JPH05994B2 - - Google Patents
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- JPH05994B2 JPH05994B2 JP59046258A JP4625884A JPH05994B2 JP H05994 B2 JPH05994 B2 JP H05994B2 JP 59046258 A JP59046258 A JP 59046258A JP 4625884 A JP4625884 A JP 4625884A JP H05994 B2 JPH05994 B2 JP H05994B2
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本発明は安定なペルオキシダーゼ（以下、
「PO」と略称することもある。）含有組成物に関
する。 POは過酸化水素の酸素を賦活してこれを被酸
化性物質に伝達する酵素であり、最近では診断試
薬、特に酵素免疫測定法（以下「EIA」と略称す
ることもある。）における標識用酵素としてその
重要性が増加してきた。しかしながらPOは溶液
状態においては単独の場合にも、また他の成分
（例えば免疫活性物質）と結合している場合にも
不安定で、特に実際に使用する約1μｇ／ml以下
の低濃度の場合には極端に不安定であり、従つて
測定用試薬の品質が維持され難く、安定した結果
が得られない。更にPOの酵素活性は、凍結乾燥
した場合でも著しく低下することがよく知られて
いる。 本発明者らは、かゝる欠点に鑑み、POを安定
化させる方法を得る目的で鋭意研究したところ、
PO、糖または糖アルコールおよび動物血清を含
有せしめた組成物が所期の目的を達成することを
見い出し、これに基づいてさらに研究した結果、
本発明を完成した。 本発明は、ペルオキシダーゼまたはこれと免
疫活性物質との結合体、糖または糖アルコール
および動物血清を含有せしめた組成物である。 本発明に用いられるペルオキシダーゼは、いず
れの由来のものでもよい。たとえば、植物から得
られるものとして、西洋わさび、パイナツプル、
イチジク、甘藷、ソラマメ、トウモロコシなどか
ら得られるペルオキシダーゼが挙げられ、特に西
洋わさびから得られるホースラデイツシユ・パー
オキシダーゼが好ましい。脊椎動物から得られる
ものとして、トリプトフアン・ピロラーゼなどが
挙げられる。微生物から得られるものとして、シ
ユードモナス属菌から得られるチトクロームＣ・
ペルオキシダーゼなどが挙げられる。 POは単独でもよいが、免疫活性物質と結合し
た結合状態のものであつてもよい。該免疫活性物
質としては、抗原、抗体および薬物等のハプテン
があげられる。該抗原としては、ホルモン〔例、
ヒト絨毛性ゴナドトロピン（以下「hCG」と略称
する。）、ヒト胎盤性ラクトーゲン、黄体ホルモ
ン、インスリン、成長ホルモン、副甲状腺ホルモ
ン、甲状腺刺激ホルモン、膵グルカゴン、カルシ
トニン、副腎皮質ホルモン、成長ホルモンなど〕、
タンパク質〔例、IgG，IgM，IgE，IGA，α−
フエトプロテイン、CEA（癌胎児性抗原）、フイ
ブリノーゲン、β2−ミクログロブリン、ミオグロ
ブリン、Ｃ反応性タンパクなど〕、ウイルス抗原
（例、風疹ウイルスHA抗原、センダイウイルス
HA抗原、肝炎ウイルス抗原など）、投与薬剤な
どが挙げられる。 抗体としては、従来既知の方法でウサギ、ラツ
ト、モルモツト、ヒツジ、ヤギ等の哺乳動物やニ
ワトリ、アヒル、ガチヨウ等の鳥類に抗原を免疫
して得られた抗体（例、抗hCG抗体、抗インシユ
リン抗体、抗α−フエトプロテイン抗体、抗膵グ
ルカゴン抗体、抗IgG抗体、抗IgM抗体、抗IgE
抗体など）ならびにMilsteinらの方法〔ネイチユ
ア（Nature）、第256巻（1975年）、第495頁〕で
得られたモノクローナル抗体であればいずれでも
よい。 ハプテンとしては、たとえばステロイド類、ビ
タミン類、カテコールアミン類、抗生物質（例、
ペニシリン類、セフアロポリン類、マクロライド
類、β−アドレナリン作働薬、ジアゼパム類な
ど）などが挙げられる。 POと免疫活性物質との結合の形態としては、
共有結合があげられる。結合方法としては、種々
の公知の方法に従えばよく、たとえば(a)メソツ
ド・エンザイモロジー（Methods Enzymology）
第37巻133頁（1975年）に記載された過ヨウ素酸
架橋法、すなわち、ペルオキシダーゼの糖の部分
を過ヨウ素酸で酸化してアルデヒドとし、これと
免疫活性物質のアミノ基とを架橋結合させる方
法、(b)ペルオキシダーゼと免疫化学的活性物質例
えばタンパクとをグルタルアルデヒドで架橋する
グルタルアルデヒド架橋法、すなわちペルオキシ
ダーゼとタンパクとを同時に加える１段階法〔イ
ムノケミストリー（Immunochemistry）、第６巻
（1969年）、第43頁参照〕とペルオキシダーゼをグ
ルタルアルデヒドで処理し洗浄後タンパクを結合
させる２段階法〔イムノケミストリー、第８巻
（1971年）、第1175頁参照〕、(c)アナリテイカル・
レターズ（Analytical Letters）第15巻147頁
（1982年）、特開昭58−149700号公報に記載の方
法、すなわちＮ−（４−カルボキシシクロヘキシ
ルメチル）マレイミドのＮ−ハイドロキシサクシ
ニイミドエステル等の化合物を用いて、POのア
ミノ基と免疫活性物質のスルフヒドリル基とを架
橋結合させる方法等があげられる。 本発明における糖としては、たとえば単糖類と
