JPH06105687A

JPH06105687A - ヒトコラーゲンｖ型遺伝子

Info

Publication number: JPH06105687A
Application number: JP35830091A
Authority: JP
Inventors: Kazuhiko Takahara; 和彦高原; Yoshiko Sato; 美子佐藤; Kazuhide Okazawa; 一秀岡澤; Nobuko Okamoto; 伸子岡本; Akihiro Noda; 晃弘野田; Yoshito Yaoi; 義人矢追; Ikunoshin Katou; 郁之進加藤
Original assignee: Takara Shuzo Co Ltd
Current assignee: Takara Shuzo Co Ltd
Priority date: 1991-12-27
Filing date: 1991-12-27
Publication date: 1994-04-19

Abstract

(57)【要約】【目的】ヒトコラーゲンＶ型遺伝子を明らかにし、そ
の塩基配列を提供する。【構成】配列表の配列番号１で表されるＤＮＡ配列を
有するヒトコラーゲンＶ型遺伝子。塩基配列の長さは５
６７６個である。これは８個のシステインを有し、ホモ
型３重鎖の形成能を有しており、他の繊維状コラーゲン
とは異なるコドンユーセージを示す。【効果】ヒトコラーゲンＶ型に関連した疾病の遺伝子
診断に応用できる。工業的生産が可能になったことに伴
い、生体関連物質の製造に利用できる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、生体内構成タンパク質
として重要な、ヒトコラーゲンＶ型の遺伝子に関する。

【０００２】

【従来の技術】コラーゲンは生体に広く分布し、臓器や
骨の形成及び細胞周辺の環境を維持する生体に必須な構
成タンパク質であり〔カーペンター（ Carpenter )ら、
アニュアルレビューオブバイオケミストリー（ A
nnual Review of Biochemistry)、第４８巻、第１９３
〜２１６頁（１９７９）〕、コラーゲン代謝に関する疾
病も多く報告されている。例えば、アルポート症、骨形
成不全症、エーラース・ダンロス症候群、軟骨発育不全
及びマルファン症候群等が主なものである。ヒトコラー
ゲンＶ型は、ヒトコラーゲンＩ〜IV型と共に生体内コラ
ーゲンの大部分を占めるものであり、かつ、多数の組織
に存在が確認されている。タンパク質学的な性質として
は、ＤＮＡ結合能〔ザジャーナルオブイムノロジ
ー（Ｊ．Immunol.）、第１３５巻、第１０９７〜１１０
０頁（１９８５）〕、ヘパランスルフエート結合能
〔ザジャーナルオブバイオロジカルケミストリー
〔 The Jounal of Biological Chemistry ) 、第２６４
巻、第７９５０〜７９５６頁（１９８９）〕、スロンボ
スポンジン結合能〔ザジャーナルオブセルラーバ
イオロジー（Ｊ．Cell. Biol. ) 、第９８巻、第６４６
〜６５２頁（１９８４）〕、ヘパリン結合能〔ビオキミ
カエビオフィジカアクタ（ Biochim. Biophys. A
cta ) 、第１０３５巻、第１３９〜１４５頁（１９９
０）〕、及びインシュリン結合能〔エクスペリメンタル
セルリサーチ（ Experimental Cell Research ) 、
第１９４巻、第１８０〜１８５頁（１９９１）、特開平
２−２０９８９９号公報〕等が知られており、またある
種の細胞の基質への接着阻害能〔ハシモト（ Hashimoto
)ら、セルストラクチャーアンドファンクション
（ Cell Structure and Function )、第１６巻、第３９
１〜３９７頁（１９９１）〕、細胞運動への関与〔ネイ
チャー（ Nature ) 、第２７７巻、第２２９〜２３２頁
（１９７９）、バイオケミカルアンドバイオフィジ
カルリサーチコミュニケーションズ（ Biochem. Biop
hys. Res. Commun. ）、第１５１巻、第１０６０〜１０
６８頁（１９８８）〕、及び高血圧症との関連が示唆さ
れている。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】前述の様にヒトコラー
ゲンＶ型は種々のタンパク質学的特徴を有するが、ヒト
生体内物質であり、機能性ポリペプチドとして大量に調
製することは困難であり、遺伝子工学的製造法の開発が
望まれている。また、ヒトコラーゲンＶ型の生体内にお
ける詳しい生理的機能は完全には明らかではなく、生体
内での発現と疾病との関連性などを検討する上でも、遺
伝子レベルでのアプローチも望まれている。しかしなが
ら、ヒトコラーゲンＶ型の遺伝子構造は不明であり、遺
伝子レベルでのアプローチが不可能であった。本発明の
目的は、ヒトコラーゲンＶ型の生体内での遺伝子レベル
での解析、及びヒトコラーゲンＶ型及び関連ポリペプチ
ドの遺伝子組換えによる工業的レベルでの生産に有用な
ヒトコラーゲンＶ型遺伝子を明らかにし、その塩基配列
を提供することにある。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明を概説すれば、本
発明はヒトコラーゲンＶ型遺伝子に関する発明であっ
て、配列表の配列番号１で表されるＤＮＡ配列であるこ
とを特徴とする。

