JPH06103304B2 - 個々の金属粒子を可視化する方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 近年、大きさの小さい金属粒子、殊にコロイド状金粒子
は、特定の有機物質および構造物の、位置測定、キャラ
クタリゼーションおよび定量（quantitation）のための
マーカー（marker）として益々使用されるようになって
きた。普通、生物学的な起源の、かかる物質およびび構
造物、および金属ラベリング（labelling）を用いたこ
れらのものの測定は、生化学、薬理学、細胞学および組
織学の種々の分野において、有用であることが判明して
きた。関連技術は、純粋に科学的な研究においては勿
論、ルーチン的な用途に対する実際的な応用、例えば診
断の手順においてもまた、広汎な用途が見出されてき
た。

原理的には、コロイド状金属粒子のマーカーとしての使
用は、かかる粒子が核酸類、多糖類等の如きポリマーと
結合する特性、およびこれらのポリマーが直接もしくは
間接に特定の有機物質もしくは構造物と相互作用する特
性とに基づいている。一般に、かかる相互作用は、抗原
−抗体、受容体（receptor）−配位子、および同様の相
互作用の如き、受容体（acceptor）−配位子錯体形成に
基づくものであり、従って、免疫学的測定はコロイド状
金属マーキング（colloidal metal marking）に基づく
技術の好ましい応用分野であり、それによって金のゾル
が主として金属粒子として使用されている。

組織化学および細胞化学雑誌（J.Histochem.Cytoche
m.），25,1187（1977）において、コロイド状の金を粒
子状の蛋白質でコーティングする方法、および特定の蛋
白質でコーティングされた金粒子を、電子顕微鏡法によ
る特定の細胞表面抗原の検出用のマーカーとして使用す
る方法が、記載されている。

米国特許第4,313,734号には、特定的な結合蛋白および
対応する結合性物質の間の反応の、１つもしくはそれ以
上の成分を検出しおよび／または測定する方法が広く記
載されており、そのために適当な金属粒子にカップリン
グされた１つもしくはそれ以上の成分を使用する。その
ようにして生成される反応生成物もしくは錯体の検出お
よび／または測定は、関連の分屑の中に含有される金属
の物理的特性を利用することによって、間接的に行なわ
れる。文献に従うと、測定は、例えば分散された形の金
属の光学査察もしくは色度測定、炎光光度法およびフレ
ームレス原子吸光光度法の如き公知の方法論に従って行
なうことができる。実質上、この方法は免疫学的な種類
の相互作用に関するもので、この形では、一般にゾル粒
子免疫分析（Sol Particle Immuno−Assay）（SPIA）と
呼ばれている。

最近、固定化された金属ラベリング錯体もしくは金属ラ
ベリング構造物の可視化に対する、改善された簡単化さ
れた方法が記載されており、これによって明視野顕微鏡
法（bright field microscopy）が主な検出手段として
使用される。例えば、米国特許第4,420,558号において
は、血液細胞およびこれらのものの前駆体の亜形を数え
上げ特性づけるための、明視野光学顕微鏡法が記載され
ているが、これは、該細胞および前駆体を金でラベリン
グされた抗体でよく規定された条件下でラベリングする
ことからなる。文献中に示される如く、ラベリングされ
た細胞表面の可視化は、指示された条件下では広汎な斑
点を生成する、金粒子の凝集特性に基づくものである。

米国特許第4,446,238号は、組織学的薄片中の限定され
た抗原の免疫細胞化学的局在に対する、明視野光学顕微
鏡法のマーカーとして、コロイド状の金を使用すること
を記載している。再び、顕微鏡による検出は、抗原含有
表面上の数多くの金粒子の集積によって生起する、強い
赤味がかった色の観察に基づいている。

典型的には、上記の手順においては、使用される金属粒
子は約10乃至約100nmの直径を有する。これは、一般に2
00nm付近にあるとされている、明視野光学顕微鏡法の分
解限度をよく下まわっている。従って、以前に知られて
いた全ての可視光顕微鏡法が、金属粒子の固定化された
凝集体の検出に対するこれらのものの応用において制限
されるものであることは、極めて論理的なことである。
個々の粒子は、超顕微鏡的技術によってのみ、殊に電子
顕微鏡を用いて、観察できる。

