JPH08252090A - 遺伝子 - Google Patents

遺伝子

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JPH08252090A
JPH08252090A JP7057461A JP5746195A JPH08252090A JP H08252090 A JPH08252090 A JP H08252090A JP 7057461 A JP7057461 A JP 7057461A JP 5746195 A JP5746195 A JP 5746195A JP H08252090 A JPH08252090 A JP H08252090A
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JP
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cka
chain
gene
subunit
monoclonal antibody
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JP7057461A
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Hiromasa Shirai
宏政 白井
Tadao Suzuki
直生 鈴木
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Unitika Ltd
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Unitika Ltd
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Abstract

(57)【要約】 【構成】 配列表の配列番号１で示される塩基配列を有
することを特徴とするクレアチンキナーゼＭサブユニッ
トを阻害し、Ｍ’サブユニットを阻害しないＣＫＡ−５
モノクローナル抗体のＨ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子。 【効果】 抗原認識部位のアミノ酸配列が推測され、構
造の解明、遺伝子レベルでの保存、遺伝子工学的手法に
よるＣＫＡ−５モノクローナル抗体の改変が可能とな
る。さらに、本発明の遺伝子を用いることにより、従来
のＣＫＡ−５モノクローナル抗体よりも微量のタンパク
量でクレアチンキナーゼＭサブユニットを阻害すること
のできるＣＫＡ−５の組換え体を大量に調製することが
可能となる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、新規な遺伝子に関する
ものであり、さらに詳しくは、心筋梗塞の早期診断に用
いられている、クレアチンキナーゼＭサブユニットを阻
害し、かつＭ’サブユニットを阻害しないＣＫＡ−５モ
ノクローナル抗体（以下、単にＣＫＡ−５モノクローナ
ル抗体という。）のＶ領域の遺伝子に関するものある。
【０００２】
【従来の技術】生体液中、特に血清中のクレアチンキナ
ーゼ（以下、ＣＫと略す。）活性の測定は筋疾患の診断
に有用であるが、中でも心筋梗塞の診断において重要で
あり、日常的に測定されている。ＣＫには２つのサブユ
ニットの組合せによりＣＫ−ＭＭ，ＣＫ−ＭＢ，ＣＫ−
ＢＢの３つのアイソザイムが存在することが知られてお
り、ＣＫ−ＭＢは心筋に、ＣＫ−ＢＢは主に脳及び腎等
の臓器に存在している。この中で、ＣＫ−ＭＢは心筋に
特異的に存在するので、その特異的測定は心筋梗塞の診
断において特に有用なマーカーであることが明らかにさ
れている。そのため、ＣＫ−ＭＢを特異的に測定する試
