JPS6113155A - 個々の金属粒子を可視化する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 近年、大きさの小さい金属粒子、殊にコロイド状金粒子
は、特定の有機物質および構造物の、位置測定、キャラ
クタリゼーションおよび定量（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏ
ｎ）のためのマーカー（ｍａｒｋｅｒ）として益々使用
されるようになってきた。普通、生物学的な起源の、か
かる物質および構造物、および金属ラベリング（ｌａｂ
’ｅ’ｌｌｉｎｇ）を用いたこれらのものの測定は、生
化学、薬理学、細胞学および組織学の種々の分野におい
て、有用であることが判明してきた。関連技術は、純粋
に科学的な研究においては勿論、ルーチン的な用途に対
する実際的な応用、例えば診断の手順においてもまた、
広汎な用途が見出されてきた。

原理的には、コロイド状金属粒子のマーカーとしての使
用は、かかる粒子が核酸類、多糖類等の如きポリマーと
結合する特性、およびこれらめポリマーが直接もしくは
間接に特定の有機物質もしくは構造物と相互作用する特
性とに基づいている。　・般に、かかる相互作用は、抗
原−抗体、受容体（ｒｅｃｅｐｔｏｒ）−配位子、およ
び同様の相互作用の如き、受容体（ａｃｃｅｐｔｏｒ）
−配位子錯体形成に基づくものであり、従って、免疫学
的測定はコロイド状金属マーキング（ｃ。

１１ｏｉｄａｌ　　ｍｅｔａｌ　　ｍａｒｋｉｎｇ）に
基づく技術の好ましい応用分野であり、それによって金
のゾルが主として金属粒子として使用されている。

組織化学および細胞化学雑誌（Ｊ、Ｈｉｓｔ。

ｃｈｅｍ、　　Ｃｙ’ｔｏ’ｃｈｅｍ、）、２５，１１
８７　（１９７７）において、コロイド状の金を粒子状
の蛋白質でコーティングする方法、および特定の蛋白質
でコーティングされた金粒子を、電子顕微鏡法による特
定の細胞表面抗原の検出用のマーカーとして使用する方
法が、記載されている。

米国特許第４，３１３，７３４号には、特定的な結合蛋
白および対応する結合性物質の間の反応の、１２もしく
はそれ以上の成分を検出しおよび／または測定する方法
が広く記載されており、そのために適当な金属粒子にカ
ップリングされた１つもしくはそれ以上の成分を使用す
る。そのようにして生成される反応生成物もし七は錯体
の検出および／または測定は、関連の分層の中に含有さ
れる金属の物理的特性を利用することによって、間接的
に行なわれる。文献に従うと、測定は、例えば分散され
た形の金属の光学査察もしくは色度測定、炎光光度法お
よびフレームレス原子吸光光度法の如き公知の方法論に
従って行なうことができる。実質上、この方法は免疫学
的な種類の相互作用に関するもので、この形では、−・
般にゾル粒子免疫分析（Ｓｏｌ　　Ｐａｒｔｉｃｌｅ　
　Ｉｍｍｕｎｏ−Ａｓｓａｙ）（ＳＰＩＡ）と呼ばれて
い最近、固定化された金属ラベリング錯体もしくは金属
ラベリング構造物の可視化に対する、改善された簡単化
された方法が記載されており、これによって明視野顕微
鏡法（ｂｒｉｇｈｔ　　ｆｉｅｌｄ　　ｍ１ｃｒｏｓｃ
ｏｐｙ）が主な検出手段として使用される。例えば、米
国特許第４，４２０．５’５８号においては、血液細胞
およびこれらのものの前駆体の亜形を数え上げ特性づけ
るための、明視野光学顕微鏡法が記載されているが、こ
れは、該細胞および前駆体を金でラベリングされた抗体
でよく規定された条件下でラベリングすることからなる
。文献中に示される如く、ラベリングされた細胞表面の
可視化は、指示された条件下では広汎な斑点を生成する
、金粒子の凝集特性に基づくものである。

