JPH06100589A - 新規な蛋白性生理活性物質およびそのｄｎａ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】ＰＧＩ₂ の有する血小板凝集抑制作用、平滑筋
弛緩作用、胃酸分泌抑制作用等に基づき溶血性尿毒症症
候群、血栓性血小板減少性紫斑病、末梢動脈閉塞、心虚
血、脳虚血、動脈硬化、脳閉塞、高脂血症、糖尿病、心
不全、狭心症、虚血性心疾患、うっ血性心疾患、脈絡膜
循環障害、気管支疾患、胃潰瘍、妊娠子癇等の医薬用途
として応用できる新規な蛋白性生理活性物質の提供。 【構成】プロスタグランジンＩ₂ ( ＰＧＩ₂ ）産生刺激
活性を有する新規な蛋白性生理活性物質、詳しくは血管
内皮細胞に作用し、血管内皮細胞からのＰＧＩ ₂ の産生
を促進させる活性を有する新規な蛋白性生理活性物質、
その製造方法および該蛋白性生理活性物質をコードする
ＤＮＡ。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、プロスタグランジンＩ
₂ （別名；プロスタサイクリン（Ｐｒｏｓｔａｃｙｃｌ
ｉｎ）、以下ＰＧＩ₂ と記す）産生刺激活性を有する新
規な蛋白性生理活性物質、詳しくは血管内皮細胞に作用
し、血管内皮細胞からのＰＧＩ₂ の産生を促進させる活
性を有する新規な蛋白性生理活性物質、その製造方法お
よび該蛋白性生理活性物質をコードするＤＮＡに関す
る。

【０００２】

【従来の技術】プロスタグランジン（ｐｒｏｓｔａｇｌ
ａｎｄｉｎ、ＰＧ）は１９３０年にクルツロックら［プ
ロシーディング オブ ザ ソサイエティ フォー エ
クスペリメンタル バイオロジー アンド メディスン
（Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．）、
２８巻、２６８頁、１９３０年］により、精液中に存在
する子宮筋収縮活性物質として発見報告された。その後
プロスタグランジンに関する基礎的研究は急速な発展を
とげた。プロスタグランジンはヒト、動物の組織、臓器
に含まれるプロスタン酸を基本構造とする生理活性物質
の総称であり、細胞内でアラキドン酸を出発物質として
アラキドン酸カスケードと呼ばれる一連の化学反応によ
り化学構造の異なる数種のプロスタグランジンが生合成
される。それらは内分泌系、神経系、炎症、免疫系その
他生体の恒常性の維持に関与する重要な活性物質として
注目されており、炎症、血栓形成、末梢循環、動脈硬
化、老化などの諸機構に広汎に関与する［臨床科学、１
７巻、９５８頁、１９８１年］と考えられている。さら
に、プロスタグランジンは血管平滑筋に対する血管作動
性物質として重要な役割をはたしており［病態生理、２
巻、７９２頁、１９８３年］、血小板や血管壁由来の活
性型プロスタノイドであるトロンボキサンＡ₂ （ＴＸＡ
₂ ）［プロシーディング オブ ザ ナショナル アカ
デミー オブ サイエンス オブ ザ ユナイテッド
ステイツ オブ アメリカ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）、７２巻、２９９４頁、１９７
５年］およびＰＧＩ₂ ［ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、
２６３巻、６６３頁、１９７６年］が、血小板と血管系
の生理と病態における臨床的意義において注目されてい
る。

【０００３】これらプロスタグランジンの中で、とりわ
けＰＧＩ₂ は強力な血小板凝集抑制作用と血管弛緩作用
を呈し、血小板由来のＴＸＡ₂ と拮抗的に作用し生体内
のホメオスターシスの維持に関与している［ブリティッ
シュ ジャーナル オブ ファーマコロジー（Ｂｒ．
Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃ．）、７６巻、３頁、１９８２
年］。正常の血管内皮細胞は、物理的、化学的刺激が加
わると、主としてＰＧＩ₂ を生成し、血小板の活性化を
抑制するのみならず自ら血管壁トーヌスを調節して局所
循環の恒常性を維持する機構が作動している。すなわ
ち、血栓症や動脈硬化症などの血管障害の発症にはＴＸ
Ａ₂ およびＰＧＩ₂ の産生不均衡とりわけＰＧＩ ₂ の産
生低下が関与している［ブリティッシュ ジャーナル
オブ ファーマコロジー（Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａ
ｃ．）、７６巻、３頁、１９８２年］ことが知られてい
る。１９７８年マックインタイヤーら［ネイチャー（Ｎ
ａｔｕｒｅ）、２７１巻、５４９頁、１９７８年］は流
血中に血管壁でのＰＧＩ₂ 産生を刺激する因子の存在を
認めており、本因子は熱に不安定な高分子物質であるこ
とを報告している。その後レムッジらにより溶血性尿毒
症症候群で本因子が低下していることが報告されて以来
［ランセット（Ｌａｎｃｅｔ）、２巻、８７１頁、１９
７８年］、血栓性血小板減少性紫斑病［ランセット（Ｌ
ａｎｃｅｔ）、２巻、７４８頁、１９７９年］、鎌状赤
血球性貧血［ブリティッシュ ジャーナル オブへマト
ロジー（Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．）、４８巻、５
４５頁、１９８１年］、急性心筋梗塞［コロナリー（Ｃ
ｏｒｏｎａｒｙ）、２巻、４９頁、１９８５年］、糖尿
病等の血栓性・動脈硬化性疾患で本因子の低下がその病
因と密接に関与していることが明らかにされている。と
くに、糖尿病性血管障害の発症・進展因子としての血小
板凝集亢進機序については、血小板由来ＴＸＡ₂ の産生
亢進［トロンボシス リサーチ（Ｔｈｒｏｍｂ．Ｒｅ
ｓ．）、１９巻、２１１頁、１９８０年、ジャーナル
オブ ラボラトリー アンド クリニカル メディスン
（Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．）、９７巻、８７
頁、１９８１年］の他に、血管由来のＰＧＩ₂ 産生低下
が糖尿病患者や実験糖尿病動物について報告されている
［ランセット（Ｌａｎｃｅｔ）、１巻、３２５頁、１９
７９年、ランセット（Ｌａｎｃｅｔ）、２巻、１３６５
頁、１９７９年、ザ ニュウ イングランド ジャーナ
ル オブ メディスン（Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅ
ｄ．）、３００巻、３６６頁、１９７９年およびライフ
サイエンス（Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．）、２３巻、３５１
頁、１９７８年］。しかも、この産生低下は、上述の血
中に存在するＰＧＩ₂ 産生刺激活性の低下が一因を担っ
ている可能性が示唆されている［メタボリズム（Ｍｅｔ
ａｂｏｌｉｓｍ）、３８巻、８３７頁、１９８９年、へ
モスタシス（Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ）、１６巻、４４
７頁、１９８６年およびダイアベティス リサーチ ア
ンド クリニカル プラクティス（Ｄｉａｂ．Ｒｅｓ．
Ｃｌｉｎ．Ｐｒａｃｔ．）、３巻、２４３頁、１９８７
年］。

【０００４】上述のごとくＰＧＩ₂ は血小板凝集抑制作
用を有するが、それ以外にも血管および気管支などの平
滑筋弛緩作用、胃酸分泌抑制作用等を有する。これらの
生理作用に基づきＰＧＩ₂ を医薬用品として開発するこ
とが考えられるが、ＰＧＩ₂は３７℃中性の水で半減期
５分と極めて化学的に不安定な物質であり、実用化に至
ってない。一方、天然のＰＧＩ₂ 様作用を保ちながら、
化学的に安定なＰＧＩ ₂ 類縁体を血液凝固阻止剤、血管
拡張剤等の医薬品として開発しようとする試みがなされ
ている。しかし、生体にとっては、ＰＧＩ₂ が不安定で
短寿命である方がむしろ望ましい場合も考えられる。す
なわち、緊急の事態に至って速やかに生成されるＰＧＩ
₂ に対して、生体は常に反応できる態勢にならなければ
ならず、安定なＰＧＩ₂ 類縁体を多量に与えることによ
って、細胞のＰＧＩ₂ に対する応答性が低下し、緊急の
場合にＰＧＩ₂ に反応できなくなる可能性も考えられ
る。実際、プロスタグランジンＥ₁ （ＰＧＥ₁ ）や安定
なＰＧＩ₂ 類縁体の前処理が原因で、ＰＧＩ₂ に対して
当然起こるべきｃＡＭＰ上昇反応が生じなくなった細胞
の例が報告されている［プロスタグランジンズ（Ｐｒｏ
ｓｔａｇｌａｎｄｉｎｓ．）、１９巻、２頁、１９８０
年］。

【０００５】従って、ＰＧＩ₂ の有する上述の作用を期
待するのであれば、化学的に安定な類縁体を用いるより
も、必要なときに必要な濃度のＰＧＩ₂ を必要な部位に
産生させてやることが生体にとってより好ましいと考え
られる。生体内でのＰＧＩ₂代謝は２つの因子により制
御されており、その１つはＰＧＩ₂ 安定化因子で近年ア
ポリポプロテインＡ−１（ＡｐｏＡ−１）であることが
同定された［ザ ジャーナル オブ クリニカル イン
ベスティゲーション（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓ
ｔ．）、８２巻、８０３頁、１９８８年］。他の１つは
ＰＧＩ₂ 産生刺激因子（Ｐｒｏｓｔａｃｙｃｌｉｎ Ｐ
ｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ＳｔｉｍｕｌａｔｉｎｇＦａｃｔ
ｏｒ、ＰＳＦ）である。上述のごとくすでに血中にはＰ
ＧＩ₂ 産生刺激活性（Ｐｒｏｓｔａｃｙｃｌｉｎ Ｓｔ
ｉｍｕｌａｔｉｎｇ Ａｃｔｉｖｉｔｙ、ＰＳＡ）が存
在することが報告されているが、その活性本体（ＰＳ
Ｆ）は同定されておらずその同定が望まれている。ＰＳ
Ｆは血管内皮細胞からのＰＧＩ₂産生を刺激し、血中の
ＰＧＩ₂ 濃度を高めることによりＰＧＩ₂ の有する血小
板凝集抑制作用、平滑筋弛緩作用、胃酸分泌抑制作用等
を発現することができる。このような作用に基づきＰＳ
Ｆは溶血性尿毒症症候群、血栓性血小板減少性紫斑病、
末梢動脈閉塞、心虚血、脳虚血、動脈硬化、脳閉塞、高
脂血症、糖尿病、心不全、狭心症、虚血性心疾患、うっ
血性心疾患、脈絡膜循環障害、気管支疾患、胃潰瘍、妊
娠子癇等の医薬品となる可能性を有している。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、血管
内皮細胞からのＰＧＩ₂ 産生を刺激する新規な物質を精
製単離し、その新規な蛋白性生理活性物質を提供するこ
とである。また、本発明はその製造方法を提供すること
である。さらに、本発明は、該蛋白性生理活性物質をコ
ードする遺伝子を提供し、遺伝子工学的な該蛋白性生理
活性物質の大量製造方法を提供することにある。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは上述の目的
を達成するために、血中およびヒト細胞株培養上清中に
存在するＰＧＩ₂ 産生刺激活性について鋭意研究を重ね
た結果、正常ヒト二倍体線維芽細胞の培養上清中にＰＧ
Ｉ₂ 産生刺激活性を有する物質が高濃度に存在すること
を確認した。次いで、この培養上清よりＰＧＩ₂ 産生刺
激活性を有する新規な蛋白性生理活性物質を単離精製
し、アミノ酸配列の一部を決定する事に成功した。さら
に本発明者らはアミノ酸配列を手がかりとして、正常ヒ
ト二倍体線維芽細胞のｃＤＮＡライブラリーより該蛋白
性生理活性物質のｃＤＮＡを入手し、該蛋白性生理活性
物質の遺伝子工学的な大量生産への道を切り開いた。

