ば羊血清、ヤギ血清、ウサギ血清、ウシ血清等が
あげられる。
本発明の組成物において、ペルオキシダーゼま
たはこれと免疫活性物質との結合体に対する糖ま
たは糖アルコールの比率は、通常約103ないし109
倍※
であり、好ましくは約105ないし107倍※
であ
る。ペルオキシダーゼまたはこれと免疫活性物質
との結合体に対する動物血清の比率は、通常約
103ないし109倍※
であり、好ましくは約105ない
し107倍※
である。（※：重量比）
本発明の組成物が混合物である場合、各成分の
添加順序は特に限定されない。
本発明の組成物とは、ペルオキシダーゼまた
はこれと免疫活性物質との結合体、糖または糖
アルコールおよび動物血清を含有せしめた水性
組成物のみならず、これを凍結乾燥して得られた
ものを含む。
本発明の水性組成物あるいは上記凍結乾燥に付
す直前の水性組成物において、POの含有量は通
常、該水性組成物中１ml当り約10pgないし１mg
となる量、好ましくは約100pgないし10μｇとな
る量である。また糖または糖アルコールの含有量
は、通常、該水性組成物中の濃度が約0.1ないし
30W／Ｖ％となる量、好ましくは約１ないし
10W／Ｖ％となる量である。動物血清の含有量
は、通常、該水性組成物中の濃度が約0.1ないし
30V／Ｖ％となる量、好ましくは約１ないし
10V／Ｖ％となる量である。
該水性組成物を調整する場合、各物質の添加順
序は特に限定されない。またこれら水性組成物に
数パーセントのアルギニン、リジン、グリシン、
アラニンなどのアミノ酸またはゼラチン、ゲリセ
イト、スキムミルクなどの蛋白質を添加してもよ
い。
該水性組成物を凍結乾燥するには常法、例えば
約−30℃ないし約−50℃で該水性組成物を凍結さ
せ、ついで約10℃ないし約20℃の温度で減圧下で
氷を昇華させて行なわれる。凍結乾燥後、窒素ガ
スシール又は減圧密栓すると、カビ・細菌等の混
入による腐敗・劣化を防止するためにより好まし
い。該窒素ガスシールは、通常、凍結乾燥物を十
分に窒素ガスで置換した後、窒素ガス気流下で密
栓することにより行われる。また減圧密栓は、通
常、凍結乾燥物を減圧下（例えば約10ないし0.01
mmHg）で密栓することにより行なわれる。
このようにして得られたPOを含有する水性組
成物の凍結乾燥物は、POの酵素活性がほとんど
失なわれておらず、また良い形状を保つているの
で、試薬として有用である。
また上記方法で得られたPOと免疫活性物質と
の結合体を含有する水性組成物の凍結乾燥物は、
その酵素活性は安定化されており、免疫活性の低
下が防止され、また良い形状を保つているので、
診断試薬として有用であり、特にPOが比較的安
価で高い比活性を有していることからEIA用の測
定試薬として有用である。かかるEIAでは、酵素
と結合した抗原を一定量の抗体と共に定量すべき
検液中の抗原に加え、競争的に結合させ、抗体に
結合もしくは非結合の酵素活性を測定する競争結
合法〔フエブス・レターズ（FEBS Letters）第
15巻232頁（1971年）、クリニカ、キミカ、アクタ
（Clinica Chimica Acta）第67巻283頁（1976年）
参照〕、あるいは固相上の抗体もしくは抗原に検
液中の抗原もしくは抗体を反応させ、固相に結合
した酵素活性を測定するサンドイツチ法が用いら
れ、また種々の変法が使用される〔クリニカ・キ
ミカ・アクタ（Clinica Chimica Acta）第81巻
第１頁（1977年）参照〕。
本発明の凍結乾燥物は、たとえば、サンドイツ
チ法によるhCGの免疫化学的測定法に、下記定量
用キツトの成分として用いることができる。該キ
ツトとしては、主として
(1) 担体上に保持された抗体
(2) POにより標識化された抗体（本発明の凍結
乾燥物。糖または糖アルコールおよび動物血清
も含有する。）
(3) ０〜100IUの標準hCG
(4) 上記(1)〜(3)の試薬および被検試料の希釈に用
いる緩衝液（該試薬および該被検試料の希釈に
用いることができる緩衝剤であればいずれでも
よいが、その一例としてはPH６〜９のリン酸緩
衝液またはグリシン緩衝液が挙げられる。）
(5) インキユベーシヨン後、担体の洗浄に用いる
緩衝液（該担体の洗浄に用いることができる緩
衝剤であればいずれでもよいが、その一例とし
てはリン酸緩衝液またはグリシン緩衝液が挙げ
られる。）
(6) 酸素基質（好ましくはオルトフエニレンジア
ミン）、酵素基質の溶解に用いる緩衝液（好ま
しくはリン酸緩衝液）および酵素反応停止に用
いる緩衝液（好ましくは硫酸）が挙げられる。
また、上記(1)と(2)とは、あらかじめ混合してあ
るものでもよい。
上記のキツトはたとえば下記の方法により使用
するのが好ましい。
標準hCGもしくは被検液約10〜200μに試薬
(4)を加えて希釈し、一定量の試薬 (1)、次いで試
薬(2)を約10〜300μを加えたのち、約０〜40℃
で反応させる。約１〜24時間反応後、試薬(5)で洗