本発明において、200nmより小さい直径の個々の金属粒
子が、可視スペクトル中で明視野光学顕微鏡法もしくは
外部偏光顕微鏡法（epi−polarization microscopy）を
用いることにより、得られる像を電子的なコントラスト
増幅にかけるという条件のもとで、はっきりと可視化で
きることが、極めて驚くべきことに見出された。本発明
によって提起される、全く予期されない極めて驚異的な
可能性にも拘らず、このことが確立されたどの自然の法
則とも矛盾しないということを述べなければならない。
分解能の限界は、普通、離れていると識別し得る２つの
小さい物体の間の最近接距離として定義される。可視ス
ペクトル中での光学顕微鏡法に対しては、この限界は約
200nmであることが定説である。一般に、これは同時
に、可視光学顕微鏡法によって観察し得る粒子もしくは
構造物の最小断面である。200nmより小さく、更には20n
mより小さいことさえある直径の、単一の金属粒子を可
視化し、場合により特性づけもすることを、本出願者ら
がここで可能としたという事実は、従って、本分野の著
しい進展を構成するものである。

光学顕微鏡法とビデオカメラを用いる電子的コントラス
ト増幅との組み合せは、200nmより小さい寸法の或る種
の構造物の可視化を可能とすることが報告されているこ
とは事実であるが、記載されている到達点は、どれも、
検出限界および光学的鮮明度の点で、本発明の実現値と
は比べることができないものである。セル・モテリテイ
（Cell Motility）1,275〜289（1981）では、約25nmの
直径を有する微小細管が、ビデオ増幅コントラスト、差
動干渉コントラスト（Differential Interference Cont
rast）顕微鏡法（AVEC−DIC）によって可視化し得るこ
とが教唆されている。しかし、微小細管が線型の構造物
で、その長さが200nmを大きく超えていることが実測さ
れねばならない。更に、動いている小さい粒子もしくは
構造物は、それが静止している時よりも、観察が容易で
ある。このものと対照させて言うならば、本発明は、静
止していることも或いは運動中であることをも得る、限
外顕微鏡的寸法の、単一の実質的に球状の粒子の可視化
に関するものである。

TINS,1984年４月,112では、AVEC−DIC技術が、分解能の
通常の限界を下まわる、軸索内機能質（intra−axonalo
rganelle）の運動を検出するのに使用されたこと、およ
び見かけ上非常に小さい小胞（多分30〜50nm）であるも
ののかすかな流れが観測されたということが更に述べら
れている。再び、この文献の開示内容は、かすかな流れ
としてのみ可視的になる、運動中の粒子の観察のみに限
定されている。これと極めて異なったことに、本発明の
方法は、運動中および静止中の限外顕微的金属粒子の可
視化を、粒子が非金属性取り巻き物から容易に区別する
ことができ、そしてそれらのものの検出と場合により計
数が自動化さえできるくらいの鮮明度およびコントラス
トをもって、可能とするものである。

その簡単さと信頼性の点で、本発明に従う方法は、限外
顕微的金属粒子の検出を実質的に簡単化し、かかる粒子
を診断の道具として使用することに対して新しい見直し
を開くものである。原理的に、本発明の方法は、光学顕
微鏡観察の役に供される、どのような非金属的取り巻き
物であっても、その中の200nmより小さい直径の金属粒
子の、位置測定、定量および／またはキャラクタリゼー
ションに使用し得る。例えば、実質的に透明な如何なる
基体中のものでも、或いは透明もしくは不透明な基体の
表面におけるものである、約１乃至200nm、好ましくは
５乃至200nmの直径を有する、どんな性質の金属粒子で
も、可視化するのに本発明の方法を使用し得る。明らか
に、不透明基体の表面における測定は、外部ルミネッセ
ンス、殊に外部偏光顕微鏡法を必要とすることになる。
測定は、単に定性的とすることも、或いは定量的とする
こともできる。後者の場合、定量的な測定は、予め決め
られた大きさの視野の中の粒子の数を計数することによ
って簡単に行ない得る。その指定された大きさの粒子が
本発明の方法に従って可視化できる金属の例としては、
金、銀、白金、銅並びに鉄、ニッケル、亜鉛、クロム、
チタン、マンガン、コバルト、モリブデン、ロジウム、
パラジウム、カドミウム、オスミウム、イリジウム、水
銀、アルミニウム等を挙げることができる。好ましい応
用は、貴金属粒子、殊に金、銀および白金の検出および
測定に見出される。