して５炭糖のアラビノース、キシロース、リボー
スなどが、６炭糖のグルコース、フラクトース、
マンノース、ガラクトース、ラムノースなどが、
二糖類としてマルトース、セロビオース、トレハ
ロース、ゲンチオビオース、ラクトース、シヨ糖
などが、三糖類としてラフイノース、マルトトリ
オースなどが、多糖類としてデキストリン、シク
ロデキストリン（α−，β−，γ−）、可溶性デ
ンプンなどが、それぞれ挙げられる。 糖アルコールとしては、炭素数５の単糖アルコ
ールとしてキシリツトなどが、炭素数６の単糖ア
ルコールとしてソルビツト、マンニツト、イノシ
トールなどが挙げられる。 なかでも、二糖類が好ましい。 糖または糖アルコールは、それらの混合物でも
よい。 本発明に用いられる動物血清としては、たとえ
ば羊血清、ヤギ血清、ウサギ血清、ウシ血清等が
あげられる。 本発明の組成物において、ペルオキシダーゼま
たはこれと免疫活性物質との結合体に対する糖ま
たは糖アルコールの比率は、通常約103ないし109
倍※ であり、好ましくは約105ないし107倍※ であ
る。ペルオキシダーゼまたはこれと免疫活性物質
との結合体に対する動物血清の比率は、通常約
103ないし109倍※ であり、好ましくは約105ない
し107倍※ である。（※：重量比） 本発明の組成物が混合物である場合、各成分の
添加順序は特に限定されない。 本発明の組成物とは、ペルオキシダーゼまた
はこれと免疫活性物質との結合体、糖または糖
アルコールおよび動物血清を含有せしめた水性
組成物のみならず、これを凍結乾燥して得られた
ものを含む。 本発明の水性組成物あるいは上記凍結乾燥に付
す直前の水性組成物において、POの含有量は通
常、該水性組成物中１ml当り約10pgないし１mg
となる量、好ましくは約100pgないし10μｇとな
る量である。また糖または糖アルコールの含有量
は、通常、該水性組成物中の濃度が約0.1ないし
30W／Ｖ％となる量、好ましくは約１ないし
10W／Ｖ％となる量である。動物血清の含有量
は、通常、該水性組成物中の濃度が約0.1ないし
30V／Ｖ％となる量、好ましくは約１ないし
10V／Ｖ％となる量である。 該水性組成物を調整する場合、各物質の添加順
序は特に限定されない。またこれら水性組成物に
数パーセントのアルギニン、リジン、グリシン、
アラニンなどのアミノ酸またはゼラチン、ゲリセ
イト、スキムミルクなどの蛋白質を添加してもよ
い。 該水性組成物を凍結乾燥するには常法、例えば
約−30℃ないし約−50℃で該水性組成物を凍結さ
せ、ついで約10℃ないし約20℃の温度で減圧下で
氷を昇華させて行なわれる。凍結乾燥後、窒素ガ
スシール又は減圧密栓すると、カビ・細菌等の混
入による腐敗・劣化を防止するためにより好まし
い。該窒素ガスシールは、通常、凍結乾燥物を十
分に窒素ガスで置換した後、窒素ガス気流下で密
栓することにより行われる。また減圧密栓は、通
常、凍結乾燥物を減圧下（例えば約10ないし0.01
mmHg）で密栓することにより行なわれる。 このようにして得られたPOを含有する水性組
成物の凍結乾燥物は、POの酵素活性がほとんど
失なわれておらず、また良い形状を保つているの
で、試薬として有用である。 また上記方法で得られたPOと免疫活性物質と
の結合体を含有する水性組成物の凍結乾燥物は、
その酵素活性は安定化されており、免疫活性の低
下が防止され、また良い形状を保つているので、
診断試薬として有用であり、特にPOが比較的安
価で高い比活性を有していることからEIA用の測
定試薬として有用である。かかるEIAでは、酵素
と結合した抗原を一定量の抗体と共に定量すべき
検液中の抗原に加え、競争的に結合させ、抗体に
結合もしくは非結合の酵素活性を測定する競争結
合法〔フエブス・レターズ（FEBS Letters）第
15巻232頁（1971年）、クリニカ、キミカ、アクタ
（Clinica Chimica Acta）第67巻283頁（1976年）
参照〕、あるいは固相上の抗体もしくは抗原に検
液中の抗原もしくは抗体を反応させ、固相に結合
した酵素活性を測定するサンドイツチ法が用いら
れ、また種々の変法が使用される〔クリニカ・キ
ミカ・アクタ（Clinica Chimica Acta）第81巻
第１頁（1977年）参照〕。 本発明の凍結乾燥物は、たとえば、サンドイツ
チ法によるhCGの免疫化学的測定法に、下記定量
用キツトの成分として用いることができる。該キ
ツトとしては、主として (1) 担体上に保持された抗体 (2) POにより標識化された抗体（本発明の凍結
乾燥物。糖または糖アルコールおよび動物血清
も含有する。） (3) ０〜100IUの標準hCG (4) 上記(1)〜(3)の試薬および被検試料の希釈に用
いる緩衝液（該試薬および該被検試料の希釈に
用いることができる緩衝剤であればいずれでも
よいが、その一例としてはPH６〜９のリン酸緩
衝液またはグリシン緩衝液が挙げられる。） (5) インキユベーシヨン後、担体の洗浄に用いる
緩衝液（該担体の洗浄に用いることができる緩
衝剤であればいずれでもよいが、その一例とし
てはリン酸緩衝液またはグリシン緩衝液が挙げ
られる。） (6) 酸素基質（好ましくはオルトフエニレンジア
ミン）、酵素基質の溶解に用いる緩衝液（好ま
しくはリン酸緩衝液）および酵素反応停止に用
いる緩衝液（好ましくは硫酸）が挙げられる。 また、上記(1)と(2)とは、あらかじめ混合してあ
るものでもよい。 上記のキツトはたとえば下記の方法により使用