【０００８】すなわち、本発明は、下記式［１］ないし
［１１］（配列表の配列番号１ないし１１）のいずれか
で表されるアミノ酸配列を、少なくとも１つ有している
新規な蛋白性生理活性物質を提供する。

【０００９】 式［１］ Val Ile Gly Ile Pro Thr Pro Val Leu Ile Trp Asn Lys Val Lys 1 5 10 15 Arg Gly His Tyr Gly Val Gln Arg Thr Glu 20 25 式［２］ Leu Leu Pro Gly Asp Arg Asp Asn Leu Ala Ile Gln Thr Arg Gly 1 5 10 15 Gly Pro Glu

【００１０】 式［３］ Cys His Ala Ser Asn Ser Gln Gly Gln Ala Ser Ala Ser Ala Lys 1 5 10 15 Ile Thr Val Val 19 式［４］ Ile Thr Val Val Asp Ala Leu His Glu Ile Pro Val Lys Lys Gly 1 5 10 15 Glu Gly Ala Glu Leu 20

【００１１】 式［７］ Thr Glu Leu Leu Pro Gly Asp Arg Asp Asn Leu Ala Ile Gln Thr 1 5 10 15 Arg 式［９］ Lys Ala Ile Thr Gln Val Ser Lys Gly Thr Cys Glu 1 5 10

【００１２】 式［１０］ Xaa Glu Pro Xaa Gly Gly Gly Gly Ala Gly Arg Gly Tyr Gln Ala 1 5 10 15 Pro Gly 式［１１］ Gln Gly Pro Ser Ile Val Thr Pro Xaa Lys Asp Ile 1 5 10

【００１３】さらに、本発明は、下記式［１２］または
［１３］（配列表の配列番号１２または１３）で表され
るアミノ酸配列を含有する新規な蛋白性生理活性物質を
提供する。

【００１４】 式［１２］ Val Ile Gly Ile Pro Thr Pro Val Leu Ile Trp Asn Lys Val Lys 1 5 10 15 Arg Gly His Tyr Gly Val Gln Arg Thr Glu Leu Leu Pro Gly Asp 20 25 30 Arg Asp Asn Leu Ala Ile Gln Thr Arg Gly Gly Pro Glu Lys His 35 40 45 Glu Val Thr Gly Trp Val Leu Val Ser Pro Leu Ser Lys Glu Asp 50 55 60 Ala Gly Glu Tyr Glu Cys His Ala Ser Asn Phe Gln Gly Gln Ala 65 70 75 Ser Ala Ser Ala Lys Ile Thr Val Val Asp Ala Leu His Glu Ile 80 85 90 Pro Val Lys Lys Gly Glu Gly Ala Glu Leu 95 100

【００１５】 式［１３］ Val Ile Gly Ile Pro Thr Pro Val Leu Ile Trp Asn Lys Val Lys 1 5 10 15 Arg Gly His Tyr Gly Val Gln Arg Thr Glu Leu Leu Pro Gly Asp 20 25 30 Arg Asp Asn Leu Ala Ile Gln Thr Arg Gly Gly Pro Glu Lys His 35 40 45 Glu Val Thr Gly Trp Val Leu Val Ser Pro Leu Ser Lys Glu Asp 50 55 60 Ala Gly Glu Tyr Glu Cys His Ala Ser Asn Ser Gln Gly Gln Ala 65 70 75 Ser Ala Ser Ala Lys Ile Thr Val Val Asp Ala Leu His Glu Ile 80 85 90 Pro Val Lys Lys Gly Glu Gly Ala Glu Leu 95 100

【００１６】この新規な蛋白性生理活性物質は、非還元
条件下におけるドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）において分子
量が３０〜３６ｋＤａである場合に好適であり、また、
プロスタグランジンＩ₂ （ＰＧＩ₂ ）産生刺激活性を有
することを特徴とする場合、さらに好適である。また、
本発明は、本発明の蛋白性生理活性物質をコードする塩
基配列を有するＤＮＡを提供する。さらに、下記式［１
４］または［１５］（配列表の配列番号１４または１
５）で表される塩基配列を有するＤＮＡを提供する。

【００１７】 式［１４］ GGTCATCGGA ATCCCGACAC CTGTCCTCAT CTGGAACAAG GTAAAAAGGG GTCACTATGG 60 AGTTCAAAGG ACAGAACTCC TGCCTGGTGA CCGGGACAAC CTGGCCATTC AGACCCGGGG 120 TGGCCCAGAA AAGCATGAAG TAACTGGCTG GGTGCTGGTA TCTCCTCTAA GTAAGGAAGA 180 TGCTGGAGAA TATGAGTGCC ATGCATCCAA TTTCCAAGGA CAGGCTTCAG CATCAGCAAA 240 AATTACAGTG GTTGATGCCT TACATGAAAT ACCAGTGAAA AAAGGTGAAG GTGCCGAGCT 300 ATAAACCTCC AGAATATTAT TAGTCTGCAT GGTTAAAAGT AGTCATGGAT AACTACATTA 360 CCTGTTCTTG CCTAATAAGT TTCTTTTAAT CCAATCCACT AACACTTTAG TTATATTCAC 420 TGGTTTTACA CAGAGAAATA CAAAATAAAG ATCACACATC AAGACTATCT ACAAAAATTT 480 ATTATATATT TACAGAAGAA AAGCATGCAT ATCATTAAAC AAATAAAATA CTTTTTATCA 540 CAAAAAAAAA AAAAAAA 557

【００１８】 式［１５］ GGTCATCGGA ATCCCGACAC CTGTCCTCAT CTGGAACAAG GTAAAAAGGG GTCACTATGG 60 AGTTCAAAGG ACAGAACTCC TGCCTGGTGA CCGGGACAAC CTGGCCATTC AGACCCGGGG 120 TGGCCCAGAA AAGCATGAAG TAACTGGCTG GGTGCTGGTA TCTCCTCTAA GTAAGGAAGA 180 TGCTGGAGAA TATGAGTGCC ATGCATCCAA TTCCCAAGGA CAGGCTTCAG CATCAGCAAA 240 AATTACAGTG GTTGATGCCT TACATGAAAT ACCAGTGAAA AAAGGTGAAG GTGCCGAGCT 300 ATAAACCTCC AGAATATTAT TAGTCTGCAT GGTTAAAAGT AGTCATGGAT AACTACATTA 360 CCTGTTCTTG CCTAATAAGT TTCTTTTAAT CCAATCCACT AACACTTTAG TTATATTCAC 420 TGGTTTTACA CAGAGAAATA CAAAATAAAG ATCACACATC AAGACTATCT ACAAAAATTT 480 ATTATATATT TACAGAAGAA AAGCATGCAT ATCATTAAAC AAATAAAATA CTTTTTATCA 540 CAAAAAAAAA AAAAAAA 557

【００１９】また、本発明は、上記の新規な蛋白性生理
活性物質を含む原料を、下記（ａ）〜（ｃ）の工程の少
なくとも１つを用いて精製することを特徴とする製造方
法を提供する。 （ａ）イオン交換クロマトグラフィー （ｂ）アフィニティークロマトグラフィー （ｃ）ゲルろ過クロマトグラフィー

【００２０】以下本発明を詳細に説明する。本発明の蛋
白性生理活性物質は、下記式［１］ないし［１１］（配
列表の配列番号１ないし１１）のいずれかで表されるア
ミノ酸配列を、少なくとも１つ有している新規な蛋白性
生理活性物質である。 式［１］ Val Ile Gly Ile Pro Thr Pro Val Leu Ile Trp Asn Lys Val Lys 1 5 10 15 Arg Gly His Tyr Gly Val Gln Arg Thr Glu 20 25 式［２］ Leu Leu Pro Gly Asp Arg Asp Asn Leu Ala Ile Gln Thr Arg Gly 1 5 10 15 Gly Pro Glu

【００２１】 式［３］ Cys His Ala Ser Asn Ser Gln Gly Gln Ala Ser Ala Ser Ala Lys 1 5 10 15 Ile Thr Val Val 19 式［４］ Ile Thr Val Val Asp Ala Leu His Glu Ile Pro Val Lys Lys Gly 1 5 10 15 Glu Gly Ala Glu Leu 20

【００２２】 式［７］ Thr Glu Leu Leu Pro Gly Asp Arg Asp Asn Leu Ala Ile Gln Thr 1 5 10 15 Arg 式［９］ Lys Ala Ile Thr Gln Val Ser Lys Gly Thr Cys Glu 1 5 10 式［１０］ Xaa Glu Pro Xaa Gly Gly Gly Gly Ala Gly Arg Gly Tyr Gln Ala 1 5 10 15 Pro Gly 式［１１］ Gln Gly Pro Ser Ile Val Thr Pro Xaa Lys Asp Ile 1 5 10

【００２３】上記式［１］ないし［１１］（配列表の配
列番号１ないし１１）のいずれかのアミノ酸配列の部分
は本発明の蛋白性生理活性物質の任意の部分でよい。上
記式［１］ないし［１１］（配列表の配列番号１ないし
１１）のアミノ酸配列部分は互いに隣接していても、そ
れらの間に任意のアミノ酸配列が含まれていてもよい。

【００２４】さらに、本発明の蛋白性生理活性物質は、
下記式［１２］または［１３］（配列表の配列番号１２
または１３）で表されるアミノ酸配列を含有する新規な
蛋白性生理活性物質である。

【００２５】 式［１２］ Val Ile Gly Ile Pro Thr Pro Val Leu Ile Trp Asn Lys Val Lys 1 5 10 15 Arg Gly His Tyr Gly Val Gln Arg Thr Glu Leu Leu Pro Gly Asp 20 25 30 Arg Asp Asn Leu Ala Ile Gln Thr Arg Gly Gly Pro Glu Lys His 35 40 45 Glu Val Thr Gly Trp Val Leu Val Ser Pro Leu Ser Lys Glu Asp 50 55 60 Ala Gly Glu Tyr Glu Cys His Ala Ser Asn Phe Gln Gly Gln Ala 65 70 75 Ser Ala Ser Ala Lys Ile Thr Val Val Asp Ala Leu His Glu Ile 80 85 90 Pro Val Lys Lys Gly Glu Gly Ala Glu Leu 95 100

