JPH0599A - ホスフアターゼの活性測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 アルカリ性ホスファターゼや酸性ホスファタ
ーゼの活性を正確に、つまり血清中のヘモグロビンやビ
リルビンの影響を受けることなく、しかも比較的短時間
で、そして簡単に測定できる技術を提供することであ
る。 【構成】 下記の一般式で表される色原体基質が用いら
れるホスファターゼの活性測定法。 【化１】

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ホスファターゼの活性
測定法に関するものである。

【０００２】

【発明の背景】人の体液中のアルカリ性ホスファターゼ
の活性を知ることは臨床検査上極めて重要である。すな
わち、一般に、アルカリ性ホスファターゼの活性が高い
時は、肝臓、骨などの新陳代謝が不順な状態にあり、肝
臓病、くる病、骨肉腫、甲状線異常などの症状が現れ
る。従って、アルカリ性ホスファターゼの活性を測定す
る為に種々の方法が考え出されている。

【０００３】日常の臨床検査におけるアルカリ性ホスフ
ァターゼ定量法としては、操作が簡単で、かつ、再現性
の良いことが必要であるが、この目的にはいわゆる比色
法と蛍光法とがある。比色法は、アルカリ性ホスファタ
ーゼの作用によって加水分解されて色素あるいは色素の
前駆体を放出する化合物を酵素反応の基質として用い、
酵素反応の結果放出される色素を比色定量することによ
り、あるいは酵素反応の結果放出される色素前駆体に試
薬を加えて化学反応させて色素に変え、この色素を比色
定量することによりアルカリ性ホスファターゼの活性度
を知る方法であり、広く普及している比色計あるいは分
光光度計を用いて定量できるという利点がある。蛍光法
は、アルカリ性ホスファターゼの作用によって加水分解
され、蛍光物質を放出する化合物を酵素反応の基質とし
て用い、酵素反応の結果放出される発蛍光物質の蛍光強
度を測定することによりアルカリ性ホスファターゼの活
性度を知る方法であり、比色法に比べて感度が高いが、
微量に共存する発蛍光物質による妨害を受け易く、しか
も蛍光光度計があまり普及していないという難点があ
る。

【０００４】ところで、比色法によるアルカリ性ホスフ
ァターゼの定量には、酵素の作用下で加水分解により色
素を放出する基質を用い、放出された色素を比色定量す
る方法が用いられている。このような基質として、従来
では、ｐ−ニトロフェニルリン酸二ナトリウム（Ｏ．
Ａ．Ｂｅｓｓｅｙ，Ｏ．Ｈ．Ｌｏｗｒｙ及びＭ．Ｊ．Ｂ
ｒｏｃｈ、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａ
ｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第１６４巻、３２１頁、１９
４６年）、リン酸フェノールフタレイン（Ａ．Ｌ．Ｂａ
ｂｓｏｎ，Ｓ．Ｊ．Ｇｒｅｅｌｅｙ，Ｃ．Ｍ．Ｃｏｌｅ
ｍａｎ及びＧ．Ｅ．Ｐｈｉｌｌｉｐｓ、Ｃｌｉｎｉｃａ
ｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第１２巻、４８２頁、１９６
６年）、リン酸チモールフタレイン（Ｃ．Ｍ．Ｃｏｌｅ
ｍａｎ、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第１
３巻、４０１頁、１９６６年）あるいはチモールブルー
モノホスフェイト（特開昭５１−１３６６６２号公報）
が提案されている。

【０００５】上記基質のうちｐ−ニトロフェニルリン酸
二ナトリウムを用いる方法（Ｂｅｓｓｅｙ−Ｌｏｗｒｙ
法）は、アルカリ性ホスファターゼの定量法として最も
広く用いられているが、比色波長が４１０ｎｍである
為、血清中のビリルビンやヘモグロビンなどの有色物に
よる妨害を免れ得ず、妨害を避ける為には検体盲検が必
要となり、それだけ操作が繁雑になる欠点がある。リン
酸フェノールフタレイン、リン酸チモールフタレインあ
るいはチモールブルーモノホスフェイトの基質を用いる
法においては、比色波長がさらに長波長域にある為、ｐ
−ニトロフェニルリン酸二ナトリウム法の欠点は克服さ
れている。しかしながら、フタレイン類のモノリン酸エ
ステルは純度の高いものを合成することが難しい。つま
り、これらのモノリン酸エステルは、対応するフタレイ
ンを分子中の１個の水酸基をオキシ塩化リンと反応させ
て得られるフタレインのモノホスホロジクロリデートを
加水分解して合成するが、フタレインに対するオキシ塩
化リン量が多いと、フタレイン分子中の２個の水酸基が
ホスホリル化されてしまい、又、フタレインに対するオ
キシ塩化リンの量が少ないと、オキシ塩化リン１分子に
対してフタレインが２分子あるいは３分子反応するの
で、生成物が２種あるいは３種の混合物となり、アルカ
リ性ホスファターゼの定量用の基質として不適当な化合
物が副生する。そして、反応後の単離精製は繁雑であ
り、純度の高い生成物を大量に合成することは困難であ
る。

【０００６】又、酸性ホスファターゼは、前立腺、肝
臓、脾臓、顆粒球、赤血球、骨などの組織に広く分布し
ており、中でも前立腺組織とその分泌液の中に大量に含
まれていて、前立腺導管の閉塞によって血中濃度が上昇
することから、前立腺疾患の診断指標として利用されて
いる。酸性ホスファターゼ活性の測定方法としては、使
用する基質で分類すると、グリセロリン酸法、フェニル
リン酸法、ｐ−ニトロフェニルリン酸法、α−ナフチル
リン酸法、チモールフタレインモノリン酸法、ブロムフ
ェノールブルーモノリン酸法、２，６−ジクロル−４−
ニトロフェニルリン酸法等が提案されている。これらの
うち試料中に共存する物質による影響を比較的受け難
く、レイトアッセイによる測定が可能な方法としては、
α−ナフチルリン酸法、ブロムフェノールブルーモノリ
ン酸法、２，６−ジクロル−４−ニトロフェニルリン酸
法等が挙げられる。

【０００７】しかしながら、α−ナフチルリン酸法は、
酸性ホスファターゼにより分解遊離したα−ナフトール
をジアゾ試薬を用いてジアゾカップリング反応により発
色させるものであって、この反応の阻害剤である還元性
物質の影響を受け易い。又、ブロムフェノールモノリン
酸法や２，６−ジクロル−４−ニトロフェニルリン酸法
においては、酸性ホスファターゼにより分解遊離するブ
ロムフェノールブルーや２，６−ジクロル−４−ニトロ
フェノール等を直接測定する為、試料中に共存する物質
による影響は軽微であるが、基質そのものの安定性が悪
く、測定試液中のみならず、固形状態で保存した場合で
も化学的な分解が起こり易く、それ故基質を使用直前に
合成あるいは精製する必要があったり、測定試液調製後
極く短時間しか使用できない等の問題がある。