浄し担体上に結合している標識剤の活性を測定す
る。基質液約10〜1000μを加えて約20〜40℃で
約0.5〜24時間反応させたのち、酵素反応を停止
させ、反応液中の吸光度を測定する。
上記した如く、本発明の組成物は、ペルオキシ
ダーゼの酵素活性が高く保持されている。したが
つて、該組成物は、試薬あるいは酵素免疫測定法
における診断試薬として有用である。
特に酵素免疫測定法による診断試薬の場合、高
い感度と再現性は重要な課題であり、そのために
は酵素標識抗体の酵素活性が高く保持されている
ことは必須である。さらに商品価値の面から、凍
結乾燥品の外観、溶解性とも良好でなければなら
ない。その点、本発明の組成物は、これら必要な
条件を全て満たしており、診断試薬としてきわめ
て有用である。
以下に、参考例、実施例を挙げて本発明を更に
具体的に説明するが、これらが本発明の範囲を制
限するものでないことはいうまでもない。
参考例 １
高度精製抗hCG・IgGの製造：
(1) 精製hCG（単位約10000IU／mg）をフロイン
ドの完全アジユバントと混合しウサギに免疫し
て得た抗hCG血清（ウサギ）に飽和硫酸アンモ
ニウムを添加し、塩析を行なつた。3000rpm30
分間遠心後、生じた沈澱を生理食塩水に溶解
し、一晩生理食塩水に透析し、抗hCG抗体ガン
マグロブリンを得た。
(2) 上記抗hCG抗体ガンマグロブリンをブロムシ
アン活性化セフアロース4B（フアルマシア・フ
アイン・ケミカル社製、スエーデン）に精製
hCG（単位約10000IU／mg）をザ・ジヤーナ
ル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー
（The Journal of Biological Chemistry）、第
245巻（1970年）、第3059頁に記載の方法に従つ
て結合させて作製したhCG結合セフアロース
4Bカラムで、免疫アフイニテイークロマトグ
ラフイーを行なつた。hCG結合セフアロース
4Bに保持された抗hCG抗体画分は、1M食塩加
グリシン−塩酸緩衝液（PH1.0）で溶出した。
溶出液から分取した有効画分は0.1M生理食塩
加リン酸緩衝液に対して透析し、精製抗hCG抗
体ガンマグロブリンを得た。
参考例 ２
抗hCG・IgG−Fab′−HRPO結合体の製造：
(1) 参考例１で作製した精製抗hCG・IgGをザ・
ジヤーナル・オブ・イムノロジー、第116巻
（1976年），第1554頁に記載の方法に従つて、ペ
プシンで消化しさらに２−メルカプトエチルア
ミンで37℃４時間還元した後、セフアデツクス
G25（フアルマシア・フアイン・ケミカルズ社
製、スエーデン）で精製し、抗hCG−IgGの
Fab′フラクシヨンを採取した。
(2) 西洋わさび由来のホースラデイツシユ・ペル
オキシダーゼ（HRPOと略称する。）にアナリ
テイカル・レターズ、第15巻（1982年）、第147
頁あるいは特開昭58−149700号公報に記載の方
法に従つて、Ｎ−（４−カルボキシシクロヘキ
シルメチル）マレイミドのＮ−ハイドロオキシ
サクシニイミドエステルを作用させてマレイミ
ド基を導入した。このマレイミド結合ペルオキ
シダーゼ1.5mgに上記(1)で作製した抗hCG・IgG
のFab′フラクシヨン1.7mgを加え、４℃、１晩
反応させた。反応混合物はウルトロゲル
（LKB社製、フランス）カラムで精製し、酵素
活性ならびに抗体活性を有するフラクシヨンを
分取し、抗hCG・IgGのFab′とHRPOの結合体
を得た。
参考例 ３
メソツド・エンゼイモロジー第37巻（1975年）、
第133頁に記載の方法に従つて、ペルオキシダー
ゼとフルオロジニトロベンゼン（DNP）とを室
温で１時間反応させ、0.01M Na2CO3緩衝液（PH
9.5）１晩透析した。透析後は0.06M過ヨウ素酸
を加えて室温30分酸化した後エチレングリコール
を加えて反応を停止させ、再び0.01M Na2CO3緩
衝液（PH9.5）で１晩透析した。次いで得られた
DNP−アルデヒド−パーオキシダーゼはヒト
IgGと室温３時間反応させ、NaBH4で還元、セ
フアデツクスＧ−200カラムで精製し、酵素活性
ならびに抗体活性を有するフラクシヨンを分取
し、ヒトIgGとHRPOとの結合体を得た。
参考例 ４
酵素活性の測定法：
0.02％過酸化水素含有0.2％、オルトフエニレ
ンジアミン溶液（PH4.9）500μにペルオキシダ
ーゼまたはペルオキシダーゼ結合抗体を所定量加
え、混合した後、室温で１時間反応する。次いで
2N−硫酸1.5mlを加え混合し、酵素反応を停止さ
せる。反応液中の吸光値（波長492nm）を測定
し、酵素活性を算出する。
実施例 １
西洋わさび由来のホースラデイツシユ・ペルオ
キシダーゼを下記の緩衝液(a)，(b)及び(c)にそれぞ
れ溶解した。溶解液のそれぞれのHRPO濃度は
40ng／mlであつた。
(a) ５％（Ｗ／Ｖ）糖または糖アルコール（糖ま