するのが好ましい。 標準hCGもしくは被検液約10〜200μに試薬
(4)を加えて希釈し、一定量の試薬 (1)、次いで試
薬(2)を約10〜300μを加えたのち、約０〜40℃
で反応させる。約１〜24時間反応後、試薬(5)で洗
浄し担体上に結合している標識剤の活性を測定す
る。基質液約10〜1000μを加えて約20〜40℃で
約0.5〜24時間反応させたのち、酵素反応を停止
させ、反応液中の吸光度を測定する。 上記した如く、本発明の組成物は、ペルオキシ
ダーゼの酵素活性が高く保持されている。したが
つて、該組成物は、試薬あるいは酵素免疫測定法
における診断試薬として有用である。 特に酵素免疫測定法による診断試薬の場合、高
い感度と再現性は重要な課題であり、そのために
は酵素標識抗体の酵素活性が高く保持されている
ことは必須である。さらに商品価値の面から、凍
結乾燥品の外観、溶解性とも良好でなければなら
ない。その点、本発明の組成物は、これら必要な
条件を全て満たしており、診断試薬としてきわめ
て有用である。 以下に、参考例、実施例を挙げて本発明を更に
具体的に説明するが、これらが本発明の範囲を制
限するものでないことはいうまでもない。 参考例 １ 高度精製抗hCG・IgGの製造： (1) 精製hCG（単位約10000IU／mg）をフロイン
ドの完全アジユバントと混合しウサギに免疫し
て得た抗hCG血清（ウサギ）に飽和硫酸アンモ
ニウムを添加し、塩析を行なつた。3000rpm30
分間遠心後、生じた沈澱を生理食塩水に溶解
し、一晩生理食塩水に透析し、抗hCG抗体ガン
マグロブリンを得た。 (2) 上記抗hCG抗体ガンマグロブリンをブロムシ
アン活性化セフアロース4B（フアルマシア・フ
アイン・ケミカル社製、スエーデン）に精製
hCG（単位約10000IU／mg）をザ・ジヤーナ
ル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー
（The Journal of Biological Chemistry）、第
245巻（1970年）、第3059頁に記載の方法に従つ
て結合させて作製したhCG結合セフアロース
4Bカラムで、免疫アフイニテイークロマトグ
ラフイーを行なつた。hCG結合セフアロース
4Bに保持された抗hCG抗体画分は、1M食塩加
グリシン−塩酸緩衝液（PH1.0）で溶出した。
溶出液から分取した有効画分は0.1M生理食塩
加リン酸緩衝液に対して透析し、精製抗hCG抗
体ガンマグロブリンを得た。 参考例 ２ 抗hCG・IgG−Fab′−HRPO結合体の製造： (1) 参考例１で作製した精製抗hCG・IgGをザ・
ジヤーナル・オブ・イムノロジー、第116巻
（1976年），第1554頁に記載の方法に従つて、ペ
プシンで消化しさらに２−メルカプトエチルア
ミンで37℃４時間還元した後、セフアデツクス
G25（フアルマシア・フアイン・ケミカルズ社
製、スエーデン）で精製し、抗hCG−IgGの
Fab′フラクシヨンを採取した。 (2) 西洋わさび由来のホースラデイツシユ・ペル
オキシダーゼ（HRPOと略称する。）にアナリ
テイカル・レターズ、第15巻（1982年）、第147
頁あるいは特開昭58−149700号公報に記載の方
法に従つて、Ｎ−（４−カルボキシシクロヘキ
シルメチル）マレイミドのＮ−ハイドロオキシ
サクシニイミドエステルを作用させてマレイミ
ド基を導入した。このマレイミド結合ペルオキ
シダーゼ1.5mgに上記(1)で作製した抗hCG・IgG
のFab′フラクシヨン1.7mgを加え、４℃、１晩
反応させた。反応混合物はウルトロゲル
（LKB社製、フランス）カラムで精製し、酵素
活性ならびに抗体活性を有するフラクシヨンを
分取し、抗hCG・IgGのFab′とHRPOの結合体
を得た。 参考例 ３ メソツド・エンゼイモロジー第37巻（1975年）、
第133頁に記載の方法に従つて、ペルオキシダー
ゼとフルオロジニトロベンゼン（DNP）とを室
温で１時間反応させ、0.01M Na2CO3緩衝液（PH
9.5）１晩透析した。透析後は0.06M過ヨウ素酸
を加えて室温30分酸化した後エチレングリコール
を加えて反応を停止させ、再び0.01M Na2CO3緩
衝液（PH9.5）で１晩透析した。次いで得られた
DNP−アルデヒド−パーオキシダーゼはヒト
IgGと室温３時間反応させ、NaBH4で還元、セ
フアデツクスＧ−200カラムで精製し、酵素活性
ならびに抗体活性を有するフラクシヨンを分取
し、ヒトIgGとHRPOとの結合体を得た。 参考例 ４ 酵素活性の測定法： 0.02％過酸化水素含有0.2％、オルトフエニレ
ンジアミン溶液（PH4.9）500μにペルオキシダ
ーゼまたはペルオキシダーゼ結合抗体を所定量加
え、混合した後、室温で１時間反応する。次いで
2N−硫酸1.5mlを加え混合し、酵素反応を停止さ
せる。反応液中の吸光値（波長492nm）を測定
し、酵素活性を算出する。 実施例 １ 西洋わさび由来のホースラデイツシユ・ペルオ
キシダーゼを下記の緩衝液(a)，(b)及び(c)にそれぞ
れ溶解した。溶解液のそれぞれのHRPO濃度は
40ng／mlであつた。 (a) ５％（Ｗ／Ｖ）糖または糖アルコール（糖ま
たは糖アルコールの種類は第１表に示す）、
0.85％（Ｗ／Ｖ）NaCl含有0.01Mリン酸緩衝液
（PH8.0） (b) ５％（Ｗ／Ｖ）糖または糖アルコール、５％
（Ｖ／Ｖ）羊血清、0.85％（Ｗ／Ｖ）NaCl含有
0.01Mリン酸緩衝液（PH8.0） (c) (b)と同様であるが糖または糖アルコールを含