【００２６】 式［１３］ Val Ile Gly Ile Pro Thr Pro Val Leu Ile Trp Asn Lys Val Lys 1 5 10 15 Arg Gly His Tyr Gly Val Gln Arg Thr Glu Leu Leu Pro Gly Asp 20 25 30 Arg Asp Asn Leu Ala Ile Gln Thr Arg Gly Gly Pro Glu Lys His 35 40 45 Glu Val Thr Gly Trp Val Leu Val Ser Pro Leu Ser Lys Glu Asp 50 55 60 Ala Gly Glu Tyr Glu Cys His Ala Ser Asn Ser Gln Gly Gln Ala 65 70 75 Ser Ala Ser Ala Lys Ile Thr Val Val Asp Ala Leu His Glu Ile 80 85 90 Pro Val Lys Lys Gly Glu Gly Ala Glu Leu 95 100

【００２７】この新規な蛋白性生理活性物質は、非還元
条件下におけるドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）において分子
量が３０〜３６ｋＤａである場合に好適である。また、
本発明の新規な蛋白性生理活性物質は、プロスタグラン
ジンＩ₂ （ＰＧＩ₂ ）産生刺激活性を有する場合に好適
である。この活性の測定方法は後述する。

【００２８】次に本発明の新規な蛋白性生理活性物質の
製造方法について説明する。本発明の新規な蛋白性生理
活性物質は、いかなる起源のものでも良いが、ヒト由来
のものが好ましく、さらに好ましくは、正常ヒト二倍体
線維芽細胞由来のものであり、特に、この正常ヒト二倍
体線維芽細胞の培養上清中に産生されるものが好まし
い。本発明の新規な蛋白性生理活性物質は、例えば、適
当な生育媒体中で正常ヒト二倍体線維芽細胞等を培養
し、ＰＧＩ₂ 産生刺激活性を有する培養液を回収して得
られる培養上清を精製することにより得ることができ
る。正常ヒト二倍体線維芽細胞の培養は、通常用いられ
る培地を用いてもよいが、特にダルベッコ改変イーグル
培地、ＲＰＭＩ１６４０培地、イーグル最少必須培地ま
たはハム培地等が好ましい。また、血清を添加してもし
なくてもよいが、培養上清より本発明の物質を精製し、
単離することから、無血清培地を用いた方が好ましい。
培養終了後の培養上清は、例えばフィルター法または限
外ろ過法等の方法により濃縮した方が好ましい。

【００２９】上述のようにして得られた本発明の新規な
蛋白性生理活性物質を含む原料を下記工程の少なくとも
１つを用いて精製するが、下記工程（ａ）、（ｂ）およ
び（ｃ）の各々は、公知のプロトコールに従って行えば
よい。 （ａ）イオン交換クロマトグラフィー （ｂ）アフィニティークロマトグラフィー （ｃ）ゲルろ過クロマトグラフィー また、その順序は任意でよく、必要に応じて繰り返して
もよい。さらに、一つの工程と他の工程との間または前
後に、濃縮、透析等の操作を加えてもよく、さらに必要
に応じて、例えば、クロマトフォーカシング、吸着クロ
マトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、逆相クロ
マトグラフィー、薄層クロマトグラフィー、分配クロマ
トグラフィー等の他のクロマトグラフィーや、等電点電
気泳動法、ポリアクリルアミド電気泳動法、塩折法等の
他の蛋白質の精製方法と組み合わせてもよい。

【００３０】また、工程（ａ）〜（ｃ）の後、単離精
製、純度確認等の目的のため、さらに、収集画分を逆相
高速液体クロマトグラフィーにかけてもよい。上記工程
（ａ）、（ｂ）および（ｃ）は各々、低圧液体クロマト
グラフィーであっても、高圧液体クロマトグラフィー
（高性能液体クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ）であって
もよい。各クロマトグラフィーにおける溶出方法は、各
クロマトグラフィー担体、目的物質、含有される夾雑物
質の物性等を考慮して、適当な溶出条件、溶出液を選択
すればよい。溶出は、直線濃度勾配溶出であっても、段
階的濃度勾配溶出であってもよい。

【００３１】上記工程（ａ）〜（ｃ）を用いて、好まし
くは下記の方法により培養上清から本発明の新規な蛋白
性生理活性物質を単離することができる。正常ヒト二倍
体線維芽細胞の培養上清を陰イオン交換クロマトグラフ
ィー、例えばＤＥＡＥ−５ＰＷ（東ソー社製）、Ｍｏｎ
ｏＱ（ファルマシア社製）またはＱ−セファロースカラ
ム（ファルマシア社製）等に吸着させ、塩化ナトリウム
の直線濃度勾配法にて溶出する。溶出した各フラクショ
ンのＰＧＩ₂ 産生刺激活性を測定し、活性のある画分を
得る。ＰＧＩ₂ 産生刺激活性の測定については後述す
る。さらにこの画分をアフィニティークロマトグラフィ
ー、例えばヘパリン−５ＰＷ（東ソー社製）等に吸着さ
せ、塩化ナトリウムの直線濃度勾配法にて溶出する。Ｐ
ＧＩ₂ 産生刺激活性を同様に測定し、活性画分を集め
る。次にこの画分をゲルろ過クロマトグラフィー、例え
ばプロテイン−パック（日本ミリポア リミテッド ウ
ォーターズ クロマトグラフィー事業部）、セファクリ
ル Ｓ−１００ＨＲ（ファルマシア社製）またはＴＳＫ
ゲルＧ３０００ＳＷ _XLカラム（東ソー社製）等を用いて
展開し、ＰＧＩ₂ 産生刺激活性を測定し、生物学的活性
画分を得ることができる。さらにこの画分をアフィニテ
ィークロマトグラフィー、例えばインシュリン様増殖因
子（Ｉｎｓｕｌｉｎｅ−ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａ
ｃｏｒ，ＩＧＦ）−ＩまたはIIをリガンドとして結合さ
せたＩＧＦ−アフィニティーカラム、または、小麦胚芽
凝集素をリガンドとして結合させたＷＧＡ−アフィニテ
ィーカラムにかけることにより、ＰＧＩ₂ 産生刺激活性
を示す新規な蛋白性生理活性物質を単離精製できる。

【００３２】各クロマトグラフィーにおける目的とする
本発明の蛋白性生理活性物質の画分は、溶出した各フラ
クションのＰＧＩ₂ 産生刺激活性を測定し、活性のある
画分を集めることにより得ることができる。ＰＧＩ₂ 産
生刺激活性の測定は、以下の方法により実施できる。す
なわち、ウシ胸部大動脈内膜より剥離法にて採取した血
管内皮細胞を１０％ウシ胎児血清含有ダルベッコ改変イ
ーグル培地で継代培養し、飽和細胞密度に達するまで培
養した後、測定試料を添加し６０分間インキュベーショ
ン後、上清中のＰＧＩ₂ の安定代謝産物である、

【化１】 （以下、６−ケト−ＰＧＦ１αと記す）を測定すること
によりＰＧＩ₂ 産生量を求めることができる。この測定
には市販の６−ケト−ＰＧＦ１α測定用キットを用いて
もよい。

【００３３】精製されたＰＧＩ₂ 産生刺激活性を有する
本発明の新規な蛋白性生理活性物質のアミノ酸配列を決
定するために、以下の方法を用いることができる。例え
ば、自動気相シークエンサーを使用する場合は、直接本
発明の物質を該シークエンサーで分析しても、または、
トリプシン、エンドプロテイナーゼＧｌｕ−Ｃ（プロテ
アーゼＶ８）、リジルエンドペプチダーゼ等の酵素切断
により得られるペプチド断片を分析してもよく、それぞ
れのアミノ酸配列を決定することができる。本発明の新
規な蛋白性生理活性物質は、配列表の配列番号１ないし
１１の少なくともいずれか１つのアミノ酸配列で特徴づ
けられる新規物質である。さらに、本発明の新規な蛋白
性生理活性物質は、配列表の配列番号１２または１３の
アミノ酸配列で特徴づけられる新規物質である。本発明
の新規な蛋白性生理活性物質の製造方法により、血管内
皮細胞からのＰＧＩ₂ 産生を刺激し、ＰＧＩ₂ の産生低
下によって生じる前述の各種疾患等の治療に用いること
が可能な新規な蛋白性生理活性物質を得ることができ
る。

【００３４】本発明の新規な蛋白性生理活性物質を医薬
用途として用いるためには大量にしかも高純度で製造で
きる方法を開発する必要がある。その方法としては、前
述の正常ヒト二倍体線維芽細胞から得る方法以外にも遺
伝子工学的手法を用いた方法があげられる。一般的な遺
伝子工学的手法としては、本発明の蛋白性生理活性物質
のアミノ酸配列を明らかにし、それを基にＤＮＡプロー
ブを作製し、適当なｃＤＮＡライブラリー、好ましくは
正常ヒト二倍体線維芽細胞よりｍＲＮＡを調製しｃＤＮ
Ａを合成して得られたｃＤＮＡライブラリーをスクリー
ニングすることにより本発明の新規な蛋白性生理活性物
質のｃＤＮＡを得ることができる。また、精製された該
蛋白性生理活性物質を用いて、あるいはアミノ酸配列解
析または遺伝子解析により決定されたアミノ酸配列の一
部を合成ペプチドとして合成しこれを用いてウサギ、マ
ウス等を免疫し抗体を得た後、この抗体を用いてｃＤＮ
Ａライブラリーをスクリーニングすることも可能であ
る。好ましくは下記の方法により本発明の新規な蛋白性
生理活性物質をコードするｃＤＮＡを取得することがで
きる。正常ヒト二倍体線維芽細胞から全ＲＮＡを調製
し、ポリ（Ａ）⁺ ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を調製する。例え
ば、全ＲＮＡの調製は、一般的なグアニジンチオシアネ
ート法や熱フェノール法またはＡＧＰＣ法により可能で
ある。またｍＲＮＡは全ＲＮＡをオリゴ（ｄＴ）セルロ
ースやポリＵ−セファロース等を用いたアフィニティー
クロマトグラフィーをカラム法やバッチ法で実施するこ
とにより調製できる。次いで、逆転写酵素を用いて２本
鎖ｃＤＮＡを合成し、各種プラスミドベクター、例えば
プラスミドｐＵＣ１１９、プラスミドｐＥＦ−ＢＯＳ
［ヌクレイック アシッド リサーチ（Ｎｕｃｌ．Ａｃ
ｉｄｓ Ｒｅｓ．）、１８巻、５３２２頁、１９９０
年］等に、あるいはクローニング用ファージベクターλ
ｇｔ１０、λｇｔ１１等に導入し、大腸菌を形質転換し
て、あるいはインビトロパッケージングすることにより
ｃＤＮＡライブラリーを作製する。ｃＤＮＡの合成は、
グブラーとホフマンの方法［ジーン（Ｇｅｎｅ）、２５
巻、２６３頁、１９８３年］等に従って合成することが
できる。市販されているｃＤＮＡ合成キット（アマシャ
ム社製、ベーリンガー社製、インヴィトロジェン社製）
を用いてもよい。上述のプラスミドベクターもしくはフ
ァージベクターへのｃＤＮＡの導入は合成したｃＤＮＡ
にリンカーを付加すること等によって実施できる。使用
するリンカーは、特に限定されるものではないが、プラ
スミドｐＥＦ−ＢＯＳを用いる場合にはＢｓｔＸＩリン
カーが好ましい。リンカーの付加、プラスミドおよびフ
ァージベクターへのｃＤＮＡの導入は、市販のライゲー
ションキット（宝酒造社製）を用いても可能である。形
質転換する大腸菌は通常用いられる株であれば特に限定
されるものではないが、ＨＢ１０１、ＤＨ５およびＭＣ
１０６１／Ｐ３が好ましい。大腸菌へのｃＤＮＡを導入
したプラスミドＤＮＡの導入方法はエレクトロポレーシ
ョン法、塩化カルシウム法等により実施可能である。イ
ンビトロパッケージングは市販のインビトロパッケージ
ングキット（ストラタジーン社製、アマシャム社製）を
用いても実施可能である。