薬がいくつか提案されており、その中でも、免疫阻害法
がもっともよく用いられている。すなわち、ＣＫ−ＭＭ
及びＭＢ中のＭサブユニットを特異的に阻害する抗体を
加えてＭサブユニットを完全に阻害し、残ったＢサブユ
ニットの活性を測定する方法（特公昭５６−１９２３９
号公報、特公昭５８−２０２７４号公報参照）である。
また最近、心臓や骨格筋等から心筋梗塞や筋疾患により
血中に逸脱したＣＫ−ＭＭ及びＭＢ中のＭサブユニット
は、血漿中のカルボキシペプチダーゼＮによる分解を受
けて、Ｍ’サブユニットに修飾されていくことが明らか
にされた〔例えば、ジャーナル オブバイオロジカルケ
ミストリー（J. Biol. Chem.）２５９巻、２６６７頁
（１９８４年）参照〕。すなわち、ＣＫ−ＭＭは、ＭＭ
3 （組織型、ＭＭ）からＭＭ2（ハイブリッド型、Ｍ
Ｍ’）を経てＭＭ1 （血清型、Ｍ’Ｍ’）と変化してい
く（Ｍ’は修飾されたサブユニットを示す）。さらに、
平常時はＭＭ3 ／ＭＭ1 の値が０．３前後であるのに対
し、心筋梗塞の場合は発作後３〜６時間でＭＭ3 ／ＭＭ
1 の値が上昇し、２前後の値を示すことが明らかになっ
た〔例えば、サーキュレーション（Circulation ）７１
巻、３６３頁（1985年）参照〕。このため、このＭＭ3
／ＭＭ1 の値を測定することにより、心筋梗塞の早期診
断が可能である。
【０００３】このＭＭ3 ／ＭＭ1 を短時間で測定する方
法としては、特開昭６２−１０４５９８号公報に記載さ
れているようなクレアチンリン酸を含むＣＫ定量用試薬
を用いて総ＣＫ活性を測定し、次に特開平１−２５７２
６６号公報に記載されているＣＫ−Ｍサブユニットを阻
害し、かつＭ’サブユニットを阻害しない（すなわち、
ＭＭ3 を阻害し、ＭＭ1 を阻害しない）ＣＫＡ−５モノ
クローナル抗体を含んだＣＫ活性測定用試薬を用いた免
疫阻害法で残存活性（ＣＫアイソフォーム活性：Ｍ
Ｍ1 ）を測定する方法がある。また、我々はさらに短時
間で総ＣＫ活性とＣＫアイソフォーム活性を測定するた
め、総ＣＫ活性を測定した直後に、ＣＫＡ−５モノクロ
ーナル抗体を添加することによって、総ＣＫ活性とＣＫ
アイソフォーム活性を同時に測定することを可能とした
（特開平２−２１６６８３号公報参照）。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】この心筋梗塞の早期診
断を可能にしたＣＫＡ−５モノクローナル抗体は、従
来、ＣＫＡ−５モノクローナル抗体産生能を有するハイ
ブリドーマを培養することにより得られてきたが、一般
にモノクローナル抗体産生細胞は、長期間培養を繰り返
すと抗体産生能の低下を生じることが知られており、ま
た生産性も低い。この問題点を解決するために抗体遺伝
子をクローニングした後、遺伝子レベルでの長期保存を
行ったり、バクテリアや酵母等に遺伝子導入することに
よって大量発現させること等が行われている。このよう
に、遺伝子工学的手法により生産するためにはその遺伝
子の分離、さらにはその構造の解明が重要である。しか
し、ＣＫＡ−５モノクローナル抗体は、抗体クラスがＩ
ｇＧ、サブクラスがγ１であることが明らかにされてい
るだけで、このモノクローナル抗体を構成するＬ鎖とＨ
鎖、さらには抗原を特異的に認識し、結合するＶ領域の
遺伝子構造については全く知られていない。
【０００５】本発明は、抗原確認部位のアミノ酸配列が
推測され、構造の解明、遺伝子レベルでの保存、遺伝子
工学的手法によるＣＫＡ−５モノクローナル抗体の改変
が可能となるＣＫＡ−５モノクローナル抗体のＶ領域の
遺伝子を提供することを目的とするものである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、このよう
な課題を解決するために鋭意研究の結果、ＣＫＡ−５モ