まないもの。 (d) (a)と同様であるが糖または糖アルコールを含
まないもの。 上記HRPO含有水性組成物を−40℃で凍結し、
次いで10℃、10mmHg以下で凍結乾燥し、凍結乾
燥物を得た。室温で２日間放置後凍結乾燥物を開
封し、得られた組成物について参考例４記載の方
法でHRPO酵素活性を測定したところ第１表の
結果を得た。
「PO」と略称することもある。）含有組成物に関
する。 POは過酸化水素の酸素を賦活してこれを被酸
化性物質に伝達する酵素であり、最近では診断試
薬、特に酵素免疫測定法（以下「EIA」と略称す
ることもある。）における標識用酵素としてその
重要性が増加してきた。しかしながらPOは溶液
状態においては単独の場合にも、また他の成分
（例えば免疫活性物質）と結合している場合にも
不安定で、特に実際に使用する約1μｇ／ml以下
の低濃度の場合には極端に不安定であり、従つて
測定用試薬の品質が維持され難く、安定した結果
が得られない。更にPOの酵素活性は、凍結乾燥
した場合でも著しく低下することがよく知られて
いる。 本発明者らは、かゝる欠点に鑑み、POを安定
化させる方法を得る目的で鋭意研究したところ、
PO、糖または糖アルコールおよび動物血清を含
有せしめた組成物が所期の目的を達成することを
見い出し、これに基づいてさらに研究した結果、
本発明を完成した。 本発明は、ペルオキシダーゼまたはこれと免
疫活性物質との結合体、糖または糖アルコール
および動物血清を含有せしめた組成物である。 本発明に用いられるペルオキシダーゼは、いず
れの由来のものでもよい。たとえば、植物から得
られるものとして、西洋わさび、パイナツプル、
イチジク、甘藷、ソラマメ、トウモロコシなどか
ら得られるペルオキシダーゼが挙げられ、特に西
洋わさびから得られるホースラデイツシユ・パー
オキシダーゼが好ましい。脊椎動物から得られる
ものとして、トリプトフアン・ピロラーゼなどが
挙げられる。微生物から得られるものとして、シ
ユードモナス属菌から得られるチトクロームＣ・
ペルオキシダーゼなどが挙げられる。 POは単独でもよいが、免疫活性物質と結合し
た結合状態のものであつてもよい。該免疫活性物
質としては、抗原、抗体および薬物等のハプテン
があげられる。該抗原としては、ホルモン〔例、
ヒト絨毛性ゴナドトロピン（以下「hCG」と略称
する。）、ヒト胎盤性ラクトーゲン、黄体ホルモ
ン、インスリン、成長ホルモン、副甲状腺ホルモ
ン、甲状腺刺激ホルモン、膵グルカゴン、カルシ
トニン、副腎皮質ホルモン、成長ホルモンなど〕、
タンパク質〔例、IgG，IgM，IgE，IGA，α−
フエトプロテイン、CEA（癌胎児性抗原）、フイ
ブリノーゲン、β2−ミクログロブリン、ミオグロ
ブリン、Ｃ反応性タンパクなど〕、ウイルス抗原
（例、風疹ウイルスHA抗原、センダイウイルス
HA抗原、肝炎ウイルス抗原など）、投与薬剤な
どが挙げられる。 抗体としては、従来既知の方法でウサギ、ラツ
ト、モルモツト、ヒツジ、ヤギ等の哺乳動物やニ
ワトリ、アヒル、ガチヨウ等の鳥類に抗原を免疫
して得られた抗体（例、抗hCG抗体、抗インシユ
リン抗体、抗α−フエトプロテイン抗体、抗膵グ
ルカゴン抗体、抗IgG抗体、抗IgM抗体、抗IgE
抗体など）ならびにMilsteinらの方法〔ネイチユ
ア（Nature）、第256巻（1975年）、第495頁〕で
得られたモノクローナル抗体であればいずれでも
よい。 ハプテンとしては、たとえばステロイド類、ビ
タミン類、カテコールアミン類、抗生物質（例、
ペニシリン類、セフアロポリン類、マクロライド
類、β−アドレナリン作働薬、ジアゼパム類な
ど）などが挙げられる。 POと免疫活性物質との結合の形態としては、
共有結合があげられる。結合方法としては、種々
の公知の方法に従えばよく、たとえば(a)メソツ
ド・エンザイモロジー（Methods Enzymology）
第37巻133頁（1975年）に記載された過ヨウ素酸
架橋法、すなわち、ペルオキシダーゼの糖の部分
を過ヨウ素酸で酸化してアルデヒドとし、これと
免疫活性物質のアミノ基とを架橋結合させる方
法、(b)ペルオキシダーゼと免疫化学的活性物質例
えばタンパクとをグルタルアルデヒドで架橋する
グルタルアルデヒド架橋法、すなわちペルオキシ
ダーゼとタンパクとを同時に加える１段階法〔イ
ムノケミストリー（Immunochemistry）、第６巻
（1969年）、第43頁参照〕とペルオキシダーゼをグ
ルタルアルデヒドで処理し洗浄後タンパクを結合
させる２段階法〔イムノケミストリー、第８巻
（1971年）、第1175頁参照〕、(c)アナリテイカル・
レターズ（Analytical Letters）第15巻147頁
（1982年）、特開昭58−149700号公報に記載の方
法、すなわちＮ−（４−カルボキシシクロヘキシ
ルメチル）マレイミドのＮ−ハイドロキシサクシ
ニイミドエステル等の化合物を用いて、POのア
ミノ基と免疫活性物質のスルフヒドリル基とを架
橋結合させる方法等があげられる。 本発明における糖としては、たとえば単糖類と
して５炭糖のアラビノース、キシロース、リボー
スなどが、６炭糖のグルコース、フラクトース、
マンノース、ガラクトース、ラムノースなどが、
二糖類としてマルトース、セロビオース、トレハ
ロース、ゲンチオビオース、ラクトース、シヨ糖
などが、三糖類としてラフイノース、マルトトリ
オースなどが、多糖類としてデキストリン、シク
ロデキストリン（α−，β−，γ−）、可溶性デ
