JPH06105256B2 - 免疫分析方法 - Google Patents
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- JPH06105256B2 JPH06105256B2 JP58106345A JP10634583A JPH06105256B2 JP H06105256 B2 JPH06105256 B2 JP H06105256B2 JP 58106345 A JP58106345 A JP 58106345A JP 10634583 A JP10634583 A JP 10634583A JP H06105256 B2 JPH06105256 B2 JP H06105256B2
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- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/554—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being a biological cell or cell fragment, e.g. bacteria, yeast cells
- G01N33/555—Red blood cell
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
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- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/536—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase
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Description
【発明の詳細な説明】 〔発明の技術分野〕 この発明は、試料中の特定の抗原，抗体または補体価を
定量分析するための免疫分析方法に関する。
定量分析するための免疫分析方法に関する。
従来の免疫分析方法として、たとえば、ラジオアイソト
ープで標識した抗体（または抗原）と生体より採取した
試料中の抗原（または抗体）との抗原抗体反応を利用し
て試料中の特定の抗原（または抗体）を定量分析するラ
ジオイムノアツセイ法や、酵素で標識した抗体（または
抗原）と生体より採取した試料中の抗原（または抗体）
との抗原抗体反応により抗原抗体結合物を得、その抗原
抗体結合物に標識した酵素による酵素反応を利用して試
料中の特定の抗原（または抗体）を定量分析するエンザ
イムイムノアツセイ法等がある。
ープで標識した抗体（または抗原）と生体より採取した
試料中の抗原（または抗体）との抗原抗体反応を利用し
て試料中の特定の抗原（または抗体）を定量分析するラ
ジオイムノアツセイ法や、酵素で標識した抗体（または
抗原）と生体より採取した試料中の抗原（または抗体）
との抗原抗体反応により抗原抗体結合物を得、その抗原
抗体結合物に標識した酵素による酵素反応を利用して試
料中の特定の抗原（または抗体）を定量分析するエンザ
イムイムノアツセイ法等がある。
しかしながら、前記ラジオイムノアツセイ法は、放射性
物質を利用するので設備が大がかりになるという欠点が
あり、また、ラジオイムノアツセイ法およびエンザイム
イムノアツセイ法のいずれにおいても、十分な検出感度
に達するまでには数時間から数十時間を要して分析に長
時間を要するという欠点がある。一方、血清中の補体価
の測定法としては、Meyerから開発した50％溶血法（CH5
0）がある。これは、至適濃度の溶血素（抗羊赤血球抗
体）で感作された羊赤血球と被検血清とを緩衝液中で37
℃,60分間反応させると、感作羊赤血球は補体の作用を
受け溶血するので、溶血の程度を調べる事により、被検
血清中の補体価を求める方法である。しかしながらこの
方法は補体による膜障害反応を氷冷と云う手段でしか停
止出来ず、更に溶血の程度を見る為には反応液を遠心分
離して上澄を得、その541nmにおける吸光度を測定して
いた。従つて本法は手間もかゝり、しかも必ずしも定量
性に富むとは言い難い面があつた。
物質を利用するので設備が大がかりになるという欠点が
あり、また、ラジオイムノアツセイ法およびエンザイム
イムノアツセイ法のいずれにおいても、十分な検出感度
に達するまでには数時間から数十時間を要して分析に長
時間を要するという欠点がある。一方、血清中の補体価
の測定法としては、Meyerから開発した50％溶血法（CH5