ノクローナル抗体のＨ鎖及びＬ鎖のＶ領域の遺伝子を単
離し、その遺伝子のＤＮＡ塩基配列を解明することによ
り、本発明に到達した。すなわち、第１の発明は配列表
の配列番号１に示される塩基配列を有することを特徴と
するＣＫＡ−５モノクローナル抗体のＨ鎖Ｖ領域の遺伝
子を要旨とするものである。また、第２の発明は配列表
の配列番号２で示される塩基配列を有することを特徴と
するＣＫＡ−５モノクローナル抗体のＬ鎖Ｖ領域の遺伝
子を要旨とするものである。
【０００７】以下、本発明を詳細に説明する。本発明の
ＣＫＡ−５モノクローナル抗体のＨ鎖Ｖ領域及びＬ鎖Ｖ
領域の遺伝子は、ＣＫＡ−５モノクローナル抗体を産生
するマウスハイブリドーマＣＫＨ−５（ＦＥＲＭ Ｐ−
９８３９）よりｍＲＮＡを抽出、精製し、逆転写酵素に
よりｃＤＮＡを合成した後、ＰＣＲ（酵素的ＤＮＡ増
幅）法によってこのｃＤＮＡを増幅し、クローニングす
ることによって得ることができ、さらにこの遺伝子の塩
基配列を解析した。
【０００８】以下、これらの工程についてさらに詳細に
説明する。 （１）ｍＲＮＡの単離精製 本発明において使用される細胞としては、抗ＣＫ−Ｍ抗
体産生マウスリンパ球とマウスミエローマ細胞を融合さ
せたハイブリドーマが挙げられ、具体的には、特開昭６
３−４９０９５号公報に記載されている、単一の抗原決
定基を認識する抗ＣＫ−Ｍ活性阻害モノクローナル抗体
を定常的に生産するＣＫＨ−５ハイブリドーマである。
このＣＫＨ−５ハイブリドーマは、昭和６３年１月２６
日に通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所（現在
の生命工学工業技術研究所）に寄託の手続きを行い、微
工研菌寄第９８３９号（ＦＥＲＭ Ｐ−９８３９）とし
て受け入れられている。次に、このようなハイブリドー
マを適当な条件下、例えば３７℃、炭酸ガス濃度５％で
培養増殖させ、得られた細胞を遠心分離によって集めた
後、細胞から常法、例えばファヴァロロ（Favaloro）等
の方法〔メソッズ イン エンザイムロジー（Methods
in Enzymology ）、６５巻、７１８頁 (1980）〕により
全核酸を抽出し、次いで、これを常法、例えばオリゴｄ
Ｔセルロース等を用いた吸着クロマトグラフィーにより
ｍＲＮＡ画分を分離すればよい。本発明においては、Ｃ
ＫＨ−５ハイブリドーマから、ファルマシア社製のクイ
ックプレップｍＲＮＡピューリフィケーションキットを
用いてｍＲＮＡを抽出，精製し、以下のクローニングに
供した。
【０００９】（２）ＰＣＲ法によるＨ鎖及びＬ鎖のＶ領
域遺伝子の増幅 （１）の工程で得られたｍＲＮＡを鋳型とし、オリゴｄ
Ｔ又はランダムに任意の部位に結合するヘキサマーの合
成オリゴヌクレオチドをプライマーとしてdATP,dCTP,dG
TP,dTTP の存在下で逆転写酵素により、ｍＲＮＡと相補
的な単鎖ｃＤＮＡを合成し、このｃＤＮＡを鋳型とし
て、例えばオランディー（Orlandi ）等の方法〔プロシ
ーディング オブ ザ ナショナル アカデミー オブ
サイエンスユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. U
SA）、８６巻 ３８３３頁（1989）〕によりＨ鎖とＬ鎖
のＶ領域の遺伝子を増幅する。増幅したＤＮＡ断片は、
１．２％アガロースゲル電気泳動又は５％ポリアクリル
アミドゲル電気泳動で展開することにより、目的とする
Ｈ鎖とＬ鎖のＶ領域の遺伝子を抽出することができる。
得られたＨ鎖とＬ鎖のＶ領域の遺伝子は、それぞれ適当
なベクター、例えばpUC18 ベクター、pBR322ベクター等
に連結した後、適当な大腸菌、例えばJM109 、HB101 等
に形質転換することによりクローニングすることができ