【００３５】本発明の新規な蛋白性生理活性物質をコー
ドするｃＤＮＡの選択は、一般的なｃＤＮＡスクリーニ
ング法を組み合わせることにより可能である。例えば得
られた部分アミノ酸配列に基づいてプローブを作製し直
接ｃＤＮＡライブラリーまたはファージライブラリーを
スクリーニングするか、ＰＣＲプライマーを作製しＰＣ
Ｒ法により増幅されるＤＮＡ断片を有するクローンを選
択する方法等が考えられる。またｃＤＮＡを発現させる
ことのできるライブラリー、例えばλｇｔ１１ファージ
ベクターを用いて作製したライブラリーを用いる場合に
は上述の方法で得た抗体を用いてクローンを選択するこ
とができる。この中では一度に大量のクローンを処理で
きることからＰＣＲ法を用いるスクリーニング法が好ま
しい。得られた目的のクローン中に含まれるｃＤＮＡの
塩基配列はジデオキシターミネーション法により決定で
きる。決定されたＤＮＡ配列は下記式［１４］または
［１５］（配列表の配列番号１４または１５）で示され
る。

【００３６】 式［１４］ GGTCATCGGA ATCCCGACAC CTGTCCTCAT CTGGAACAAG GTAAAAAGGG GTCACTATGG 60 AGTTCAAAGG ACAGAACTCC TGCCTGGTGA CCGGGACAAC CTGGCCATTC AGACCCGGGG 120 TGGCCCAGAA AAGCATGAAG TAACTGGCTG GGTGCTGGTA TCTCCTCTAA GTAAGGAAGA 180 TGCTGGAGAA TATGAGTGCC ATGCATCCAA TTTCCAAGGA CAGGCTTCAG CATCAGCAAA 240 AATTACAGTG GTTGATGCCT TACATGAAAT ACCAGTGAAA AAAGGTGAAG GTGCCGAGCT 300 ATAAACCTCC AGAATATTAT TAGTCTGCAT GGTTAAAAGT AGTCATGGAT AACTACATTA 360 CCTGTTCTTG CCTAATAAGT TTCTTTTAAT CCAATCCACT AACACTTTAG TTATATTCAC 420 TGGTTTTACA CAGAGAAATA CAAAATAAAG ATCACACATC AAGACTATCT ACAAAAATTT 480 ATTATATATT TACAGAAGAA AAGCATGCAT ATCATTAAAC AAATAAAATA CTTTTTATCA 540 CAAAAAAAAA AAAAAAA 557

【００３７】 式［１５］ GGTCATCGGA ATCCCGACAC CTGTCCTCAT CTGGAACAAG GTAAAAAGGG GTCACTATGG 60 AGTTCAAAGG ACAGAACTCC TGCCTGGTGA CCGGGACAAC CTGGCCATTC AGACCCGGGG 120 TGGCCCAGAA AAGCATGAAG TAACTGGCTG GGTGCTGGTA TCTCCTCTAA GTAAGGAAGA 180 TGCTGGAGAA TATGAGTGCC ATGCATCCAA TTCCCAAGGA CAGGCTTCAG CATCAGCAAA 240 AATTACAGTG GTTGATGCCT TACATGAAAT ACCAGTGAAA AAAGGTGAAG GTGCCGAGCT 300 ATAAACCTCC AGAATATTAT TAGTCTGCAT GGTTAAAAGT AGTCATGGAT AACTACATTA 360 CCTGTTCTTG CCTAATAAGT TTCTTTTAAT CCAATCCACT AACACTTTAG TTATATTCAC 420 TGGTTTTACA CAGAGAAATA CAAAATAAAG ATCACACATC AAGACTATCT ACAAAAATTT 480 ATTATATATT TACAGAAGAA AAGCATGCAT ATCATTAAAC AAATAAAATA CTTTTTATCA 540 CAAAAAAAAA AAAAAAA 557

【００３８】本発明のＤＮＡ配列は、本発明の蛋白性生
理活性物質をコードするもので、式［１４］または［１
５］（配列表の配列番号１４または１５）で表されるＤ
ＮＡ配列の一部であっても良いし全部であってもよい。
また、式［１４］または［１５］（配列表の配列番号１
４または１５）で表されるＤＮＡ配列を一部に含むもの
であってもよい。本発明のＤＮＡ配列は、ＲＮＡを鋳型
に合成しても良いし、有機化学的に合成してもよい。ま
た、ＰＣＲ法によって増幅させて得てもよい。一般に、
遺伝子組換え技術分野では、遺伝暗号の縮重に従い、遺
伝子から産生される蛋白質のアミノ酸配列を変えること
なく、その遺伝子のＤＮＡ配列の少なくとも一つの塩基
を他の塩基に置換することができる。従って、本発明の
ＤＮＡ配列は、また、遺伝暗号の縮重に基づく置換によ
って変化された塩基配列をも含有する。この場合、置換
により得られたＤＮＡ配列から演繹されるアミノ酸配列
は、式［１２］または［１３］（配列表の配列番号１２
または１３）で示すアミノ酸配列と一致する。

【００３９】本発明では、式［１４］または［１５］
（配列表の配列番号１４または１５）のＤＮＡ配列と相
補的なＤＮＡ配列を提供することも可能であり、この場
合、相補的なＤＮＡ配列は、式［１４］または［１５］
（配列表の配列番号１４または１５）のＤＮＡ配列全体
と相補的なものであっても良いし、一部と相補的なもの
であってもよい。また、相補的ＤＮＡ配列を一部に含む
ものであってもよい。また、式［１４］または［１５］
（配列表の配列番号１４または１５）のＤＮＡとそれと
相補的なＤＮＡは、互いに相補的に結合して２本鎖ＤＮ
Ａを形成しても良いし、相補的な１本鎖ＤＮＡ単独でも
よい。式［１４］または［１５］（配列表の配列番号１
４または１５）で表されるＤＮＡ配列より導かれるアミ
ノ酸配列は、式［１２］または［１３］（配列表の配列
番号１２または１３）で示される。

【００４０】 式［１２］ Val Ile Gly Ile Pro Thr Pro Val Leu Ile Trp Asn Lys Val Lys 1 5 10 15 Arg Gly His Tyr Gly Val Gln Arg Thr Glu Leu Leu Pro Gly Asp 20 25 30 Arg Asp Asn Leu Ala Ile Gln Thr Arg Gly Gly Pro Glu Lys His 35 40 45 Glu Val Thr Gly Trp Val Leu Val Ser Pro Leu Ser Lys Glu Asp 50 55 60 Ala Gly Glu Tyr Glu Cys His Ala Ser Asn Phe Gln Gly Gln Ala 65 70 75 Ser Ala Ser Ala Lys Ile Thr Val Val Asp Ala Leu His Glu Ile 80 85 90 Pro Val Lys Lys Gly Glu Gly Ala Glu Leu 95 100

【００４１】 式［１３］ Val Ile Gly Ile Pro Thr Pro Val Leu Ile Trp Asn Lys Val Lys 1 5 10 15 Arg Gly His Tyr Gly Val Gln Arg Thr Glu Leu Leu Pro Gly Asp 20 25 30 Arg Asp Asn Leu Ala Ile Gln Thr Arg Gly Gly Pro Glu Lys His 35 40 45 Glu Val Thr Gly Trp Val Leu Val Ser Pro Leu Ser Lys Glu Asp 50 55 60 Ala Gly Glu Tyr Glu Cys His Ala Ser Asn Ser Gln Gly Gln Ala 65 70 75 Ser Ala Ser Ala Lys Ile Thr Val Val Asp Ala Leu His Glu Ile 80 85 90 Pro Val Lys Lys Gly Glu Gly Ala Glu Leu 95 100

【００４２】本発明の新規な蛋白性生理活性物質は、式
［１２］または［１３］（配列表の配列番号１２または
１３）で表されるアミノ酸配列の一部を含むものであっ
ても良いし、全部を含むものであっても良い。自然の変
異により、または人工的変異により、その本来の機能を
変化させることなく、ＤＮＡの構造およびそれから演繹
されるポリペプチドの構造の一部を変異せしめることが
可能である。従って、本発明の新規な蛋白性生理活性物
質は、前述のすべてのアミノ酸配列の相同変異体に相当
する構造を有する配列を含有することも可能である。

【００４３】本発明の新規な蛋白性生理活性物質をコー
ドする配列表の配列番号１４のＤＮＡを含むプラスミド
ｐＭ９５０で形質転換された大腸菌ＤＨ５（ｐＭ９５
０）は、工業技術院微生物工業技術研究所に寄託［受託
番号：微工研菌寄第１３１７２号（FERM P-13172、寄託
日 平成４年９月２１日）］されている。

【００４４】本発明の新規な蛋白性生理活性物質を遺伝
子工学的に得るには、一般的に使用されている宿主−ベ
クター系を用いることができる。例えば宿主として大腸
菌を用いる場合は、プロモーターとしてＬａｃＵＶ５、
トリプトファンプロモーターやλＰ_L プロモーター等を
含有する発現ベクターが使用可能である。また、λファ
ージ系のベクターであるλｇｔ１１を用いて、β−ガラ
クトシダーゼとの融合蛋白質として得ることもできる。
さらに、哺乳動物培養細胞を宿主として使用することも
でき、サル由来ＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター由
来ＣＨＯ細胞、マウス由来３Ｔ３細胞あるいはヒト由来
線維芽細胞等が好適である。これらを宿主とする場合に
は、プロモーターとして、ＳＶ４０初期プロモーター、
アデノウイルス主要後期プロモーターあるいはβ−アク
チンプロモーターやポリペプチド鎖伸長因子プロモータ
ー等を含有する発現ベクターが使用できる。これらの宿
主−ベクター系を用いた場合、各々の宿主が好適に増殖
し得る条件下で培養し、かつ、各々のプロモーターが機
能するような条件を与えることによって、本発明の新規
な蛋白性生理活性物質を得ることができる。

【００４５】本発明の新規な蛋白性生理活性物質は、Ｐ
ＧＩ₂ の有する血小板凝集抑制作用、平滑筋弛緩作用、
胃酸分泌抑制作用等に基づき、前述の各種疾患に対し
て、本発明の蛋白性生理活性物質を少なくとも１つの有
効成分として含有することを特徴とする医薬組成物を提
供することができる。本発明の医薬組成物の医薬形態
は、その疾患病巣に有効量を供給できるものであればい
かなるものでもよく、例えば、錠剤、粉末剤、散剤、カ
プセル剤、あるいは注射剤等が例示される。また、本発
明の医薬組成物は、その薬理学的特性を損なわない限
り、一般的に使用される製剤学的混合物である賦型剤、
安定化剤あるいは溶解補助剤等を含有していてもよい。
具体例として、リンガー液、リン酸緩衝液、ヒト血清ア
ルブミン、水解ゼラチン、ショ糖、デキストラン、ポリ
エチレングリコール等があり、薬剤形態により、適宜選
択使用される。