0）がある。これは、至適濃度の溶血素（抗羊赤血球抗
体）で感作された羊赤血球と被検血清とを緩衝液中で37
℃,60分間反応させると、感作羊赤血球は補体の作用を
受け溶血するので、溶血の程度を調べる事により、被検
血清中の補体価を求める方法である。しかしながらこの
方法は補体による膜障害反応を氷冷と云う手段でしか停
止出来ず、更に溶血の程度を見る為には反応液を遠心分
離して上澄を得、その541nmにおける吸光度を測定して
いた。従つて本法は手間もかゝり、しかも必ずしも定量
性に富むとは言い難い面があつた。
前記欠点を解消して短時間のうちに試料中の抗原（また
は抗体）を定量分析する方法を、この出願人は、先に、
昭和57年特許願第195117号に係る明細書に開示したが、
前記明細書に開示する方法は、遠心分離器を使用しなけ
ればならず、装置が大掛りになるとの新たな問題点を生
じた。
は抗体）を定量分析する方法を、この出願人は、先に、
昭和57年特許願第195117号に係る明細書に開示したが、
前記明細書に開示する方法は、遠心分離器を使用しなけ
ればならず、装置が大掛りになるとの新たな問題点を生
じた。
この発明は前記事情に鑑みてなされたものであり、極め
て短い分析時間で試料中の抗原抗体および補体価を分析
することのできる免疫分析用試薬を用いた簡便な免疫分
析方法を提供することを目的とするものである。
て短い分析時間で試料中の抗原抗体および補体価を分析
することのできる免疫分析用試薬を用いた簡便な免疫分
析方法を提供することを目的とするものである。
前記目的を達成するためこの発明の概要は、補体活性に
より膜溶解作用を受けるマイクロカプセル膜に抗原また
は抗体を結合するマイクロカプセルと補体とを少なくと
も含有する試薬と、前記抗原または抗体と抗原抗体反応
を生ずる抗体または抗原を有する試料とを混合し、この
混合により反応した混合液を混合状態のまま二波長分光
測光する事により、試料中の抗原又は抗体を定量する事
を特徴とするものである。
より膜溶解作用を受けるマイクロカプセル膜に抗原また
は抗体を結合するマイクロカプセルと補体とを少なくと
も含有する試薬と、前記抗原または抗体と抗原抗体反応
を生ずる抗体または抗原を有する試料とを混合し、この
混合により反応した混合液を混合状態のまま二波長分光
測光する事により、試料中の抗原又は抗体を定量する事
を特徴とするものである。
この発明に係る方法における試薬は、補体活性により溶
解作用を受けるマイクロカプセル膜に抗原または抗体を
結合するマイクロカプセルを含有する液である。
解作用を受けるマイクロカプセル膜に抗原または抗体を
結合するマイクロカプセルを含有する液である。
抗体（または抗原）を結合することのできるマイクロカ
プセルとしては、動物たとえば羊の赤血球、およびリポ
ゾームを用いることができる。なお、他の動物の赤血球
あるいは赤血球以外の動物細胞であつても、細胞膜に抗
体（または抗原）を結合することができれば、この発明
におけるマイクロカプセルとして使用することができ
る。
プセルとしては、動物たとえば羊の赤血球、およびリポ
ゾームを用いることができる。なお、他の動物の赤血球
あるいは赤血球以外の動物細胞であつても、細胞膜に抗
体（または抗原）を結合することができれば、この発明
におけるマイクロカプセルとして使用することができ
る。
マイクロカプセル膜に結合する抗体（または抗原）は、
試料中の抗原（または抗体）と特異な抗原抗体反応を惹
起するものが適宜に選ばれる。たとえば、試料中の抗原
がα−フエトプロテインであるときは、抗α−フエトプ
ロテイン抗体が挙げられる。又補体価測定を目的とする
時には、マイクロカプセル膜に結合させる抗体は、当該
マイクロカプセルに対する抗体を用いる。
試料中の抗原（または抗体）と特異な抗原抗体反応を惹
起するものが適宜に選ばれる。たとえば、試料中の抗原
がα−フエトプロテインであるときは、抗α−フエトプ
ロテイン抗体が挙げられる。又補体価測定を目的とする
時には、マイクロカプセル膜に結合させる抗体は、当該
マイクロカプセルに対する抗体を用いる。
次に本発明の原理を説明する。抗体（又は抗原）を感作
したマイクロカプセルを適当な濃度で懸濁し、光をあて
ると光はマイクロカプセルにより散乱する。従つて吸光
度測定の際、所謂濁度により高いブランク値を与える。
一方マイクロカプセル内に特定の光学的特性を有した物
質が封入されていても、光の散乱等の撮影により、その
物質特有のシグナルは余り強くは検出されない。一方、
抗原抗体反応及びそれに伴う補体の活性化によりマイク
ロカプセル膜が破壊されると、マイクロカプセル内容物
が反応液内に流出し、マイクロカプセル膜自体は所謂ゴ