る。本発明においては、（１）の工程で得られたｍＲＮ
Ａを鋳型として、ランダムプライマーによりｃＤＮＡを
合成し、オランディー（Orlandi ）等の方法によりＨ鎖
とＬ鎖のＶ領域の遺伝子を増幅した。増幅したＤＮＡ断
片は５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動により展開
し、目的とするＨ鎖とＬ鎖のＶ領域の遺伝子を抽出し
た。得られた遺伝子はpUC18 のHincIIサイトに連結した
後、HB101 に形質転換した。
【００１０】（３）塩基配列の決定 得られた遺伝子の塩基配列を決定する方法としては、マ
キサム・ギルバート法〔プロシーディング オブ ザ
ナショナル アカデミー オブ サイエンスユーエスエ
ー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA) 、７４巻、５６０頁
(1977) 〕やサンガー法〔プロシーディング オブ ザ
ナショナル アカデミー オブ サイエンス ユーエ
スエー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA）、７４巻、５４
６３頁(1977) 〕等が挙げられる。本発明においては、
上記のサンガー法により塩基配列を決定した。
【００１１】（４）遺伝子の発現 このようにして得られた遺伝子は、ボス（Boss）等の方
法〔ヌクレイック アシズ リサーチ（Nucleic Acids
Reserch)、１２巻、３７９１頁 (1984) 〕や、ウッド
（Wood) 等の方法〔ネイチャー(Nature)、３１４巻、４
４６頁 (1985) 〕に従い、適当なベクターを用いて適当
なプロモーター、リボソーム結合領域をつけることによ
り、大腸菌、枯草菌、酵母等で発現させることができ
る。また、ベター（Better) 等の方法〔サイエンス（Sc
ience)、２４０巻、１０４１頁 (1988）〕や、サリー
（Sally)等の方法〔ネイチャー（Nature) 、３４１巻、
５４４頁(1989) 〕に従い、抗体の結合領域を含む断片
（Ｆｖ）を適当なシグナル配列につけることにより、大
腸菌のペリプラズムに分泌発現させることもできる。本
発明においては、上記のサリー等の方法により遺伝子を
発現させた。
【００１２】
【実施例】次に、本発明を実施例によって具体的に説明
する。 実施例１ （１）ＣＫＨ−５マウスハイブリドーマ細胞からのｍＲ
ＮＡの抽出及び精製 ｍＲＮＡの抽出、精製としては、ファルマシア社製のク
イックプレップｍＲＮＡピューリフィケーションキット
を用いて行った。特開昭６３−４９０９５号公報に記載
されている、ＣＫＡ−５モノクローナル抗体を産生する
ＣＫＨ−５マウスハイブリドーマセル（ＦＥＲＭ Ｐ−
９８３９）３×１０7 個を遠心分離により回収し、グア
ニジンチオシアン酸とＮ−ラウロイルサルコシンを含む
１．５ミリリットルのイクストラクションバッファーに
懸濁した。これを１ミリリットルのシリンジを用いて２
１ゲージの注射針に繰り返し通して細胞を破砕し、均一
な抽出物を得た。この抽出物に１ｍＭのＥＤＴＡ（エチ
レンジアミン４酢酸）と１０ｍＭのトリス（ハイドロキ
シメチィルアミノメタン）−塩酸バッファー（ｐＨ７．
４）を含むイリューションバッファー３ミリリットルを
加えて激しく攪拌し、これを滅菌したポリプロピレンの
遠沈チューブに移して１２０００×ｇで１０分間遠心分
離（日立高速冷却遠心分離機SCR20B）した。次に、オリ
ゴ（ｄＴ）−セルロース（ファルマシア社製） スパン
カラムに抽出物の上清を添加し、プロトコールに従い
０．５ＭのＮａＣｌと１ｍＭのＥＤＴＡと１０ｍＭのト
リス−塩酸バッファー（ｐＨ７．４）とを含むハイソル