たは糖アルコールの種類は第１表に示す）、
0.85％（Ｗ／Ｖ）NaCl含有0.01Mリン酸緩衝液
（PH8.0）
(b) ５％（Ｗ／Ｖ）糖または糖アルコール、５％
（Ｖ／Ｖ）羊血清、0.85％（Ｗ／Ｖ）NaCl含有
0.01Mリン酸緩衝液（PH8.0）
(c) (b)と同様であるが糖または糖アルコールを含
まないもの。
(d) (a)と同様であるが糖または糖アルコールを含
まないもの。
上記HRPO含有水性組成物を−40℃で凍結し、
次いで10℃、10mmHg以下で凍結乾燥し、凍結乾
燥物を得た。室温で２日間放置後凍結乾燥物を開
封し、得られた組成物について参考例４記載の方
法でHRPO酵素活性を測定したところ第１表の
結果を得た。
The present invention provides stable peroxidase (hereinafter referred to as
It is sometimes abbreviated as "PO". ) Containing composition. PO is an enzyme that activates oxygen in hydrogen peroxide and transfers it to oxidizable substances, and recently it has been used as a label in diagnostic reagents, especially in enzyme-linked immunosorbent assays (hereinafter sometimes abbreviated as "EIA"). Its importance as an enzyme has increased. However, PO is unstable in solution either alone or in combination with other components (e.g., immunoactive substances), especially at low concentrations below about 1 μg/ml, which is used in practice. is extremely unstable, and therefore the quality of the measurement reagent is difficult to maintain and stable results cannot be obtained. Furthermore, it is well known that the enzymatic activity of PO is significantly reduced even when it is freeze-dried. In view of these drawbacks, the present inventors conducted extensive research with the aim of finding a method to stabilize PO, and found that
We found that a composition containing PO, sugar or sugar alcohol, and animal serum achieved the intended purpose, and based on this, we conducted further research.
The invention has been completed. The present invention is a composition containing peroxidase or a conjugate thereof with an immunologically active substance, sugar or sugar alcohol, and animal serum. The peroxidase used in the present invention may be of any origin. For example, horseradish, pineapple,
Examples include peroxidase obtained from figs, sweet potatoes, fava beans, corn, etc., and horseradish peroxidase obtained from horseradish is particularly preferred. Examples of those obtained from vertebrates include tryptophan pyrrolase. Cytochrome C, obtained from Pseudomonas bacteria, can be obtained from microorganisms.