【０００８】これに対し、基質の分解を防ぐ代わりに、
安定性の良い２−クロル−４−ニトロフェニルリン酸を
用いる方法が提案（特公昭５８−６４８０号公報、特開
昭６２−９６０９９号公報、特開昭６２−１１５２９８
号公報）されているが、２−クロル−４−ニトロフェニ
ルリン酸は溶液中での安定性は従来のものに比較して良
いものの、酸性ホスファターゼとの反応の結果遊離され
る２−クロル−４−ニトロフェノールのｐＫａが５．４
である為、酸性ホスファターゼの至適ｐＨである５〜６
の範囲での検出感度が低く、レイトアッセイによる測定
には利用できないという問題がある。

【０００９】この問題を解決すべく、２−クロル−４−
ニトロフェニルリン酸を基質として含む酸性ホスファタ
ーゼの活性測定用試液に、シクロデキストリンやクラウ
ンエーテル等の包接化合物を共存させ、酸性ホスファタ
ーゼとの反応の結果遊離する２−クロル−４−ニトロフ
ェノールの見かけのｐＫａをより酸性側に移行させ、検
出感度を上昇させる方法が提案（特公昭５８−５０１３
５７号公報及び特開昭６２−１１５２９８号公報）され
ている。しかしながら、この方法により調製された酸性
ホスファターゼ活性測定用試液においては、遊離してく
る２−クロル−４−ニトロフェノールの検出感度は上昇
するが、反面、基質である２−クロル−４−ニトロフェ
ニルリン酸の測定試液中での安定性が著しく低下すると
いう現象が起きる。この為、この方法を利用した酸性ホ
スファターゼ測定用の試液においては、測定試液を基質
溶液と包接化合物溶液との二つに分ける二液法としなけ
ればならず、実際の測定には応用し難い。

【００１０】

【発明の開示】本発明の目的は、アルカリ性ホスファタ
ーゼや酸性ホスファターゼの活性を正確に、つまり血清
中のヘモグロビンやビリルビンの影響を受けることな
く、しかも比較的短時間で、そして簡単に測定できる技
術を提供することである。この本発明の目的は、下記の
一般式で表される色原体基質が用いられることを特徴と
するホスファターゼの活性測定法によって達成される。

【００１１】

【化２】

【００１２】（式中、Ａｒは置換基を有していても良い
フェニル基又はナフチル基、Ｒは一価の置換基、Ｚは６
員環を形成する為の原子群で、形成された環は置換基を
有していても良く、Ｘは、水素原子、アルカリ金属又は
含窒素有機塩基である。）上記本発明の色原体基質にお
けるＡｒとしては、置換基を有していても良いフェニル
基またはナフチル基であり、かかる置換基としては、例
えば塩素原子、臭素原子、フッ素原子などのハロゲン原
子、ニトロ基、スルホ基、アミノ基（アミノ、アルキル
アミノ、アニリノ、Ｎ−アルキルアニリノ等）、アルキ
ル基（メチル、エチル、プロピル等）、アルコキシ基
（メトキシ、エトキシ等）、アミド基（アセトアミド
等）、アシル基、カルバモイル基、スルファモイル基、
アルキルスルホニル基などが挙げられる。

【００１３】又、Ｒで表される一価の置換基のうちの原
子としてはハロゲン原子が好ましく、有機基としては脂
肪族炭化水素残基、ヘテロ環残基、アリール基、−ＮＲ
₁ ＳＯ₂ Ｒ₂ 、−ＳＯ₂ ＮＲ₁ Ｒ₂ 、−ＳＯ₃ Ｍ等が挙
げられ、又、前記Ａｒに係る置換基と同様なものも挙げ
られる。ここで、Ｒ₁ ，Ｒ₂は水素原子、脂肪族炭化水
素を表し、Ｍは水素原子、アルカリ金属を表す。

【００１４】Ｚとしてはフェニル基、ピリジニル基、ピ
ラジニル基、チアジニル基などが挙げられ、フェニル基
が特に好ましい。Ｘで表される含窒素有機塩基として
は、アニリン、ｏ−メチルアニリン等のアニリン誘導体
やモノエチルアミン、トリエチルアミン等のアルキルア
ミン化合物、ピリジン等の含窒素芳香族化合物が挙げら
れる。

【００１５】本発明で用いられる色原体基質の具体例と
しては、次のようなものが有る。

【００１６】

【化３】

【００１７】

【化４】

【００１８】

【化５】

【００１９】

【化６】

【００２０】

【化７】

【００２１】

【化８】

【００２２】

【化９】

【００２３】

【化１０】

【００２４】

【化１１】

【００２５】

【化１２】

【００２６】

【化１３】

【００２７】

【化１４】

【００２８】

【化１５】

【００２９】

【化１６】

【００３０】

【化１７】

【００３１】

【化１８】

【００３２】

【化１９】

【００３３】

【化２０】

【００３４】尚、上記一般式で表される化合物のうち、
例えば〔化３〕の化合物は次のようにすれば合成でき
る。先ず、オキシ塩化リン２ｍｌとアセトン１０ｍｌと
を混ぜて−１０℃に冷却し、この溶液に２−フェニルア
ゾ−４−メトキシ−１−ナフトール１ｇを４ｍｌのピリ
ジン、４ｍｌのアセトン及び３ｍｌのトリメチル酸に溶
かした溶液を１０分間かけて滴下した。尚、この間反応
液の温度は０℃以下に保つ。

【００３５】次いで、氷水１０ｍｌを加え、２０分間攪
拌した。反応混合物を２０ｍｌの飽和食塩水と少量の氷
との混合物に加え、生じた結晶を濾取した。この結晶を
水に懸濁し、１ＮのＮａＯＨ水溶液を加え、ｐＨ１０と
した。不溶物を濾過手段で除去した後、濾液を７０ｍｌ
のエタノール中に加え、析出した結晶を濾取し、エタノ
ールで洗浄した後、乾燥すると、上記〔化３〕で表され
る化合物の黄色の結晶０．５ｇが得られる。

【００３６】本発明の化合物を用いてアルカリ性ホスフ
ァターゼを定量するには、Ｂｅｓｓｅｙ−Ｌｏｗｒｙ法
におけるｐ−ニトロフェニルリン酸二ナトリウムの代わ
りに本発明の化合物を用い、Ｂｅｓｓｅｙ−Ｌｏｗｒｙ
法において酵素反応の結果生じるｐ−ニトロフェノール
の量を求める代わりに本発明の化合物から生じる色素の
量を求めればよい。