ーストとなる。この反応に伴つて反応液の濁度は低下
し、それに伴つてベースラインも低下し、それと反対に
マイクロカプセル内に封じ込められていた光学特性を有
する物質に由来するシグナルが増大する。ヘモグロビン
を光学特性物質として、ヘモグロビンを溶血させた際の
吸光度のスペクトル変化を第１図に示す。この時ヘモグ
ロビン由来の415nmの吸光度（A415）とベースにあたる5
00nmの吸光度（A500）の差を測定すると、A415−A500は
赤血球の破壊と直線的に比例している（第２図）。従っ
て、この様に特定の二波長の差をとる事により、マイク
ロカプセルの破壊度即ち被検液中の抗原，抗体，又は補
体量を測定する事が出来る。本法はこの様に抗原抗体反
応とそれに伴う補体活性化によるマイクロカプセル膜の
破壊をマイクロカプセル共存下で所謂レートアツセイに
より測定する為、測定時間が大巾に短縮され手技も簡便
となつた。
したマイクロカプセルを適当な濃度で懸濁し、光をあて
ると光はマイクロカプセルにより散乱する。従つて吸光
度測定の際、所謂濁度により高いブランク値を与える。
一方マイクロカプセル内に特定の光学的特性を有した物
質が封入されていても、光の散乱等の撮影により、その
物質特有のシグナルは余り強くは検出されない。一方、
抗原抗体反応及びそれに伴う補体の活性化によりマイク
ロカプセル膜が破壊されると、マイクロカプセル内容物
が反応液内に流出し、マイクロカプセル膜自体は所謂ゴ
ーストとなる。この反応に伴つて反応液の濁度は低下
し、それに伴つてベースラインも低下し、それと反対に
マイクロカプセル内に封じ込められていた光学特性を有
する物質に由来するシグナルが増大する。ヘモグロビン
を光学特性物質として、ヘモグロビンを溶血させた際の
吸光度のスペクトル変化を第１図に示す。この時ヘモグ
ロビン由来の415nmの吸光度（A415）とベースにあたる5
00nmの吸光度（A500）の差を測定すると、A415−A500は
赤血球の破壊と直線的に比例している（第２図）。従っ
て、この様に特定の二波長の差をとる事により、マイク
ロカプセルの破壊度即ち被検液中の抗原，抗体，又は補
体量を測定する事が出来る。本法はこの様に抗原抗体反
応とそれに伴う補体活性化によるマイクロカプセル膜の
破壊をマイクロカプセル共存下で所謂レートアツセイに
より測定する為、測定時間が大巾に短縮され手技も簡便
となつた。
本発明においては、前記マイクロカプセルの破壊により
放出されたマイクロカプセル内容物を含有する反応液を
二波長分光測光する。従つてマイクロカプセル内容物は
分光分析可能な光学的特性を有し、しかもマイクロカプ
セル内に安定に封入されるものであれば何でもよい。こ
の様なものとしては例えばヘモグロビン，アルブミン，
等のたん白質，ポリヌクレオチドの様な核酸，等があ
る。ヘモグロビンの場合は前述の様に赤血球そのものを
利用する事が出来る為便利である。又、種々の螢光物
質，発光物質もマイクロカプセルの封入物質として利用
出来る。これらを用いると吸光度測定に比べ測定感度を
増す事が出来る。更に、分光分析可能な酸素反応生成物
を与える酸素または基質が挙げられる。マイクロカプセ
ル内に酵素または基質を封入したマイクロカプセルを用
いるときには、試薬には、前記マイクロカプセルのほか
に、酵素反応の可能な基質または酵素を含めておくこと
が好ましい。また、マイクロカプセル内に酵素を収容す
る態様として、そのような酵素を含有する微生物をマイ
クロカプセル内に収容するものであつてもよい。マイク
ロカプセル内に前記酵素を収容するかわりに前記した各
種の酵素と特異的に反応する基質を収容してもよい。た
だし、酵素を収容したマイクロカプセルを有する免疫分
析用試薬を長時間にわたつて保存しておくと、酵素が失
活してしまうことがあるので、マイクロカプセル内に収
容するのは酵素よりも基質であるのが好ましい。
放出されたマイクロカプセル内容物を含有する反応液を
二波長分光測光する。従つてマイクロカプセル内容物は
分光分析可能な光学的特性を有し、しかもマイクロカプ
セル内に安定に封入されるものであれば何でもよい。こ
の様なものとしては例えばヘモグロビン，アルブミン，
等のたん白質，ポリヌクレオチドの様な核酸，等があ
る。ヘモグロビンの場合は前述の様に赤血球そのものを
利用する事が出来る為便利である。又、種々の螢光物
質，発光物質もマイクロカプセルの封入物質として利用
出来る。これらを用いると吸光度測定に比べ測定感度を
増す事が出来る。更に、分光分析可能な酸素反応生成物
を与える酸素または基質が挙げられる。マイクロカプセ
ル内に酵素または基質を封入したマイクロカプセルを用
いるときには、試薬には、前記マイクロカプセルのほか