Examples include peroxidase. PO may be used alone or in a bound state in which it is bound to an immunologically active substance. Examples of the immunologically active substance include antigens, antibodies, and haptens such as drugs. The antigen includes hormones [e.g.
human chorionic gonadotropin (hereinafter abbreviated as "hCG"), human placental lactogen, progestin, insulin, growth hormone, parathyroid hormone, thyroid stimulating hormone, pancreatic glucagon, calcitonin, adrenocortical hormone, growth hormone, etc.],
Proteins [e.g., IgG, IgM, IgE, IGA, α-
fetoprotein, CEA (carcinoembryonic antigen), fibrinogen, β 2 -microglobulin, myoglobulin, C-reactive protein, etc.], viral antigens (e.g., rubella virus HA antigen, Sendai virus)
(HA antigen, hepatitis virus antigen, etc.), administered drugs, etc. Antibodies include antibodies obtained by immunizing mammals such as rabbits, rats, guinea pigs, sheep, and goats, and birds such as chickens, ducks, and geese using known methods (e.g., anti-hCG antibodies, anti-insulin antibodies). Antibodies, anti-α-fetoprotein antibodies, anti-pancreatic glucagon antibodies, anti-IgG antibodies, anti-IgM antibodies, anti-IgE
Any monoclonal antibody obtained by the method of Milstein et al. [Nature, Vol. 256 (1975), p. 495] may be used. Examples of haptens include steroids, vitamins, catecholamines, antibiotics (e.g.
penicillins, cephaloporins, macrolides, β-adrenergic agonists, diazepams, etc.). The form of binding between PO and immunoactive substances is as follows:
Examples include covalent bonds. As a binding method, various known methods may be used, such as (a) Methods Enzymology.
The periodic acid crosslinking method described in Vol. 37, p. 133 (1975) involves oxidizing the sugar moiety of peroxidase with periodic acid to form an aldehyde, which is then crosslinked with the amino group of the immunoactive substance. (b) Glutaraldehyde cross-linking method in which peroxidase and an immunochemically active substance such as protein are cross-linked with glutaraldehyde, i.e., a one-step method in which peroxidase and protein are added simultaneously [Immunochemistry, Vol. 6 (1969) (c) Analytical
The method described in Analytical Letters, Vol. 15, p. 147 (1982), JP-A-58-149700, that is, compounds such as N-hydroxysuccinimide ester of N-(4-carboxycyclohexylmethyl)maleimide Examples include a method of cross-linking the amino group of PO and the sulfhydryl group of an immunologically active substance using . Examples of sugars in the present invention include monosaccharides such as pentose arabinose, xylose, ribose, hexose glucose, fructose, etc.
Mannose, galactose, rhamnose, etc.
Disaccharides include maltose, cellobiose, trehalose, gentiobiose, lactose, sucrose, etc. Trisaccharides include raffinose, maltotriose, etc. Polysaccharides include dextrin, cyclodextrin (α-, β-, γ-), soluble starch, etc. can be mentioned respectively. Examples of the sugar alcohol include monosaccharide alcohols having 5 carbon atoms, such as xylitol, and monosaccharide alcohols having 6 carbon atoms, such as sorbitol, mannitol, and inositol. Among them, disaccharides are preferred. The sugar or sugar alcohol may be a mixture thereof. Examples of the animal serum used in the present invention include sheep serum, goat serum, rabbit serum, and bovine serum. In the composition of the present invention, the ratio of sugar or sugar alcohol to peroxidase or its conjugate with an immunoactive substance is usually about 10 3 to 10 9
times*, preferably about 10 5 to 10 7 times*. The ratio of animal serum to peroxidase or its conjugate with an immunoactive substance is usually approximately
10 3 to 10 9 times*, preferably about 10 5 to 10 7 times*. (*: Weight ratio) When the composition of the present invention is a mixture, the order of addition of each component is not particularly limited. The composition of the present invention includes not only an aqueous composition containing peroxidase or its conjugate with an immunoactive substance, sugar or sugar alcohol, and animal serum, but also a composition obtained by freeze-drying the same. . In the aqueous composition of the present invention or the aqueous composition immediately before being subjected to freeze-drying, the content of PO is usually about 10 pg to 1 mg per ml of the aqueous composition.