【００３７】例えば、本発明の化合物をｐＨ８．５ない
し１１．０前後の緩衝液に溶解し、基質液を調製する。
この時、基質液に、酵素活性化剤（例えば塩化マグネシ
ウム）等を添加すると好ましい。この時、本発明の化合
物は、基質液中に約０．５ないし５０ｍＭの濃度で存在
していることが好ましい。次に、この基質液に、被測定
物であるアルカリ性ホスファターゼを含有する液を添加
し、反応を行わせる。尚、本発明の化合物は、アルカリ
性ホスファターゼに対して過剰に、すなわちモル比で１
０倍以上存在していることが好ましい。上記反応は、約
１０ないし５０℃の温度で約５ないし１５分間行われ
る。そして、必要に応じて、溶液のｐＨを塩基または酸
を添加して上げたり、下げたり、場合によってはＤＭ
Ｆ、メチルセロソルブ等の有機溶剤を添加してこの反応
を停止させ、このときの生成した色素の濃度を分光光度
計などによって濃度測定することによって、必要によ
り、検量線からアルカリ性ホスファターゼが定量され
る。比色波長は当該色素の吸収極大波長付近に設定すれ
ばよいが、比色の際にシクロデキストリン類のような包
接化合物、好ましくはα−シクロデキストリンを添加す
ることにより、吸収極大波長を長波長側へシフトさせる
ことも可能である。尚、シクロデキストリン類の添加量
は、比色液１ｍｌ当たり０．１ないし２０ｍｌ、好まし
くは１ないし１０ｍｌである。

【００３８】本発明の化合物を用いて酸性ホスファター
ゼを定量するには、上記アルカリ性ホスファターゼの定
量操作と同様にすれば良い。尚、基質液調整時のｐＨは
５．０ないし７．０であり、そして本発明の化合物は、
基質液中に約０．５ないし５０ｍＭの濃度で存在してい
ることが好ましい。又、本発明の目的は、アスコルビン
酸−２−リン酸を基質としてホスファターゼの活性を測
定する方法であって、酵素反応で生成したアスコルビン
酸により金属を還元し、この還元金属とキレート化合物
を形成する色原体との反応により生成した色素からホス
ファターゼの活性を測定することを特徴とするホスファ
ターゼの活性測定法によって達成される。

【００３９】本発明にあっては、ホスファターゼの作用
によりアスコルビン酸−２−リン酸が加水分解されて生
成するアスコルビン酸で酸化状態の高い金属イオンがよ
り低い酸化状態のものに還元される訳であるが、このよ
うな金属イオンとしては例えば鉄イオン、コバルトイオ
ン、銅イオン、ニッケルイオン、亜鉛イオン、パラジウ
ムイオン、ガリウムイオン、ルテイウムイオン、ロジウ
ムイオン等が有る。例えば、アスコルビン酸によりＦｅ
³⁺→Ｆｅ²⁺、Ｃｏ⁴⁺→Ｃｏ³⁺といったように還元され
る。尚、これらの金属イオンの供給源としては塩化物、
硫酸化物などの塩の形態のものを用いることが出来る。
酵素反応で生成したアスコルビン酸により還元型のもの
とされた金属イオンとキレートを形成する色原体として
は、例えば次のようなものが挙げられる。

【００４０】

【化２１】

【００４１】尚、この化合物（２，９−ジメチル−１，
１０−フェナントロリン）はＣｕ（Ｉ）と反応して橙黄
色のキレート化合物（λｍａｘ＝４５４ｎｍ）を生成す
る。

【００４２】

【化２２】

【００４３】尚、この化合物（２−ニトロソ−５（Ｎ−
エチル−Ｎ−スルホプロピルアミノ）フェノール）はＦ
ｅ（ＩＩ）、Ｃｏ（ＩＩＩ）、Ｎｉ（ＩＩ）、Ｃｕ（Ｉ
Ｉ）と反応してキレート化合物を生成する。

【００４４】

【化２３】

【００４５】尚、この化合物（２−（５−クロロ−２−
ピリジルアゾ）−５−ジエチルアミノフェノール）はＦ
ｅ（ＩＩ）、Ｃｏ（ＩＩ）、Ｎｉ（ＩＩ）、Ｃｕ（Ｉ
Ｉ）と反応してキレート化合物を生成する。

【００４６】

【化２４】

【００４７】尚、この化合物（２−（５−ブロモ−２−
ピリジルアゾ）−５−（Ｎ−プロピル−Ｎ−スルホプロ
ピルアミノ）フェノール２ナトリウム塩）はＺｎ（Ｉ
Ｉ）と反応して赤色のキレート化合物（λｍａｘ＝５５
２ｎｍ）を生成する。又、Ｃｕ（ＩＩ）、Ｆｅ（Ｉ
Ｉ）、Ｎｉ（ＩＩ）、Ｃｏ（ＩＩ）、Ｒｈ（ＩＩＩ）、
Ｐｄ（ＩＩ）、Ｒｕ（ＩＩＩ）、Ｐｔ（ＩＩ）等とも反
応してキレート化合物を生成する。

【００４８】

【化２５】

【００４９】尚、この化合物（２−（５−ブロモ−２−
ピリジルアゾ）−５−ジエチルアミノフェノール）はＣ
ｕ（ＩＩ）、Ｎｉ（ＩＩ）、Ｃｏ（ＩＩ）、Ｚｎ（Ｉ
Ｉ）、Ｕ（ＶＩ）、Ｖ（Ｖ）等と反応してキレート化合
物を生成する。

【００５０】

【化２６】

【００５１】尚、この化合物（２−（２−ピリジルア
ゾ）クロモトロピックアシッド２ナトリウム塩）はＣｏ
（ＩＩ）、Ｎｉ（ＩＩ）等と反応してキレート化合物を
生成する。

【００５２】

【化２７】

【００５３】尚、この化合物（４−（５−ブロモ−２−
ピリジルアゾ）−１，３−ジアミノベンゼン）はＣｏ
（ＩＩＩ）等と反応してキレート化合物を生成する。

【００５４】

【化２８】

【００５５】尚、この化合物（２−（５−ブロモ−２−
ピリジルアゾ）−５−（Ｎ−プロピル−Ｎ−スルホプロ
ピルアミノ）アニリン２ナトリウム塩）はＣｕ（Ｉ
Ｉ）、Ｆｅ（ＩＩ）、Ｎｉ（ＩＩ）、Ｃｏ（ＩＩＩ）等
と反応してキレート化合物を生成する。