に、酵素反応の可能な基質または酵素を含めておくこと
が好ましい。また、マイクロカプセル内に酵素を収容す
る態様として、そのような酵素を含有する微生物をマイ
クロカプセル内に収容するものであつてもよい。マイク
ロカプセル内に前記酵素を収容するかわりに前記した各
種の酵素と特異的に反応する基質を収容してもよい。た
だし、酵素を収容したマイクロカプセルを有する免疫分
析用試薬を長時間にわたつて保存しておくと、酵素が失
活してしまうことがあるので、マイクロカプセル内に収
容するのは酵素よりも基質であるのが好ましい。
マイクロカプセル内に収容する物質の量としては、マイ
クロカプセル膜に結合する抗体（または抗原）と反応す
る抗原（または抗体）量の最低10-15M前後に対し十分に
過剰な量たとえば酵素活性値に換算して100U/ml以上、
好ましくは500U/ml〜1000U/mlである。このように抗体
（または抗原）量に対してマイクロカプセル内の酵素
（または基質）量が大過剰であるので、免疫分析測定を
短時間のうちに行なうことができる。マイクロカプセル
内に物質を封入する方法としては、マイクロカプセルが
赤血球の場合、透折法（古沢満，生化学53（９）,1066
（'81））等が応用される。又、リポソームをマイクロ
カプセルとした場合も常法に従い、膜原料脂質溶液の分
散媒中に予め当該物質を溶解させておけばよい（M.Haga
eal,Anal.Biochem.,118,286（'81））。マイクロカプセ
ル表面に抗原又は抗体を結合させる方法としては、通常
行なわれている塩化クロム法、の他２価性架橋試薬等に
よる結合方法が行なわれる。
クロカプセル膜に結合する抗体（または抗原）と反応す
る抗原（または抗体）量の最低10-15M前後に対し十分に
過剰な量たとえば酵素活性値に換算して100U/ml以上、
好ましくは500U/ml〜1000U/mlである。このように抗体
（または抗原）量に対してマイクロカプセル内の酵素
（または基質）量が大過剰であるので、免疫分析測定を
短時間のうちに行なうことができる。マイクロカプセル
内に物質を封入する方法としては、マイクロカプセルが
赤血球の場合、透折法（古沢満，生化学53（９）,1066
（'81））等が応用される。又、リポソームをマイクロ
カプセルとした場合も常法に従い、膜原料脂質溶液の分
散媒中に予め当該物質を溶解させておけばよい（M.Haga
eal,Anal.Biochem.,118,286（'81））。マイクロカプセ
ル表面に抗原又は抗体を結合させる方法としては、通常
行なわれている塩化クロム法、の他２価性架橋試薬等に
よる結合方法が行なわれる。
試薬中の補体は、動物の血液中に含まれているものを使
用することができ、たとえばモルモツトの血清を補体含
有液としてそのまま使用することができる。
用することができ、たとえばモルモツトの血清を補体含
有液としてそのまま使用することができる。
試薬中のマイクロカプセル内に酵素または基質を封入し
た場合、試薬中の第３成分としての基質（または酵素）
は、前記マイクロカプセル中に収容された酵素（または
基質）と特異的に酵素反応をする前述の基質（または酵
素）を使用することができる。基質（または酵素）の量
としては、マイクロカプセル内に収容されている酵素
（または基質）に対応する量でよい。
た場合、試薬中の第３成分としての基質（または酵素）
は、前記マイクロカプセル中に収容された酵素（または
基質）と特異的に酵素反応をする前述の基質（または酵
素）を使用することができる。基質（または酵素）の量
としては、マイクロカプセル内に収容されている酵素
（または基質）に対応する量でよい。
この発明における試料は生体より採取したところの抗体
抗原，または補体を有するものであり、たとえば患者よ
り採取した血液、尿、リンパ液体、腔液、膵液等が挙げ
られる。
抗原，または補体を有するものであり、たとえば患者よ
り採取した血液、尿、リンパ液体、腔液、膵液等が挙げ
られる。
この発明においては、前記試薬と前記試料とを混合する
ことにより、第３図に示すように、前記試薬中のマイク
ロカプセルにおける抗体３または抗原と前記試料中の抗
原４または抗体とで抗原抗体反応を進行させ、この抗原
抗体反応により前記試薬中の補体５を活性化することに
より補体５の膜溶解作用を発現し、これによつてマイク
ロカプセル膜１を破壊し、マイクロカプセル内より反応
液中にマイクロカプセル内容物２放出させる。これら一
連の過程は、通常の反応容器内又は光学測定用セル内で
行なうことができる。
ことにより、第３図に示すように、前記試薬中のマイク
ロカプセルにおける抗体３または抗原と前記試料中の抗