かかる測定の目的は、かかる粒子そのものの位置測定お
よび／もしくは定量とすることもでき、或いは、それ自
身をかかる粒子に直接もしくは間接に結びつける、特定
的な物質もしくは構造物の、位置測定および／または同
定および／または定量とすることもできる。その第一の
側面では、本発明は、好適な液体、半固体もしくは固体
媒質の如何なるものの中においても、金属粒子を測定す
る、きちんとした信頼性のある方法を提供し、例えば水
系もしくは有機媒質中に懸濁された金属ゾル中の金属粒
子の測定方法を提供する。更に、この方法を行なう際の
容易さのため、二元系もしくは多成分系の混合時の均一
性を研究したり、液体、半固体もしくは固体、殊に無定
形媒質の流動特性を研究したり、或いは液体もしくは固
体膜コーティング等の厚さを測定したりするのに、指定
された大きさの金属粒子をトレーサーとして使用するこ
とを、魅力あるものとしている。

その第二の側面では、本方法は、多くの場合生物学的起
源の、試験管中および生体中の両方の、特定の有機物質
もしくは構造物の測定に、応用し得る。かかる応用は、
一般に、よく規定された有機物質にカップリングされ
た、金属ゾル粒子、殊に金粒子を使用することになる
が、現在、金によるラベルが有用であると知られている
場合の例を、原則として含むものであるが、その例のみ
に限定されるべきものではない。かくて、本発明の方法
は、生物学的物質等の細胞学、組織学、細胞内および細
胞外診断の如き領域における操作の、かなりの進歩と便
宜性とを供与するものである。本発明の方法の主要な利
点の一つは、少なくとも原理的には、これが非破壊的で
あって、そのままの構造的に組織された、殊に生物学的
な系に応用し得る点である。例えば、特定の蛋白質、例
えば抗体にカップリングされた金属粒子を使用し、これ
らのものを好適な結合性の物質と相互作用させることに
よって、後者の正確な位置測定が、容易に、しかも実質
的に非破壊のやり方で行ない得る。非常に小さい粒子を
使用し得るということは、上記の現象を微視的な環境下
で、例えば一つの細胞中、もし望まれれば生きた細胞中
で観測することを可能とする。従って、本発明の方法
は、個々の細胞中の特定の結合性物質および／または構
造物を位置測定および／または定量し、且つ／或いは細
胞内でのその分布および／または運動を追跡し、且つ／
或いは細胞内での或る特定の輸送現象の速度を測定する
ことに使用し得る。生きている生物においてさえも本発
明の方法を用いて容易に観測し得る、特定的な細胞内輸
送現象の例には、微小細管および軸索輸送が含まれる。
生きている神経生検における軸索輸送の測定は、例え
ば、筋ジストロフィーの如き条件を研究し、或いはかか
る疾病の発現を追跡する、診断の道具として使用し得
る。この方法は、更に、種々の種類のウィルス性感染を
検出するのに使用し得る。

その一般的な特性のため、この方法は、生物学的媒質も
しくは誘導される分屑の中の、表面抗原もしくは細胞内
抗原または一般的に如何なる特定の有機物質でも検出す
るということに基づいて、診断試験において使用し得
る。普通、かかる物質は、例えばホルモン、蛋白質、酵
素等の如きポリペプチド性を有する。原理的に、本発明
の方法に基づく診断技術を単細胞に応用することは可能
である。その非破壊特性の観点で、この方法は、偏位す
る生物化学的特性をもった単細胞を他の細胞から区別す
るのに、従って有利に使用することができ、それによっ
て、選ばれた細胞は完全に生きたままでいることがで
き、更に増殖することもできる。かかる応用は、遺伝子
操作の手順において殊に有用であり、即ち、陽性のもの
を陰性の圧潰器細胞（expressor cell）から迅速に分離
するのに有用である。これはまた、分娩前の生体におけ
る遺伝子偏位もしくは代謝欠陥を検出するのにも好適で
ある。