【００５６】

【化２９】

【００５７】尚、この化合物（４，７−ジフェニル−
１，１０−フェナントロリンジスルホン酸２ナトリウム
塩）はＣｕ（Ｉ）、Ｆｅ（ＩＩ）等と反応してキレート
化合物を生成する。

【００５８】

【化３０】

【００５９】尚、この化合物（４，７−ジフェニル−
２，９−ジメチル−１，１０−フェナントロリンジスル
ホン酸２ナトリウム塩）はＣｕ（Ｉ）等と反応してキレ
ート化合物（λｍａｘ＝４８３ｎｍ）を生成する。

【００６０】

【化３１】

【００６１】尚、この化合物（４，７−ジフェニル−
１，１０−フェナントロリン）はＦｅ（ＩＩ）、Ｃｕ
（Ｉ）等と反応してキレート化合物を生成する。

【００６２】

【化３２】

【００６３】尚、この化合物（２−ニトロソ−５−（Ｎ
−プロピル−Ｎ−スルホプロピルアミノ）フェノール）
はＦｅ（ＩＩ）、Ｎｉ（ＩＩ）、Ｃｏ（ＩＩＩ）等と反
応してキレート化合物を生成する。

【００６４】

【化３３】

【００６５】尚、この化合物（２−（３，５−ジブロモ
−２−ピリジルアゾ）−５−ジエチルアミノフェノー
ル）はＣｏ（ＩＩ）、Ｐｄ（ＩＩ）、Ｔｉ（ＩＩＩ）等
と反応してキレート化合物を生成する。

【００６６】

【化３４】

【００６７】尚、この化合物（２−（５−ニトロ−２−
ピリジルアゾ）−５−（Ｎ−プロピル−Ｎ−スルホプロ
ピルアミノ）フェノール２ナトリウム塩・２水和物）は
Ｎｉ（ＩＩ）、Ｃｏ（ＩＩＩ）、Ｆｅ（ＩＩ）、Ｃｕ
（ＩＩ）、Ｚｎ（ＩＩ）等と反応してキレート化合物を
生成する。

【００６８】

【化３５】

【００６９】尚、この化合物（２−〔２−（３，５−ジ
ブロモピリジル）アゾ〕−５−ジメチルアミノベンゾイ
ックアシッド）はＮｉ（ＩＩ）、Ｃｏ（ＩＩＩ）、Ｆｅ
（ＩＩ）、Ｖ（Ｖ）等と反応してキレート化合物を生成
する。

【００７０】

【化３６】

【００７１】尚、この化合物（４−（３，５−ジブロモ
−２−ピリジルアゾ）−Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピ
ルアニリン）はＣｕ（ＩＩ）等と反応してキレート化合
物を生成する。

【００７２】

【化３７】

【００７３】尚、この化合物（１−（２−ピリジルア
ゾ）−２−ナフトール）はＣｏ（ＩＩ）、Ｃｕ（Ｉ
Ｉ）、Ｍｎ（ＩＩ）等と反応してキレート化合物を生成
する。

【００７４】

【化３８】

【００７５】尚、この化合物（３−（２−ピリジル）−
５，６−ジフェニル−１，２，４−トリアジン）はＦｅ
（ＩＩ）、Ｃｕ（Ｉ）、Ｒｕ（ＩＩ）等と反応してキレ
ート化合物を生成する。

【００７６】

【化３９】

【００７７】尚、この化合物（３−（２−ピリジル）−
５，６−ビス（４−スルホフェニル）−１，２，４−ト
リアジン２ナトリウム塩）はＣｏ（ＩＩ）、Ｆｅ（Ｉ
Ｉ）、Ｃｕ（Ｉ）、Ｒｕ（ＩＩＩ）、Ｏｓ（ＶＩＩＩ）
等と反応してキレート化合物を生成する。

【００７８】

【化４０】

【００７９】尚、この化合物（１，１０−フェナントロ
リン・１水和物）はＦｅ（ＩＩ）、Ｃｕ（Ｉ）、Ｒｕ
（ＩＩ）等と反応してキレート化合物を生成する。本発
明によりホスファターゼを定量するには、酵素反応で生
成したアスコルビン酸により金属を還元し、この還元金
属とキレート化合物を形成する色原体とを作用させて生
成した色素量により求めれば良い。

【００８０】例えば、アスコルビン酸−２−リン酸及び
金属塩化合物をｐＨ８．５〜１１．０前後の緩衝液に溶
解し、アルカリ性ホスファターゼ検出用基質液を調製す
る。尚、基質液に、酵素活性化剤（例えば塩化マグネシ
ウム）等を添加すると好ましい。この時、アスコルビン
酸−２−リン酸は基質液中に約１〜３００ｍＭ、金属塩
化合物は基質液中に約１〜１００ｍＭ、色原体は１〜３
００ｍＭの濃度で存在していることが好ましい。尚、ア
スコルビン酸−２−リン酸と金属塩化合物は別々に用意
され、ホスファターゼの定量に際して混合されるように
しても良い。

【００８１】次に、この基質液に、被測定物であるアル
カリ性ホスファターゼを含有する液を添加し、反応を行
わせる。尚、アスコルビン酸−２−リン酸及び金属塩化
合物は、アルカリ性ホスファターゼに対して過剰に、例
えばモル比で１０倍以上存在していることが好ましい。
上記反応は、約１０〜５０℃の温度で約５〜１５分間行
われる。そして、必要に応じて、溶液のｐＨを塩基また
は酸を添加して上げたり、下げたり、場合によってはＤ
ＭＦ、メチルセロソルブ等の有機溶剤を添加してこの反
応を停止させ、このときの生成した色素の濃度を分光光
度計などによって濃度測定することによって、必要によ
り、検量線からアルカリ性ホスファターゼが定量され
る。比色波長は当該色素の吸収極大波長付近に設定すれ
ばよい。

【００８２】アスコルビン酸−２−リン酸を用いて酸性
ホスファターゼを定量するには、上記アルカリ性ホスフ
ァターゼの定量操作と同様にすれば良い。尚、基質液調
整時のｐＨは５．０〜７．０であり、そしてアスコルビ
ン酸−２−リン酸は基質液中に約１〜３００ｍＭ、金属
塩化合物は基質液中に約１〜１００ｍＭ、色原体は１〜
３００ｍＭの濃度で存在していることが好ましい。