The amount is preferably about 100 pg to 10 μg. The content of sugar or sugar alcohol in the aqueous composition is usually about 0.1 to
30W/V%, preferably about 1 to
The amount is 10W/V%. The content of animal serum is usually such that the concentration in the aqueous composition is about 0.1 to
30V/V%, preferably about 1 to
The amount is 10V/V%. When preparing the aqueous composition, the order of addition of each substance is not particularly limited. These aqueous compositions also contain several percent of arginine, lysine, glycine,
Amino acids such as alanine or proteins such as gelatin, gelisate, and skim milk may be added. The aqueous composition can be lyophilized using conventional methods, such as freezing the aqueous composition at about -30°C to about -50°C and then sublimating the ice under reduced pressure at a temperature of about 10°C to about 20°C. It is done. After freeze-drying, sealing with nitrogen gas or sealing under reduced pressure is more preferable in order to prevent spoilage and deterioration due to contamination with mold, bacteria, etc. The nitrogen gas sealing is usually performed by sufficiently replacing the freeze-dried material with nitrogen gas and then sealing the container under a nitrogen gas flow. In addition, vacuum seals are usually used to store freeze-dried products under reduced pressure (for example, about 10 to 0.01
mmHg). The lyophilized product of the aqueous composition containing PO obtained in this manner is useful as a reagent because the enzymatic activity of PO is hardly lost and the composition maintains a good shape. In addition, the freeze-dried product of the aqueous composition containing the conjugate of PO and immunoactive substance obtained by the above method is
Its enzyme activity is stabilized, preventing a decline in immune activity and maintaining its good shape.
It is useful as a diagnostic reagent, and is particularly useful as a measurement reagent for EIA because PO is relatively inexpensive and has a high specific activity. In such EIA, an antigen bound to an enzyme is added to the antigen in a test solution to be quantified together with a certain amount of antibody, and the competitive binding method [Hevbus Co., Ltd. Letters (FEBS Letters) No.
Vol. 15, p. 232 (1971), Clinica Chimica Acta, Vol. 67, p. 283 (1976)
Alternatively, the Sand-Deutsch method is used, in which the antigen or antibody in the test solution is reacted with the antibody or antigen on the solid phase and the activity of the enzyme bound to the solid phase is measured, and various modified methods are also used [Clinica et al.・See Clinica Chimica Acta, Volume 81, Page 1 (1977)]. The lyophilizate of the present invention can be used, for example, in an immunochemical measurement method for hCG using the Sand-Deutsch method, as a component of the quantitative kit described below. The kit mainly contains (1) an antibody held on a carrier, (2) an antibody labeled with PO (lyophilized product of the present invention, also containing sugar or sugar alcohol and animal serum), (3) 0 ~100 IU of standard hCG (4) Buffer used for diluting the reagents (1) to (3) above and the test sample (any buffer that can be used for diluting the reagent and test sample) (5) After incubation, a buffer used for washing the carrier (an example is a phosphate buffer or a glycine buffer with a pH of 6 to 9). (6) A buffer used for dissolving an oxygen substrate (preferably orthophenylenediamine) and an enzyme substrate ( (preferably a phosphate buffer) and a buffer (preferably sulfuric acid) used for stopping an enzyme reaction. Moreover, the above (1) and (2) may be mixed in advance. The kit described above is preferably used, for example, in the following manner. Standard hCG or test solution approximately 10-200μ reagent
Add reagent (4) to dilute it, add a certain amount of reagent (1), then add about 10 to 300μ of reagent (2), and then
React with. After reacting for about 1 to 24 hours, the carrier is washed with reagent (5) and the activity of the labeling agent bound on the carrier is measured. After adding about 10 to 1000 μ of the substrate solution and reacting at about 20 to 40°C for about 0.5 to 24 hours, the enzyme reaction is stopped and the absorbance in the reaction solution is measured. As described above, the composition of the present invention maintains high peroxidase enzyme activity. Therefore, the composition is useful as a reagent or a diagnostic reagent in enzyme immunoassay. Particularly in the case of diagnostic reagents based on enzyme immunoassay, high sensitivity and reproducibility are important issues, and for this purpose it is essential that the enzyme activity of the enzyme-labeled antibody is maintained at a high level. Furthermore, from the viewpoint of commercial value, the lyophilized product must have good appearance and solubility. In this respect, the composition of the present invention satisfies all of these necessary conditions and is extremely useful as a diagnostic reagent. The present invention will be explained in more detail below by reference examples and examples, but it goes without saying that these do not limit the scope of the present invention. Reference Example 1 Production of highly purified anti-hCG/IgG: (1) Add saturated ammonium sulfate to anti-hCG serum (rabbit) obtained by immunizing rabbits with purified hCG (unit: approx. 10,000 IU/mg) mixed with Freund's complete adjuvant. Then, salting out was performed. 3000rpm30
After centrifugation for one minute, the resulting precipitate was dissolved in physiological saline and dialyzed against physiological saline overnight to obtain the anti-hCG antibody gamma globulin. (2) Purify the above anti-hCG antibody gamma globulin to bromcyan-activated Sepharose 4B (manufactured by Pharmacia Huain Chemical, Sweden)
hCG (approximately 10,000 IU/mg) in The Journal of Biological Chemistry, No.