【００４６】

【実施例】以下に本発明を実施例をもってより具体的に
示すが、これは本発明の実施態様の一つの例示であり、
本発明はこれに限定されるものではない。なお、実施例
中の学術用語、略号等は特に断らない限り当該技術分野
で一般的に使用されているものに従った。また、蛋白質
精製に関わる基本的操作は、日本生化学会編 ”新生化
学実験講座第１巻 蛋白質Ｉ 分離・精製・性質” 東
京化学同人 １９９０年を参考として実施した。さら
に、遺伝子操作に関わる基本的操作は、マニアティスら
”モレキュラークローニング ア ラボラトリーマニ
ュアル”コールド スプリング ハーバー ラボラトリ
ー １９８９年、村松正實編 ”ラボマニュアル遺伝子
工学”丸善 １９８８年等を参考として実施した。各種
機器、試薬等の使用方法は各々附属の使用説明書に従っ
た。

【００４７】（実施例１） 蛋白性生理活性物質の精製 下記の方法で、培養上清を作製し、精製し、本発明の新
規な蛋白性生理活性物質を得た。なお、ＰＧＩ₂ 産生刺
激活性の測定は以下の方法で行った。血管内皮細胞はウ
シ胸部大動脈内膜より剥離法にて採取した。次いで得ら
れた血管内皮細胞を１０％ウシ胎児血清を含む１００Ｕ
／ｍＬペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬストレプトマ
イシン含有ダルベッコ改変イーグル培地中、５％炭酸ガ
ス−９５％空気下、３７℃にて継代培養した。培地は週
２回交換し、５〜１０代継代後、血管内皮細胞を０．０
５％トリプシン処理した。次いで、１０％ウシ胎児血清
含有ダルベッコ改変イーグル培地１ｍＬの入った２４穴
培養皿に血管内皮細胞を移し、５×１０⁴ 細胞／穴まで
培養した。１０％以下の各種試料含有ダルベッコ改変イ
ーグル培地５００μＬを添加後、３７℃で６０分間イン
キュベーションした。培養上清からの６−ケト−ＰＧＦ
１αの抽出と精製はジャッフェらの方法［ザジャーナル
オブ クリニカル インベスティゲーション（Ｊ．Ｃ
ｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．）、５２巻、３９８頁、１９７
３年］を改良して行った。培養上清１ｍＬに０．１Ｎ塩
酸１．５ｍＬを加え、５ｍＬ酢酸エチルで２度抽出し
た。窒素ガス下で酢酸エチルを蒸発させ、エタノールに
再溶解させた。アッセイに使用するまで−２０℃で保存
した。４０℃でエタノールを蒸発させ０．１Ｍリン酸緩
衝液（ｐＨ７．２、１Ｍ塩化ナトリウム、１％ゼラチン
含有）に溶解させた。６−［ ³Ｈ］ケトＰＧＦ１αと抗
６−ケト−ＰＧＦ１α抗体を用いたニューイングランド
ヌクレアー（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａ
ｒ）社製の６−ケト−ＰＧＦ１α測定ラジオイムノアッ
セイキットを用い、添付マニュアルに従い６−ケト−Ｐ
ＧＦ１αの濃度を測定した。ＰＧＩ₂ 産生量は、１時
間、１０⁴細胞当たりの６−ケト−ＰＧＦ１α産生量
（ｐｇ／１０⁴ 細胞／時間）によって、求めた。

【００４８】（１） 正常ヒト二倍体線維芽細胞の培養
上清の作製 正常ヒト二倍体線維芽細胞を１５％ウシ胎児血清含有ダ
ルベッコ改変イーグル培地にて４．８×１０⁴ 細胞／ｍ
Ｌに調製した。この細胞懸濁液３Ｌを回転培養容器に植
え込み、５％炭酸ガス−９５％空気下、３７℃にて培養
した。細胞植え込み３日後に培養液を新鮮な１５％ウシ
胎児血清含有ダルベッコ改変イーグル培地３Ｌに交換
し、さらに培養を２日間継続した。次いで、培養液を除
去し、Ｃａ ²⁺、Ｍｇ²⁺不含ダルベッコ−リン酸生理食塩
溶液を用いて細胞を洗浄した後、フェノールレッド不含
のダルベッコ改変イーグル培地３Ｌを添加し、３７℃、
２日間培養した。培養液を回収後、２．５μｍのフィル
ター（ＣＮカートリッジ ３０インチ、ミリポア社製）
にてろ過し細胞片を除去した。次いでホローファイバー
モジュール（モルセップファイバーＦＳ−１０ ６ｋＤ
ａ カットオフ、ダイセル化学工業社製）、分画分子量
１０ｋＤａの限外ろ過カセット（オメガミニセット、富
士フィルター工業社製）による２段階の濃縮操作にて濃
縮した。この濃縮液を分画分子量３．５ｋＤａの透析チ
ューブ（スペクトラム社製）を用いて、２０ｍＭトリス
−塩酸緩衝液（ｐＨ７．８）で４℃、１晩透析した。同
緩衝液でさらに４℃、８時間透析後、１．２μｍフィル
ター（ディエフエイ アセンブリ、日本ポール社製）、
０．２２μｍフィルターシステム（コーニング社製）で
順次ろ過した。

【００４９】（２） ＰＧＩ₂ 産生刺激因子の精製 工程１ （１）に従って作製した正常ヒト二倍体線維芽細胞の培
養上清を予め２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．
８）で平衡化したＤＥＡＥ−５ＰＷ（東ソー社製）陰イ
オン交換クロマトカラムに吸着させ、２０ｍＭトリス−
塩酸緩衝液（ｐＨ７．８）を用いて作製した０〜１．０
Ｍの塩化ナトリウムの直線濃度勾配法にて溶出させ、２
８０ｎｍにおいて吸光度を同時に測定した。溶出した各
フラクションのＰＧＩ₂ 産生刺激活性を上述の方法に従
って測定し、５０〜１５０ｍＭの塩化ナトリウム濃度で
溶出されたＰＧＩ₂ 産生刺激活性を有する画分をプール
した（図１）。 工程２ 工程１で得られた活性画分を１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．４）で透析後、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．
４）で平衡化したヘパリン（ＨＥＰＡＲＩＮ）−５ＰＷ
（東ソー社製）アフィニティーカラムに吸着させ、１０
ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を用いて作製した０〜
１．０Ｍの塩化ナトリウムの直線濃度勾配法にて溶出さ
せ、２８０ｎｍにおいて吸光度を同時に測定した。溶出
した各フラクションのＰＧＩ₂ 産生刺激活性を測定し、
４５０〜５００ｍＭの塩化ナトリウム濃度で溶出された
ＰＧＩ₂ 産生刺激活性を有する画分をプールした（図
２）。

【００５０】工程３ 工程２で得られた活性画分をセントリコン−１０（アミ
コン社製）にて濃縮後、予め１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．４）で平衡化したプロテイン−パック（ＰＲＯＴ
ＥＩＮ−ＰＡＫ）３００（日本ミリポア リミテッド
ウォーターズクロマトグラフィー事業部）のゲルろ過カ
ラムを２本連結したものを用いて展開し、２８０ｎｍに
おいて吸光度を同時に測定した。各フラクションのＰＧ
Ｉ₂ 産生刺激活性を測定したところ、活性は分子量３０
ｋＤａ付近に認められた（図３）。図３中の数字は分子
量（ｋＤａ）、Ｖｔは充填剤の総体積、Ｖｏは排除体積
を表す。 工程４ 工程３で得られた活性画分を１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．４）で平衡化したＩＧＦ−アフィニティーカラム
にかけた。ＩＧＦ−アフィニティーカラムは、アフィプ
レップ１０（日本バイオラッドラボラトリース社製）に
組換ＩＧＦ−Ｉをリガンドとして結合させた耐圧カラム
を作製し、本実験に用いた。サンプルを吸着後、０．５
Ｍ酢酸で溶出した。ＰＧＩ₂ 産生刺激活性を測定したと
ころ、ＰＧＩ₂ 産生刺激活性は、非吸着画分に認められ
た。

【００５１】工程５ 工程４で得られた活性画分を０．１％トリフルオロ酢酸
含有１０％アセトニトリル水溶液で平衡化したＣ₄ 逆相
ＨＰＬＣカラム（ウォーターズ社製）にかけた後、溶出
液０．１％トリフルオロ酢酸／アセトニトリル溶液を用
いて作製した１０〜６０％アセトニトリルの直線濃度勾
配法にて溶出した。その結果、本発明の新規な蛋白性生
理活性物質は単一なピークとして溶出された。

【００５２】（３） 正常ヒト二倍体線維芽細胞由来の
ＰＧＩ₂ 産生刺激因子の物性の測定 分子量の測定 （２）の工程５で得られた本発明の新規な蛋白性生理活
性物質の分子量を、非還元条件下におけるドデシル硫酸
ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ
−ＰＡＧＥ）で求めたところ、分子量３０〜３６ｋＤａ
に単一のバンドとして認められた（図４）。図４はＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥの泳動後の参考写真の模式図である。図４
中、ラインＡおよびＣは既知分子量を持つ標準試料のバ
ンドであり、ラインＢは本発明の新規な蛋白性生理活性
物質のバンドである。また、数字は標準試料の分子量
（ｋＤａ）を表す。 アミノ酸配列の解析 （２）の工程５で得られた本発明の新規な蛋白性生理活
性物質を、トリプシンで消化して、あるいは還元カルボ
キシメチル化後、Ｃ₈ 逆相ＨＰＬＣカラム（日本ウォー
タース社製）で脱塩し、次いでエンドプロテイナーゼＧ
ｌｕ−Ｃ（プロテアーゼＶ８）で消化してペプチドフラ
グメント化した。これらのサンプルを各々０．１％トリ
フルオロ酢酸水溶液で平衡化したＣ₈ 逆相ＨＰＬＣカラ
ム（セパレーションズグループ社製）にかけた後、０．
０８％トリフルオロ酢酸／アセトニトリル溶液を用いて
作製した０〜１００％アセトニトリルの直線濃度勾配法
にて溶出させた。自動気相シークエンサー（アプライド
バイオシステムズ４７７Ａ−１２０Ａ）を用い、エドマ
ン分解により各々のペプチドフラグメントのアミノ酸配
列を決定した。得られたアミノ酸配列を下記式［１］〜
［１１］（配列表の配列番号１〜１１）に示す。

【００５３】 式［１］ Val Ile Gly Ile Pro Thr Pro Val Leu Ile Trp Asn Lys Val Lys 1 5 10 15 Arg Gly His Tyr Gly Val Gln Arg Thr Glu 20 25 式［２］ Leu Leu Pro Gly Asp Arg Asp Asn Leu Ala Ile Gln Thr Arg Gly 1 5 10 15 Gly Pro Glu

【００５４】 式［３］ Cys His Ala Ser Asn Ser Gln Gly Gln Ala Ser Ala Ser Ala Lys 1 5 10 15 Ile Thr Val Val 19 式［４］ Ile Thr Val Val Asp Ala Leu His Glu Ile Pro Val Lys Lys Gly 1 5 10 15 Glu Gly Ala Glu Leu 20