トバッファー及び０．１ＭのＮａＣｌと１ｍＭのＥＤＴ
Ａと１０ｍＭのトリス−塩酸バッファー（ｐＨ７．４）
とを含むローソルトバッファーで洗浄後、イリューショ
ンバッファーで溶出し、ポリ（Ａ）+ ｍＲＮＡ３８μｇ
を得た。
【００１３】（２）ｃＤＮＡの合成 （１）の方法で得たｍＲＮＡを鋳型とし、アマシャム社
製のｃＤＮＡ合成キットＲＰＮ１２５６Ｙを用いてｃＤ
ＮＡを合成した。すなわち、ヘキサマーの合成オリゴヌ
クレオチドをプライマーとして逆転写酵素によりｃＤＮ
Ａを合成した。
【００１４】（３）Ｈ鎖とＬ鎖のＶ領域遺伝子の増幅及
びクローニング Ｖ領域遺伝子の増幅は、オランディー（Orlandi ）等の
方法に従った。すなわち、（２）の方法で得たｃＤＮＡ
を鋳型として、以下に示したH1及びH2のプライマーによ
りＨ鎖の、L1及びL2のプライマーによりＬ鎖のＶ領域の
遺伝子をＰＣＲ法によって増幅した。遺伝子増幅用のタ
ックＤＮＡポリメラーゼ及び反応バッファーとしては、
宝酒造社製のものを用いた。ＤＮＡ増幅装置としては、
コイラボラトリープロダクト社製のテンプサイクラーモ
デル５０を用いた。反応条件としては、Ｈ鎖が９４℃１
分変性、６５℃１分半アニーリング、７２℃１分半伸長
反応を３０サイクル行った。また、Ｌ鎖としては、アニ
ーリング温度を６６℃にして３０サイクル行った。増幅
したＤＮＡ断片は５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動
により展開し、目的とするＨ鎖（約３４０塩基対）とＬ
鎖（約３２０塩基対）のＶ領域の遺伝子を抽出した。得
られた遺伝子を宝酒造社のＤＮＡブランティングキット
で平滑末端化し、pCU18 （宝酒造社製）のHincIIサイト
に連結した後、大腸菌HB101 （宝酒造社製）に形質転換
した。
【００１５】合成プライマーの塩基配列 H1 5' -AGGTGCAGCTGCAGGAGTCAGG- 3' H2 5' -TGAGGAGACGGTGACCGTGGTCCCTTGGCCCC- 3' L1 5' -GACATTGAGCTCACCCAGTCTCC- 3' L2 5' -GTTAGATCTCCAGCTTGGTCCC- 3'
【００１６】（４）塩基配列の決定 （３）の方法でクローン化したＣＫＡ−５のＨ鎖及びＬ
鎖のＶ領域の遺伝子の塩基配列を、ファルマシア社の
Ａ．Ｌ．Ｆ．ＤＮＡシーケンサーを用いて決定した。そ
の結果、ＣＫＡ−５のＨ鎖及びＬ鎖のＶ領域の遺伝子の
塩基配列は、それぞれ配列表の配列番号１及び２に示し
たように決定された。
【００１７】参考例１ 実施例１によりクローン化したＣＫＡ−５のＨ鎖及びＬ
鎖のＶ領域の遺伝子を、以下に示す方法で大腸菌で発現
させた。 （１）発現用ベクターの構築 pUC19 のHindIII とEcoRI サイトにシャイン・ダルガル
ノ（ＳＤ）配列、開始コドン及び組換え体を大腸菌のペ
リプラズムに発現させるためのリーダー配列を組み込ん
だ発現用ベクターを構築した。すなわち、アプライド
バイオシステムズ社製のＤＮＡ合成機を用いて以下に示
す６種類のＤＮＡ（B1,B2,B3,B1',B2',B3'）を合成し、
この合成ＤＮＡの５’末端に、T4ポリヌクレオチドキナ
ーゼを用いてりん酸を付加し、B1とB1' 、B2とB2' 、B3
とB3' を各々混合して９０℃で１分間煮沸した後、自然
に冷却してアニーリング（二本鎖形成）を行った。pUC1
9 １０μｇを３０ユニットのHindIII とEcoRI で消化
し、１％アガロースゲル電気泳動で精製した。次に、ア
ニーリングしたB1-B1',B2-B2',B3-B3'と、HindIII とEc
oRI で消化したpUC19 とを混合し、これをライゲーショ
ンキット（宝酒造社製）を用いて結合した後、大腸菌HB
101に形質転換した。得られた発現用ベクターの塩基配