ンプンなどが、それぞれ挙げられる。 糖アルコールとしては、炭素数５の単糖アルコ
ールとしてキシリツトなどが、炭素数６の単糖ア
ルコールとしてソルビツト、マンニツト、イノシ
トールなどが挙げられる。 なかでも、二糖類が好ましい。 糖または糖アルコールは、それらの混合物でも
よい。 本発明に用いられる動物血清としては、たとえ
ば羊血清、ヤギ血清、ウサギ血清、ウシ血清等が
あげられる。 本発明の組成物において、ペルオキシダーゼま
たはこれと免疫活性物質との結合体に対する糖ま
たは糖アルコールの比率は、通常約103ないし109
倍※ であり、好ましくは約105ないし107倍※ であ
る。ペルオキシダーゼまたはこれと免疫活性物質
との結合体に対する動物血清の比率は、通常約
103ないし109倍※ であり、好ましくは約105ない
し107倍※ である。（※：重量比） 本発明の組成物が混合物である場合、各成分の
添加順序は特に限定されない。 本発明の組成物とは、ペルオキシダーゼまた
はこれと免疫活性物質との結合体、糖または糖
アルコールおよび動物血清を含有せしめた水性
組成物のみならず、これを凍結乾燥して得られた
ものを含む。 本発明の水性組成物あるいは上記凍結乾燥に付
す直前の水性組成物において、POの含有量は通
常、該水性組成物中１ml当り約10pgないし１mg
となる量、好ましくは約100pgないし10μｇとな
る量である。また糖または糖アルコールの含有量
は、通常、該水性組成物中の濃度が約0.1ないし
30W／Ｖ％となる量、好ましくは約１ないし
10W／Ｖ％となる量である。動物血清の含有量
は、通常、該水性組成物中の濃度が約0.1ないし
30V／Ｖ％となる量、好ましくは約１ないし
10V／Ｖ％となる量である。 該水性組成物を調整する場合、各物質の添加順
序は特に限定されない。またこれら水性組成物に
数パーセントのアルギニン、リジン、グリシン、
アラニンなどのアミノ酸またはゼラチン、ゲリセ
イト、スキムミルクなどの蛋白質を添加してもよ
い。 該水性組成物を凍結乾燥するには常法、例えば
約−30℃ないし約−50℃で該水性組成物を凍結さ
せ、ついで約10℃ないし約20℃の温度で減圧下で
氷を昇華させて行なわれる。凍結乾燥後、窒素ガ
スシール又は減圧密栓すると、カビ・細菌等の混
入による腐敗・劣化を防止するためにより好まし
い。該窒素ガスシールは、通常、凍結乾燥物を十
分に窒素ガスで置換した後、窒素ガス気流下で密
栓することにより行われる。また減圧密栓は、通
常、凍結乾燥物を減圧下（例えば約10ないし0.01
mmHg）で密栓することにより行なわれる。 このようにして得られたPOを含有する水性組
成物の凍結乾燥物は、POの酵素活性がほとんど
失なわれておらず、また良い形状を保つているの
で、試薬として有用である。 また上記方法で得られたPOと免疫活性物質と
の結合体を含有する水性組成物の凍結乾燥物は、
その酵素活性は安定化されており、免疫活性の低
下が防止され、また良い形状を保つているので、
診断試薬として有用であり、特にPOが比較的安
価で高い比活性を有していることからEIA用の測
定試薬として有用である。かかるEIAでは、酵素
と結合した抗原を一定量の抗体と共に定量すべき
検液中の抗原に加え、競争的に結合させ、抗体に
結合もしくは非結合の酵素活性を測定する競争結
合法〔フエブス・レターズ（FEBS Letters）第
15巻232頁（1971年）、クリニカ、キミカ、アクタ
（Clinica Chimica Acta）第67巻283頁（1976年）
参照〕、あるいは固相上の抗体もしくは抗原に検
液中の抗原もしくは抗体を反応させ、固相に結合
した酵素活性を測定するサンドイツチ法が用いら
れ、また種々の変法が使用される〔クリニカ・キ
ミカ・アクタ（Clinica Chimica Acta）第81巻
第１頁（1977年）参照〕。 本発明の凍結乾燥物は、たとえば、サンドイツ
チ法によるhCGの免疫化学的測定法に、下記定量
用キツトの成分として用いることができる。該キ
ツトとしては、主として (1) 担体上に保持された抗体 (2) POにより標識化された抗体（本発明の凍結
乾燥物。糖または糖アルコールおよび動物血清
も含有する。） (3) ０〜100IUの標準hCG (4) 上記(1)〜(3)の試薬および被検試料の希釈に用
いる緩衝液（該試薬および該被検試料の希釈に
用いることができる緩衝剤であればいずれでも
よいが、その一例としてはPH６〜９のリン酸緩
衝液またはグリシン緩衝液が挙げられる。） (5) インキユベーシヨン後、担体の洗浄に用いる
緩衝液（該担体の洗浄に用いることができる緩
衝剤であればいずれでもよいが、その一例とし
てはリン酸緩衝液またはグリシン緩衝液が挙げ
られる。） (6) 酸素基質（好ましくはオルトフエニレンジア
ミン）、酵素基質の溶解に用いる緩衝液（好ま
しくはリン酸緩衝液）および酵素反応停止に用
いる緩衝液（好ましくは硫酸）が挙げられる。 また、上記(1)と(2)とは、あらかじめ混合してあ
るものでもよい。 上記のキツトはたとえば下記の方法により使用
するのが好ましい。 標準hCGもしくは被検液約10〜200μに試薬
(4)を加えて希釈し、一定量の試薬 (1)、次いで試
薬(2)を約10〜300μを加えたのち、約０〜40℃
で反応させる。約１〜24時間反応後、試薬(5)で洗
浄し担体上に結合している標識剤の活性を測定す
る。基質液約10〜1000μを加えて約20〜40℃で
約0.5〜24時間反応させたのち、酵素反応を停止