【００５５】 式［７］ Thr Glu Leu Leu Pro Gly Asp Arg Asp Asn Leu Ala Ile Gln Thr 1 5 10 15 Arg

【００５６】 式［９］ Lys Ala Ile Thr Gln Val Ser Lys Gly Thr Cys Glu 1 5 10 式［１０］ Xaa Glu Pro Xaa Gly Gly Gly Gly Ala Gly Arg Gly Tyr Gln Ala 1 5 10 15 Pro Gly 式［１１］ Gln Gly Pro Ser Ile Val Thr Pro Xaa Lys Asp Ile 1 5 10

【００５７】（実施例２） ｃＤＮＡライブラリーの作製 工程１ 正常ヒト二倍体線維芽細胞の調製 正常ヒト二倍体線維芽細胞を１５％ウシ胎児血清含有ダ
ルベッコ改変イーグル培地にて４．８ｘ１０⁴ 細胞／ｍ
Ｌに調製した。この細胞懸濁液３Ｌを回転培養容器に植
え込み、５％炭酸ガス−９５％空気下、３７℃にて培養
した。細胞植え込み３日後に培養液を新鮮な１５％ウシ
胎児血清含有ダルベッコ改変イーグル培地３Ｌに交換
し、さらに培養を２日間継続した。次いで、培養液を除
去し、Ｃａ ²⁺、Ｍｇ²⁺不含ダルベッコ−リン酸生理食塩
溶液を用いて細胞を洗浄した後、フェノールレッド不含
のダルベッコ改変イーグル培地３Ｌを添加し、３７℃、
２４時間継続した。次いで、培養液を除去し、Ｃａ²⁺、
Ｍｇ²⁺不含生理的リン酸緩衝液（ＰＢＳ（−））を用い
て細胞を洗浄し、７本の回転培養容器から８ｘ１０⁹個
の細胞を得た。

【００５８】工程２ 全ＲＮＡの調製 正常ヒト二倍体線維芽細胞より、コムシズンスキ（Chom
czynski,P ）ら［アナリティカル バイオケミストリ
（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．）、１６２巻、１５６
頁、１９８７年］のＡＧＰＣ（Ａｃｉｄ Ｇｕａｎｉｄ
ｉｎｉｕｍ Ｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ−Ｐｈｅｎｏｌ−
Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ）法に従い、ＲＮＡを調製した。
すなわち、工程１で得られた約１０⁹ 個の細胞に６０ｍ
Ｌの４Ｍグアニジンチオシアネート溶液（ｐＨ７．０、
２５ｍＭクエン酸ナトリウム、０．５％ザルコシル及び
０．１Ｍ ２−メルカプトエタノール含有）を添加し、
強く振とうした。さらに、細胞溶解液に１／１０容の２
Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０）、６０ｍＬの水飽和フ
ェノール、１／５容のクロロホルム−イソアミルアルコ
ール混液（４９：１）を順時添加混合し、さらに１０秒
間強く振った後、１５分間氷中に放置した。４℃で８５
００ｒｐｍ、２０分間遠心後、水層（上部）を新しいチ
ューブに移した。得られた水層と等量の１００％イソプ
ロパノールを添加し、−２０℃で終夜放置した。４℃で
８５００ｒｐｍ、３０分間遠心後、得られたペレットを
約５０ｍＬの４Ｍグアニジンチオシアネート溶液（ｐＨ
７．０、２５ｍＭクエン酸ナトリウム、０．５％ザルコ
シル及び０．１Ｍ ２−メルカプトエタノール含有）で
溶解し、約５０ｍＬのイソプロパノールを添加した。−
２０℃で１時間放置後、４℃、８５００ｒｐｍで３０分
間遠心した。ペレットを約３０ｍＬの０．５ｍＭ ＥＤ
ＴＡに溶解後、常法に従って塩化ナトリウム存在下でエ
タノール沈澱後、ペレットを３．５ｍＬの０．５ｍＭ
ＥＤＴＡに溶解した。約９ｍｇの全ＲＮＡを得た。

【００５９】工程３ ポリ（Ａ）⁺ ＲＮＡの調製 全ＲＮＡよりオリゴ（ｄＴ）セルロースカラムを用い、
ポリ（Ａ）⁺ ＲＮＡを分離した。すなわち、オリゴ（ｄ
Ｔ）セルロース樹脂５００ｍｇを２００ｍＭトリス−塩
酸緩衝溶液（ｐＨ７．５、２０ｍＭ ＥＤＴＡ、４００
ｍＭ塩化ナトリウム及び０．１％ＳＤＳ含有）に懸濁
し、約２ｍＬ容量のカラムを作製した。工程２で得られ
た全ＲＮＡ（３．５ｍＬ）を６５℃で５分間熱処理した
後、急冷し、さらに全ＲＮＡ溶液と等量の４００ｍＭト
リス−塩酸緩衝溶液（ｐＨ７．５、４０ｍＭ ＥＤＴ
Ａ、８００ｍＭ塩化ナトリウム及び０．２％ＳＤＳ含
有）を加えた。この溶液を上述の２００ｍＭトリス−塩
酸緩衝溶液（ｐＨ７．５、２０ｍＭ ＥＤＴＡ、４００
ｍＭ塩化ナトリウム及び０．１％ＳＤＳ含有）で平衡化
したオリゴ（ｄＴ）セルロースカラムに吸着させた。１
０ｍＬの１００ｍＭトリス−塩酸緩衝溶液（ｐＨ７．
５、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、２００ｍＭ塩化ナトリウム及
び０．１％ＳＤＳ含有）で洗浄した。次いで、１０ｍＬ
の滅菌蒸留水でポリ（Ａ）⁺ ＲＮＡを溶出後、常法に従
い塩化ナトリウム存在下でエタノール沈澱を行った。ポ
リ（Ａ）⁺ ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）約２７０μｇを得た。

【００６０】工程４ ２本鎖ｃＤＮＡの合成 グブラーとホフマンの方法［ジーン（Ｇｅｎｅ）、２５
巻、２６３頁、１９８３年］を改良したシステムに基づ
いて構成されているｃＤＮＡ合成システムキット（アマ
シャム社製）を用いて２本鎖ｃＤＮＡを合成した。この
ｃＤＮＡ合成システムキットに添付の５ｘ１本鎖ｃＤＮ
Ａ合成反応用バッファー、ピロリン酸ナトリウム溶液、
ヒト胎盤リボヌクレアーゼインヒビター、デオキシヌク
レオシド三リン酸混液、オリゴ（ｄＴ）プライマーを順
々に混合した溶液に、工程３で得られた１０μｇのポリ
（Ａ）⁺ ＲＮＡ溶液を加えて静かに混和後、２００Ｕの
逆転写酵素を添加した。反応溶液は１００μＬとした。
静かに混和後、４２℃で４０分間インキュベートし、反
応チューブを氷冷した。上述のｃＤＮＡシステム合成キ
ットに添付の２本鎖ｃＤＮＡ合成反応用バッファー、大
腸菌リボヌクレアーゼＨ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ
を順々に添加し、滅菌水で総量５００μＬに調製し静か
に混和した。このチューブを１２℃で６０分間、次いで
２２℃で６０分間反応させた後、さらに７０℃で１０分
間インキュベートした。氷浴中に戻して２０ＵのＴ４Ｄ
ＮＡポリメラーゼを添加し静かに混和後、３７℃で１０
分間反応させた。反応液に２０μＬの０．２５Ｍ ＥＤ
ＴＡ（ｐＨ８．０）を加えて反応を停止し、常法に従っ
てフェノール／クロロホルム抽出および酢酸アンモニウ
ム存在下でエタノール沈澱を行い２本鎖ｃＤＮＡを精製
した。

【００６１】工程５ ＢｓｔＸＩリンカーの付加 インヴィトロジェン社製ＢｓｔＸＩリンカーを２本鎖ｃ
ＤＮＡに付加した。方法はＤＮＡライゲーションキット
（宝酒造社製）を用い、添付マニュアルに従って実施し
た。すなわち、工程４で合成した２本鎖ｃＤＮＡ約５０
０ｎｇに約５００ｎｇのＢｓｔＸＩリンカーを加えた溶
液３０μＬ（１００ｍＭトリス−塩酸緩衝溶液（ｐＨ
７．６）、５ｍＭ塩化マグネシウム、３００ｍＭ塩化ナ
トリウム含有）を用意した。次に、３０μＬの酵素溶液
（ＤＮＡライゲーションキットＢ液、以後、Ｂ液と称す
る）を加えよく混合し、１０℃で３時間反応させた。７
０℃で１０分間熱処理し、酢酸アンモニウム存在下でエ
タノール沈澱を行った。次に、低融点アガロースゲルで
電気泳動を実施し、５００ｂｐ以上の画分を集め、６５
℃で熱処理することによりゲルを溶解後、フェノール／
クロロホルム抽出および塩化ナトリウム存在下でエタノ
ール沈澱を行った。最終的に約１００ｎｇのリンカー付
加ｃＤＮＡを回収した。

【００６２】工程６ ｃＤＮＡのベクターへの導入 プラスミドベクターへのｃＤＮＡの挿入は、ＤＮＡライ
ゲーションキット（宝酒造社製）を用いて行った。すな
わち、制限酵素ＢｓｔＸＩで消化した１００ｎｇのプラ
スミドｐＥＦ−ＢＯＳ［ヌクレイック アシッド リサ
ーチ（Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．）、１８巻、
５３２２頁、１９９０年］と、工程５で得られたリンカ
ー付加２本鎖ｃＤＮＡ約２０ｎｇを含むＤＮＡ溶液４．
５μＬに３６μＬの反応用バッファー（ＤＮＡライゲー
ションキットＡ液）を加えよく混合した。次いで、４．
５μＬの酵素溶液（Ｂ液）を加えよく混合し、１６℃で
３０分間反応させた。酢酸アンモニウム存在下でエタノ
ール沈澱を行った後、ＴＥ溶液に溶解して、ｃＤＮＡと
プラスミドベクターの連結物を得た。大腸菌へのＤＮＡ
の導入は、エレクトロポレーション法を用いた。エレク
トロポレーション法は、ドワーら［ヌクレイック アシ
ッド リサーチ（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．）、
１６巻、６１２７頁、１９８８年］の方法に従って実施
した。