原４または抗体とで抗原抗体反応を進行させ、この抗原
抗体反応により前記試薬中の補体５を活性化することに
より補体５の膜溶解作用を発現し、これによつてマイク
ロカプセル膜１を破壊し、マイクロカプセル内より反応
液中にマイクロカプセル内容物２放出させる。これら一
連の過程は、通常の反応容器内又は光学測定用セル内で
行なうことができる。
前記試薬中のマイクロカプセルの内部に、アルブミン、
ヘモグロビン等の内容物が存在するときには、反応液は
前記内容物を含有する。また、前記試薬中のマイクロカ
プセルの内部に酵素または基質を封入するときは、マイ
クロカプセル膜の破壊により放出された酵素または基質
と、試薬中の第３成分である基質または酵素とによる酵
素反応生成物を、前記反応液中に含有することとなる。
ヘモグロビン等の内容物が存在するときには、反応液は
前記内容物を含有する。また、前記試薬中のマイクロカ
プセルの内部に酵素または基質を封入するときは、マイ
クロカプセル膜の破壊により放出された酵素または基質
と、試薬中の第３成分である基質または酵素とによる酵
素反応生成物を、前記反応液中に含有することとなる。
抗原抗体反応とそれに伴う補体活性化によりマイクロカ
プセルの破壊が進行している反応液を二波長分光測光に
供する。この時二波長分光測光用装置としては測定波長
を自由に変えられる分光装置であればどの様なものでも
かまわないが、同時に希望する特定の２波長測光が出来
る様な装置であれば、尚望ましい。又、この出願人らが
先に提案した、昭和57年特許願第54907号明細書に記載
の新規な分光分析装置を好適に使用することもできる。
プセルの破壊が進行している反応液を二波長分光測光に
供する。この時二波長分光測光用装置としては測定波長
を自由に変えられる分光装置であればどの様なものでも
かまわないが、同時に希望する特定の２波長測光が出来
る様な装置であれば、尚望ましい。又、この出願人らが
先に提案した、昭和57年特許願第54907号明細書に記載
の新規な分光分析装置を好適に使用することもできる。
このようにして、二波長分光測光により、マイクロカプ
セル内容物あるいは酵素反応生成物を定量することがで
き、その定量により試料中の抗体、抗原，あるいは補体
価の定量を行なうことができる。
セル内容物あるいは酵素反応生成物を定量することがで
き、その定量により試料中の抗体、抗原，あるいは補体
価の定量を行なうことができる。
前述の様に本法はマイクロカプセル懸濁状態で当該マイ
クロカプセルの破壊をレートアツセイ法で測定する為、
測定時間が大巾に短縮され更にマイクロカプセル内容物
あるいは酵素反応生成物の量は、試料中の抗体あるいは
抗原の量に比して大過剰であるから、従来方法では数10
時間もの時間を要していた抗体あるいは抗原の定量を５
〜10分程度の短時間のうちに迅速に行なうことができ
る。しかも、遠心分離等の操作を何ら行なうことなく、
反応液を二波長分光測装置内の測定セルに装填するだけ
で測定可能となるので、分析操作を著しく簡便化するこ
とができ、二波長分光測光により度の高い分析値を得る
ことができる。
クロカプセルの破壊をレートアツセイ法で測定する為、
測定時間が大巾に短縮され更にマイクロカプセル内容物
あるいは酵素反応生成物の量は、試料中の抗体あるいは
抗原の量に比して大過剰であるから、従来方法では数10
時間もの時間を要していた抗体あるいは抗原の定量を５
〜10分程度の短時間のうちに迅速に行なうことができ
る。しかも、遠心分離等の操作を何ら行なうことなく、
反応液を二波長分光測装置内の測定セルに装填するだけ
で測定可能となるので、分析操作を著しく簡便化するこ
とができ、二波長分光測光により度の高い分析値を得る
ことができる。
この発明における免疫分析方法は、ガン発見のためのα
−FP（α−フエトプロテイン）の定量分析、肝炎発見の
ためのHBS分析、テンカン治療のために使用される抗テ
ンカン剤を抗原とする抗テンカン剤の生体内濃度の定量
分析等更には補体価測定などにつききわめて有効かつ巾
広い項目に適用することができる。
−FP（α−フエトプロテイン）の定量分析、肝炎発見の
ためのHBS分析、テンカン治療のために使用される抗テ
ンカン剤を抗原とする抗テンカン剤の生体内濃度の定量
分析等更には補体価測定などにつききわめて有効かつ巾
広い項目に適用することができる。
免疫分析方法の実験例 ＜実験例１＞ 先ず、二波長分光測光の有効性を確かめた。
感作赤血球を含有する液（E,A）（感作赤血球数:2×109
個/ml）の所定量をゼラチンベロナール緩衝液（GVB）で
遠心洗浄した後、再度GVBを加えて、感作赤血球数が５
×108個/mlの調整液を得る。次いでモルモツト補体を0.