hCG-conjugated sepharose prepared by conjugation according to the method described in Vol. 245 (1970), p. 3059
Immunoaffinity chromatography was performed on a 4B column. hCG-conjugated cephalose
The anti-hCG antibody fraction retained in 4B was eluted with 1M sodium chloride glycine-hydrochloric acid buffer (PH 1.0).
The effective fraction collected from the eluate was dialyzed against 0.1 M saline phosphate buffer to obtain purified anti-hCG antibody gamma globulin. Reference Example 2 Production of anti-hCG/IgG-Fab'-HRPO conjugate: (1) The purified anti-hCG/IgG produced in Reference Example 1 was
According to the method described in Journal of Immunology, Vol. 116 (1976), p. 1554, after digestion with pepsin and further reduction with 2-mercaptoethylamine at 37°C for 4 hours, cephadex
Anti-hCG-IgG was purified using G25 (Pharmacia Huain Chemicals, Sweden).
Fab′ fraction was collected. (2) Horseradish peroxidase (abbreviated as HRPO) derived from horseradish, Analytical Letters, Volume 15 (1982), No. 147
A maleimide group was introduced by reacting with N-hydroxysuccinimide ester of N-(4-carboxycyclohexylmethyl)maleimide according to the method described in JP-A-58-149700. Add 1.5 mg of this maleimide-conjugated peroxidase to the anti-hCG/IgG prepared in (1) above.
1.7 mg of Fab' fraction was added thereto, and the mixture was reacted at 4°C overnight. The reaction mixture was purified using an Ultrogel (LKB, France) column, and a fraction having enzyme activity and antibody activity was fractionated to obtain a conjugate of anti-hCG/IgG Fab' and HRPO. Reference example 3 Method Engineology Volume 37 (1975),
According to the method described on page 133, peroxidase and fluorodinitrobenzene (DNP) were reacted at room temperature for 1 hour, and 0.01M Na 2 CO 3 buffer (PH
9.5) Dialyzed overnight. After dialysis, 0.06M periodic acid was added to oxidize at room temperature for 30 minutes, ethylene glycol was added to stop the reaction, and the mixture was again dialyzed overnight against 0.01M Na 2 CO 3 buffer (PH9.5). then obtained
DNP-aldehyde-peroxidase is human
The mixture was reacted with IgG at room temperature for 3 hours, reduced with NaBH 4 , purified using a Sephadex G-200 column, and a fraction having enzyme activity and antibody activity was collected to obtain a conjugate of human IgG and HRPO. Reference example 4 Enzyme activity measurement method: Add a specified amount of peroxidase or peroxidase-conjugated antibody to 500μ of 0.2% orthophenylenediamine solution (PH4.9) containing 0.02% hydrogen peroxide, mix, and react for 1 hour at room temperature. . then
Add 1.5 ml of 2N sulfuric acid and mix to stop the enzyme reaction. Measure the absorbance value (wavelength 492 nm) in the reaction solution and calculate the enzyme activity. Example 1 Horseradish peroxidase derived from horseradish was dissolved in the following buffers (a), (b) and (c), respectively. The respective HRPO concentration of the lysate is
It was 40ng/ml. (a) 5% (W/V) sugar or sugar alcohol (types of sugar or sugar alcohol are shown in Table 1),
0.01M phosphate buffer (PH8.0) containing 0.85% (W/V) NaCl (b) 5% (W/V) sugar or sugar alcohol, 5%
(V/V) Sheep serum, containing 0.85% (W/V) NaCl
0.01M phosphate buffer (PH8.0) (c) Same as (b) but without sugar or sugar alcohol. (d) Same as (a) but without sugars or sugar alcohols. Freeze the HRPO-containing aqueous composition at -40°C,
The mixture was then freeze-dried at 10°C and below 10 mmHg to obtain a freeze-dried product. After being left at room temperature for 2 days, the lyophilized product was opened, and the HRPO enzyme activity of the resulting composition was measured by the method described in Reference Example 4, and the results shown in Table 1 were obtained.