列を、ファルマシア社製のＤＮＡシーケンサーを用いて
確認した。なお、プラスミドベクター、ホスト大腸菌、
制限酵素及びＤＮＡ修飾酵素はすべて宝酒造社製のもの
をプロトコールに従って使用した。
【００１８】 合成ＤＮＡの塩基配列 B1 5'-AAGCTTGCATGCAAATTCTATTTCAAGGAGACAGTCATAATGAAATAC- 3' B2 5'-CTATTGCCTACGGCAGCCGCTGGATTGTTATTACTCGCTGCCCAACCA- 3' B3 5'-GCGATGGCCCAGGTGCAGCTGCAGACAGATCTAATAAG- 3' B1' 5'-TTCATTATGACTGTCTCCTTGAAATAGAATTTGCATGCAAGCT- 3' B2' 5'-TGGGCAGCGAGTAATAACAATCCAGCGGCTGCCGTAGGCAATAGGTAT- 3' B3' 5'-GAATTCTTATTAGATCTGTCTGCAGCTGCACCTGGGCCATCGCTGGT- 3'
【００１９】（２）クローニング Ｈ鎖とＬ鎖のＶ領域の遺伝子をつなぐリンカーは、Gly-
Gly-Gly-Gly-Ser のアミノ酸配列を３回繰り返す構造の
ものを用いた。すなわち、以下に示すリンカー１及び２
を、アプライド バイオシステムズ社製のＤＮＡ合成機
を用いて合成し、上記の方法で５’末端にりん酸を付加
した後、アニーリングを行った。
【００２０】 リンカーの塩基配列 リンカー１ 5'-GTCACCGTCTCCTCAGGTGGCGGTGGCTCGGGCGGTGGTGGGTCGGGTGGCGGCGG ATCTGACATTGAGCT- 3' リンカー２ 5'-CAATGTCAGATCCGCCGCCACCCGACCCACCACCGCCCGAGCCACCGCCACCTGAG GAGACG- 3'
【００２１】Ｈ鎖及びＬ鎖のＶ領域の遺伝子としては、
実施例１でクローニングしたものを、Ｈ鎖としては、Sa
cIとBglII で、Ｌ鎖としては、PstIとBstEIIで消化した
後、５％アクリルアミドゲル電気泳動で精製することに
よって得られた、それぞれ２９２塩基対、２７９塩基対
のＤＮＡ断片を用いた。次いで、これらのＤＮＡ断片と
アニーリングを行ったリンカーとをライゲーションキッ
ト（宝酒造社製）を用いて結合し、６４２塩基対のＤＮ
Ａ断片を５％アクリルアミドゲル電気泳動で精製した。
【００２２】次に、（１）で構築した発現用ベクターを
PstIとBglII で消化し、１％アガロースゲルで精製した
後、このベクターと（２）で精製した６４２塩基対のＤ
ＮＡ断片とをライゲーションキット（宝酒造社製）を用
いて結合し、これを大腸菌MV1184（宝酒造社製）に組み
込んだ。得られたクローンの内の数個の塩基配列を決定
して、正しく遺伝子が組み込まれていることを確認し、
このクローンをpCKFv1とした。
【００２３】（３）組換え体の培養及び精製 上記の方法で得られたクローンpCKFv1を３０リットルの
ジャーファーメンター（丸菱社製）を用い、Ｌブロス培
地（１％ペプトン、０．５％酵母エキス、１％ＮａＣ
ｌ、１０ｍｇ／リットル アンピシリン）１５リットル
で対数増殖期後期まで培養し、得られた培養液を遠心分
離（２５℃）して０. ５ｋｇの湿菌体を得た。この湿菌
体を１ｍＭのＥＤＴＡ及び２５重量％のスクロースを含
む１０ｍＭのトリス−塩酸バッファー（ｐＨ７. ５）３
リットルに懸濁し、１０分間室温で穏やかに撹拌した。
10,000×ｇ、５分間の遠心分離（２５℃）の後、上清を
除いた。遠沈管に残った湿菌体を氷冷水１リットルに穏
やかに懸濁し、１０分間氷水中で穏やかに撹拌した。1
0,000×ｇ、５分間の遠心分離（４℃）を行い、上清を
回収した。次に、この上清を２リットルのＤＥ５０陰イ