【００６３】大腸菌ＭＣ１０６１／Ｐ３をシングルコロ
ニーから１０ｍＬのＬ−ブロスに植菌し、終夜培養し
た。１０ｍＬの終夜培養液を１ＬのＬ−ブロスに植菌
し、Ａ_{60 0} ＝約０．５になるまで３７℃で培養した。培
養液を氷冷した後６０００ｒｐｍにて４℃で１５分間遠
心し集菌した。上清をデカンテーションにて除去した
後、１Ｌの氷冷滅菌水に再懸濁した。６０００ｒｐｍに
て４℃で１５分間遠心した後、上清を除去し、さらに５
００ｍＬの氷冷滅菌水に懸濁し、６０００ｒｐｍにて４
℃で１５分間遠心後上清を除去した。２０ｍＬの氷冷１
０％グリセロールに再懸濁し、６０００ｒｐｍにて４℃
で１５分間遠心後上清を除去した。２ｍＬの氷冷１０％
グリセロールに細胞を再懸濁し適量ずつ１．５ｍＬチュ
ーブに分注した。ドライアイスエタノールで急冷凍結し
た後、−７０℃前後で凍結保存した。４０〜５０μＬの
凍結保存大腸菌を氷上で融解後、上述の１μＬのｃＤＮ
Ａとベクターの連結物を含むＤＮＡ溶液を添加した。Ｄ
ＮＡ−大腸菌混合液をキュベット（電極間距離０．１ｃ
ｍ）に移した後、エレクトロポレーションの条件（ジー
ンパルサー、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製、キャパシタンス：２
５μＦ、電圧：１．８ｋＶ、パルスコントローラー：２
００Ω）を設定し、パルスを１回かけ、１ｍＬのＳＯＣ
培地をキュベット内に加え大腸菌を懸濁した。懸濁液を
培養チューブに移し１時間培養後、５０μｇ／ｍＬのア
ンピシリン含有ＬＢプレートに適量まき、３７℃で１晩
培養した。上記操作により形質転換体約６０万クローン
を得た。

【００６４】（実施例３） 蛋白性生理活性物質をコー
ドするｃＤＮＡの取得 工程１ プライマーの作製 実施例１で決定した部分アミノ酸配列のうち式［４］
（配列表の配列番号４）で示される２０アミノ酸配列の
Ｎ端およびＣ端のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列
を３９４型ＤＮＡ／ＲＮＡ合成機（アプライドバイオシ
ステムズ社製）を用いてホスホアミダイド法にて合成し
た。すなわち、Ｎ端の７アミノ酸をコードするＤＮＡと
して下記式［１６］（配列表の配列番号１６）で示され
る２０塩基からなるＤＮＡの混合物を、またＣ端の７ア
ミノ酸をコードするＤＮＡの相補鎖配列として下記式
［１７］（配列表の配列番号１７）で示される２０塩基
からなるＤＮＡの混合物を作製した。

【００６５】

【００６６】上記ＤＮＡ混合物をプライマーとして実施
例２の工程４で作製した２本鎖ｃＤＮＡを鋳型にＰＣＲ
法を実施した。すなわち、Ｇｅｎｅ Ａｍｐ ＰＣＲ
Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ（パーキン エルマー シータ
ス インスツルメント社製（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ
Ｃｅｔｕｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ））を用いてＤ
ＮＡ溶液を含む反応溶液２０μＬ（１０ｍＭトリス−塩
酸緩衝溶液（ｐＨ８．３）、５０ｍＭ塩化カリウム、
１．５ｍＭ塩化マグネシウム、各２００μＭ ｄＮＴ
Ｐ、１μＭセンスプライマー、１μＭアンチセンスプラ
イマー及び０．０２５Ｕ／μＬ ＡｍｐｌｉＴａｑ Ｄ
ＮＡ ポリメラーゼ）を調製し、ＧｅｎｅＡｍｐ^TM Ｐ
ＣＲシステム９６００（パーキン エルマー シータス
インスツルメント社製（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ
Ｃｅｔｕｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ））にセットし、
９４℃で３０秒、５５℃で３０秒及び７２℃で１分の反
応を２５回繰り返した。次に反応産物を１０％ポリアク
リルアミドゲルで電気泳動し、５９ｂｐ付近にバンドが
出現することを確認した。次いで得られた５９ｂｐ付近
の増幅産物ＤＮＡ断片を常法に従い抽出し、Ｔ４ＤＮＡ
ポリメラーゼを用いて常法に従い末端を平滑化し、プラ
スミドｐＵＣ１１８のＳｍａＩサイトにクローニングし
た。ＤＮＡ断片の塩基配列は後述のシークエンシング法
に従い決定した。その配列を下記式［１８］（配列表の
配列番号１８）に示す。

【００６７】 式［１８］ 5'-ATTACGGTGG TTGATGCGTT ACATGAAATA CCAGTGAAAA 10 20 30 40 AAGGCGAAGG CGCCGAATT-3' 50 59

【００６８】式［１８］（配列表の配列番号１８）で示
された塩基配列のうち１１〜３０までの塩基配列をもつ
２０ｍｅｒのＤＮＡ断片（式［１９］（配列表の配列番
号１９）と３１〜５０までの塩基配列に相補的な２０ｍ
ｅｒのＤＮＡ断片（式［２０］（配列表の配列番号２
０）を上述の方法と同様の方法で合成し、以下ＰＣＲ法
によるスクリーニング用プライマーとして使用した。

【００６９】 式［１９］ 5'-TTGATGCGTTACATGAAATA-3' 式［２０］ 5'-CCTTCGCCTTTTTTCACTGG-3'

【００７０】工程２ ＰＣＲ法による正常ヒト二倍体線
維芽細胞のｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング 実施例２で得られた形質転換体を１プールあたり約１４
０００クローンを含むように分割し、これを４６プール
作製し、各々をアンピシリン５０μｇ／ｍＬを含有ＬＢ
培地３ｍＬに植菌し、３７℃で終夜振とう培養した。プ
ラスミドＤＮＡの抽出はモレキュラークローニング ア
ラボラトリーマニュアル（コールドスプリング ハー
バー ラボラトリー １９８９年）の方法に従って実施
した。すなわち、１．５ｍＬの培養液を５０００ｒｐｍ
で３分遠心し上清を除去した後、沈澱を１００μＬグル
コース−リゾチーム溶液（５０ｍＭグルコース、１０ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ、２５ｍＭトリス−塩酸緩衝溶液（ｐＨ
８．０）及び４ｍｇ／ｍＬリゾチーム含有）に懸濁し、
室温で５分間放置した。氷中で２００μＬアルカリ溶液
（０．２Ｎ 水酸化ナトリウム及び１％ＳＤＳ含有）を
加え、穏やかに混合し、氷中に５分間放置した。次に、
１５０μＬ酢酸カリウム溶液（４℃）を加え、良く混合
し、氷中に５分間置いた。４℃、１２０００ｒｐｍで５
分間遠心後、上清を他のチューブに移し、４００μＬフ
ェノール−クロロホルム溶液を加え、良く撹拌した後、
１２０００ｒｐｍ、５分間遠心した。水層に２容量（約
８００μＬ）のエタノールを加え、混合した後、室温で
２分間放置した。１２０００ｒｐｍで５分間遠心後、上
清を完全に除去し、沈澱を７０％エタノールで洗浄後、
乾燥させ、２０μｇ／ｍＬ ＲＮａｓｅを含む５０μＬ
ＴＥ溶液に溶解した。得られたプラスミドＤＮＡ溶液
２．５μＬを制限酵素ＸｂａＩで３７℃、１時間処理
し、プラスミドとＤＮＡを切断した。

【００７１】次いでＧｅｎｅ Ａｍｐ ＰＣＲ Ｒｅａ
ｇｅｎｔ Ｋｉｔ（パーキン エルマー シータス イ
ンスツルメント社製（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｅ
ｔｕｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ））を用いて、上記Ｄ
ＮＡ溶液を含む反応溶液２０μＬ（１０ｍＭトリス−塩
酸緩衝溶液（ｐＨ８．３）、５０ｍＭ塩化カリウム、
１．５ｍＭ塩化マグネシウム、各２００μＭ ｄＮＴ
Ｐ、１μＭセンスプライマー、１μＭアンチセンスプラ
イマー及び０．０２５Ｕ／μＬ ＡｍｐｌｉＴａｑＤＮ
Ａ ポリメラーゼ）を調製し、Ｇｅｎｅ Ａｍｐ^TM Ｐ
ＣＲシステム９６００（パーキン エルマー シータス
インスツルメント社製（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｃ
ｅｔｕｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ））にセットし、９
４℃で３０秒、５５℃で３０秒及び７２℃で１分の反応
を２５回繰り返した。次に反応産物を１０％ポリアクリ
ルアミドゲルで電気泳動し、４０ｂｐ付近にバンドが検
出されたものを陽性と判断した。１つの陽性プールのプ
ラスミドＤＮＡで大腸菌ＤＨ５を形質転換し、得られた
形質転換体を１プールあたり約１８００クローンを含む
ように分割し、これを１５プール作製し、前述の方法と
同様にＤＮＡを調製し、ＰＣＲ法により４０ｂｐ付近に
バンドが検出されるものを陽性と判断した。以下本操作
を繰り返し、計６回のスクリーニングで陽性クローンを
同定した。

【００７２】（実施例４） 塩基配列の決定 塩基配列の決定は、ラボマニュアル遺伝子工学（村松正
實編、丸善 １９８８年）に記載された方法に従って実
施した。すなわち、実施例３で得られた陽性クローンの
ｃＤＮＡを制限酵素ＸｂａＩで消化し、切り出されたＤ
ＮＡ断片を制限酵素ＸｂａＩで消化したｐＵＣ１１９と
混合し、前述のライゲーションキットを用いてライゲー
ションした。大腸菌ＪＭ１０９をライゲーション混合物
で形質転換した後、常法に従い１本鎖ＤＮＡを調製し
た。調製された１本鎖ＤＮＡをＤＮＡシーケンサー（３
７３Ａ、アプライドバイオシステムズ社製）を用い添付
マニュアルに従って塩基配列を決定した。その結果を配
列表の配列番号１４または１５に示した。またそのＤＮ
Ａ配列より演繹されるアミノ酸配列を配列表の配列番号
１２または１３に示した。

【００７３】

【発明の効果】本発明の新規な蛋白性生理活性物質は血
管内皮細胞からのＰＧＩ₂ 産生を刺激する作用を有す
る。従ってＰＧＩ₂ の有する血小板凝集抑制作用、平滑
筋弛緩作用、胃酸分泌抑制作用等に基づき溶血性尿毒症
症候群、血栓性血小板減少性紫斑病、末梢動脈閉塞、心
虚血、脳虚血、動脈硬化、脳閉塞、高脂血症、糖尿病、
心不全、狭心症、虚血性心疾患、うっ血性心疾患、脈絡
膜循環障害、気管支疾患、胃潰瘍、妊娠子癇等の医薬用
途としての応用が期待できる。また本発明の蛋白性生理
活性物質をコードするＤＮＡを用いて、遺伝子工学的に
本発明の新規な蛋白性生理活性物質を大量に得ることも
可能である。

【配列表】

【００７４】配列番号 ：１ 配列の長さ：２５ 配列の型 ：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Val Ile Gly Ile Pro Thr Pro Val Leu Ile Trp Asn Lys Val Lys 1 5 10 15 Arg Gly His Tyr Gly Val Gln Arg Thr Glu 20 25

【００７５】配列番号 ：２ 配列の長さ：１８ 配列の型 ：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Leu Leu Pro Gly Asp Arg Asp Asn Leu Ala Ile Gln Thr Arg Gly 1 5 10 15 Gly Pro Glu

【００７６】配列番号 ：３ 配列の長さ：１９ 配列の型 ：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Cys His Ala Ser Asn Ser Gln Gly Gln Ala Ser Ala Ser Ala Lys 1 5 10 15 Ile Thr Val Val 19

【００７７】配列番号 ：４ 配列の長さ：２０ 配列の型 ：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Ile Thr Val Val Asp Ala Leu His Glu Ile Pro Val Lys Lys Gly 1 5 10 15 Glu Gly Ala Glu Leu 20