させ、反応液中の吸光度を測定する。 上記した如く、本発明の組成物は、ペルオキシ
ダーゼの酵素活性が高く保持されている。したが
つて、該組成物は、試薬あるいは酵素免疫測定法
における診断試薬として有用である。 特に酵素免疫測定法による診断試薬の場合、高
い感度と再現性は重要な課題であり、そのために
は酵素標識抗体の酵素活性が高く保持されている
ことは必須である。さらに商品価値の面から、凍
結乾燥品の外観、溶解性とも良好でなければなら
ない。その点、本発明の組成物は、これら必要な
条件を全て満たしており、診断試薬としてきわめ
て有用である。 以下に、参考例、実施例を挙げて本発明を更に
具体的に説明するが、これらが本発明の範囲を制
限するものでないことはいうまでもない。 参考例 １ 高度精製抗hCG・IgGの製造： (1) 精製hCG（単位約10000IU／mg）をフロイン
ドの完全アジユバントと混合しウサギに免疫し
て得た抗hCG血清（ウサギ）に飽和硫酸アンモ
ニウムを添加し、塩析を行なつた。3000rpm30
分間遠心後、生じた沈澱を生理食塩水に溶解
し、一晩生理食塩水に透析し、抗hCG抗体ガン
マグロブリンを得た。 (2) 上記抗hCG抗体ガンマグロブリンをブロムシ
アン活性化セフアロース4B（フアルマシア・フ
アイン・ケミカル社製、スエーデン）に精製
hCG（単位約10000IU／mg）をザ・ジヤーナ
ル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー
（The Journal of Biological Chemistry）、第
245巻（1970年）、第3059頁に記載の方法に従つ
て結合させて作製したhCG結合セフアロース
4Bカラムで、免疫アフイニテイークロマトグ
ラフイーを行なつた。hCG結合セフアロース
4Bに保持された抗hCG抗体画分は、1M食塩加
グリシン−塩酸緩衝液（PH1.0）で溶出した。
溶出液から分取した有効画分は0.1M生理食塩
加リン酸緩衝液に対して透析し、精製抗hCG抗
体ガンマグロブリンを得た。 参考例 ２ 抗hCG・IgG−Fab′−HRPO結合体の製造： (1) 参考例１で作製した精製抗hCG・IgGをザ・
ジヤーナル・オブ・イムノロジー、第116巻
（1976年），第1554頁に記載の方法に従つて、ペ
プシンで消化しさらに２−メルカプトエチルア
ミンで37℃４時間還元した後、セフアデツクス
G25（フアルマシア・フアイン・ケミカルズ社
製、スエーデン）で精製し、抗hCG−IgGの
Fab′フラクシヨンを採取した。 (2) 西洋わさび由来のホースラデイツシユ・ペル
オキシダーゼ（HRPOと略称する。）にアナリ
テイカル・レターズ、第15巻（1982年）、第147
頁あるいは特開昭58−149700号公報に記載の方
法に従つて、Ｎ−（４−カルボキシシクロヘキ
シルメチル）マレイミドのＮ−ハイドロオキシ
サクシニイミドエステルを作用させてマレイミ
ド基を導入した。このマレイミド結合ペルオキ
シダーゼ1.5mgに上記(1)で作製した抗hCG・IgG
のFab′フラクシヨン1.7mgを加え、４℃、１晩
反応させた。反応混合物はウルトロゲル
（LKB社製、フランス）カラムで精製し、酵素
活性ならびに抗体活性を有するフラクシヨンを
分取し、抗hCG・IgGのFab′とHRPOの結合体
を得た。 参考例 ３ メソツド・エンゼイモロジー第37巻（1975年）、
第133頁に記載の方法に従つて、ペルオキシダー
ゼとフルオロジニトロベンゼン（DNP）とを室
温で１時間反応させ、0.01M Na2CO3緩衝液（PH
9.5）１晩透析した。透析後は0.06M過ヨウ素酸
を加えて室温30分酸化した後エチレングリコール
を加えて反応を停止させ、再び0.01M Na2CO3緩
衝液（PH9.5）で１晩透析した。次いで得られた
DNP−アルデヒド−パーオキシダーゼはヒト
IgGと室温３時間反応させ、NaBH4で還元、セ
フアデツクスＧ−200カラムで精製し、酵素活性
ならびに抗体活性を有するフラクシヨンを分取
し、ヒトIgGとHRPOとの結合体を得た。 参考例 ４ 酵素活性の測定法： 0.02％過酸化水素含有0.2％、オルトフエニレ
ンジアミン溶液（PH4.9）500μにペルオキシダ
ーゼまたはペルオキシダーゼ結合抗体を所定量加
え、混合した後、室温で１時間反応する。次いで
2N−硫酸1.5mlを加え混合し、酵素反応を停止さ
せる。反応液中の吸光値（波長492nm）を測定
し、酵素活性を算出する。 実施例 １ 西洋わさび由来のホースラデイツシユ・ペルオ
キシダーゼを下記の緩衝液(a)，(b)及び(c)にそれぞ
れ溶解した。溶解液のそれぞれのHRPO濃度は
40ng／mlであつた。 (a) ５％（Ｗ／Ｖ）糖または糖アルコール（糖ま
たは糖アルコールの種類は第１表に示す）、
0.85％（Ｗ／Ｖ）NaCl含有0.01Mリン酸緩衝液
（PH8.0） (b) ５％（Ｗ／Ｖ）糖または糖アルコール、５％
（Ｖ／Ｖ）羊血清、0.85％（Ｗ／Ｖ）NaCl含有
0.01Mリン酸緩衝液（PH8.0） (c) (b)と同様であるが糖または糖アルコールを含
まないもの。 (d) (a)と同様であるが糖または糖アルコールを含
まないもの。 上記HRPO含有水性組成物を−40℃で凍結し、
次いで10℃、10mmHg以下で凍結乾燥し、凍結乾
燥物を得た。室温で２日間放置後凍結乾燥物を開
封し、得られた組成物について参考例４記載の方
法でHRPO酵素活性を測定したところ第１表の
結果を得た。
【表】