ゾル粒子免疫分析に基づく現存する診断法と比較して、
本発明の方法は遥かに大きい感度を有する。事実、現存
する方法は、一般に、吸収されもしくは懸濁された金属
粒子のバルクによる、光吸収もしくは散乱に基づいてい
る。明らかに、例えば吸取媒質上での色の測定は、まと
まった数の粒子の存在を必要とする。これとは対照的
に、本発明の方法は、単粒子の観測および計数を可能と
する。従って、本発明の方法は、現存の、例えば視覚的
もしくは色度測定的な技術の感度が足りない場合の、例
えば肝炎の検出への応用のための、診断用吸取紙（diag
nostic blot）の発展を大いに扶けるものである。

薬理学の分野においては、本方法は、薬品およびその受
容体の細胞および限外細胞位置測定を行なうための、価
値ある手段となろう。

ゾル粒子、殊に金粒子の製造、好適な結合物質、例えば
抗体へのこれらのもののカップリング、およびこれらの
ものを直接もしくは間接に望みの結合物質と化合させる
種々の方法論は、十分に公知である。この関連では、例
えば、IBROハンドブックシリーズのエー．シー．キュエ
ロ編の免疫組織化学（Immunohistochemistry）,Wiley,N
ew York,1983,p347〜372および米国特許第4,313,784号
およびジェー．エム．ポラック、エス．ヴァン．ヌルデ
ン編の免疫細胞化学（Immunocytochemistry）,Wright P
SG,Bristol,1983年、p82〜112を参照することができ
る。

本発明に従って金属粒子を可視化する方法は、現在手に
することのできる装置を用いて行なわせることができ
る。かかる装置は、一方に適当な光学顕微鏡、他方に電
子的コントラスト増幅装置からなるものである。適当な
光学顕微鏡としては、明視野顕微鏡法および／または外
部偏光顕微鏡法のために装備された、標準の、品質の良
い如何なる顕微鏡をも使用することができる。単色光の
使用は必須ではないが、品質を改善させる。実際には、
単色性の緑色光が優秀な結果を与えることが判ってい
る。明視野顕微鏡法が使用される時は、差動干渉コント
ラスト（differentialinterference contrast）（DIC）
法を用いることによって、更に改善を行なうことができ
る。電子的コントラスト増幅装置としては、手動もしく
は自動の、輝度およびコントラスト調整を装備された、
普通の種類のどんなビデオカメラでも好適であろう。勿
論、像の質は、装置の精度に直接的に関連するものであ
る。

本発明に従う方法を使用する時、および関連する金属粒
子を周囲の基体から可能な限り最大限に区別するために
は、基体の最適な可視化に要求されるよりも大きい、実
効のレンズ口径を使用することが適当となろう。実際
上、最良の結果は、全開もしくは全開に近い口径、即ち
直接の顕微鏡像がその過剰の輝度のために殆どコントラ
ストを有さず、その理由で視覚的な観察には全く不適当
である条件下で操作する時に得られる。適正に観察さ
れ、ビデオカメラで処理されると、これによって殆どの
迷光が遮断されコントラストが増幅されるが、金属粒子
はよく規定されたとびとびのスポットの如く明瞭に見え
るようになる。明視野顕微鏡法のもとでは、スポットは
明るい背景に対して暗くなるが、一方、外部変更顕微鏡
法のもとでは、粒子は明るいきらめくスポットとして見
えるようになる。顕微鏡が、視野の再調整なしに、明視
野から外部偏光顕微鏡法への移行を許容するものである
ならば、両方の方法による粒子の交番的な可視化によっ
て、その正体に対して優良な確証が得られる。

金属粒子が、加工された像の上で目に見える明瞭さの点
からは、適当な基体におけるこれらのものの検出および
定量は、普通の種類の如何なる自動計数装置を使用する
ことによっても、容易に自動化し得る。

本発明を更に以下の実施例によって例示するが、これは
決して本発明の範囲を限定する目的のものではない。

実施例 ナノメーター粒子ビデオ超顕微鏡法（ナノビド（Nanovi
d）超顕微鏡法）による微小細管依存性細胞内能動性の
精査 方法：ナノ粒子ビデオ超顕微鏡法もしくはナノビド超顕
微鏡法。