5mlの純水に溶解し、さらにGVBで81倍に希釈して補体コ
ントロール液を得る。前記調整液と前記補体コントロー
ル液と前記GVBとを次表に示す割合に混合し、次いで37
℃に維持して抗原抗体反応を行ない、赤血球を溶解させ
た。
個/ml）の所定量をゼラチンベロナール緩衝液（GVB）で
遠心洗浄した後、再度GVBを加えて、感作赤血球数が５
×108個/mlの調整液を得る。次いでモルモツト補体を0.
5mlの純水に溶解し、さらにGVBで81倍に希釈して補体コ
ントロール液を得る。前記調整液と前記補体コントロー
ル液と前記GVBとを次表に示す割合に混合し、次いで37
℃に維持して抗原抗体反応を行ない、赤血球を溶解させ
た。
反応液につき吸光分析を行ない、波長415nmと波長500nm
とにおける吸光度差A415−A500を測定しつゝ反応のタイ
ムコースをとると第４図の様になり、約２分間のラグの
後、溶血反応が開始され、約２分間反応は直線的に進行
した後プラトーに達した。
とにおける吸光度差A415−A500を測定しつゝ反応のタイ
ムコースをとると第４図の様になり、約２分間のラグの
後、溶血反応が開始され、約２分間反応は直線的に進行
した後プラトーに達した。
次に各試料における直線反応域における１分間当りのA4
15−A500を測定したところ、第５図の様になり、添加し
た補体濃度に伴つて、二波長吸光度差が増加した。
15−A500を測定したところ、第５図の様になり、添加し
た補体濃度に伴つて、二波長吸光度差が増加した。
＜実験例２＞ 予め調製したα−フエトプロテイン（以下α−FP）抗体
を感作した羊赤血球を８％濃度に生理含塩水に浮遊させ
た。この感作赤血球50μを光路長70mmの吸光度測定用
セルに入れ、次にα−FP含有量が既知である血清試料を
添加した。更に、前記ゼラチンベロナールバツフアー1.
9mlとモルモツト補体（50倍希釈物）を1.0ml加え混合し
37℃に加温しつつA415−A500を測定した。その結果第６
図に示した様に、α−FP濃度に伴つてA415−A500が増加
し、本法が免疫測定法として極めて有効な手段となりう
る事が証明された。
を感作した羊赤血球を８％濃度に生理含塩水に浮遊させ
た。この感作赤血球50μを光路長70mmの吸光度測定用
セルに入れ、次にα−FP含有量が既知である血清試料を
添加した。更に、前記ゼラチンベロナールバツフアー1.