【００７８】配列番号 ：５ 配列の長さ：７ 配列の型 ：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド

【００７９】配列番号 ：６ 配列の長さ：７ 配列の型 ：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド

【００８０】配列番号 ：７ 配列の長さ：１６ 配列の型 ：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Thr Glu Leu Leu Pro Gly Asp Arg Asp Asn Leu Ala Ile Gln Thr 1 5 10 15 Arg

【００８１】配列番号 ：８ 配列の長さ：４ 配列の型 ：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド

【００８２】配列番号 ：９ 配列の長さ：１２ 配列の型 ：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Lys Ala Ile Thr Gln Val Ser Lys Gly Thr Cys Glu 1 5 10

【００８３】配列番号 ：１０ 配列の長さ：１７ 配列の型 ：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Xaa Glu Pro Xaa Gly Gly Gly Gly Ala Gly Arg Gly Tyr Gln Ala 1 5 10 15 Pro Gly

【００８４】配列番号 ：１１ 配列の長さ：１２ 配列の型 ：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Gln Gly Pro Ser Ile Val Thr Pro Xaa Lys Asp Ile 1 5 10

【００８５】配列番号 ：１２ 配列の長さ：１００ 配列の型 ：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Val Ile Gly Ile Pro Thr Pro Val Leu Ile Trp Asn Lys Val Lys 1 5 10 15 Arg Gly His Tyr Gly Val Gln Arg Thr Glu Leu Leu Pro Gly Asp 20 25 30 Arg Asp Asn Leu Ala Ile Gln Thr Arg Gly Gly Pro Glu Lys His 35 40 45 Glu Val Thr Gly Trp Val Leu Val Ser Pro Leu Ser Lys Glu Asp 50 55 60 Ala Gly Glu Tyr Glu Cys His Ala Ser Asn Phe Gln Gly Gln Ala 65 70 75 Ser Ala Ser Ala Lys Ile Thr Val Val Asp Ala Leu His Glu Ile 80 85 90 Pro Val Lys Lys Gly Glu Gly Ala Glu Leu 95 100

【００８６】配列番号 ：１３ 配列の長さ：１００ 配列の型 ：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Val Ile Gly Ile Pro Thr Pro Val Leu Ile Trp Asn Lys Val Lys 1 5 10 15 Arg Gly His Tyr Gly Val Gln Arg Thr Glu Leu Leu Pro Gly Asp 20 25 30 Arg Asp Asn Leu Ala Ile Gln Thr Arg Gly Gly Pro Glu Lys His 35 40 45 Glu Val Thr Gly Trp Val Leu Val Ser Pro Leu Ser Lys Glu Asp 50 55 60 Ala Gly Glu Tyr Glu Cys His Ala Ser Asn Ser Gln Gly Gln Ala 65 70 75 Ser Ala Ser Ala Lys Ile Thr Val Val Asp Ala Leu His Glu Ile 80 85 90 Pro Val Lys Lys Gly Glu Gly Ala Glu Leu 95 100

【００８７】配列番号 ：１４ 配列の長さ：５５７ 配列の型 ：核酸 鎖の数 ：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｍＲＮＡ 配列 GGTCATCGGA ATCCCGACAC CTGTCCTCAT CTGGAACAAG GTAAAAAGGG GTCACTATGG 60 AGTTCAAAGG ACAGAACTCC TGCCTGGTGA CCGGGACAAC CTGGCCATTC AGACCCGGGG 120 TGGCCCAGAA AAGCATGAAG TAACTGGCTG GGTGCTGGTA TCTCCTCTAA GTAAGGAAGA 180 TGCTGGAGAA TATGAGTGCC ATGCATCCAA TTTCCAAGGA CAGGCTTCAG CATCAGCAAA 240 AATTACAGTG GTTGATGCCT TACATGAAAT ACCAGTGAAA AAAGGTGAAG GTGCCGAGCT 300 ATAAACCTCC AGAATATTAT TAGTCTGCAT GGTTAAAAGT AGTCATGGAT AACTACATTA 360 CCTGTTCTTG CCTAATAAGT TTCTTTTAAT CCAATCCACT AACACTTTAG TTATATTCAC 420 TGGTTTTACA CAGAGAAATA CAAAATAAAG ATCACACATC AAGACTATCT ACAAAAATTT 480 ATTATATATT TACAGAAGAA AAGCATGCAT ATCATTAAAC AAATAAAATA CTTTTTATCA 540 CAAAAAAAAA AAAAAAA 557

【００８８】配列番号 ：１５ 配列の長さ：５５７ 配列の型 ：核酸 鎖の数 ：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｍＲＮＡ 配列 GGTCATCGGA ATCCCGACAC CTGTCCTCAT CTGGAACAAG GTAAAAAGGG GTCACTATGG 60 AGTTCAAAGG ACAGAACTCC TGCCTGGTGA CCGGGACAAC CTGGCCATTC AGACCCGGGG 120 TGGCCCAGAA AAGCATGAAG TAACTGGCTG GGTGCTGGTA TCTCCTCTAA GTAAGGAAGA 180 TGCTGGAGAA TATGAGTGCC ATGCATCCAA TTCCCAAGGA CAGGCTTCAG CATCAGCAAA 240 AATTACAGTG GTTGATGCCT TACATGAAAT ACCAGTGAAA AAAGGTGAAG GTGCCGAGCT 300 ATAAACCTCC AGAATATTAT TAGTCTGCAT GGTTAAAAGT AGTCATGGAT AACTACATTA 360 CCTGTTCTTG CCTAATAAGT TTCTTTTAAT CCAATCCACT AACACTTTAG TTATATTCAC 420 TGGTTTTACA CAGAGAAATA CAAAATAAAG ATCACACATC AAGACTATCT ACAAAAATTT 480 ATTATATATT TACAGAAGAA AAGCATGCAT ATCATTAAAC AAATAAAATA CTTTTTATCA 540 CAAAAAAAAA AAAAAAA 557

【００８９】配列番号 ：１６ 配列の長さ：２０ 配列の型 ：核酸 鎖の数 ：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ

【００９０】配列番号 ：１７ 配列の長さ：２０ 配列の型 ：核酸 鎖の数 ：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ

【００９１】配列番号 ：１８ 配列の長さ：５９ 配列の型 ：核酸 鎖の数 ：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＰＣＲ産物 配列 5'-ATTACGGTGG TTGATGCGTT ACATGAAATA CCAGTGAAAA 10 20 30 40 AAGGCGAAGG CGCCGAATT-3' 50 59

【００９２】配列番号 ：１９ 配列の長さ：２０ 配列の型 ：核酸 鎖の数 ：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 5'-TTGATGCGTTACATGAAATA-3'

【００９３】配列番号 ：２０ 配列の長さ：２０ 配列の型 ：核酸 鎖の数 ：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 5'-CCTTCGCCTTTTTTCACTGG-3'

【図面の簡単な説明】

【図１】 ＤＥＡＥ−５ＰＷ陰イオン交換クロマトグラ
フィーによる溶出パターンを示すグラフである。

【図２】 ヘパリン−５ＰＷアフィニティークロマトグ
ラフィーによる溶出パターンを示すグラフである。

【図３】 プロテイン−パックゲルろ過カラムクロマト
グラフィーによる溶出パターンを示すグラフである

【図４】 ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる実験結果を示す模式
図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｋ 7/08 7537−4Ｈ 7/10 7537−4Ｈ 13/00 8517−4Ｈ Ｃ１２Ｎ 15/12 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 8214−4Ｂ // Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＢＸ 8314−4Ｃ ＡＣＢ 8314−4Ｃ ＡＣＤ 8314−4Ｃ ＡＣＬ 8314−4Ｃ ＡＤＰ 8314−4Ｃ Ｃ０７Ｋ 99:00 8318−4Ｈ (72)発明者 新 居 淳 東京都新宿区四谷一丁目７番地 持田製薬 株式会社内 (72)発明者 長 瀬 安 数 東京都新宿区四谷一丁目７番地 持田製薬 株式会社内

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】下記式［１］ないし［１１］（配列表の配
   列番号１ないし１１）のいずれかで表されるアミノ酸配
   列を、少なくとも１つ有する新規な蛋白性生理活性物
   質。 式［１］ Val Ile Gly Ile Pro Thr Pro Val Leu Ile Trp Asn Lys Val Lys 1 5 10 15 Arg Gly His Tyr Gly Val Gln Arg Thr Glu 20 25 式［２］ Leu Leu Pro Gly Asp Arg Asp Asn Leu Ala Ile Gln Thr Arg Gly 1 5 10 15 Gly Pro Glu 式［３］ Cys His Ala Ser Asn Ser Gln Gly Gln Ala Ser Ala Ser Ala Lys 1 5 10 15 Ile Thr Val Val 19 式［４］ Ile Thr Val Val Asp Ala Leu His Glu Ile Pro Val Lys Lys Gly 1 5 10 15 Glu Gly Ala Glu Leu 20 式［７］ Thr Glu Leu Leu Pro Gly Asp Arg Asp Asn Leu Ala Ile Gln Thr 1 5 10 15 Arg 式［９］ Lys Ala Ile Thr Gln Val Ser Lys Gly Thr Cys Glu 1 5 10 式［１０］ Xaa Glu Pro Xaa Gly Gly Gly Gly Ala Gly Arg Gly Tyr Gln Ala 1 5 10 15 Pro Gly 式［１１］ Gln Gly Pro Ser Ile Val Thr Pro Xaa Lys Asp Ile 1 5 10
2. 【請求項２】配列表の配列番号１２記載のアミノ酸配列
   の一部または全部を含有する新規な蛋白性生理活性物
   質。
3. 【請求項３】配列表の配列番号１３記載のアミノ酸配列
   の一部または全部を含有する新規な蛋白性生理活性物
   質。
4. 【請求項４】非還元条件下におけるドデシル硫酸ナトリ
   ウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡ
   ＧＥ）において分子量が３０〜３６ｋＤａである請求項
   １ないし３のいずれかに記載の新規な蛋白性生理活性物
   質。
5. 【請求項５】プロスタグランジンＩ₂ （ＰＧＩ₂ ）の産
   生刺激活性を有することを特徴とする請求項１ないし４
   のいずれかに記載の新規な蛋白性生理活性物質。
6. 【請求項６】請求項１ないし５のいずれかに記載の新規
   な蛋白性生理活性物質をコードする塩基配列を有するＤ
   ＮＡ。
7. 【請求項７】前記ＤＮＡが、配列表の配列番号１４記載
   の塩基配列の一部または全部である請求項６記載のＤＮ
   Ａ。
8. 【請求項８】前記ＤＮＡが、配列表の配列番号１５記載
   の塩基配列の一部または全部である請求項６記載のＤＮ
   Ａ。
9. 【請求項９】請求項１ないし５のいずれかに記載の新規
   な蛋白性生理活性物質を含む原料を、下記（ａ）〜
   （ｃ）の工程の少なくとも１つを用いて精製することを
   特徴とする請求項１ないし５のいずれかに記載の新規な
   蛋白性生理活性物質の製造方法。 （ａ）イオン交換クロマトグラフィー （ｂ）アフィニティークロマトグラフィー （ｃ）ゲルろ過クロマトグラフィー