PTK（ポトラストリダクチリス腎（Potorous Tridactyli
s Kidney））細胞を、ガラスのカバーグラス上に播種し
て24〜48時間後に使用した。20〜40nmの大きさを有し、
血清アルブミン（Nordic）でコーティングされた、コロ
イド状金粒子を、ポリエチレングリコールで安定化させ
た。粒度分布を超構造的に測定した。倒立位相差コント
ラスト顕微鏡（inverted phase contrast microscope）
上で顕微注射を行なった。先端開口±１μｍまで引き伸
ばされたガラスキャピラリーを、キャピラリー作用によ
って逆充填した。注射直後に、カバーグラスをペトリ皿
から取り出し、パラフィルム細片をスペーサーとして使
用し、バラップ（ワセリン、ラノリン、パラフィン各々
1/3）を顕微室の封入に使用して、スライド上に載せ
た。この標本を次にライカート（Reichert）（ウィー
ン、オーストリア）ポリバール（Polyvar）顕微鏡に載
せた。標本の温度は、空気流式インキュベーターによっ
て37゜±１℃に保った。顕微鏡には、ユニバーサルコン
デンサー（universal condenser）と100倍のプラナポレ
ンズ（planapo lens）とを装備した。集光鏡および対物
レンズの両方の油浸漬を使用して、観測期間全体に亘っ
て、ケーレル照明法をなしとげた。集光鏡配設またはフ
ィルターユニットを切り換えることによって、同じ細胞
を、30秒より短い間に、順序が下記の光学並びによって
観測することができた：二色鏡およびクロス偏光板およ
びアナライザーを用いる、透過光、差動干渉コントラス
ト（DIC）干渉反射顕微鏡法、100倍のプラナポ位相コン
トラスト対物レンズを使用する、外部ケイ光、暗視野観
測もしくは位相コントラスト。透過光もしくはDICによ
り、系の数値全開の口径を使用した。照明は、100ワッ
トのハロゲンランプもしくは200ワットの水銀アーチ（m
ercury arch）の緑色線によって行なった。

像（全視野の中央および20％）は、800本のTV線の水平
解像能を提供する、パナソニックWV−1800ビデオカメラ
の表面板の上へ、直接投影させた。ビデオ信号は、パン
ソニックWV5340モニター、および340本の水平解像能を
提供するソニーVD−5850P Uマチックビデオカセットレ
コーダーへ、供給した。記録は、実時間で行なうか、或
いは、ソニーレコーダーのためにEOSによって組み立て
られたAC580アニメーションコントロールユニットを使
用して、時間経過モードで行なった。一般に、レコーダ
ーは、10秒毎に２コマ取りこむように命令した。普通の
速度（25コマ／秒）での再生は、従って、125倍の加速
となった。写真記録は、実時間再生を使用してモニター
からとるか、或いは、記録が時間経過モードで行なわれ
た時は静止画像からとった。シャッター時間は1/4〜1/8
秒の間とした。