米国特許第４，４４６，２３８号は、組織学的薄片中の
限定された抗原の免疫細胞化学的局在に対する、明視野
光学顕微鏡法のマーカーとして、コロイド状の金を使用
することを記載している。−再び、顕微鏡による検出は
、抗原含有表面上の数多くの金粒子の集積によって生起
する、強い赤味がかった色の観察に基づいている。

典型的には、上記の手順においては、使用される金属粒
子は約１０乃至約１１００ｎの直径を有する。これは、
一般に２００ｎｍ付近にあるとされている、明視野光学
顕微鏡法の分解限度をよく下まわっている６従って、以
前に知られていた全ての可視光顕微鏡法が、金属粒子の
固定化された凝集体の検出に対するこれらのものの応用
において制限されるものであることは、極めて論理的な
ことである。個々の粒子は、超顕微鏡的技術によっての
み、殊に電子顕微鏡を用いて、観察できる。

本発明において、２００ｎｍより小さい直径の個々の金
属粒子が、可視スペクトル中で明視野光学顕微鏡法もし
くは外部偏光顕微鏡法（ｅ　ｐ　ｉ　−−ｐｏｌａｒｉ
ｚａｔｉｏｎ　　ｍ１ｃｒｏｓｃｏｐｙ）を用いること
により、得られる像を電子的なコントラスト増幅にかけ
るという条件のもとで、はっきりと可視化できることが
、極めて驚くべきことに見出された。本発明によって提
起される、全く予期されない極めて驚異的な可能性にも
拘らず、このことが確立されたどの自然の法則とも矛盾
しないということを述べなければならない。分解能の限
界は、普通、離れていると識別し得る２つの小さい物体
の間の最近接距離として定義される。可視スペクトル中
での光学顕微鏡法に対しては、この限界は約２００ｎｍ
であることが定説である。−・般に、これは同時に、可
視光学顕微鏡法によって観察し得る粒子もしくは構造物
の最小断面である。２００ｎｍより小さく、更には２０
ｎｍより小さいことさえある直径の、単一・の金属粒子
を可視化し、場合により特性づけもすることを、本出願
者らがここで可能としたという事実は、従って、本分野
の著しい進展を構成するものである。

光学顕微鏡法とビデオカメラを用いる電子的コントラス
ト増幅との組み合せは、２００・ｎｍより小さい寸法の
成る種の構造物の可視化を可能とすることが報告されて
いることは事実であるアヘ、記載されている到達点は、
どれも、検出限界および光学的鮮明度の点で、本発明の
実現値とは比べることができないものである。セル拳モ
テリテイ（Ｃｅｌｌ　　Ｍｏｔｉｌｉｔｙ）１，２７５
〜２８９　（１９８１）では、約２５ｎｍの直径を有す
る微小細管が、ビデオ増幅コントラスト、差動干渉コン
トラスト（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ　　Ｉｎｔｅｒｆ
ｅｒｅｎｃｅ　　Ｃｏｎｔｒａｓｔ）顕微鏡法（ＡＶＥ
Ｃ−ＤＩＣ）ｉこよっそ可視化し得ることが教唆されて
いる。しかし、微小細管が線型の構造物で、その長さが
２００ｎｍを大きく超えていることが実測されねばなら
ない。更に、動いている小さい粒子もしくは構造物は、
それが酸１トしている時よりも、観察が容易である。こ
のものと対照させて言うならば、本発明は、静止してい
ることも或いは運動中であることをも得る、限外顕微的
寸法の、単一・の実質的に球状の粒子の可視化に関する
ものである。

ＴｌＮ５，１９８４年４月、１１２では、ＡＶＥＣ−Ｄ
ＩＣ技術が、分解能の通常の限界を下まわる、軸索内機
部質（ｉｎｔｒａ−ａｘｏｎａｌｏｒｇａｎｅｌｌｅ）
の運動を検出するのに使用されたこと、および見かけ上
非常に小さい小胞（多分３０〜５０ｎｍ）であるものの
かすかな流れが観測されたということが更に述べられて
いる。再び、この文献の開示内容は、かすかな流れとし
てのみ可視的になる、運動中の粒子の観察のみに限定さ
れている。これと極めて異なったことに、本発明の方法
は、運動中および静止中の限外顕微的金属粒子の可視化
を、粒子が非金属性取り巻き物から容易に区別すること
ができ、そしてそれらのものの検出と場合により計数が
自動化さえできるくらいの鮮明度およびコントラストを
もって、可能とするものである。

その簡単さと信頼性の点で、本発明に従う方法は、限外
顕微的金属粒子の検出を実質的に簡単化し、かかる粒子
を診断の道具として使用することに対して新しい見直し
を開くものである。原理的に５本発明の方法は、光学顕
微鏡観察の役に供される、どのような非金属的取り巻き
物であっても、その中の２００ｎｍより小さい直径の金
属粒子の、位置測定、定量および／またはキャラクタリ
ゼーションに使用し得る。例えば、実質的に透明な如何
なる基体中のものでも、或いは透明もしくは不透明な基
体の表面におけるものである。約１乃至２００ｎｍ、好
ましくは５乃至２００ｎｍの直径を有する、どんな性質
の金属粒子でも、可視化するのに本発明の方法を使用し
得る。明らかに、不透明基体の表面における測定は、外
部ルミネッセンス、殊に外部偏光顕微鏡法を必要とする
ことになる。測定は、単に定性的とすることも、或いは
定量的とすることもできる。後者の場合、定量的な測定
は、予め決められた大きさの視野の中の粒子の数を計数
することによって簡単に行ない得る。、その指定された
大きさの粒子が本発明の方法に従って可視化できる金属
の例としては、。

金、銀、白金、銅並びに鉄、ニッケル、亜鉛、クロム、
チタン、マンガン、コバルト、モリブデン、ロジウム、
パラジウム、カドミウム、オスミウム、イリジウム、水
銀、アルミニウム等を挙げることができる。好ましい応
用は、貴金属粒子、り７に金、銀および白金の検出およ
び測定に見出される。

かかる測定の目的は、かかる粒子そのものの位置測定お
よび／もしくは定量とすることもでき、或いは、それ自
身をかかる粒子に直接もしくは間接に結びつける、特定
的な物質もしくは構造物の、位置測定および／または同
定および／または定量とすることもできる。その第一の
側面では、本発明は、好適な液体、半固体もしくは固体
媒質の如何なるものの中においても、金属粒子を測定す
る、きちんとした信頼性のある方法を提供し、例えば水
系もしくは有機媒質中に懸濁された金属ツル中の金属粒
子の測定方法を提供する。更に。

この方法を行なう際の容易さのため、二元系もしくは多
成分系の混合時の均一性を研究したり、液体、半固体も
しくｔｔＷ体、殊に無定形媒質の流動特性を研究したり
、或いは液体もしくは固体膜コーティング等の厚さを測
定した化するのに、指定された大きさの金属粒子をトレ
ーサーとして使用することを、魅力あるものとしている
。

その第二の側面では、本方法は、多くの場合生物学的起
源の、試験管中および生体中の両方の、特定の有機物質
もしくは構造物の測定に、応用し得る。かかる応用は、
一般に、よく規定された有機物質にカップリングされた
、金属ゾル粒子、殊に金粒子を使用することになるが、
現在、金によるラベルが有用であると知られている場合
の例を、原則として含むものであるが、その例のみに限
可、されるべきものではない。かくて、本発明の方法は
、生物学的物質等の細胞学、組織学、細胞内および細胞
外診断の如き領域にお、ける操作の、かなりの進歩と便
宜性とを供与するものアある。

本発明の方法の主要な利点の＝一つは、少なくとも原理
的には、これが非破壊的であって、そのままの構造的に
組織された、殊に生物学的な系に応用し得る点である。

例えば、特定の蛋白質、例えば抗体にカンプリングされ
た金属粒子を使用し、これらの台のを好適な結合性の物
質と相互作用させることによって、後者の正確な位置測
定が、容易に、しかも実質的に非破壊のやり方で行ない
得る。非常に小さい粒子を使用し得るということは、上
記の現象を微視的な環境下で、例えば一つの細胞中、も
し望まれれば生きた細胞中で観測することを可能とする
。従って、本発明の方法は、個々の細胞中の特定の結合
性物質および／または構造物を位置測定お°よび／また
は定量し、且つ／或いは細胞内でのその分布および／ま
たは運動を追跡し、且つ／或いは細胞内での成る特定の
輸送現象の速度を測定することに使用し得る。生きてい
る生物においてさえも本発明の方法を用いて容易に観測
し得る、特定的な細胞内輸送現象の例には、微小細管お
よび軸索輸送が含まれる。生きている神経生検における
軸索輸送の測定は、例えば、筋ジストロフィーの如き条
件を研究し、或いはかかる疾病の発現を追跡する、診断
の道具として使用し得る。この方法は、更に、種々の種
類のウィルス性感染を検出するのに使用し得る。

その一般的な特性のため、この方法は、生物学的媒質も
しくは誘導される分層の中の、表面抗原もしくは細胞内
抗原または一般的に如何なる特定の有機物質でも検出す
るということに基づいて、診断試験において使用し得る
。普通、かかる物質は、例えばホルモン、蛋白質、酵素
等の如きポリペプチド性を有する。原理的に、本発明の
方法に基づく診断技術を単細胞に応用することは可能で
ある。その非破壊特性の観点で、この方法は、偏位する
生物化学的特性をもった単細胞を他の細胞から区別する
のに、従って有利に使用することができ、それによって
、選ばれた細胞は完全に生きたままでいることができ、
更に増殖することもできる。かかる応用は、遺伝子操作
の手順において殊に有用であり、即ち、陽性のものを陰
性の圧漬器細胞（ｅｘｐｒｅｓｓｏｒ　　ｅｅｌ　ｌ）
から迅速に分離するのに有用である。これはまた、分娩
前の生体における遺伝子偏位もしくは代謝欠陥を検出す
るのにも好適である。

ツル粒子免疫分析に基づく現存する診断法と比較［７て
、本発明の方法は遥かに大きい感度を有する。事実、現
存する方法は、一般に、吸収されもしくは懸濁された金
属粒子のバルクによる、光吸収もしくは散乱に基づいて
いる。明らかに、例えば吸取媒質上での色の測定は、ま
とまった数の粒子の存在を必要とする。これとは対照的
に、本発明の方法は、単粒子の観測および計数を可能と
する。従って、本発明の方法は、現存の、例えば視覚的
もしくは色度測定的な技術の感度が足りない場合の、例
えば肝炎の検出への応用のための、診断用吸取紙（ｄｉ
ａｇｎｏｓｔｉｃ　　ｂｌｏｔ）の発展を大いに扶ける
ものである。

薬理学の分野においては、本方法は、釆品およびその受
容体の細胞および限外細胞位置測定を行なうための、価
値ある手段となろう。　６ゾル粒子、殊に金粒子の製造
、好適な結合物質、例えば抗体へのこれらのもののカッ
プリング、およびこれらのものを直接もしくは間接に望
みの結合物質と化合させる種々の方法論は、十分に公知
である。この関連では、例えば、Ｉ　ＢＲＯハンドブッ
クシリーズのニー、シー、キュエロ編の免疫組織化学（
Ｉｍｍｕｎｏｈｉ　ｓｔ　ｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、Ｗ
ｉｌｅｙ、Ｎｅｗ　　Ｙ　　ｏ　　ｒｋ、１９８３１ｐ
３４７〜３７２および米国特許第４，３１３．７８４号
およびジュー。エム、ボラック、ニス、ヴアン、ヌルデ
ン編の免疫細胞化学（Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ）、Ｗｒｉｇｈｔ　　ＰＳＧ、Ｂｒ１ｓｔｏｌ
。

１９８３年、ｐ８２〜１１２を参照することができる。

本発明に従って金属粒子を可視化する方法は、現在子に
することのできる装置、を用いて行なわせることかでき
る。かかる装置は、　・方に適当な光学顕微鏡、他方に
電子的コントラスト増幅装置からなるものである。適当
な光学顕微鏡としては、明視野顕微鏡法および／または
外部偏光顕微鏡法のためにｉ備された、標準の、″品質
の良い如何なる顕微鏡をも使用することができる。単色
享の使用は必須ではないが、品質を改善させる。実際に
は、単色性の緑色光が優秀な結果を与えることが判って
いる。明視野顕微鏡法が使用される時は、差動干渉コン
トラスト（ｄｉ　ｆｆｅｒｅｎｔ　ｉ　ａｌｉｎｔｅｒ
ｆｅｒｅｎｃｅ　　ｃｏｎｔｒａｓｔ）（ＤＩＣ）法を
用いることによって、“更に改善を行なうことができる
。電子的コントラスト増幅装置としては、手動もしくは
自動の、輝度およびコントラスト調整を装備された、普
通の種類のどんなビデオカメラでも好適であろう、勿論
、像の質は、装置の精度に直接的に関連するものである
。

本発明に従う方法を使用する時、および関連す？金属粒
子を周囲の基体から可能な限り最大限に区別するために
は、基体の最適な可視化に要求されるよりも大きい、実
効のレンズ口径を使用することが適当となろう。実際上
、最良の結果は、全開もしくは全開に近い口径、即ち直
接の顕微鏡像がその゛過剰の輝度のために殆どコントラ
ストを有さず、その理由で視覚的な観察には、全く不適
当である条件下で操作する時に得られる。適正に観察さ
れ、ビデオカメラで処理されると、これによって殆どの
迷光が遮断されコントラストが増幅されるが、金属粒子
はよく規定されたとびとびのスポットの如く明瞭に見え
るようになる。明視野顕微鏡法のもとでは、スポットは
明るい背景に対して暗くなるが、−・方、外部変更顕微
鏡法のもとでは、粒子は明るいきらめくスポットとして
見えるようになる一顕微鏡が、視野の再調整なしに、明
視野から外部偏光顕微鏡法への移行を許容するものであ
るならば、両方の方法による粒子の交番的な可視化によ
ろ・て、その正体に対して優良な確証が得られる。

金属粒子が、加工された像のヒで目に見える明瞭さの点
からは、適当な基体におけるこれらのものの検出および
定量は、普通の種類の如何なる自動計数装置を使用する
ことによっても、容易に自動化し得る。

本発明を更に以下の実施例によって例示するが、これは
決して本発明の範囲を限定する目的のものではない。

万迭：ナノ粒子ビデオ超顕微鏡法もしくはナノビド超顕
１鋳法′。

ＰＴＫ　（ボトラストリダクチリス腎（Ｐｏｔ。

ｒｏｕｓ　　　Ｔｒｉｄａｃｔｙｌｉｓ　　　Ｋｉｄｎ
ｅｙ））細胞を、ガラスのカバーゲラストに播種して２
４〜４８時間後に使用した。２０〜４０ｎｍの大きさを
有し、血清アルブミン（ＮｏｒｄｉＣ）でコーティング
された、コロイド状金粒子を、ポリエチレングリコール
で安定化させた。粒度分布を超構造的に測定した。倒立
位相差コントラスト顕微鏡（ｉｎｖｅｒｔｅｄ　　ｐｈ
ａｓｅｃｏｎｔ　ｒａｓｔ　　ｍ１ｃｒｏｓｃｏｐｅ）
　Ｌで顕微注射を行なった。先端開口±ＩＩＬｍまで引
き伸ばされたガラスキャピラリーを、キャピラリー作用
によって逆充填した。注射直後に、カバーグラスをベト
リ皿から取り出し、パラフィルム細片をスペーサーとし
て使用し、パラツブ（ワセリン、ラノリン、パラフィン
各々１／３）を顕微室の封入に使用して、スライドヒに
載せた。この標本を次にライカート（Ｒ’ｅｉｃｈｅｒ
ｔ）（ウィーン、オーストリア）ポリバール（Ｐｏｌｙ
ｖａｒ）顕微鏡に載せた。標本の温度は、空気流式イン
キュベーターによって３７°±１℃に保った。顕微鏡に
は、ユニバーサルコンデンサー（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　
ｃｏｎｃｆｅｎｓｅｒ）と１００倍のプラナボレンズ（
ｐｌａｎａｐｏ　　ＩｅｎＳ）とを装備した。集光鏡お
よび対物レンズの両方の油浸漬を使用して、観測期間全
体に亘って、ケーレル照明法をなしとげた。集光鏡配設
またはフィルターユニットを切り換えることによって、
同じ細胞を、３０秒より短い間に、順序が下記の光学並
びによって観測することができた：二色鋺およびクロス
偏光板およびアナライザーを用いる、透過光、差動干渉
コントラス）（ＤＩＣ）干渉反射顕微鏡法、１００倍の
プラナポ位相コントラスト対物レンズを使用する、外部
ケイ光、暗視腎観測もしくは位相コントラスト。透過光
もしくはＤＩＣにより、系の数値全開の口径を使用した
。照明は　ｌＯＯワ・シトのハロゲンランプもしくは２
００ワツトの水銀アーチ（ｍｅｒｃｕｒｙａ　ｒ　ｃ　
ｈ’）の緑色線によって行なった。

像（全視野の中央および２０％）は、８００本のＴＶ線
の水平解像能を提供する、バナソニックＷＶ−１８００
ビデオカメラの表面板のＦへ、直接投影させた。ビデオ
信号は、パンソニックｗｖ５３４０モニター、および３
４０本の水平解像能を提供するソニーＶＤ−５８５０Ｐ
　　Ｕマチックビデオカセットレコーダーへ、供給した
。記録は、実時間で行なうか、或いは、ソニー、−レコ
ーダーのためにＥＯＳによって組み立てられたＡＣ３８
０アニメーシヨンコントロールユニツトヲ使用して、時
間経過モードで行なった。一般に、レコーダーは、１０
秒毎に２コマ取りこむように命令した。普通の速度（２
５コマ／秒）での再生は、従って、１２５倍の加速とな
った。写真記録は、実時間再生を使用してモニターから
とるか、死いは、記録が時間経過モードで行なわれた時
は静１Ｆ画像からとった６シヤツタ一時間は１／４〜１
／８秒の間とした。

極めて予想外なことに、集光鏡を正常な明視野透過に向
け、カメラを完全に飽和させるべく照明を上げた時に、
はっきりと見わけられる暗色のスポットが、全体に白色
の背景の上にスクリーン上に出現した。光はクロスされ
たアナライザーの中を通ったので、金の粒子が偏光され
た光を反射し、そして十分な二色性効果をうみ出したも
のである。これらのものは、細胞の通常の干渉反射画像
からなる背景のＬに、明るく輝く点として出現した。普
通は細胞中央に位置する。非常に大きし・凝集体以外は
、接眼鏡を通しては点は全く見えず、写真乾板トには何
も記録することができなかった。ノルマンスキー差動干
渉コントラスト（Ｄ　Ｉ　Ｃ）を使用すると、最も小さ
い粒子さえもが容易に検出された。しかし、これらのも
のは、明槽野観測に行ったり来たり切り換えられなけれ
ば、内生小器官から識別することができない。偕々の金
粒子を検出するために、ホルムバールでコーティングさ
れたグリッドヒで２０もしくは４０ｎｍの金と共に成長
させた細胞を注射して、ビデオテープに記録し、その後
直ちにゲルタールアルデヒドを用いた速流によって固定
した。これらのものを、次に、全マウント電子顕微鏡観
察用に更に加工した。同様な実験を、その上へ金のゾル
を吸着させた、裸のグリッドを用いて行なった。

両方の試験によって、最も小さい点の殆どのものが個々
の金粒子であるということがはっきりと示された。２〜
３個の粒子の小さな凝集体は、同じ大きさを有するよう
に見えた。その中では少ししかないが、より大きな凝集
体は、ミクロピペットのキャピラリー先端の中で多分生
成されようが、このものは４０　ｎｍの大きさを使用す
るとつまるようになることがしばしばであった。これら
のものはスクリーン上では０．５〜１μｍの小球体とし
て現れた。全マウント電子顕微鏡法は、殊にステレオ写
真を使用すると、殆どの金粒子が細胞質中では自由であ
り、しばしば微小細管に密接に付随していることを示す
のにもまた見かけになるものであった。溶解細胞体（Ｉ
ｙｓｏｓｏｍａｌ）の構造メー画を示すべく、細胞をア
クリジンオレンジで生体染色しても、これらの小器官内
には金の粒子は全く見えなかったが、このことは細胞に
同じ粒子を媒質中で供給した時に明らかにそうなるにも
拘らず、見られなかった。かなり頻繁に、金の粒子は、
それ自身微小細管に接続されている、小さな小胞に見か
け上は結合されていた。

ビデオテープ分析は、顕微注射が常に核に近くで行なわ
れるのにも拘らず、金の粒子が細胞全体に１０〜１５分
以内に分散されることを示した。

実時間および時間経過モードの観測により、全ての粒子
が、典型的なとびとびの機作で、中心体に向かい、また
中心体から離れて、線型の軌跡に沿って運動することが
示された。殊に、個々の粒子（２０および４０ｎｍの両
者）は、典型的な線型の運動および局所的な不規則「周
辺ジャンプ（ｊｕｍｐｉｎｇ　　ａｒｏｕｎｄ）Ｊに交
互に属するものであった。後者の種類の運動は、しかし
ながら、媒質中の金属粒子の真のブラウン運動よりも遥
かに遅いものであった。小さい粒子は注射後２〜４時間
までは細胞質内に分散されたままであったが、一方、よ
り大きなものは、中心体の領域の中に集積する傾向があ
った。異なる大きさの全凝集体のとびとびの運動の速度
および頻度の分析および内性小器官との比較により、興
味深くもそれぞれの大きさに依存しているこれらのもの
の挙動における、仮想的個性が明らかとなった。

微小細管抑制因子ノコダゾール（Ｉ　Ｏ−８〜１０−５
Ｍ）の効果は、極めて予想可能なものであり、内性小器
官および金粒子の両者に対して同一であった。とびとび
の動きは徐々に消失し、不規則な局所運動のみが持続さ
れた。アジ化ナトリウム（１０−２，Ｍ）は、ＡＴＰの
急速な消耗に相当して、数分以内にとびとび運動を停［
トさせた。

タキソルの効果は興味あるものであった。小さい粒子は
、しばしば末梢の微小細管索に沿って、とびとび運動を
続けた。より大きな―集体は、しかしながら、完全に停
止された０面白いことに、蛋白質架橋剤（ｐｒｏｔｅｉ
ｎ　　ｃｒｏｓｓ　　１１ｎｋｅｒ）であるアクリジン
オレンジは、とびとび連動を停止させるだけではなく、
他の医薬のどれとも異なって、局所不規則運動をも停止
トさせた。

微小細管はとびとび運動の中に明瞭に含まれている。下
部単位（ｓｕｂｕｎｉｔ）の踏み車運動（ｔ　ｒｅａｄ
ｍｉ　１１　ｉ　ｎｇ）が可能な分子的機構であると示
唆されているので、モノクロナール抗体にカップリング
された４０ｎｍの粒子を細管に対して注射した。顕微注
射されたケイ先約にラベリングされた抗体が、細胞中の
全微小細管系を覆うが、とびとび連動、細胞の形状およ
び運動または有糸分裂には、６ｍｇ／＋ｍｎ（注射溶液
）以下の濃度では全く効果を有さないことが、初めて確
証された。成る細胞内では、金粒子の殆どのものが１０
〜１５分以内に完全に固定された動けない位置につき、
そして２時間より長い間、動かずにとどまっていた。観
測期間の間には、少しの粒子だけしか脱着して他の場所
に再結合しなかった。しばしば、粒子は、中心体に向か
って収束する、明瞭に線型の配列を形成した。ＤＩＣへ
の切り換えにより、金粒子によって輪郭を描かれた軌跡
にしばしば沿うようにして、内性小器官の正常な運動が
示された。他の細胞内では、変動する数の粒子が固定さ
れず、とびとびの運動をした。これらのものは、抗体の
非存在によるか、或いは抗原結合座位の、例えば自由な
細管下部単位によるマスキングによるかの何れかによっ
て、自由な細管結合座位を全く有さなかったと推測され
る。自由な下部単位の量は、非常によく細胞のサイクル
の段階に依存し書名。