9mlとモルモツト補体（50倍希釈物）を1.0ml加え混合し
37℃に加温しつつA415−A500を測定した。その結果第６
図に示した様に、α−FP濃度に伴つてA415−A500が増加
し、本法が免疫測定法として極めて有効な手段となりう
る事が証明された。
この発明によると、試料中の含有量の少ない抗体または
抗原につき、抗原抗体反応により破壊されてマイクロカ
プセル内より放出されるところの、前記抗体または抗原
よりも過剰量であるマイクロカプセル内容物を有する反
応液の定量によつて、従来法におけるよりもはるかに迅
速に定量分析をすることができる。
抗原につき、抗原抗体反応により破壊されてマイクロカ
プセル内より放出されるところの、前記抗体または抗原
よりも過剰量であるマイクロカプセル内容物を有する反
応液の定量によつて、従来法におけるよりもはるかに迅
速に定量分析をすることができる。
この発明によると、前記反応液を二波長分光測光するこ
とにより定量分析しているので、遠心分離等の手数をか
けることなく簡便に分析処理を行なうことができ、しか
も、精度の高い分析を行なうことができる。
とにより定量分析しているので、遠心分離等の手数をか
けることなく簡便に分析処理を行なうことができ、しか
も、精度の高い分析を行なうことができる。
第１図は、この発明に係る二波長分光測定の原理を示す
説明図である。 第２図は、第１図における415nm及び500nmにおける二波
長吸光度差と溶血率の関係を示す説明図である。 第３図は、本発明に係る免疫測定法の原理を示す説明図
である。 第４図は、補体価測定時の溶血の経時変化を示す説明図
である。 第５図は、補体濃度（希釈系列）と反応液の吸光度差変
化量の関係を示す説明図である。 第６図は、α−FP濃度と反応液の吸光度差変化量の関係
を示す説明図である。 ……羊赤血球ケンダク液の吸収スペクトル、 ……30％溶血時の吸収スペクトル、 ……50％溶血時の吸収スペクトル ……60％ 〃 ……75％ 〃 ……100％ 〃 ……ベースライン１ ……マイクロカプセル,2……マイクロカプセル内容
物,3……抗体,4……抗原,5……補体。
説明図である。 第２図は、第１図における415nm及び500nmにおける二波
長吸光度差と溶血率の関係を示す説明図である。 第３図は、本発明に係る免疫測定法の原理を示す説明図
である。 第４図は、補体価測定時の溶血の経時変化を示す説明図
である。 第５図は、補体濃度（希釈系列）と反応液の吸光度差変
化量の関係を示す説明図である。 第６図は、α−FP濃度と反応液の吸光度差変化量の関係
を示す説明図である。 ……羊赤血球ケンダク液の吸収スペクトル、 ……30％溶血時の吸収スペクトル、 ……50％溶血時の吸収スペクトル ……60％ 〃 ……75％ 〃 ……100％ 〃 ……ベースライン１ ……マイクロカプセル,2……マイクロカプセル内容
物,3……抗体,4……抗原,5……補体。
Claims (5)
- 【請求項１】補体活性により膜溶解作用を受けるマイク
ロカプセル膜に抗原または抗体を結合するマイクロカプ
セルと補体とを少なくとも含有する試薬と、前記抗原ま
たは抗体と抗原抗体反応を生ずる抗体または抗原を有す
る試料とを混合し、この混合により反応した混合液を混
合状態のまま二波長分光測光する事により、試料中の抗
原又は抗体を定量する事を特徴とする免疫分析方法。 - 【請求項２】前記測光方法が吸光度、螢光又は発光測定
である事を特徴とする特許請求の範囲第１項に記載の免
疫分析方法。 - 【請求項３】前記試薬中のマイクロカプセル内に特定の
光学的特性を有する物質が封入されている事を特徴とす
る特許請求の範囲第１項に記載の免疫分析方法。 - 【請求項４】前記試薬中のマイクロカプセル内に封入さ
れている物質が特定の光学的特性を有する物質の前駆体
であり、マイクロカプセル外の試薬中に上述前駆体を光
学特性のある物質に変換せしめる成分を含有する事を特
徴とした特許請求の範囲第１項に記載の免疫分析方法。 - 【請求項５】前記試薬中のマイクロカプセル外に、特定
の光学的特性を有する物質の前駆体が含有され、マイク
ロカプセル内には、上述前駆体が光学特性のある物質に
変換せしめる成分が封入されている事を特徴とする特許
請求の範囲第１項に記載の免疫分析方法。
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58106345A JPH06105256B2 (ja) | 1983-06-14 | 1983-06-14 | 免疫分析方法 |
| DE8484106421T DE3463417D1 (en) | 1983-06-14 | 1984-06-05 | Immunoassay |
| EP84106421A EP0132556B1 (en) | 1983-06-14 | 1984-06-05 | Immunoassay |
| US06/618,936 US4714672A (en) | 1983-06-14 | 1984-06-08 | Immunoassays involving complement lysing of chromophore containing microcapsules |
| CA000456482A CA1223197A (en) | 1983-06-14 | 1984-06-13 | Immunoassay |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58106345A JPH06105256B2 (ja) | 1983-06-14 | 1983-06-14 | 免疫分析方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS59231451A JPS59231451A (ja) | 1984-12-26 |
| JPH06105256B2 true JPH06105256B2 (ja) | 1994-12-21 |
Family
ID=14431222
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58106345A Expired - Lifetime JPH06105256B2 (ja) | 1983-06-14 | 1983-06-14 | 免疫分析方法 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4714672A (ja) |
| EP (1) | EP0132556B1 (ja) |
| JP (1) | JPH06105256B2 (ja) |
| CA (1) | CA1223197A (ja) |
| DE (1) | DE3463417D1 (ja) |
Families Citing this family (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3501496A1 (de) * | 1985-01-18 | 1986-07-24 | Behringwerke Ag, 3550 Marburg | Verfahren zur bestimmung der aktivitaet des komplementsystems des blutes |
| US5093271A (en) * | 1986-11-28 | 1992-03-03 | Shimadzu Corporation | Method for the quantitative determination of antigens and antibodies by ratio of absorbances at different wavelengths |
| US4954435A (en) * | 1987-01-12 | 1990-09-04 | Becton, Dickinson And Company | Indirect colorimetric detection of an analyte in a sample using ratio of light signals |
| JPH0799374B2 (ja) * | 1987-02-06 | 1995-10-25 | 株式会社日立製作所 | 免疫分析用試薬およびこれを用いる免疫分析方法 |
| US4857454A (en) * | 1987-04-09 | 1989-08-15 | a Division of Yeshiva University Albert Einstein College of Medicine of Yeshiva University | Spectrophotometric method for kinetic absorbance measurements in two-phase enzyme immunoassay and apparatus therefor |
| DE69228817T2 (de) * | 1991-07-26 | 1999-09-23 | Dade Chemistry Systems Inc., Deerfield | Signalerkennungspruefung in der anwesenheit von einem suspendierten festen träger |
| WO1994017412A1 (en) * | 1993-01-27 | 1994-08-04 | Isis Innovation Limited | Assay method |
| US5874216A (en) * | 1996-02-23 | 1999-02-23 | Ensys Environmental Products, Inc. | Indirect label assay device for detecting small molecules and method of use thereof |
| CA2318127A1 (en) | 1998-01-20 | 1999-07-22 | University Of Victoria Innovation And Development Corporation | Detection of gpi anchored proteins |
| WO2009117510A2 (en) * | 2008-03-20 | 2009-09-24 | Abaxis, Inc. | Multi-wavelength analyses of sol-particle specific binding assays |
Family Cites Families (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2106754A5 (ja) * | 1970-09-23 | 1972-05-05 | Commissariat Energie Atomique | |
| US3850578A (en) * | 1973-03-12 | 1974-11-26 | H Mcconnell | Process for assaying for biologically active molecules |
| US4130634A (en) * | 1974-03-15 | 1978-12-19 | University Of Illinois Foundation | Method for detecting and quantifying antigens |
| US4235792A (en) * | 1977-04-14 | 1980-11-25 | The Governing Council Of The University Of Toronto | Immunological materials |
| US4372745A (en) * | 1979-12-19 | 1983-02-08 | Electro-Nucleonics, Inc. | Chemical luminescence amplification substrate system for immunochemistry involving microencapsulated fluorescer |
| JPS56132564A (en) * | 1980-02-04 | 1981-10-16 | Koraboreiteibu Research Inc | Product for and method of immunity analysis |
| US4342826A (en) * | 1980-02-04 | 1982-08-03 | Collaborative Research, Inc. | Immunoassay products and methods |
| US4305659A (en) * | 1980-03-06 | 1981-12-15 | Baxter Travenol Laboratories, Inc. | Photometric apparatus and method |
| US4385126A (en) * | 1980-11-19 | 1983-05-24 | International Diagnostic Technology, Inc. | Double tagged immunoassay |
| US4483921A (en) * | 1981-01-12 | 1984-11-20 | Collaborative Research, Inc. | Immunoassay with antigen or antibody labeled liposomes sequestering enzyme |
| US4517303A (en) * | 1982-10-20 | 1985-05-14 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Specific binding assays utilizing analyte-cytolysin conjugates |
-
1983
- 1983-06-14 JP JP58106345A patent/JPH06105256B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1984
- 1984-06-05 DE DE8484106421T patent/DE3463417D1/de not_active Expired
- 1984-06-05 EP EP84106421A patent/EP0132556B1/en not_active Expired
- 1984-06-08 US US06/618,936 patent/US4714672A/en not_active Expired - Fee Related
- 1984-06-13 CA CA000456482A patent/CA1223197A/en not_active Expired
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0132556A1 (en) | 1985-02-13 |
| CA1223197A (en) | 1987-06-23 |
| JPS59231451A (ja) | 1984-12-26 |
| EP0132556B1 (en) | 1987-04-29 |
| US4714672A (en) | 1987-12-22 |
| DE3463417D1 (en) | 1987-06-04 |
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