【表】
上記の表１から明らかなように、HRPO含有
水性組成物(a)の凍結乾燥物を開封して得られた組
成物はいずれもPOの酵素活性は低いが、糖また
は糖アルコールおよび羊血清を添加したHRPO
含有水性組成物(b)の凍結乾燥物を開封して得られ
た組成物では、いずれも初期活性の80％以上とい
う高い酵素活性を保持していた。またHRPO含
有水性組成物(c)および(d)の凍結乾燥物を開封して
得られた組成物では、酵素活性はきわめて低下し
ていた。
実施例 ２
参考例２で得られた抗hCG・IgGのFab′−
HRPO結合体を実施例１で選定した下記の緩衝
液に溶解した。それぞれの溶液中のHRPO−
Fab′濃度は500ng／mlであつた。
(a) ５％（Ｗ／Ｖ）糖（糖の種類は第２表に示
す）、0.85％（Ｗ／Ｖ）NaCl含有0.1Mリン酸緩
衝液（PH8.0）
(b) ５％（Ｗ／Ｖ）糖、５％（Ｖ／Ｖ）羊血清、
0.85％（Ｗ／Ｖ）NaCl含有0.1Mリン酸緩衝液
（PH8.0）
(c) (a)と同じであるが、糖類を含まないもの。
上記のHRPO−Fab′含有水性組成物を−40℃
で凍結し、次いで10℃、10mmHg以下で凍結乾燥
後、該凍結乾燥物を十分に窒素ガス置換し、窒素
ガス気流下で密栓することにより窒素ガスシール
を行ない、凍結乾燥を得た。凍結乾燥物につい
て、凍結乾燥直後および50℃、24時間保存後の
HRPO酵素活性を実施例１と同様測定したとこ
ろ、第２表の結果を得た。[Table] As is clear from Table 1 above, all of the compositions obtained by opening the freeze-dried product of HRPO-containing aqueous composition (a) have low PO enzyme activity, but contain sugar or sugar alcohol and HRPO supplemented with sheep serum
The compositions obtained by opening the freeze-dried products of the aqueous composition (b) contained therein all retained a high enzyme activity of 80% or more of the initial activity. Further, in the compositions obtained by opening the freeze-dried products of HRPO-containing aqueous compositions (c) and (d), the enzyme activity was extremely reduced. Example 2 Fab'- of anti-hCG/IgG obtained in Reference Example 2
The HRPO conjugate was dissolved in the following buffer selected in Example 1. HRPO− in each solution
Fab' concentration was 500ng/ml. (a) 5% (W/V) sugar (types of sugar are shown in Table 2), 0.1M phosphate buffer containing 0.85% (W/V) NaCl (PH8.0) (b) 5% (W/V) /V) sugar, 5% (V/V) sheep serum,
0.1M phosphate buffer containing 0.85% (W/V) NaCl (PH8.0) (c) Same as (a), but without sugars. The above HRPO-Fab′-containing aqueous composition was heated at −40°C.
After freeze-drying at 10° C. and below 10 mmHg, the freeze-dried product was sufficiently replaced with nitrogen gas, and sealed under a nitrogen gas flow to seal with nitrogen gas to obtain freeze-drying. For freeze-dried products, immediately after freeze-drying and after storage at 50℃ for 24 hours.
HRPO enzyme activity was measured in the same manner as in Example 1, and the results shown in Table 2 were obtained.