オンクロマトグラフィー（ワットマン社）に供し、１ｍ
ＭのＥＤＴＡを含む２５ｍＭのトリス−塩酸バッファー
（ｐＨ７. ５）５リットルで洗浄した後、０〜０. ５Ｍ
のＮａＣｌの塩濃度勾配による溶出を行った。得られた
各画分のＣＫ−ＭＭ3 阻害活性を参考例３に示した方法
により測定し、ＣＫ−Ｍサブユニットを特異的に阻害す
る画分１０ｇを回収した。得られた組換え体タンパクを
ＣＫＡ−５Ｆｖとした。
【００２４】なお、比較のため、特開平１−１１９９０
号公報に記載されているようにハイブリドーマＣＫＨ−
５（ＦＥＲＭ Ｐ−９８３９）を１０容量％の牛胎児血
清を含むＲＰＭ１１６４０培地で培養し、細胞濃度２×
１０6 個／ミリリットルとなった培養物３００ミリリッ
トルを遠心分離して上清を集め、５０％飽和硫安分画に
より粗抗体画分を分離し、透析後、プロテインＡセファ
ロース（ｐＨ８．０）に吸着させ、ｐＨ４．０のクエン
酸緩衝液で溶出して、モノクローナル抗体ＣＫＡ−５を
３．２mg得た。このように、本発明によって得られたＣ
ＫＡ−５Ｆｖは大腸菌の培養液１リットルあたり、６７
０mg生産されるのに対し、従来のＣＫＡ−５はハイブリ
ドーマセルＣＫＨ−５の培養液１リットルあたり約１１
mgしか生産されなかった。この結果から、本発明の遺伝
子を用いることにより、生産性が大幅に向上することが
わかる。
【００２５】次に、上記で得られたＣＫＡ−５Ｆｖ（本
発明）及びＣＫＡ−５（従来）の阻害活性を測定した。
この阻害活性の測定には特開昭６３−４９０９５号公報
に記載の方法に従って行った。すなわち、バチルス テ
アロサーモフィルス由来のグルコキナーゼ（生化学工業
社製）１．４ユニット／ミリリットル、ロイコノストッ
ク メセンテロイデス由来のグルコース６リン酸デヒド
ロゲナーゼ（オリエンタル酵母社製）１．２ユニット／
ミリリットル、ＡＤＰ１．２ｍＭ、ＮＡＤＰ０．７５ｍ
Ｍ、グルコース２５ｍＭ、ＡＭＰ６．２５ｍＭ、Ａｐ５
Ａ１２．５μＭ、Ｎ−アセチルシステイン１２．５ｍ
Ｍ、酢酸マグネシウム１２．５ｍＭ、アジ化ナトリウム
１０ｍＭ、ＥＤＴＡ２．５ｍＭ、イミダゾール−酢酸バ
ッファー（ｐＨ６．７）１５０ｍＭよりなる第１試薬を
調製し、次いで、クレアチンリン酸１００ｍＭ、アジ化
ナトリウム１０ｍＭ、トリス−塩酸バッファー（ｐＨ
８．５）２５ｍＭよりなる第２試薬を調製した。
【００２６】上記の第１試薬に上記で生産したＣＫＡ−
５ＦｖとＣＫＡ−５をそれぞれ添加し、その０．５ミリ
リットルに血清中からクロマトフォーカシング法によっ
て分離したＣＫ−ＭＭ3 を加えて、光路長１ｃｍのセル
に入れ、３０℃で１５分間インキュベートし、次いで、
第２試薬０．１２５ミリリットルを加え、セル室を３０
℃に保った分光光度計にて３４０ｎｍの吸光度の変化よ
り残存活性を測定した。また、対照としてＣＫＡ−５Ｆ
ｖ及びＣＫＡ−５を含まない第１試薬にＣＫ−ＭＭ3 を
加えて、以下同様に測定した。その結果を図１に示す。
図１は、ＣＫＡ−５ＦｖとＣＫＡ−５のＣＫ−ＭＭ3の
阻害活性を示したものであり、縦軸にはＣＫ−ＭＭ3 阻
害活性（単位：％）を、横軸にはＣＫＡ−５Ｆｖ又はＣ
ＫＡ−５の蛋白濃度（単位：μｇ／ミリリットル）を示
している。この図から、ＣＫＡ−５がＣＫ−ＭＭ3 を１
００％阻害するのに必要な量は測定系で１００μｇ／ミ
リリットルであるのに対して、ＣＫＡ−５Ｆｖは５０μ
ｇ／ミリリットルであり、本発明の遺伝子を用いて生産
したＣＫＡ−５Ｆｖは、従来法のハイブリドーマセルよ
り得られたＣＫＡ−５より優れた阻害活性を示すことが
わかる。
【００２７】
【発明の効果】本発明によれば、ＣＫＡ−５モノクロー
ナル抗体のＶ領域の遺伝子が明かとなったため、抗原認
識部位のアミノ酸配列が推測され、構造の解明、遺伝子