極めて予想外なことに、集光鏡を正常な明視野透過に向
け、カメラを完全に飽和させるべく照明を上げた時に、
はっきりと見わけられる暗色のスポットが、全体に白色
の背景の上にスクリーン上に出現した。光はクロスされ
たアナライザーの中を通ったので、金の粒子が偏光され
た光を反射し、そして十分な二色性効果をうみ出したも
のである。これらのものは、細胞の通常の干渉反射画像
からなる背景の上に、明るく輝く点として出現した。普
通は細胞中央に位置する、非常に大きい凝集体以外は、
接眼鏡を通しては点は全く見えず、写真乾板上には何も
記録することができなかった。ノルマンスキー差動干渉
コントラスト（DIC）を使用すると、最も小さい粒子さ
えもが容易に検出された。しかし、これらのものは、明
視野観測に行ったり来たり切り換えられなければ、内生
小器官から識別することができない。個々の金粒子を検
出するために、ホルムバールでコーティングされたグリ
ッド上で20もしくは40nmの金と共に成長させた細胞を注
射して、ビデオテープに記録し、その後直ちにグルター
ルアルデヒドを用いた還流によって固定した。これらの
ものを、次に、全マウント電子顕微鏡観察用に更に加工
した。同様な実験を、その上へ金のゾルを吸着させた、
裸のグリッドを用いて行なった。両方の試験によって、
最も小さい点の殆どのものが個々の金粒子であるという
ことがはっきりと示された。２〜３個の粒子の小さな凝
集体は、同じ大きさを有するように見えた。その中では
少ししかないが、より大きな凝集体は、ミクロピペット
のキャピラリー先端の中で多分生成されようが、このも
のは40nmの大きさを使用するとつまるようになることが
しばしばであった。これらのものはスクリーン上では0.
5〜１μｍの小球体として現れた。全マウント電子顕微
鏡法は、殊にステレオ写真を使用すると、殆どの金粒子
が細胞質中では自由であり、しばしば微小細管に密接に
付随していることを示すのにも役立つものであった。溶
解細胞体（Iysosomal）の構造区画を示すべく、細胞を
アクリジンオレンジで生体染色しても、これらの小器官
内には金の粒子は全く見えなかったが、このことは細胞
に同じ粒子を媒質中で供給した時に明らかにそうなるに
も拘らず、見られなかった。かなり頻繁に、金の粒子
は、それ自身微小細管に接続されている、小さな小胞に
見かけ上は結合されていた。

ビデオテープ分析は、顕微注射が常に核に近くで行なわ
れるのにも拘らず、金の粒子が細胞全体に10〜15分以内
に分散されることを示した。実時間および時間経過モー
ドの観測により、全ての粒子が、典型的なとびとびの機
作で、中心体に向かい、また中心体から離れて、線型の
軌跡に沿って運動することが示たれた。殊に、個々の粒
子（20および40nmの両者）は、典型的な線型の運動およ
び局所的な不規則「周辺ジャンプ（jumping around）」
に交互に属するものであった。後者の種類の運動は、し
かしながら、媒質中の金属粒子の真のブラウン運動より
も遥かに遅いものであった。小さい粒子は注射後２〜４
時間までは細胞質内に分散されたままであったが、一
方、より大きなものは、中心体の領域の中に集積する傾
向があった。異なる大きさの金凝集体のとびとびの運動
の速度および頻度の分析および内性小器官との比較によ
り、興味深くもそれぞれの大きさに依存しているこれら
のものの挙動における、仮想的個性が明らかとなった。

微小細管抑制因子ノコダゾール（10^-6〜10^-5M）の効果
は、極めて予想可能なものであり、内性小器官および金
粒子の両者に対して同一であった。とびとびの動きは徐
々に消失し、不規則な局所運動のみが持続された。アジ
化ナトリウム（10^-2M）は、ATPの急速な消耗に相当し
て、数分以内にとびとび運動を停止させた。タキソール
の効果は興味あるものであった。小さい粒子は、しばし
ば末梢の微小細管索に沿って、とびとび運動を続けた。
より大きな凝集体は、しかしながら、完全に停止され
た。面白いことに、蛋白質架橋剤（protein cross link
er）であるアクリジンオレンジは、とびとび運動を停止
させるだけではなく、他の医薬のどれとも異なって、局
所不規則運動をも停止させた。

微小細管はとびとび運動の中に明瞭に含まれている。下
部単位（subunit）の踏み車運動（treadmilling）が可
能な分子的機構であると示唆されているので、チューブ
リンに対するモノクロナール抗体にカップリングされた
40nmの粒子を注射した。顕微注射されたケイ光的にラベ
リングされた抗体が、細胞中の全微小細管系を覆うが、
とびとび運動、細胞の形状および運動または有糸分裂に
は、6mg/ml（注射溶液）以下の濃度では全く効果を有さ
ないことが、初めて確証された。或る細胞内では、金粒
子の殆どのものが10〜15分以内に完全に固定された動け
ない位置につき、そして２時間より長い間、動かずにと
どまっていた。観測期間の間には、少しの粒子だけしか
脱着して他の場所に再結合しなかった。しばしば、粒子
は、中心体に向かって収束する、明瞭に線型の配列を形
成した。DICへの切り換えにより、金粒子によって輪郭
を描かれた軌跡にしばしば沿うようにして、内性小器官
の正常な運動が示された。他の細胞内では、変動する数
の粒子が固定されず、とびとびの運動をした。これらの
ものは、抗体の非存在によるか、或いは抗原結合座位
の、例えば自由な細管下部単位によるマスキングによる
かの何れかによって、自由な細管結合座位を全く有さな
かったと推測される。自由な下部単位の量は、非常によ
く細胞のサイクルの段階に依存し得る。

前期（prophase）の間に注射された細胞の中では、幾つ
かの粒子が星状体微小細管に沿ってとびとびの運動をし
た。検出し得る内性小器官が無い防錘体内には、多くの
ものがまた見られた。極めて興味深いことに、これらの
ものは防錘体繊維に沿うばかりではなく、防錘体を側面
から通りぬけて、上方向および下方向にジャンプした。

少しの粒子しか定常的な位置を占めなかった。あるもの
は、中期（metaphase）において、中心節に近い動原体
繊維に結合されると見えた。このものは後期（anaphas
e）の間を通してそれに沿って動いた。このものが終期
（telophase）の核内で捕獲されるに至ると、染色質か
ら脱着された。その時、金粒子は、染色分体の間の空洞
内で、非常に早い典型的なブラウン運動で、運動を開始
した。媒質中の粒子は同じ速度でジャンプする。次にそ
の運動が、例えばノコダゾール（nocodazole）処理され
た細胞の細胞質の中で見られるのと同じ水準まで、急激
に減速した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 グスターフ・マリア・アルベルト・ゴイエ ンス ベルギー国ビー‐2400‐モル・グロートカ ペレン46 (72)発明者 ロニイ・マリア・ヌイデンス ベルギー国ビー‐2350‐フオセラール・ド ウイフエンストラーセ18 (72)発明者 マルク・カレル・ユリア・ヨゼフ・メレマ ンス ベルギー国ビー‐2400‐モル・ドンク90 (56)参考文献 特開 昭55−15100（ＪＰ，Ａ) 特開 昭55−151757（ＪＰ，Ａ)

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】特定の結合性蛋白質に結合し得る特定の有
   機物質を検出および／または測定する方法であって、 ｉ） １乃至200nmの間の直径の貴金属粒子を用いて、
   前記結合性蛋白質と前記結合し得る有機物質との反応生
   成物をラベリングする段階、および ii） そのようにラベリングされた反応生成物の個々の
   貴金属粒子を、顕微鏡像の直接観察に対して最適である
   よりも実質的に大きい実効口径を使用する明視野顕微鏡
   法もしくは外部偏光顕微鏡法にかけて可視化し、こうし
   て得られた像のコントラストを電子的なコントラスト増
   幅装置によって増幅する段階、 を含んでなる方法。
2. 【請求項２】該反応生成物のラベリングを、該貴金属粒
   子に直接カツプリングされた結合性蛋白質と該結合しう
   る有機物質を反応させることによって行なう特許請求の
   範囲第１項記載の方法。
3. 【請求項３】該反応生成物のラベリングを、該結合性蛋
   白質と該結合しうる有機物質を反応させ、こうして得ら
   れた反応生成物を該貴金属粒子にカツプリングされた第
   二の結合しうる有機物質もしくは結合性蛋白質とさらに
   反応させることによって行なう特許請求の範囲第１項記
   載の方法。
4. 【請求項４】該結合しうる有機物質および該結合性蛋白
   質の反応が、配位子−受容体反応である特許請求の範囲
   第１〜３項のいずれかに記載の方法。
5. 【請求項５】該結合しうる有機物質が抗原であり、該結
   合性蛋白質が該抗原に対する抗体である特許請求の範囲
   第１〜３項のいずれかに記載の方法。
6. 【請求項６】該金属粒子が金粒子、銀粒子または白金粒
   子である特許請求の範囲第５項記載の方法。
7. 【請求項７】該抗原が、細胞表面抗原、ホルモン、酵素
   および細胞内構造要素からなる群から選ばれる特許請求
   の範囲第６項記載の方法。
8. 【請求項８】該電子的なコントラスト増幅装置が、ビデ
   オカメラである特許請求の範囲第１〜７項のいずれかに
   記載の方法。