【００８３】又、本発明の目的は、アスコルビン酸−２
−リン酸を基質としてホスファターゼの活性を測定する
方法であって、酵素反応で生成したアスコルビン酸とテ
トラゾリウム塩との反応により生成した色素からホスフ
ァターゼの活性を測定することを特徴とするホスファタ
ーゼの活性測定法によって達成される。本発明にあって
は、ホスファターゼの作用によりアスコルビン酸−２−
リン酸が加水分解されて生成するアスコルビン酸とテト
ラゾリウム塩との反応により生成した色素量からホスフ
ァターゼの活性が測定される訳であるが、用いられるテ
トラゾリウム塩としては、例えば次のようなものが挙げ
られる。

【００８４】

【化４１】

【００８５】

【化４２】

【００８６】

【化４３】

【００８７】

【化４４】

【００８８】

【化４５】

【００８９】

【化４６】

【００９０】そして、ホスファターゼの定量の具体的な
操作は次のようにして行われる。例えば、アスコルビン
酸−２−リン酸及びテトラゾリウム塩をｐＨ８．５〜１
１．０前後の緩衝液に溶解し、基質液を調製する。この
時、基質液に、酵素活性化剤（例えば塩化マグネシウ
ム）等を添加すると好ましい。尚、アスコルビン酸−２
−リン酸は基質液中に約１〜３００ｍＭの濃度で、又、
テトラゾリウム塩は基質液中に約０．１〜５０ｍＭの濃
度で存在していることが好ましい。尚、テトラゾリウム
塩とアスコルビン酸−２−リン酸とを別々のものとして
おき、ホスファターゼの定量に際して混合するようにし
ても良い。

【００９１】次に、この基質液に被測定物であるアルカ
リ性ホスファターゼを含有する液を添加し、反応を行わ
せる。尚、アスコルビン酸−２−リン酸やテトラゾリウ
ム塩は、アルカリ性ホスファターゼに対して過剰に、例
えばモル比で１０倍以上存在していることが好ましい。
上記反応は、約１０〜５０℃の温度で約５〜１５分間行
われる。そして、必要に応じて、溶液のｐＨを塩基また
は酸を添加して上げたり、下げたり、場合によってはＤ
ＭＦ、メチルセロソルブ等の有機溶剤を添加してこの反
応を停止させ、このときの生成した色素の濃度を分光光
度計などによって濃度測定することによって、必要によ
り、検量線からアルカリ性ホスファターゼが定量され
る。比色波長は当該色素の吸収極大波長付近に設定すれ
ばよいが、比色の際にシクロデキストリン類のような包
接化合物、好ましくはα−シクロデキストリンを添加す
ることにより、吸収極大波長を長波長側へシフトさせる
ことも可能である。尚、シクロデキストリン類の添加量
は、比色液１ｍｌ当たり０．１〜２０ｍｌ、好ましくは
１〜１０ｍｌである。

【００９２】アスコルビン酸−２−リン酸を用いて酸性
ホスファターゼを定量するには、上記アルカリ性ホスフ
ァターゼの定量操作と同様にすれば良い。尚、基質液調
整時のｐＨは５．０〜７．０であり、アスコルビン酸−
２−リン酸は基質液中に約１〜３００ｍＭの濃度で、
又、テトラゾリウム塩は基質液中に約０．１〜５０ｍＭ
の濃度で存在していることが好ましい。

【００９３】又、前立腺癌の診断の場合に、Ｌ（＋）酒
石酸が酸性ホスファターゼの内の前立腺画分を抑制する
作用があることを利用し、これを用いて測定を行うこと
があるが、このような場合にも本発明の測定試液は既存
の酸性ホスファターゼ活性測定用試液と同様に使用可能
である。本発明で用いられるホスファターゼ活性測定用
試液は、血液、尿等生体試料中のホスファターゼ活性の
測定に極めて有効に使用でき、その測定法として、一点
測定法、レイトアッセイ法など何れにも適用できる。
又、本発明におけるホスファターゼ活性測定用試液を用
いる測定法は、用手法に用い得ることは勿論であるが、
自動分析装置への適用性もよく、例えば本発明のホスフ
ァターゼ活性測定用試液とＬ（＋）酒石酸を含む緩衝液
とを組み合わせて用いれば、１チャンネル内で総酸性ホ
スファターゼ活性と前立腺由来外酸性ホスファターゼ活
性とを連続して測定でき、非常に便利である。

【００９４】又、本発明に用いられるホスファターゼ活
性測定用試液の調製方法としては、蒸留水や精製水によ
り所定濃度に溶解し、凍結乾燥品として保存しておき、
必要に応じて調製すれば良く、その他公知の臨床検査用
試薬の調製方法に準じて行えばよい。そして、この本発
明になる色原体基質によるアルカリ性ホスファターゼや
酸性ホスファターゼの活性測定は正確で、つまり血清中
のヘモグロビンやビリルビンの影響を受けることなく、
検出度に優れ、しかも比較的短時間で、そして簡単な操
作で測定でき、さらにはこの色原体基質の安定性は優れ
ており、かつ、合成および精製は容易なといった特長が
奏される。

【００９５】

【実施例】

〔実施例１〕５０ｍ ｍｏｌ／ｌのコハク酸緩衝液（ｐ
Ｈ６．０）１０ｍｌに上記本発明の化合物（〔化〔３〕
の化合物）４０．２ｍｇを溶解し、基質液とした。高酸
性ホスファターゼ患者血清を、そのまま、２倍及び６倍
に蒸留水で希釈した検体を用い、上記気質液１ｍｌに検
体０．０５ｍｌを加え、よく攪拌した後３７℃で１５分
間反応を行い、その後蒸留水０．５ｍｌを加えて混和
し、５６０ｎｍでＯＤを測定した。

【００９６】又、検体の代わりに、０．０２ｍｌの蒸留
水を加えて同様の操作を行い、測定したブランク値をＯ
Ｄｏとした。検体は（ＯＤ−ＯＤｏ）＝△ＯＤとして表
される。一方、比較例として、上記本発明の化合物
（〔化〔３〕の化合物）の代わりにｐ−ニトロフェニル
リン酸二ナトリウム２０ｍｇを用い、又、反応終了後に
蒸留水の代わりに２％の水酸化ナトリウム０．５ｍｌを
用いた以外は全く同じように操作を行い、そして４１０
ｎｍでＯＤを測定した。ブランク値ＯＤｏも同様にして
求めた。

【００９７】上記本発明の化合物を用いた方法による△
ＯＤをＹ軸に、比較例における△ＯＤをＸ軸にプロット
した結果は、 Ｙ＝１．２８７Ｘ となり、本発明の化合物を用いた酸性ホスファターゼの
測定は比較例の方法に比較して１．２８７倍の感度があ
ることが判明した。