上記の表１から明らかなように、HRPO含有
水性組成物(a)の凍結乾燥物を開封して得られた組
成物はいずれもPOの酵素活性は低いが、糖また
は糖アルコールおよび羊血清を添加したHRPO
含有水性組成物(b)の凍結乾燥物を開封して得られ
た組成物では、いずれも初期活性の80％以上とい
う高い酵素活性を保持していた。またHRPO含
有水性組成物(c)および(d)の凍結乾燥物を開封して
得られた組成物では、酵素活性はきわめて低下し
ていた。 実施例 ２ 参考例２で得られた抗hCG・IgGのFab′−
HRPO結合体を実施例１で選定した下記の緩衝
液に溶解した。それぞれの溶液中のHRPO−
Fab′濃度は500ng／mlであつた。 (a) ５％（Ｗ／Ｖ）糖（糖の種類は第２表に示
す）、0.85％（Ｗ／Ｖ）NaCl含有0.1Mリン酸緩
衝液（PH8.0） (b) ５％（Ｗ／Ｖ）糖、５％（Ｖ／Ｖ）羊血清、
0.85％（Ｗ／Ｖ）NaCl含有0.1Mリン酸緩衝液
（PH8.0） (c) (a)と同じであるが、糖類を含まないもの。 上記のHRPO−Fab′含有水性組成物を−40℃
で凍結し、次いで10℃、10mmHg以下で凍結乾燥
後、該凍結乾燥物を十分に窒素ガス置換し、窒素
ガス気流下で密栓することにより窒素ガスシール
を行ない、凍結乾燥を得た。凍結乾燥物につい
て、凍結乾燥直後および50℃、24時間保存後の
HRPO酵素活性を実施例１と同様測定したとこ
ろ、第２表の結果を得た。
水性組成物(a)の凍結乾燥物を開封して得られた組
成物はいずれもPOの酵素活性は低いが、糖また
は糖アルコールおよび羊血清を添加したHRPO
含有水性組成物(b)の凍結乾燥物を開封して得られ
た組成物では、いずれも初期活性の80％以上とい
う高い酵素活性を保持していた。またHRPO含
有水性組成物(c)および(d)の凍結乾燥物を開封して
得られた組成物では、酵素活性はきわめて低下し
ていた。 実施例 ２ 参考例２で得られた抗hCG・IgGのFab′−
HRPO結合体を実施例１で選定した下記の緩衝
液に溶解した。それぞれの溶液中のHRPO−
Fab′濃度は500ng／mlであつた。 (a) ５％（Ｗ／Ｖ）糖（糖の種類は第２表に示
す）、0.85％（Ｗ／Ｖ）NaCl含有0.1Mリン酸緩
衝液（PH8.0） (b) ５％（Ｗ／Ｖ）糖、５％（Ｖ／Ｖ）羊血清、
0.85％（Ｗ／Ｖ）NaCl含有0.1Mリン酸緩衝液
（PH8.0） (c) (a)と同じであるが、糖類を含まないもの。 上記のHRPO−Fab′含有水性組成物を−40℃
で凍結し、次いで10℃、10mmHg以下で凍結乾燥
後、該凍結乾燥物を十分に窒素ガス置換し、窒素
ガス気流下で密栓することにより窒素ガスシール
を行ない、凍結乾燥を得た。凍結乾燥物につい
て、凍結乾燥直後および50℃、24時間保存後の
HRPO酵素活性を実施例１と同様測定したとこ
ろ、第２表の結果を得た。
【表】
上記表２から明らかなように、凍結乾燥物(a)お
よび(b)はいずれも凍結乾燥物(b)を24時間保存して
開封して得られた組成物は、高々初期活性の80％
の酵素活性を保持しているにすぎないが、糖類に
羊血清を添加した凍結乾燥物(b)は24時間保存後も
100％近い残存活性を示し、酵素の安定性は高く
保持されていた。 実施例 ３ 参考例２で得られた抗hCG・IgGのFab′−
HRPO結合体を５％（Ｗ／Ｖ）マルトースに第
３表に示す各種動物血清、牛血清アルブミン〔以
下BSAと略す〕、又はヒト血清アルブミン〔以下
HSAと略す〕を添加した0.85％（Ｗ／Ｖ）NaCl
含有0.1Mリン酸緩衝液（PH8.0）に溶解した。次
いで、実施例２と同様に処理して凍結乾燥物を得
た。 凍結乾燥物について、凍結乾燥直後および50
℃、24時間保存後のHRPO酵素活性を参考例４
記載の方法で測定したところ、第３表の結果を得
た。
よび(b)はいずれも凍結乾燥物(b)を24時間保存して
開封して得られた組成物は、高々初期活性の80％
の酵素活性を保持しているにすぎないが、糖類に
羊血清を添加した凍結乾燥物(b)は24時間保存後も
100％近い残存活性を示し、酵素の安定性は高く
保持されていた。 実施例 ３ 参考例２で得られた抗hCG・IgGのFab′−
HRPO結合体を５％（Ｗ／Ｖ）マルトースに第
３表に示す各種動物血清、牛血清アルブミン〔以
下BSAと略す〕、又はヒト血清アルブミン〔以下
HSAと略す〕を添加した0.85％（Ｗ／Ｖ）NaCl
含有0.1Mリン酸緩衝液（PH8.0）に溶解した。次
いで、実施例２と同様に処理して凍結乾燥物を得
た。 凍結乾燥物について、凍結乾燥直後および50
℃、24時間保存後のHRPO酵素活性を参考例４
記載の方法で測定したところ、第３表の結果を得
た。
【表】
表３から明らかなように、マルトースおよび動
物血清を添加した凍結乾燥物は、凍結乾燥直後お
よび50℃、24時間保存後とも、90％以上の残存酵
素活性を示し、安定性も優れていた。 しかし、マルトースおよびBSAあるいはHSA
を添加した場合は、凍結乾燥による残存活性およ
びさらに50℃、24時間保存後の酵素活性は、著し
く低下していた。 実施例 ４ 参考例３で得られたヒトIgGとHRPOとの結合
体を緩衝液〔マルトース（０〜20％Ｗ／Ｖ）、羊
血清（０〜20％Ｗ／Ｖ）、0.85％Ｗ／Ｖ NaCl含
有0.1Mリン酸緩衝液（PH8.0）〕に溶解し、実施
例２と同様に処理して凍結乾燥物を得た。凍結乾
燥物について、凍結乾燥直後および50℃、24時間
保存後のHRPO酵素活性を参考例４記載の方法