前記（ｐｒｏｐｈａｓｅ）の間に注射された細胞の中で
は、幾つかの粒子が星状体微小細管に沿ってとびとびの
運動をした。検出し得る内性小器官が無い防御体内には
、多くのものがまた見られた。極めて興味深いことに、
これらのものは防御体繊維に沿うばかりではなく、防御
体を側面から通りぬけて、上方向および下方向にジャン
プした。

少しの粒子しか定常的な位置を占めなかった。

あるものは、中期（ｍｅｔａｐｈａｓｅ）において、中
心節に近い動原体繊維に結合されると見えた。このもの
は後期（ａｎａｐｈａｓｅ）の間を通してそれに沿って
動いた。このものが終期（ｔｅｌｏｐｈａｓｅ）の核内
で捕獲されるに至ると、染色質から脱着された。その時
、金粒子は、染色分体の間の空洞内で、非常に早い典型
的なブラウン運動で、運動を開始した。媒質中の粒子は
同じ速度でジャンプする。次にその運動が、例えばノコ
ダゾール（ｎｏｃｏｄａｚｏｌｅ）処理された細胞の細
胞質の中で見られるのと同じ水準まで、急激に減速した
。

特許出願人　ジャンセン・ファーマシューチカ・ナーム
ローゼ・フェンノート

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、２００ｎｍより小さい直径の個々の金属粒子を可視
   化する方法にして、該粒子を明視野顕微鏡法（ｂｒｉｇ
   ｈｔ　ｆｉｅｌｄ　ｍｉｃｔｏｓｃｏｐｙ）もしくは外
   部偏光顕微鏡法（ｅｐｉ−ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ　
   ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）にかけ、そして得られた像のコ
   ントラストを電子的な手段によって増幅することからな
   る方法。 ２、２００ｎｍより小さい直径の個々の金属粒子を可視
   化する方法にして、顕微鏡像の直接視察に対して最適で
   あるよりは実質的に大きい実効口径を使用して、該粒子
   を明視野顕微鏡法もしくは外部偏光顕微鏡法にかけ、そ
   して得られた像のコントラストを電子的な手段によって
   増幅することからなる方法。 ３、特定的な結合蛋白質に結合し得る特定的な有機物質
   を検出および／または測定する方法にして、ｉ）該結合
   可能物質と該結合蛋白質との反応生成物を、１乃至２０
   ０ｎｍの間の直径の金属粒子でラベリング（ｌａｂｅｌ
   Ｉｉｎｇ）し、ｉｉ）そのようにラベリングされた反応
   生成物の個々の金属粒子を特許請求の範囲第１項乃至第
   ２項記載の方法によって可視化するという段階からなる
   方法。 ４、該反応生成物のラベリングを、該金属粒子に直接カ
   ップリングされた結合蛋白質と該結合可能物質を反応さ
   せることによって行なうことからなる、特許請求の範囲
   第３項記載の方法。 ５、該反応生成物のラベリングを、該金属粒子に直接カ
   ップリングされた結合蛋白質と該結合可能物質を反応さ
   せることによって行なうことからなる、特許請求の範囲
   第３項記載の方法。 ６、該結合可能物質および該結合蛋白が、配位子−受容
   体相互作用をすることからなる、特許請求の範囲第３項
   記載の方法。 ７、該結合可能物質および該結合蛋白が、免疫学的反応
   をすることからなる、特許請求の範囲第３項記載の方法
   。 ８、該結合可能物質が抗原であり、該結合蛋白質が該抗
   原に対する抗体であることからなる、特許請求の範囲第
   ７項記載の方法。 ９、該抗原が、細胞表面抗原、ホルモン、酵素および細
   胞内要素からなる群から選ばれることからなる、特許請
   求の範囲第７項記載の方法。 １０、該抗体が該金属粒子に直接カップリングされるこ
   とからなる、特許請求の範囲第８項記載の方法。 １１、該抗原および該抗体の反応生成物が、該金属粒子
   にカップリングされた第二の結合可能物質と更に反応さ
   れることからなる、特許請求の範囲第８項記載の方法。 １２、該金属粒子が金粒子であることからなる、特許請
   求の範囲第１項記載の方法。 １３、得られる像のコントラストをビデオカメラによっ
   て増幅することからなる、特許請求の範囲第１項記載の
   方法。