【表】
上記表２から明らかなように、凍結乾燥物(a)お
よび(b)はいずれも凍結乾燥物(b)を24時間保存して
開封して得られた組成物は、高々初期活性の80％
の酵素活性を保持しているにすぎないが、糖類に
羊血清を添加した凍結乾燥物(b)は24時間保存後も
100％近い残存活性を示し、酵素の安定性は高く
保持されていた。
実施例 ３
参考例２で得られた抗hCG・IgGのFab′−
HRPO結合体を５％（Ｗ／Ｖ）マルトースに第
３表に示す各種動物血清、牛血清アルブミン〔以
下BSAと略す〕、又はヒト血清アルブミン〔以下
HSAと略す〕を添加した0.85％（Ｗ／Ｖ）NaCl
含有0.1Mリン酸緩衝液（PH8.0）に溶解した。次
いで、実施例２と同様に処理して凍結乾燥物を得
た。
凍結乾燥物について、凍結乾燥直後および50
℃、24時間保存後のHRPO酵素活性を参考例４
記載の方法で測定したところ、第３表の結果を得
た。[Table] As is clear from Table 2 above, for both lyophilized products (a) and (b), the composition obtained by storing the lyophilized product (b) for 24 hours and opening it has at most initial activity. 80% of
However, the freeze-dried product (b), which is made by adding sheep serum to sugars, retains its enzyme activity even after 24 hours of storage.
It showed nearly 100% residual activity, and the stability of the enzyme was maintained at a high level. Example 3 Fab'- of anti-hCG/IgG obtained in Reference Example 2
The HRPO conjugate was mixed with 5% (W/V) maltose, various animal serums shown in Table 3, bovine serum albumin [hereinafter abbreviated as BSA], or human serum albumin [hereinafter abbreviated as BSA].
0.85% (W/V) NaCl added with HSA
It was dissolved in 0.1M phosphate buffer (PH8.0) containing Then, it was treated in the same manner as in Example 2 to obtain a freeze-dried product. For freeze-dried products, immediately after freeze-drying and 50
Reference example 4 HRPO enzyme activity after storage at ℃ for 24 hours
When measured using the method described, the results shown in Table 3 were obtained.
【表】
表３から明らかなように、マルトースおよび動
物血清を添加した凍結乾燥物は、凍結乾燥直後お
よび50℃、24時間保存後とも、90％以上の残存酵
素活性を示し、安定性も優れていた。
しかし、マルトースおよびBSAあるいはHSA
を添加した場合は、凍結乾燥による残存活性およ
びさらに50℃、24時間保存後の酵素活性は、著し
く低下していた。
実施例 ４
参考例３で得られたヒトIgGとHRPOとの結合
体を緩衝液〔マルトース（０〜20％Ｗ／Ｖ）、羊
血清（０〜20％Ｗ／Ｖ）、0.85％Ｗ／Ｖ NaCl含
有0.1Mリン酸緩衝液（PH8.0）〕に溶解し、実施
例２と同様に処理して凍結乾燥物を得た。凍結乾
燥物について、凍結乾燥直後および50℃、24時間
保存後のHRPO酵素活性を参考例４記載の方法
で測定したところ第４表の結果を得た。[Table] As is clear from Table 3, the freeze-dried product containing maltose and animal serum showed more than 90% residual enzyme activity immediately after freeze-drying and after storage at 50°C for 24 hours, and had excellent stability. was. However, maltose and BSA or HSA
When the enzyme was added, the residual activity after freeze-drying and the enzyme activity after storage at 50°C for 24 hours were significantly reduced. Example 4 The conjugate of human IgG and HRPO obtained in Reference Example 3 was added to a buffer solution [maltose (0-20% W/V), sheep serum (0-20% W/V), 0.85% W/V 0.1M phosphate buffer containing NaCl (PH8.0)] and treated in the same manner as in Example 2 to obtain a lyophilized product. The HRPO enzyme activity of the freeze-dried product was measured immediately after freeze-drying and after storage at 50°C for 24 hours using the method described in Reference Example 4, and the results shown in Table 4 were obtained.
【表】
第４表から明らかなように、マルトースと羊血
清とを含む凍結乾燥物を開封して得られた組成物
の酵素活性はいずれも初期活性の90％以上の活性
を保持していた。[Table] As is clear from Table 4, the enzyme activities of the compositions obtained by opening the freeze-dried products containing maltose and sheep serum all retained 90% or more of the initial activity. .