で測定したところ第４表の結果を得た。
物血清を添加した凍結乾燥物は、凍結乾燥直後お
よび50℃、24時間保存後とも、90％以上の残存酵
素活性を示し、安定性も優れていた。 しかし、マルトースおよびBSAあるいはHSA
を添加した場合は、凍結乾燥による残存活性およ
びさらに50℃、24時間保存後の酵素活性は、著し
く低下していた。 実施例 ４ 参考例３で得られたヒトIgGとHRPOとの結合
体を緩衝液〔マルトース（０〜20％Ｗ／Ｖ）、羊
血清（０〜20％Ｗ／Ｖ）、0.85％Ｗ／Ｖ NaCl含
有0.1Mリン酸緩衝液（PH8.0）〕に溶解し、実施
例２と同様に処理して凍結乾燥物を得た。凍結乾
燥物について、凍結乾燥直後および50℃、24時間
保存後のHRPO酵素活性を参考例４記載の方法
で測定したところ第４表の結果を得た。
【表】
第４表から明らかなように、マルトースと羊血
清とを含む凍結乾燥物を開封して得られた組成物
の酵素活性はいずれも初期活性の90％以上の活性
を保持していた。
清とを含む凍結乾燥物を開封して得られた組成物
の酵素活性はいずれも初期活性の90％以上の活性
を保持していた。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ ペルオキシダーゼまたはこれと免疫活性物
質との結合体、糖または糖アルコールおよび
動物血清を含有せしめた組成物。 ２ 上記，およびを含有せしめた水性組成
物を凍結乾燥してなる特許請求の範囲第１項記載
の組成物。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4625884A JPS60188067A (ja) | 1984-03-09 | 1984-03-09 | ペルオキシダ−ゼ含有組成物 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4625884A JPS60188067A (ja) | 1984-03-09 | 1984-03-09 | ペルオキシダ−ゼ含有組成物 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS60188067A JPS60188067A (ja) | 1985-09-25 |
| JPH05994B2 true JPH05994B2 (ja) | 1993-01-07 |
Family
ID=12742168
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4625884A Granted JPS60188067A (ja) | 1984-03-09 | 1984-03-09 | ペルオキシダ−ゼ含有組成物 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS60188067A (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4931385A (en) * | 1985-06-24 | 1990-06-05 | Hygeia Sciences, Incorporated | Enzyme immunoassays and immunologic reagents |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5554895A (en) * | 1978-10-16 | 1980-04-22 | Sanyo Chem Ind Ltd | Stable peroxidase-containing composition |
| US4252896A (en) * | 1980-01-07 | 1981-02-24 | Abbott Laboratories | Method of stabilizing peroxidase in a serum protein based medium |
| JPS57118790A (en) * | 1981-01-14 | 1982-07-23 | Takeda Chem Ind Ltd | Freeze-dried substance containing beta-d-galactosidase |
| JPS5836954B2 (ja) * | 1980-03-31 | 1983-08-12 | 栄研化学株式会社 | 酵素の安定化剤 |
| EP0070992B1 (de) * | 1981-07-30 | 1985-01-09 | F. HOFFMANN-LA ROCHE & CO. Aktiengesellschaft | Verfahren zur Stabilisierung von Peroxidase in einem flüssigen Medium und so stabilisiertes Medium |
| JPS5925683A (ja) * | 1982-08-03 | 1984-02-09 | Toyobo Co Ltd | 安定な酵素組成物 |
-
1984
- 1984-03-09 JP JP4625884A patent/JPS60188067A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS60188067A (ja) | 1985-09-25 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |