JPH06105686A - ポルフィリンモノクロ−ナル抗体構造遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 一般式（Ｉ）： 【化１】 （式中、Ｒ¹ 、Ｒ² 、Ｒ³ 及びＲ⁴ はＨまたはＣＯＯＨ
である。ただしＲ¹ ＝Ｒ ² ＝Ｒ³ ＝Ｒ⁴ ＝Ｈの場合は除
く）で示されるポルフィリンを特異的に認識するモノク
ロナ−ル抗体の構造遺伝子。 【効果】 本発明のポルフィリンモノクローナル抗体の
構造遺伝子を用いることにより、ポルフィリンモノクロ
ーナル抗体を人為的に管理された条件下で安定に生産す
ることが可能となり、かつ培養日数の大幅な短縮あるい
は生産性の大幅な上昇が可能となる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はポルフィリンモノクロー
ナル抗体の遺伝子およびポルフィリンモノクローナル抗
体に関する。

【０００２】

【従来の技術】近年、分子認識に関する研究が盛んに行
われているが、現在合成されているホスト分子は極く簡
単な低分子やイオンしか認識されず、更に大きく複雑な
分子や高分子を認識、応答するホスト分子が望まれてい
る。生体系では酵素による基質の認識、抗原抗体反応な
どの高分子による認識が行われており、非常に高い認識
特異性を有する。免疫系はその高い特異性と多様性ゆえ
にさまざまな方面に利用されている。最近、免疫系を利
用して触媒作用を示す抗体（Catalytic Antibody）が作
られている。ポルフィリンに対するモノクロナ−ル抗体
の中にはポルフィリンの金属錯体と結合することにより
吸収スペクトルが長波長にシフトしたり、また酸化酵素
活性を発現するものがあり、将来記憶素子や人工酸化酵
素として産業上の利用が期待されているものである。

【０００３】ポルフィリンの金属錯体はヘモグロビンな
どの酸化を運搬する血液蛋白やカタラ−ゼｂやP450など
の酵素の構成成分として広く生体内に存在し、エレクト
ロン輸送や過酸化水素の分解など重要な役割を果してい
る。もしこれらの機能をもつ物質を人工的に作ることが
できれば、種々の用途への応用が期待される。一方、抗
体酵素（Catalytic Antibody）と呼ばれる触媒活性を有
する抗体がラ−ナ−らあるいはシェルツらにより報告さ
れ注目を集めている（Science 234,1566(1986)）。その
理由として通常のタンパク質酵素に比べ、抗体酵素の方
が基質特異性の点で数段優れていること、安定性の点で
優れていることや適当なハプテンを用いることにより触
媒する反応や基質特異性を自由に設計できることなどが
挙げられる。これらの多くは反応の遷移状態アナログを
ハプテンとして得られる抗体であるが、補酵素などのコ
ファクタ−をハプテンとして得るこも出来る。後者の方
法の考え方によるとポルフィリンの金属錯体と特異的に
結合できる抗体が得られれば，抗体は上記の機能をもつ
可能性があることになる。

【０００４】本発明者らは既にメソーテトラキス（４−
カルボキシフェニル）ポルフィリン（ＴＣＰＰと略す
る）に対するモノクロ−ナル抗体を数種類調製し、該抗
体がＴＣＰＰのＺｎ(II)錯体と結合することが出来るこ
とを報告した（Chem.Lett., 917(1990) 。その後、その
機能および構造について検討した結果、それらの抗体の
中の一つはＴＣＰＰと結合することにより吸収スペクト
ルではＴＣＰＰのSoret帯が長波長シフトし、ＣＤスペ
クトルでは誘起コットン効果が現れる抗体や合成ポルフ
ィリンの金属錯体と結合させることにより、酸化酵素活
性を発現する抗体を見い出した（特願平3-332513号) 。
これらの抗体は以下の方法により得る。すなわち抗原で
あるＴＣＰＰとハプテンであるキ−ホ−ル・リンペット
・ヘモシアニン（ＫＬＨと略する）あるいはＢＳＡ（Bo
vine Serum albuminn ）を共有結合し、これをマウスに
投与し、これにより免疫されたマウスの脾臓細胞を取り
出してミエローマ細胞と細胞融合させて融合細胞を作製
する。この融合細胞中から一般式（Ｉ）で示されるポル
フィリンを認識する所望の抗体を産生するクロ−ンをス
クリ−ニングし、該クロ−ンを培養することにより製造
できる。

【０００５】上記の方法において単一クロ−ン化した抗
体産生株を予め約１〜２週間前にブリスタンを注射して
おいたBalb/ Ｃマウスの腹腔に注射し、２週間後腹水を
採取し硫安塩析、各種クロマトグラフィ−により精製す
る。他の方法として抗体産生細胞を無血清培地などで細
胞を拡大培養して抗体を調製する方法がある。しかしな
がらこれらのいずれの調製法も時間がかかり、また生産
される抗体量も限度があり抗体を実用的な規模で生産す
ることは困難であるという欠点を有している。そこで本
発明者らは短時間にしかも大量に生産出来、品質の安定
した抗体の生産を可能にする方法として遺伝子操作技術
で微生物による生産について鋭意検討を続けている。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的ははポル
フィリンモノクロ−ナル抗体を組み換えDNA 技術を用い
て、経済的、且つ大量に製造する新規な方法を開発する
のに必要なポルフィリンモノクロ−ナル抗体の構造遺伝
子を提供すると同時に蛋白工学手法によりポルフィリン
モノクロ−ナル抗体の性質を改変するに必要な基本とな
る構造遺伝子を提供することを目的とする。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明は一般式（Ｉ）：

【化２】 （式中、Ｒ¹ 、Ｒ² 、Ｒ³ 及びＲ⁴ はＨまたはＣＯＯＨ
である。ただしＲ¹ ＝Ｒ ² ＝Ｒ³ ＝Ｒ⁴ ＝Ｈの場合は除
く）で示されるポルフィリンを特異的に認識するモノク
ロナ−ル抗体の構造遺伝子である。

【０００８】また本発明はＬ鎖のＶL およびＣL 領域内
に、配列番号１に記載されるアミノ酸配列を含有するポ
ルフィリンモノクロ−ナル抗体またはＨ鎖のＶH および
ＣH1領域内に、配列番号２に記載されるアミノ酸配列を
含有するポルフィリンモノクロ−ナル抗体またはＦａｂ
断片内に配列番号１に記載されるアミノ酸配列および配
列番号２に記載されるアミノ酸配列を含有するポルフィ
リンモノクロ−ナル抗体である。なお、イムノグロブリ
ンＧ（ＩｇＧ）の一次構造を図１に示す。

【０００９】一般に免疫系は、病原菌に対する高等動物
の防御機構として考えられているが、非自己物質（免疫
原、抗原）が生体内に浸入するとこれを特異的に結合す
る免疫グロブリン（Ｉｇ抗体）が生産される。この免疫
グロブリンはすべて基本的に類似の構造をしており、２
本鎖の重鎖（Ｈ鎖）と２本の軽鎖（Ｌ鎖）から構成され
ている。Ｈ鎖、Ｌ鎖とも抗原との結合部位はＮ末端から
100-110 番目までのアミノ酸でそのアミノ酸配列は抗体
の特異性により変化する。そこでこの部分を可変領域
（Ｖ領域：ＶL 、ＶH ）という。Ｖ領域より後方のアミ
ノ酸配列は抗体のクラスによって一定で定常領域（Ｃ領
域：ＣL 、ＣH ）と呼ばれる（図１参照）。またＶ字形
構造の二股に分かれる根元の部分はヒンジ領域と呼ば
れ、パパインやトリプシンなどの酵素で容易に切断する
ことができる。この時に得られる抗原結合部位を有する
２つのフラグメントは、Fab フラグメントと呼ばれる。
Ｉｇ分子において抗原に認識に直接関与している部分は
可変領域であり、とりわけその領域内にある超可変領域
であると考えれている。

【００１０】本発明のポルフィリンモノクロ−ナル抗体
とは、ＴＣＣＰを特異的に認識するモノクローナル抗体
であり、以下の方法にて製造される。すなわち抗原であ
るＴＣＰＰとハプテンであるＫＬＨを共有結合し、これ
をマウスに投与して免疫されたマウスの脾臓細胞を取り
出してミエローマ細胞との融合細胞を作製する。この融
合細胞中から一般式（Ｉ）で示されるポルフィリンを認
識する所望の抗体を産生するクロ−ンをスクリ−ニング
し、該クロ−ンを培養することにより製造できる。 この
方法において単一クロ−ン化した抗体産生株を例えば予
め約１〜２週間前にブリスタンを注射しておいたBalb/
Ｃマウスの腹腔に注射し、２週間後腹水を採取し硫安塩
析、各種クロマトグラフィ−により精製する。他の方法
として抗体産生細胞を無血清培地などで細胞を拡大培養
して抗体を調製する方法がある。この融合細胞を作製
し、これにより一般式（Ｉ）で示されるポルフィリンを
認識するモノクローナル抗体を得る。

【００１１】これらの抗体は、ポルフィリンに対する解
離定数（Ｄissociation Constantsof Porphyrins ）が
異なったり、酸化酵素活性が異なるなど性質が異なる抗
体が認められる。本発明ではこれらのポルフィリンモノ
クロ−ナル抗体の一つ（13-1株産生）の構造遺伝子の取
得と塩基配列の決定に当り、次の工程を実施する。

【００１２】(a) マウスハイブリド−マ抗体産生細胞の
取得 (b) 各種細胞よりｍＲＮＡの調製 (c) ｃＤＮＡ第一鎖の合成 (d) Ｈ鎖及びＬ鎖のＰＣＲ (e) 制限酵素処理 (f）大腸菌プラスミドベクタ−によるクロ−ニングと塩
基配列決定

【００１３】以下に上記工程を詳述する。 (a) マウスハイブリド−マ抗体産生細胞の取得 ポルフィリンに対するモノクロ−ナル抗体産生細胞を作
製し、その細胞から抗体の構造遺伝子を決定するために
抗体産生細胞を以下の工程により調製する。抗体産生細
胞作製にあたりＴＣＰＰをハプテンとして用いる。まず
このポルフィリンをキヤリア−蛋白であるＫＬＨの側鎖
に結合し、これをアジュバンド（Complete Freunds Adj
uvant)と混合し、エマルジョンにしたものを抗原として
マウス（Balb/c）の腹腔内に注射する。これにより免疫
されたマウスの脾臓細胞を取り出してミエローマ細胞を
細胞融合し、融合細胞からハプテンとして用いたポルフ
ィリンを認識する抗体を、ＴＣＰＰを抗原としてEnzyme
Linked Immunosorbent Assay (ELISA) により見い出
す。それぞれの抗体産生細胞をマウスの腹腔内で増殖さ
せ、その腹水を凍結保存(-80℃）する。ｍＲＮＡ調製に
際し、それぞれの腹水を解凍し組織培養用無血清培地で
培養し細胞を回収する。

【００１４】(b) ｍＲＮＡの調製 培養細胞より常法（例えばMolecular Cloning 191 頁(1
982)）に従い、全ＲＮＡの抽出およびポリ(A)+RNA を調
製する。すなわち培養細胞のＲＮａｓｅの賦活性化とタ
ンパク質の変性作用によるＲＮＡの解離を行うため培養
細胞をグアニジウムチオシアネ−ト（ＧＴＣと略する）
およびＮ−ラウロイルザルコシンを加えホモジナイズす
る。この細胞破砕液を遠心分離し蛋白質を除去し、粗Ｒ
ＮＡを含む上澄液を得る。次にｍＲＮＡをこれより調製
する。ｍＲＮＡの3'末端に存在するポリＡ構造とこれに
相補的な塩基配列オリゴdT構造をリガンドとしてもつカ
ラムを用い、特異的な吸着と脱離でＲＮＡを精製する。
すなわち粗ＲＮＡを含む上澄液を予め活性化しておいた
オリゴ（dT）カラムに吸着させ、次に溶出させることに
よりポリ(A)+ＲＮＡを得る。

【００１５】(c)cＤＮＡ第一鎖の合成 ｃＤＮＡ第一鎖の合成には得られたポリ(A)+ＲＮＡにオ
リゴdTを付加し、これをプライマ−として逆転写酵素を
作用させることにより、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを
合成し、これを熱変性させＤＮＡ鎖を得る。

【００１６】(d) Ｈ鎖およびＬ鎖の増幅（ＰＣＲ：Ｐol
ymerase Chain Reaction） 上記(c) で得られたｃＤＮＡの第一鎖は、抗体のＬ鎖及
びＨ鎖をコ−ドしている遺伝子である。近年、抗体の研
究によりＬ鎖およびＨ鎖はモノクロ−ナル抗体の種類に
かかわらず、すべての抗体にはよく保存されているアミ
ノ酸配列を構成している領域があることが判っている。
この知見を利用してモノクロナ−ル抗体を免疫された脾
臓やリンパ節からの血球や組織から遺伝子操作手法で選
抜出来るようになってきている。すなわち下記方法がモ
ノクロナ−ル抗体産生細胞の作製のためのスクリ−ニン
グに通常、使用されている。マウスやヒトのリンパ球を
精製し細胞を融解した後、ｍＲＮＡを分離する。分離ｍ
ＲＮＡをオリゴ(dT)プライマ−でｃＤＮＡ鎖を合成す
る。次にＨ鎖およびＬ鎖に特異的な増幅プライマ−でＰ
ＣＲを行い、ｃＤＮＡ断片を増幅する。このように増幅
したＨ鎖増幅産物をプ−ルし、Ｈ鎖ベクタ−(Stratacyt
e 社製）にライゲ−ションする。同様にＬ鎖増幅産物を
プ−ルし、Ｌ鎖ベクタ−にライゲ−ションする。これを
ラムダファ−ジパッケ−ジングし、シャーレにプレ−テ
イングし、ライブラリ−を得る。Ｈ鎖ライブラリ−から
のファ−ジＤＮＡを制限酵素で切断（ストラタジ−ン社
の場合 EcoRI，HindIII)する。同様にＬ鎖ライブラリ−
からのファ−ジＤＮＡを制限酵素（ストラタジ−ン社の
場合 EcoRI, MluI）で消化する。Ｈ鎖とＬ鎖産物を結合
し、コンビネ−ションライブラリ−を作成した後、抗原
結合蛋白のためのスクリ- ニングにはパッケ−ジング、
プレ−テイングの操作を経て、発現させることによりス
クリ−ニングする方法である（ImmunoZap TM Cloninng
and Expression System, Stratacyte 社）。この方法は
1000万個のクロ−ンが１週間以内にスクリ−ニングさ
れ、従来のハイブリド−マ法に比較してスクリ−ニング
されるクロ−ン数を大幅に増加できる長所を有してい
る。

【００１７】本発明では、この方法を利用しＨ鎖および
Ｌ鎖の増幅をおこなう。すなわち、Ｌ鎖の増幅のため5'
側プライマ−としてＶL(κ) （表３に記載）、3'側プラ
イマ−としてＣL(κ) （表３に記載）を用いてＰＣＲを
行った．またＨ鎖の増幅には3'側プライマ−としてＣH1
(γ1)（表４に記載）を使用し、5'側プライマ−として
ＶHa、ＶHb、ＶHc、ＶHdの４種のプライマ−（表４に記
載）を用いて通常の方法でＰＣＲを行った。

【００１８】(e) 制限酵素処理 ＰＣＲ法により増幅したＤＮＡ鎖においてＬ鎖領域の両
側にある制限酵素サイトをもつ酵素（例えばSacIとXba
I）で処理して、切断反応物をアガロ−ス電気泳動を行
い、約700 塩基対のDNA 断片を抽出する（図２参照）。
抽出断片ＤＮＡをImmunoZapLベクタ−とライゲ−ション
し、Giga Pack Gold Kit(Stratagene 社製）を用いてパ
ッケケ−ジングを行う。次に大腸菌 XL-1Blue に形質導
入しファ−ジミドＤＮＡをアルカリ抽出により調製し、
再度制限酵素（例えばSacI-XbaI ）で処理する。切断反
応産物をアガロ−ス電気泳動し切り出されたＤＮＡ断片
を抽出する。Ｈ鎖についても同様にＰＣＲ法で増幅した
ＤＮＡ断片の中のＨ鎖を適切な制限酵素（例えばXhoIお
よびSpeI）で制限酵素処理を行い切り出す（図３参
照）。この消化反応物を次にアガロ−ス電気泳動を行い
ＤＮＡ断片を抽出する。さらにImmunoZap Ｈベクタ−と
ライゲ−ションしてＬ鎖と同様にパッケ−ジング、大腸
菌XL-Blue 形質導入、ファ−ジミド取り出し、DNA アル
カリ抽出、制限酵素（例えばXhoIおよびSpeI）処理、ア
ガロ−ス電気泳動によるＤＮＡ断片の単離を行う。

【００１９】(f) 大腸菌プラスミドベクタ−クロ−ニン
グと塩基配列決定 Ｈ鎖、Ｌ鎖各クロ−ン共に通常のシ−ケンス方法、ここ
ではM13mp18 およびM13mp19 にサブクロ−ニングし、一
本鎖シ−ケンス法により塩基配列を決定する。

【００２０】

【発明の効果】本発明の構造遺伝子は発現ベクタ−に挿
入して適当な宿主細胞において発現させ得る組み換えプ
ラスミドを調製し、宿主細胞を形質転換して組換え宿主
細胞（形質転換体）を得、本発明の構造遺伝子を発現さ
せ得る条件下で前記組換え宿主細胞（形質転換体）を培
養してポルフィリンモノクロ−ナル抗体を産生させ、回
収させることができる。すなわち本発明のポルフィリン
モノクロ−ナル抗体の構造遺伝子、該遺伝子を含有する
組換えプラスミドで宿主細胞を形質転換させた形質転換
体を用いることにより、ポルフィリンモノクロ−ナル抗
体を人為的に管理された条件下で安定に生産することが
可能になり、かつ培養日数の大幅な短縮あるいは生産性
の大幅な上昇が可能となる。また本発明の構造遺伝子を
塩基配列の変更により目的の性質を有する抗体への改変
が可能となる。

【００２１】

【実施例】以下、実施例を用いて本発明を詳しく説明す
る。 実施例１ （１）ハイブリド−マ細胞（ポルフィリンモノクロ−ナ
ル抗体産生細胞）の培養抗ポルフィリンモノクロ−ナル
抗体産生細胞の作成については既に前記した方法で作成
した。即ち、ＴＣＰＰをハプテンとして用いた。まずこ
のポルフィリンをキヤリアー蛋白であるＫＬＨの側鎖に
1,1'- カルボニルジイミダゾールを用いて共有結合し、
これをコンプリート・フロインド・アジュバンドと混合
し、懸濁化したものを抗原としてマウス（Balb/C) 腹腔
内に注射した。これにより免疫されたマウスの脾細胞を
取り出してミエローマ細胞を融合し、融合細胞からハプ
テンとし用いたポルフィリンを認識する抗体をＴＣＰＰ
を抗原としてELISA により５種類見出し、それぞれを凍
結して保存した。ここでは抗ポルフィリン抗体産生細胞
のひとつ13-1株（-800C 冷凍保存）を以下の方法で培養
した。即ちセラムチュ−ブ内に約１ml冷凍保存しておい
た抗体産生細胞を３７℃の温浴中で解凍した。次にこれ
を滅菌済みの遠心管に移し、ゲンタマイシン・サルフェ
ート５０μg/ml含むセルグロッサ−Ｈ（組織培養無血清
培地、住友製薬製）溶液１０mlと混合した後、遠心分離
（1000rpm,５分）し、アスピレ−タ−で上澄液を除去し
た。この操作を再度繰り返した後に、セルグロッサ−Ｈ
溶液３０mlを添加し約１０mlずつ３枚のシャ−レ（組織
培養用、外径ｘ高さ＝94×21：岩城硝子 25020 DISH100
N ）に分注し、３７℃、５％ＣＯ₂ で３日インキュベ−
トした。更にこの培養液から新たにシャ−レに植え継ぎ
を行い、細胞が十分に増殖したプレ−トの培養液をアス
ピレ−タ−で除き、浮遊している死細胞を除去した。こ
の細胞をもとにプレ−トに約１０mlのセルグロッサ−Ｈ
溶液を加え、プレ−ト１６枚まで拡大培養した。全ての
プレートが十分増殖したところで細胞を遠心分離により
回収した。

【００２２】（２） ｍＲＮＡの調製 (1) 細胞破砕と全ＲＮＡの抽出 遠心分離により回収した細胞に１．５mlの抽出用緩衝液
（グアニジウム・チオシアネート、N-ラウロイル・ザル
コシン) を加え、２６−Ｇの針を取り付けたシリンジで
溶液を出し入れすることによりホモジナイズした。この
ホモジナイズ液に溶出用緩衝液（10 mM Tris-HCl(pH7.
4), 1mM EDTA)３mlを加え、簡単にホモジナイズ後、滅
菌したポリプロピレンのチュ−ブに移し，遠心分離（1
0,000rpm,５分間）して上清を回収した。

【００２３】(2) ｍＲＮＡの精製 上記の方法で得た全ＲＮＡ抽出液をオリゴ(dT)- セルロ
ース・スパン・カラム(Quick PrepTM mRNA精製用キッ
ト、Pharmacia 社) にチャ−ジした後、カラムの頭に蓋
をして１０分間振とうした。その後遠心分離（350G,2
分）を行ない、上澄をデカンテ−ションにて除いた。次
に高塩緩衝液（10mM Tris-HCl(pH7.4),1mM EDTA,0.5M N
aCl)を注入し、軽く振とう後、遠心分離（350G,2分）を
行い、上清をデカンテ−ションにて除いた。更にカラム
の蓋をとり低塩緩衝液（10mM Tris-HCl(pH7.4), 1mM ED
TA, O.1M NaCl)３mlを注入し、軽く振とう後、遠心分離
(350G,２分間）し、緩衝液を除いた。次に滅菌した１.
５ml容スクリュー・トップエッペンチュ−ブを遠心管内
に入れ、その上にカラムの下部がエッペン管の開口部に
入るように置いて、６５℃でインキュベ−トしておいた
溶出用緩衝液（10mM Tris-HCl(pH7.4),1mM EDTA)２５０
μl をカラムの上から注入し、遠心分離(350G,２分）し
溶出させた。その操作をさらに２回行った。回収したｍ
ＲＮＡの定量は、２６０ nμにおける吸光度（Ａ２６
０）を測定することにより行なった。 ［ＲＮＡ濃度］＝（Ａ２６０）×４０μg/ml 尚、調製したサンプルは、グリコ−ゲン溶液（10mg/ml
DEPC処理水）１０μl と１／１０量の酢酸カリ溶液 (2.
5M酢酸カリウム(pH5.0))および２〜２．５倍量のエタノ
−ルを加え、−８０℃にて保管した。

【００２４】この方法で得られたＲＮＡ量は次の様であ
る。

【表１】

【００２５】（３）ｃＤＮＡ合成 13-1株から得られたＲＮＡ(8.3μg)をエッペンドルフチ
ュ−ブ（オ−トクレ−ブ済み）中で蒸留水を加えて溶解
させ、オリゴ(dT)18プライマ−４μl(400mg)を加え、６
５℃、５分加温した後、室温で４５分間放置した。更に
この混合液にさらに下記の試薬を加えた。 10×１本鎖ｃＤＮＡ合成緩衝液 10 μl 40U/μl ヒト胎盤由来リボクヌクレアーゼ阻害剤 10 μl (400単位） 10 mM ｄＮＴＰ 5 μl (50 nmol） 逆転写酵素（Life Sciences 社 AMVRTxL) 2 μl

【００２６】この反応混合液を４１℃、９０分間加温し
酵素反応を行った。尚、合成されたｃＤＮＡ量の推定は
次のように行なった。即ち、反応液を５μl取り、これ
に〔³²Ｐ〕ｄＣＴＰ０．５μl を加え、反応を行った。
反応後、４０℃に冷却し反応を停止させた。反応の進行
をモニタ−するための〔³²Ｐ〕ｄＣＴＰの取り込みの測
定は、反応終了後の反応液をワットマンＧＦ／Ｃフィル
タ−２枚それぞれに反応液１μl を滴下し、そのうち１
枚は風乾後、シンチレ−ション液に浸し，全〔³²Ｐ〕ｄ
ＣＴＰをカウントした。他の一枚は５％ＴＣＡ／２０mM
ピロリン酸ナトリウム、蒸留水、エタノ−ルの順でフィ
ルタ−の洗浄をおこない、ｃＤＮＡを取り込まれた〔³²
Ｐ〕ｄＣＴＰをカウントすることにより反応の進行を推
定した。合成されたｃＤＮＡ量は、０．１７μg であっ
た。

【００２７】（４）ＰＣＲによる増幅 次に、調製されたｃＤＮＡの第一鎖のＰＣＲによる増幅
をImmunoZapTM クロ−ニングキット（Stratatacyte社
製）を用いて行った。 (1)抗体遺伝子の確認 まずモノクロナ−ル抗体遺伝子が上記の方法で取得され
ていることを確認するため、コントロール実験として抗
体遺伝子構造の中でよく保存性の高いＣH₂,ＣH₃領域を
プライマ−ＣH₂，ＣH₃（IgG1用プライマ−）を用いて増
幅することを確認した（表２）。

【００２８】増幅用反応組成として下記の組成を使用し
た。 第一鎖合成反応液 5 μｌ 2mM dNTPs 10 μｌ プライマー（CH₂ ，CH₃ ） 1.5 μｌ 10 xレプリゼム緩衝液 10 μｌ 蒸留水 71.5 μｌ この反応混合液を９４℃、５分処理した後、５４℃、５
分保温し、次にレプリゼムTM０．５μl(25 Units) （Ep
icentre 社製、耐熱性 DNAポリメラーゼ）を加え、（72
℃で３分間処理、93℃で1.5 分間処理、54℃で2.5 分間
処理）を３９サイクル繰り返した後、７２℃、１０分放
置後、４０℃に冷却した。このＰＣＲによる増幅の結
果、13-1株については、５９５bpのＣH₂−ＣH₃のＰＣＲ
産物と考えられるバンドが確認され、抗体遺伝子が取得
されていることが判明した。

【００２９】

【表２】

【００３０】(2) Ｌ鎖の増幅 Ｌ鎖のＰＣＲは、抗体遺伝子の確認実験と同じ条件で行
なった。即ち5'側プライマ−としてＶL(κ)（表３に記
載）を用い、3'側プライマ−としてＣL(κ)（表３に記
載）を用いてＰＣＲを行なった。また13-1株の抗体遺伝
子については該抗体蛋白のＮ末端アミノ酸配列が決定さ
れているので、5'側プライマ−として以下に示すような
オリゴマ−ＶL(κ)・１３−１（表３に記載）を使用し
てＰＣＲを行った。その結果、目的領域のＤＮＡ断片の
増幅が見られた。

【００３１】

【表３】

【００３２】(3) Ｈ鎖の増幅 Ｈ鎖の増幅も抗体遺伝子の確認実験と同様に行なった。
3'側プライマ−としてＣH1( γ1)（表４に記載）を用
い、5'側プライマーとしてＶHa〜ＶHdの４種のプライマ
−（表４に記載）を用いてＰＣＲを行なった結果、ＶHb
−ＣH1 (γ1)のプライマ−（表４に記載）で増幅した場
合に抗体遺伝子の増幅が見られた。

【００３３】

【表４】

【００３４】（５） 制限酵素処理とクロ−ニング (1) Ｌ鎖増幅産物の制限酵素処理とクロ−ニング Ｌ鎖の増幅で得られたＰＣＲ産物(PCR反応液を全量フェ
ノ−ル／クロロホルム抽出、エタノ−ル沈殿を行い電気
泳動をかけ、目的バンドでGene CleanIIキットで回収し
蒸留水に溶解させたもの）を下記の条件で制限酵素で消
化した。 L 鎖PCR 産物 25 μl 10×Ｔ緩衝液 20 μl O.1%ＢＳＡ 20 μl SacI(12 u/ul) 6 μl(60 U) XbaI(8 u/ul) 7.5 μl(60 U) 蒸留水 147.5 μl 計 200 μl 上記反応混合液を３７℃、２０分間反応させた後、反応
液を１．５％アガロ−スゲル電気泳動をおこなった。電
気泳動後、約７００bpのＤＮＡ断片をゲル抽出用キット
（BIO-101 社、Gene CleanIIキット) を用い抽出した。

【００３５】次に調製したＤＮＡ断片を次の操作でImmu
noZAP L ベクタ−（図２）にライゲ−ションした。 ImmunoZAP L ベクター（１μg/μl) 1 μl (1μg) XbaI-SacI DNA フラグメント(0.1μg/μl) 0.3 μl (0.03 μg) T4 DNAライゲース(1U/μl) 0.5 μl (0.5 U) 5 ×ライゲーション緩衝液 2 μl 蒸留水 6.2 μl 計 10 μl

【００３６】上記反応混合液で反応温度４℃で終夜反応
させた。反応後ラムダＤＮＡインビトロパッケ−ジング
キット（Giga Pack Gold Kit,stratagene 社）を用いて
パッケ−ジングし、次に大腸菌 XL-1 Blueに感染させ、
得られたプラ−クをＳＭ緩衝液（NaCl 5.8g/l, MgSO₄
2.0g/l, 1M Tris-HCl(pH7.5)50ml/l, 2% ゼラチン 5ml/
l）：クロロホルム＝２５：１を５００μl に懸濁して
λファ−ジのストックを得た。大腸菌 XL-1 Blueに５０
μl のファ−ジストック液（1X10⁵pfu）をヘルパ−ファ
−ジR408(1X10³pfu ）とを二重感染させ、３７℃で３時
間培養した。この培養液を７０℃、２０分間の処理し遠
心分離し、その上清にブルースクリプトの１本鎖を得
た。この１本鎖ブルースクリプトを用いて大腸菌 XL-Bl
ueを形質転換し、２本鎖ブルースクリプトをもつ菌体を
得た。本菌体よりアルカリ法に従いファ−ジミドＤＮＡ
を抽出した。この調製したＤＮＡを再びXba Ｉ及びSac
Ｉで処理した反応液を前記と同様に１．５％アガロ−ス
電気泳動し約７００bpのＤＮＡ断片を抽出した（図２参
照）。

【００３７】(2) Ｈ鎖増幅産物の制限酵素処理とクロ−
ニング Ｈ鎖の増幅で得られたＰＣＲ産物を下記の条件で制限酵
素で消化した。 H 鎖ＰＣＲ産物 25 μl 10×Ｋ緩衝液 20 μl XhoI(12u/ul) 5 μl(60 U) SpeI(10 u/ul) 6 μl(60 U) 蒸留水 144 μl 計 200 μl 上記反応混合液をＬ鎖の場合と同様に、反応温度３７℃
で２時間反応させた。反応後Ｌ鎖の場合と同様に約700b
pのＤＮＡ断片をゲル抽出し、Immuno ZAP Ｈベクター
（図３）にライゲーション反応後、ラムダＤＮＡインビ
トロパッケ−ジングキット（Giga Pack Gold Kit,strat
agene 社）を用いてパッケ−ジングし、次に大腸菌 XL-
1 Blueに感染させ培養液5ml を遠心分離し、上澄みにフ
ァ−ジをえた。以後、Ｌ鎖増幅産物の制限酵素処理とク
ロ−ニングと同様に２本鎖ブルースクリプトをもつ菌体
を得た。本菌体よりアルカリ法に従い、ファ−ジミドＤ
ＮＡを抽出した。この調製ＤＮＡを再びXhoIおよびSpeI
で処理した反応液を使用して、前記と同様１．５％アガ
ロ−ス電気泳動し約７００bpのＤＮＡ断片を抽出した
（図３参照）。

【００３８】（６）大腸菌プラスミドベクタ−へのサブ
クロ−ニングとシ−ケンス (1) 大腸菌プラスミドベクタ−へのサブクロ−ニング Ｌ鎖については５−(1) 調製したＤＮＡ断片をM13mp18,
M13mp19 のXbaI-SacIサイトに常法に従いサブクロ−ニ
ングした。Ｈ鎖についても５−(2) で調製したDNA 断片
を同様にM13mp18,M13mp19 のXhoI-SpeI サイトにサブク
ロ−ニングした。このようにサブクロ−ニングしたプラ
スミドより１本鎖シ−ケンス法により塩基配列を決定し
た。シ−ケンスはシ−ケネ−ス Ver.2.0７-Deaza-dGTP
キット（USB 社製）およびＴ７シ−ケンシング・キット
（Pharmacia 社）を用いて決定した。

【００３９】以上の方法により塩基配列が得られ、図２
および図３に示しようにＬ鎖、Ｈ鎖いずれにも、可変領
域、定常領域によく保存されている領域が認められた。

【００４０】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：612 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｍＲＮＡ 起源 生物名：マウス 株名：ポルフィリンモノクローナル抗体産生細胞１３−
１株 配列の特徴： 特徴を表す記号：domain 存在位置：1..291 特徴を決定した方法：Ｅ 他の情報：ＶL ドメイン 特徴を表す記号：domain 存在位置：316..624 特徴を決定した方法：Ｅ 他の情報：ＣL ドメイン 配列 GCT TCT TTG GCT GTG TCT CTG GGG 24 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 CAG AGG GCC ACC ATC TCA TGC AGG GCC AGC AAA AGT GTC AGT GCA TCT 72 Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Ala Ser 20 25 30 GGC TAT ATT TAT ATG CAC TGG TAC CAA CAG AAA CCA GGA CAG CCA CCC 120 Gly Tyr Ile Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 AAA CTC CTC ATC TCT CTT GCA ACC AAC CTA GAA TCT GGG GTC CCT GCC 168 Lys Leu Leu Ile Ser Leu Ala Thr Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala 50 55 60 AGG TTC AGT GGC TCT GGG TCT GGG ACA GAC TTC ACC CTC AAC ATC CAT 216 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His 65 70 75 80 CCT GTG GAG GAG GAG GAT GTT GCA ACC TAT TAC TGT CAG CAC AGT AGG 264 Pro Val Glu Glu Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg 85 90 95 GAG CTT CCG CTC ACG TTC GGT GCT GGG ACC AAG CTG GAG CTG AAA CGG 312 Glu Leu Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg 100 105 110 GCT GAT GCT GCA CCA ACT GTA TCC ATC TTC CCA CCA TCC AGT GAG CAG 360 Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln 115 120 125 TTA ACA TCT GGA GGT GCC TCA GTC GTG TGC TTC TTG AAC AAC TTC TAC 408 Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr 130 135 140 CCC AAA GAC ATC AAT GTC AAG TGG AAG ATT GAT GGC AGT GAA CGA CAA 456 Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln 145 150 155 160 AAT GGC GTC CTG AAC AGT TGG ACT GAT CAG GAC AGC AAA GAC AGC ACC 504 Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 165 170 175 TAC AGC ATG AGC AGC ACC CTC ACG TTG ACC AAG GAC GAG TAT GAA CGA 552 Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg 180 185 190 CAT AAC AGC TAT ACC TGT GAG GCC ACT CAC AAG ACA TCA ACT TCA CCC 600 His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro 195 200 205 ATT GTC AAG AGC 612 Ile Val Lys Ser 210

【００４１】配列番号：２ 配列の長さ：615 配列の型：核酸 鎖の数：２本鎖 トポロジ−：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｍＲＮＡ 起源 生物名：マウス 株名：ポルフィリンモノクロ−ナル抗体産生細胞１３−
１株 配列の特徴 特徴を表す記号：domain 存在位置：1..315 特徴を決定した方法：Ｅ その他の情報：ＶH ドメイン 特徴を表す記号： 存在位置：316..615 特徴を決定した方法：Ｅ その他の情報：ＣH ドメイン 配列 GGA GGC TTG GTG AGG CCT GGA AAT 24 Gly Gly Leu Val Arg Pro Gly Asn 5 TCT CTG AAA CTC TCC TGT CTT ACC TCG GGG TTC ACT TTC AGT AAC TAC 72 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Leu Thr Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 10 15 20 CGG ATG CAC TGG CTT CGC CAG CCT CCA GGG AAG AGG CTG GAG TGG ATT 120 Arg Met His Trp Leu Arg Gln Pro Pro Gly Lys Arg Leu Glu Trp Ile 25 30 35 40 GCT GTA ATT ACA GTC AAA TCT GAT AAT TAT GGA GCA AAA TAT GCA GAG 168 Ala Val Ile Thr Val Lys Ser Asp Asn Tyr Gly Ala Lys Tyr Ala Glu 45 50 55 TCT GTG AGA GGC AGA TTC ACT ATT TCA AGA GAT GAT TCA AAA AGC AGT 216 Ser Val Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ser 60 65 70 GTC TAC CTG CAG ATG AAC AGA TTA AGA GAG GAA GAC ACT GCC ACT TAT 264 Val Tyr Leu Gln Met Asn Arg Leu Arg Glu Glu Asp Thr Ala Thr Tyr 75 80 85 TAC TGT TGT AGA ACC CCC TGG GTC TAT GCT ATG GAC TGC TGG GGT CAA 312 Tyr Cys Cys Arg Thr Pro Trp Val Tyr Ala Met Asp Cys Trp Gly Gln 90 95 100 GGA ACC TCA GTC ATC GTC TCC TCA GCC AAA ACG ACA CCC CCA TCT GTC 360 Gly Thr Ser Val Ile Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val 105 110 115 120 TAT CCA CTG GCC CCT GGA TCT GCT GCC CAA ACT AAC TCC ATG GTG ACC 408 Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr 125 130 135 CTG GGA TGC CTG GTC AAG GGC TAT TTC CCT GAG CCA GTG ACA GTG ACC 456 Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr 140 145 150 TGG AAC TCT GGA TCC CTG TCC AGC GGT GTG CAC ACC TTC CCA GCT GTC 504 Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 155 160 165 CTG CAG TCT GAC CTC TAC ACT CTG AGC AGC TCA GTG ACT GTC CCC TCC 552 Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser 170 175 180 AGC ACC TGG CCC AGC GAG ACC GTC ACC TGC AAC GTT GCC CAC CCG GCC 600 Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala 185 190 195 200 AGC AGC ACC AAG GTG 615 Ser Ser Thr Lys Val 205

【図面の簡単な説明】

【図１】イムノグロブリンＧ（ＩｇＧ）の一次構造を示
す。

【図２】Immuno ＺＡＰ Ｌベクターを示す。

【図３】Immuno ＺＡＰ Ｈベクターを示す。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｋ 15/28 8517−4Ｈ Ｃ１２Ｎ 5/20 15/06 (Ｃ１２Ｎ 15/12 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） 8931−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｃ

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 一般式（Ｉ）： 【化１】 （式中、Ｒ¹ 、Ｒ² 、Ｒ³ 及びＲ⁴ はＨまたはＣＯＯＨ
   である。ただしＲ¹ ＝Ｒ ² ＝Ｒ³ ＝Ｒ⁴ ＝Ｈの場合は除
   く）で示されるポルフィリンを特異的に認識するモノク
   ロナ−ル抗体の構造遺伝子。
2. 【請求項２】 Ｌ鎖のＶL およびＣL 領域内に、配列番
   号１に記載される塩基配列を含有する請求項１記載のモ
   ノクロナ−ル抗体構造遺伝子。
3. 【請求項３】 Ｈ鎖のＶH およびＣH1領域内に、配列番
   号２で記載される塩基配列を含有する請求項１記載のモ
   ノクロナ−ル抗体構造遺伝子。
4. 【請求項４】 Ｌ鎖のＶL およびＣL 領域内に、配列番
   号１に記載されるアミノ酸配列を含有するポルフィリン
   モノクロ−ナル抗体。
5. 【請求項５】 Ｈ鎖のＶH およびＣH1領域内に、配列番
   号２に記載されるアミノ酸配列を含有するポルフィリン
   モノクロ−ナル抗体。
6. 【請求項６】 Ｆａｂ断片内に配列番号１に記載される
   アミノ酸配列および配列番号２に記載されるアミノ酸配
   列を含有するポルフィリンモノクロ−ナル抗体。