【００９８】すなわち、本発明の基質が用いられると、
高感度で、正確に酸性ホスファターゼの測定が簡単に行
えるのである。 〔実施例２〕０．１ｍｏｌ／ｌのグリシン緩衝液（ｐＨ
＝１０．５、塩化マグネシウム０．５ｍ ｍｏｌ／ｌ含
有）１０ｍｌに、上記本発明の化合物（〔化〔４〕の化
合物）４５．１ｍｇを溶解し、基質液とした。

【００９９】高アルカリホスファターゼ患者血清を、そ
のまま、２倍及び６倍に蒸留水で希釈した検体を用い、
上記基質液１ｍｌに検体０．０２ｍｌを加え、よく混合
した後３７℃で１５分間反応を行い、５６０ｎｍでＯＤ
を測定した。又、検体の代わりに、０．０２ｍｌの蒸留
水を加えて同様の操作を行い、測定してＯＤｏとした。
検体は（ＯＤ−ＯＤｏ）＝△ＯＤとして表される。

【０１００】一方、比較として、Ｂｅｓｓｅｙ−Ｌｏｗ
ｒｙ法を用いた。これは、上記本発明の化合物の代わり
にｐ−ニトロフェニルリン酸二ナトリウム２０ｍｇを用
いた以外は全く同じように操作を行ったものである。上
記本発明の化合物（〔化〔４〕の化合物）を用いた方法
による△ＯＤをＹ軸に、Ｂｅｓｓｅｙ−Ｌｏｗｒｙ法に
おける△ＯＤをＸ軸にプロットした結果は、 Ｙ＝１．２６３Ｘ となり、本発明の化合物を用いたアルカリホスファター
ゼの測定はＢｅｓｓｅｙ−Ｌｗｏｒｙ法に比較して１．
２６３倍の感度があることが判明した。

【０１０１】すなわち、本発明の基質が用いられると、
高感度で、正確にアルカリホスファターゼの測定が簡単
に行えるのである。 〔実施例３〕純水にて洗浄後、風乾したニトロセルロー
ス膜（バイオラッド社製）に、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）
にて段階希釈したアルカリホスファターゼ１μｌをスポ
ットした。

【０１０２】風乾燥後１％ウシ血清アルブミン（ＢＳ
Ａ）−ＰＢＳ溶液により４℃にて一晩ブロッキングを行
い、次いで発色用基質液に浸積した。 〔発色用基質液〕 本発明の化合物（〔化〔４〕の化合物） ０．１２ｍＭ 塩化マグネシウム ５ｍＭ 塩化ナトリウム ２０ｍＭ トリスヒドロキシメチルアミノメタン ５ｍＭ を、純水に溶解し、ｐＨ＝１０．０に調整、最終容量を
１００ｍｌとした。

【０１０３】又、比較の為に、上記本発明の化合物
（〔化〔４〕の化合物）に代えて、０．０１２ｍ ｍｏ
ｌの５−ブロモ−４−クロル−３−インドリルリン酸、
０．０５ｍ ｍｏｌのニトロ−ＴＢをジメチルホルムア
ミド０．５ｍｌに溶解し、混合した以外は同じものを調
製した。上記各々の発色用基質液を用いて６０分間反応
後、十分水洗し、風乾した。

【０１０４】本発明の基質を用いた場合には０．００１
Ｕのアルカリホスファターゼを検出できたが、比較の基
質液では０．０１Ｕのスポットまでしかアルカリホスフ
ァターゼを検出できなかった。すなわち、本発明の基質
が用いられると、高感度で、正確にアルカリホスファタ
ーゼの測定が簡単に行えるのである。

【０１０５】〔実施例４〕 本発明に係るアルカリ性ホスファターゼ活性測定用基質
液を下記の組成で調整した。 〔本発明の基質液〕 アスコルビン酸−２−リン酸 ５ｍｍｏｌ 塩化第二鉄 １ｍｍｏｌ 塩化マグネシウム ５ｍｍｏｌ ２−ニトロソ−５−（Ｎ−プロピル−Ｎ−スルホプロピルアミノ） フェノール ３ｍｍｏｌ トリスヒドロキシメチルアミノメタン ６ｍｍｏｌ 上記の組成物を蒸留水に溶解し、そしてｐＨ９．５に１
Ｎの硫酸で調整した後、最終容量を１００ｍｌとした。

【０１０６】 〔比較例の基質液〕 ｐ−ニトロフェニルリン酸 ５ｍｍｏｌ 塩化マグネシウム ５ｍｍｏｌ トリスヒドロキシメチルアミノメタン ６ｍｍｏｌ 上記の組成物を蒸留水に溶解し、そしてｐＨ９．５に１
Ｎの硫酸で調整した後、最終容量を１００ｍｌとした。

【０１０７】そして、各種の濃度のアルカリ性ホスファ
ターゼ水溶液を調整し、基質液１ｍｌにアルカリ性ホス
ファターゼ水溶液０．０２ｍｌを加え、３７℃で保温し
つつアルカリ性ホスファターゼ水溶液添加後３０秒から
５分までの７５０ｎｍ（本発明の基質液）、４１０ｎｍ
（比較例の基質液）の吸光度（ＯＤ）を連続的に測定
し、１分間当たりのＯＤの変化（ΔＯＤ）を求めた。

【０１０８】本発明の基質液を用いたアルカリ性ホスフ
ァターゼの活性測定によるΔＯＤをＹ軸に、比較例の基
質液を用いたアルカリ性ホスファターゼの活性測定によ
るΔＯＤをＸ軸にプロットしたところ、Ｙ＝３．５６Ｘ
であった。すなわち、本発明の基質液を用いたアルカリ
性ホスファターゼの活性測定は、比較例の基質液を用い
たアルカリ性ホスファターゼの活性測定に比べて感度が
３．５６倍も高いものであった。

【０１０９】〔実施例５〕 本発明に係る酸性ホスファターゼ活性測定用基質液を下
記の組成で調整した。 〔本発明の基質液〕 アスコルビン酸−２−リン酸 ５ｍｍｏｌ 塩化第二コバルト ３ｍｍｏｌ ２−（３，５−ジブロモ−２−ピリジルアゾ）−５− ジエチルアミノフェノール ５ｍｍｏｌ コハク酸 ７ｍｍｏｌ 上記の組成物を蒸留水に溶解し、そしてｐＨ６．５に１
Ｎの水酸化カリウムで調整した後、最終容量を１００ｍ
ｌとした。

【０１１０】 〔比較例の基質液〕 ｐ−ニトロフェニルリン酸 ５ｍｍｏｌ コハク酸 ６ｍｍｏｌ 上記の組成物を蒸留水に溶解し、そしてｐＨ６．５に１
Ｎの水酸化カリウムで調整した後、最終容量を１００ｍ
ｌとした。