レベルでの保存、遺伝子工学的手法によるＣＫＡ−５モ
ノクローナル抗体の改変が可能となった。さらに、本発
明の遺伝子を用いることにより、従来のＣＫＡ−５モノ
クローナル抗体よりも微量のタンパク量でＣＫ−Ｍサブ
ユニットを阻害することのできるＣＫＡ−５の組換え体
を大量に調製することが可能となった。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の遺伝子を用いて製造したＣＫＡ−５Ｆ
ｖ及び従来のハイブリドーマセルを用いて製造したＣＫ
Ａ−５のＣＫ−ＭＭ3 阻害活性を示す図である。
【配列表】
配列番号：１ 配列の長さ：３４８ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｍＲＮＡ 配列 CTGCAGGAGT CAGGACCTGG CTTAGTGAAG CCTGGAGGGT CCCTGAAACT TCCTGTGCAG 60 GTCTCTGGAT TCACTTTCAG TAGCTATGGC ATGTCTTGGG TTCGCCAGAC TCCGGAGAAG 120 AGGCTGGAGT GGGTCGCAAC CACTAATAGT GGTGGTAGTT ATACCTACTA TCCAGACAGT 180 GTGAAGGGTC GATTCACCAT CTCCAGAGAC AATGCCAAGA ACACCCTGTA CCTGCAAATG 240 AGCAGTCTGA GGTCTGAGGA CACGGCCATG TATTACTGTG CAAGAAGGGG AATTACTACG 300 ACTACGTATG ACTATTGGGG CCAAGGGACC ACGGTCACCG TCTCCTCA 348 配列番号：２ 配列の長さ：３２７ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｍＲＮＡ 配列 GAATTCCTCA CCCAGTCTCC AGATTCTTTG GCTGTGTCTC TAGGACAGAG GGCCACCATA 60 TCCTGCCAAG CCAGCGAAAC TGTCAGTTTT GCTGGTACAA GTTTAATGCA CTGGTACCAA 120 CAGAAACCAG GACAGCCACC CACACTCCTC ATCTATCGTG CATCCAACCT AGAATCTGGA 180 GTCCCTGCCA GGTTCAGTGG CAGTGGGTCT GAGTCAGACT TCACTCTCAC CATCGATCCT 240 GTGGAGGAAG ATGATGCTGC AATGTATTAC TGTATGCAAA GTATGAAAGA TCCTCTCACG 300 TTCGGTGCTG GGACCAAGCT GGAGATC ３２
７
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/573 Ｇ０１Ｎ 33/573 Ａ 33/577 33/577 Ｂ

Claims (2)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 配列表の配列番号１で示される塩基配列
    を有することを特徴とするクレアチンキナーゼＭサブユ
    ニットを阻害し、かつＭ’サブユニットを阻害しないＣ
    ＫＡ−５モノクローナル抗体のＨ鎖Ｖ領域の遺伝子。
  2. 【請求項２】 配列表の配列番号２で示される塩基配列
    を有することを特徴とするクレアチンキナーゼＭサブユ
    ニットを阻害し、かつＭ’サブユニットを阻害しないＣ
    ＫＡ−５モノクローナル抗体のＬ鎖Ｖ領域の遺伝子。
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