【０１１１】そして、各種の濃度の前立線酸性ホスファ
ターゼ水溶液を調整し、本発明の基質液１ｍｌに前立線
酸性ホスファターゼ水溶液０．０５ｍｌを加え、３７℃
で１０分間保温し、５９０ｎｍの吸光度（ＯＤ）を測定
した。更に、前立線酸性ホスファターゼ水溶液を蒸留水
に代えて同様に行い、５９０ｎｍの吸光度（ＯＤ₀ ）を
測定し、この差ΔＯＤ（ＯＤ−ＯＤ₀ ）を求めた。

【０１１２】又、比較例の基質液１ｍｌに前立線酸性ホ
スファターゼ水溶液０．０５ｍｌを加え、３７℃で１０
分間保温し、３Ｎの水酸化ナトリウム溶液０．０５ｍｌ
を加え、混和後４１０ｎｍの吸光度（ＯＤ）を測定し
た。更に、前立線酸性ホスファターゼ水溶液を蒸留水に
代えて同様に行い、４１０ｎｍの吸光度（ＯＤ₀ ）を測
定し、この差ΔＯＤ（ＯＤ−ＯＤ₀ ）を求めた。

【０１１３】本発明の基質液を用いた酸性ホスファター
ゼの活性測定によるΔＯＤをＹ軸に、比較例の基質液を
用いた酸性ホスファターゼの活性測定によるΔＯＤをＸ
軸にプロットしたところ、Ｙ＝７．９６Ｘであった。す
なわち、本発明の基質液を用いた酸性ホスファターゼの
活性測定は、比較例の基質液を用いた酸性ホスファター
ゼの活性測定に比べて感度が７．９６倍も高いものであ
った。

【０１１４】さらには、本発明の基質液を用いた酸性ホ
スファターゼの活性測定法は、比較例の基質液を用いた
酸性ホスファターゼの活性測定法よりも、操作が非常に
簡便である。 〔実施例６〕純水で洗浄後、風乾したニトロセルロース
膜（バイオラッド社製、ポアサイズ０．４５μｍ）にリ
ン酸緩衝溶液（ＰＢＳ溶液）で段階希釈したヤギＩｇＧ
をスポットした。

【０１１５】風乾後１％ウシ血清アルブミン−リン酸緩
衝溶液（ＢＳＡ−ＰＢＳ溶液）により４℃で一晩ブロッ
キングを行い、次いでアルカリ性ホスファターゼ標識ウ
サギ抗ヤギＩｇＧ抗体（カッペル社製、１％ＢＳＡ−Ｐ
ＢＳ溶液で１５００倍に希釈）と４℃で２時間反応させ
た。そして、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０（ポリオキシ
エチレンソルビタンモノラウレート、和光純薬）−ＰＢ
Ｓ溶液にて５回洗浄し、下記の発色用基質液に１５分間
浸漬して反応させた後、水洗し、風乾した。

【０１１６】その結果は、本発明の基質液が用いられた
場合には０．０５ｎｇまでのヤギＩｇＧが検出できたも
のの、比較例の基質液が用いられた場合には１ｎｇまで
のヤギＩｇＧしか検出できなかった。 〔本発明の基質液〕 アスコルビン酸−２−リン酸 ０．１２ｍｍｏｌ 塩化第二亜鉛 ０．５ ｍｍｏｌ 塩化マグネシウム ０．５ ｍｍｏｌ ２−（５−ニトロ−２−ピリジルアゾ）−５−（Ｎ−プロピル−Ｎ− スルホプロピルアミノ）フェノール二ナトリウム塩 ０．５ ｍｍｏｌ トリスヒドロキシメチルアミノメタン ０．５ ｍｍｏｌ 上記の組成物を蒸留水に溶解し、そしてｐＨ８．５に３
Ｎの塩酸で調整した後、最終容量を１００ｍｌとした。

【０１１７】 〔比較例の基質液〕 ５−ブロモ−４−クロル−３−インドリルリン酸 ０．１２ｍｍｏｌ ３，３’−〔３，３’−ジメトキシ−（１，１’−ビフェニル）− ４，４’−ジイル〕−ビス〔２−（ｐ−ニトロフェニル）−５− フェニル−２Ｈテトラゾリウムクロリド〕 ０．５ ｍｍｏｌ 塩化マグネシウム ０．５ ｍｍｏｌ トリスヒドロキシメチルアミノメタン ０．５ ｍｍｏｌ 上記の組成物を蒸留水に溶解し、そしてｐＨ８．５に３
Ｎの塩酸で調整した後、最終容量を１００ｍｌとした。

【０１１８】〔実施例７〕 本発明に係るアルカリ性ホスファターゼ活性測定用基質
液を下記の組成で調整した。 〔本発明の基質液〕 アスコルビン酸−２−リン酸 ５ ｍｍｏｌ 塩化マグネシウム ５ ｍｍｏｌ ３，３’−〔３，３’−ジメトキシ−（１，１’−ビフェニル）−４，４’ −ジイル〕−ビス〔２−（ｐ−ニトロフェニル）−５−フェニル−２Ｈ テトラゾリウムクロリド〕前記化〔４１〕の化合物 ０．５ｍｍｏｌ トリスヒドロキシメチルアミノメタン ６ ｍｍｏｌ 上記の組成物を蒸留水に溶解し、そしてｐＨ９．５に１
Ｎの硫酸で調整した後、最終容量を１００ｍｌとした。

【０１１９】 〔比較例の基質液〕 ５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸 ５ ｍｍｏｌ 塩化マグネシウム ５ ｍｍｏｌ ３，３’−〔３，３’−ジメトキシ−（１，１’−ビフェニル）−４，４’ −ジイル〕−ビス〔２−（ｐ−ニトロフェニル）−５−フェニル−２Ｈ テトラゾリウムクロリド〕前記化〔４１〕の化合物 ０．５ｍｍｏｌ トリスヒドロキシメチルアミノメタン ６ ｍｍｏｌ 上記の組成物を蒸留水に溶解し、そしてｐＨ９．５に１
Ｎの硫酸で調整した後、最終容量を１００ｍｌとした。

【０１２０】そして、各種の濃度のアルカリ性ホスファ
ターゼ水溶液を調整し、基質液１ｍｌにアルカリ性ホス
ファターゼ水溶液０．０２ｍｌを加え、３７℃で保温し
つつアルカリ性ホスファターゼ水溶液添加後３０秒から
５分までの５３０ｎｍの吸光度（ＯＤ）を連続的に測定
し、１分間当たりのＯＤの変化（ΔＯＤ）を求めた。本
発明の基質液を用いたアルカリ性ホスファターゼの活性
測定によるΔＯＤをＹ軸に、比較例の基質液を用いたア
ルカリ性ホスファターゼの活性測定によるΔＯＤをＸ軸
にプロットしたところ、 Ｙ＝１．５８６Ｘ であった。すなわち、本発明の基質液を用いたアルカリ
性ホスファターゼの活性測定は、比較例の基質液を用い
たアルカリ性ホスファターゼの活性測定に比べて感度が
１．５８６倍も高いものであった。

【０１２１】〔実施例８〕本発明に係る酸性ホスファタ
ーゼ活性測定用基質液を下記の組成で調整した。 〔本発明の基質液〕 アスコルビン酸−２−リン酸 ５ ｍｍｏｌ 前記化〔４１〕の化合物 ０．５ｍｍｏｌ コハク酸 ７ ｍｍｏｌ 上記の組成物を蒸留水に溶解し、そしてｐＨ６．５に１
Ｎの水酸化カリウムで調整した後、最終容量を１００ｍ
ｌとした。

【０１２２】 〔比較例の基質液〕 ｐ−ニトロフェニルリン酸 ５ ｍｍｏｌ 前記化〔４１〕の化合物 ０．５ｍｍｏｌ コハク酸 ６ ｍｍｏｌ 上記の組成物を蒸留水に溶解し、そしてｐＨ６．５に１
Ｎの水酸化カリウムで調整した後、最終容量を１００ｍ
ｌとした。

【０１２３】そして、各種の濃度の前立線酸性ホスファ
ターゼ水溶液を調整し、本発明の基質液１ｍｌに前立線
酸性ホスファターゼ水溶液０．０５ｍｌを加え、３７℃
で１０分間保温し、５９０ｎｍの吸光度（ＯＤ）を測定
した。更に、前立線酸性ホスファターゼ水溶液を蒸留水
に代えて同様に行い、５９０ｎｍの吸光度（ＯＤ₀ ）を
測定し、この差ΔＯＤ（ＯＤ−ＯＤ₀ ）を求めた。

【０１２４】又、比較例の基質液１ｍｌに前立線酸性ホ
スファターゼ水溶液０．０５ｍｌを加え、３７℃で１０
分間保温し、３Ｎの水酸化ナトリウム溶液０．０５ｍｌ
を加え、混和後４１０ｎｍの吸光度（ＯＤ）を測定し
た。更に、前立線酸性ホスファターゼ水溶液を蒸留水に
代えて同様に行い、４１０ｎｍの吸光度（ＯＤ₀ ）を測
定し、この差ΔＯＤ（ＯＤ−ＯＤ₀ ）を求めた。

【０１２５】本発明の基質液を用いた酸性ホスファター
ゼの活性測定によるΔＯＤをＹ軸に、比較例の基質液を
用いた酸性ホスファターゼの活性測定によるΔＯＤをＸ
軸にプロットしたところ、 Ｙ＝２．１８５Ｘ であった。すなわち、本発明の基質液を用いた酸性ホス
ファターゼの活性測定は、比較例の基質液を用いた酸性
ホスファターゼの活性測定に比べて感度が２．１８５倍
も高いものであった。

【０１２６】さらには、本発明の基質液を用いた酸性ホ
スファターゼの活性測定法は、比較例の基質液を用いた
酸性ホスファターゼの活性測定法よりも、操作が非常に
簡便である。 〔実施例９〕純水で洗浄後、風乾したニトロセルロース
膜（バイオラッド社製、ポアサイズ０．４５μｍ）にリ
ン酸緩衝溶液（ＰＢＳ溶液）で段階希釈したヤギＩｇＧ
をスポットした。

【０１２７】風乾後１％ウシ血清アルブミン−リン酸緩
衝溶液（ＢＳＡ−ＰＢＳ溶液）により４℃で一晩ブロッ
キングを行い、次いでアルカリ性ホスファターゼ標識ウ
サギ抗ヤギＩｇＧ抗体（カッペル社製、１％ＢＳＡ−Ｐ
ＢＳ溶液で１５００倍に希釈）と４℃で２時間反応させ
た。そして、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０（ポリオキシ
エチレンソルビタンモノラウレート、和光純薬）−ＰＢ
Ｓ溶液にて５回洗浄し、下記の発色用基質液に１５分間
浸漬して反応させた後、水洗し、風乾した。

【０１２８】その結果は、本発明の基質液が用いられた
場合には０．０５ｎｇまでのヤギＩｇＧが検出できたも
のの、比較例の基質液が用いられた場合には１ｎｇまで
のヤギＩｇＧしか検出できなかった。 〔本発明の基質液〕 アスコルビン酸−２−リン酸 ０．１２ｍｍｏｌ 前記化〔４１〕の化合物 ０．５ ｍｍｏｌ 塩化マグネシウム ０．５ ｍｍｏｌ トリスヒドロキシメチルアミノメタン ０．５ ｍｍｏｌ 上記の組成物を蒸留水に溶解し、そしてｐＨ８．５に３
Ｎの塩酸で調整した後、最終容量を１００ｍｌとした。

【０１２９】 〔比較例の基質液〕 ５−ブロモ−４−クロル−３−インドリルリン酸 ０．１２ｍｍｏｌ 前記化〔４１〕の化合物 ０．５ ｍｍｏｌ 塩化マグネシウム ０．５ ｍｍｏｌ トリスヒドロキシメチルアミノメタン ０．５ ｍｍｏｌ 上記の組成物を蒸留水に溶解し、そしてｐＨ８．５に３
Ｎの塩酸で調整した後、最終容量を１００ｍｌとした。

【０１３０】

【効果】本発明によれば、高感度で、正確にホスファタ
ーゼの測定が簡単に行える。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記の一般式で表される色原体基質が用
   いられることを特徴とするホスファターゼの活性測定
   法。 【化１】 （式中、Ａｒは置換基を有していても良いフェニル基又
   はナフチル基、Ｒは一価の置換基、Ｚは６員環を形成す
   る為の原子群で、形成された環は置換基を有していても
   良く、Ｘは水素原子、アルカリ金属又は含窒素有機塩基
   である。）
2. 【請求項２】 アスコルビン酸−２−リン酸を基質とし
   てホスファターゼの活性を測定する方法であって、酵素
   反応で生成したアスコルビン酸により金属を還元し、こ
   の還元金属とキレート化合物を形成する色原体との反応
   により生成した色素からホスファターゼの活性を測定す
   ることを特徴とするホスファターゼの活性測定法。
3. 【請求項３】 アスコルビン酸−２−リン酸を基質とし
   てホスファターゼの活性を測定する方法であって、酵素
   反応で生成したアスコルビン酸とテトラゾリウム塩との
   反応により生成した色素からホスファターゼの活性を測
   定することを特徴とするホスファターゼの活性測定法。