【０００５】ヒトコラーゲンＶ型の主たる構成鎖はα１
鎖〔以下これをα１（Ｖ）と略す〕であり、本発明者ら
はこのα１（Ｖ）の全遺伝子を決定し、本発明を完成さ
せた。以下本発明を詳細に説明する。

【０００６】α１（Ｖ）をコードするｃＤＮＡ断片を得
るためには、２−ステップ・ＰＣＲ〔ポリメラーゼチ
ェーンリアクション（ polymerase chain reaction
)：サイキ（ Saiki )ら、サイエイス（ Science )、第
２３０巻、第１３５０〜１３５４頁（１９８５）〕を用
いることができる。得られたｃＤＮＡ断片を用いてヒト
胎盤ｃＤＮＡをスクリーニングし、α１（Ｖ）をコード
するｃＤＮＡクローンを得ることができる。

【０００７】上記の方法に用いるプライマーとしては、
例えば既報の、α１（Ｖ）アミノ酸の部分配列〔セイヤ
ー（ Seyer )ら、アーカイブスオブバイオケミスト
リーアンドバイオフィジックス（ Arch. Biochem. Bi
ophys. )、第２７１巻、第１２０〜１２９頁（１９８
９）〕、及びα１（Ｖ）と高ホモロジーの予想されるヒ
トコラーゲンXIα１鎖〔以下α１（XI）と略す〕のｃＤ
ＮＡ配列〔バーナード（Bernard ) ら、ザジャーナル
オブバイオロジカルケミストリー、第２６３巻、
第１７１５９頁〜１７１６６頁（１９８８）〕を参考に
して、配列表の配列番号３で表されるプライマーＰ２、
及び配列表の配列番号４で表されるプライマーＰ４、配
列表の配列番号６で表されるプライマーＰ１及び配列表
の配列番号８で表されるプライマーＰ８の２組のプライ
マーを作製し、用いることができる。図１は、該プライ
マーのハイブリダイズする部分及び２−ステップＰＣＲ
の概略を示す図である。

【０００８】本発明で用いるプライマーはＤＮＡ合成機
にて合成し、ＨＰＬＣで精製することができる。

【０００９】ＰＣＲの鋳型ＤＮＡとしては、ヒト胎盤ｍ
ＲＮＡ（クローンテック社）よりＲＡＶ−２逆転写酵素
（宝酒造社）を用いて一本鎖ｃＤＮＡを合成し〔グブラ
ー（Gubler ) ら、ジーン（ Gene ) 、第２５巻、第２
６３〜２６９頁（１９８３）〕、用いることができる。
初めにプライマーＰ２及びプライマーＰ４を用いてＰＣ
Ｒを行う。次にこの産物をプライマーＰ１及びプライマ
ーＰ８を用いて再ＰＣＲを行うと、約１８０bpのｃＤＮ
Ａ断片を得ることができる。この断片の塩基配列をダイ
デオキシ法〔プロシーディングズオブナショナル
アカデミーオブサイエンシーズオブザＵＳＡ
（ Proceedings National Academy of Sciences of the
ＵＳＡ）、第７４巻、第５４６３〜５４６７頁（１９
７７）〕により決定し、例えば既報のα１（Ｖ）鎖の部
分アミノ酸配列と比較すれば、本断片がα１（Ｖ）をコ
ードしていることが確認できる。この断片をプローブと
して、ヒト胎盤ｍＲＮＡより作製〔前出グブラーら〕し
たλｇｔ１０ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングし
〔メソッズインエンザイモロジー（ Methods in En
zymology )、第１５２巻、第３６７〜３７１頁（１９８
７）〕、図２に示す領域を含むλ３０２及びλ３０８ク
ローンを得る。更にλ３０２の両端の配列をそれぞれプ
ローブとしてλｇｔ１０ｃＤＮＡライブラリーよりλ５
０８、λ５１０、λ４０１及びλ４０２クローンを得る
ことができる。すなわち、図２はα１（Ｖ）遺伝子の制
限酵素地図及び各クローンの関係を示す図である。

【００１０】これらのｃＤＮＡの全塩基をキロベースシ
ーケンス法〔ヘニコフ（Henikoff)、ジーン、第２８
巻、第３５１〜３５９頁（１９８４）〕を用いて決定
し、これらのｃＤＮＡクローンがα１（Ｖ）の全領域を
コードしていることを確認する。更に塩基配列より決定
されたアミノ酸配列を既報の部分α１（Ｖ）アミノ酸配
列〔モーリス（ Morris ) ら、ザジャーナルオブ
バイオロジカルケミストリー、第２６５巻、第１００
８１〜１００８７頁（１９９０）、ヤオイ（ Yaoi)
ら、ビオキミカエビオフィジカアクタ、第１０３
５巻、第１３９〜１４５頁（１９９０）〕及びペプシン
処理により胎盤より得られたα１（Ｖ）のＮ末端アミノ
酸配列と比較すれば、該ｃＤＮＡがα１（Ｖ）をコード
していることを再確認できる。

【００１１】本発明により得られるα１（Ｖ）の遺伝子
配列及び全アミノ酸配列の特徴を以下に述べる。なお、
図３はα１（Ｖ）タンパク質の模式的構造を示す図、図
４はα１（Ｖ）とα１（XI）の構造の比較図である。

【００１２】（１）５′−非翻訳領域ｃＤＮＡクローンλ５０８には１２６塩基の５′−非翻
訳領域（配列表の配列番号１の塩基番号１番〜１２６番
付近）が含まれる。この配列のＧ＋Ｃ含量は約８０％と
高い値を示す（翻訳領域全体では６４％である）。ま
た、他の繊維状コラーゲン、すなわちコラーゲンＩ型α
１鎖〔以下α１（Ｉ）〕、同α２鎖〔以下α２
（Ｉ）〕、コラーゲンIII 型α１鎖〔以下α１（II
I)〕、コラーゲンII型α１鎖〔以下α１（II）〕、コラ
ーゲンＶ型α２鎖〔以下α２（Ｖ）〕、及び非繊維状コ
ラーゲン、すなわちコラーゲンIV型α１鎖〔以下α１
（IV）〕、コラーゲンIV型α２鎖〔以下α２（IV）〕等
と比較すると、その値は非繊維状コラーゲンに近い。ま
た、翻訳開始点（ＡＴＧコドン）５′側の５塩基の配列
は繊維状コラーゲン間（ＴＡＧ／ＴＡＣ）、及び非繊維
状コラーゲン間（ＣＣＡＧ／ＣＣ）でよく保存されてい
るが、α１（Ｖ）の塩基配列（ＣＣＧＧＣ）は、非繊維
状コラーゲンに近い。

【００１３】（２）シグナルペプチド（配列表の配列番
号１のアミノ酸番号１番〜３７番付近） α１（Ｖ）のシグナルペプチドは３７アミノ酸より成
り、非常に多くのロイシン残基を含む。また、それらの
ロイシン残基の多く（８９％）がＣＴＧコドンによって
コードされている。

【００１４】（３）Ｎ末端非コラーゲン領域（配列表の
配列番号１のアミノ酸番号３８番〜５５８番付近） α１（Ｖ）のＮ−末端非コラーゲン領域は５２１アミノ
酸より成り、現在までに報告されている他のコラーゲン
に比較して例外的に大きい。この領域にはいくつかのコ
ラーゲンに見出されるシステイン残基に富む部分は存在
しないが、代って、多数のチロシン残基〔α１（Ｖ）に
含有されるチロシンの７３％〕を含む高チロシン領域が
存在する（配列表の配列番号１のアミノ酸番号２６２番
〜４４２番付近）。

【００１５】タンパクレベルの解析よりα１（Ｖ）のチ
ロシン残基の硫酸比〔フェッスラー（ Fessler )ら、ザ
ジャーナルオブバイオロジカルケミストリー、
第２６１巻、第５０３４〜５０４０頁（１９８６）〕が
報告されているが、これらのチロシン残基の内、酸性ア
ミノ酸（グルタミン酸、アスパラギン酸）に隣接した残
基が硫酸化を受ける。

【００１６】このチロシン残基に富む領域の下流に、短
い不連続な（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）の繰返し配列が存在して
いる（配列表の配列番号１のアミノ酸番号４４４番〜５
３８番付近）。この（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）の配位は、生体
内で３重鎖を形成するα２（Ｖ）、α１（XI）と非常に
よく似ており（図５）、この領域で短い不連続な３重鎖
構造を形成している。すなわち図５は、各コラーゲンの
Ｎ末端非コラーゲン領域中の（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）配列の
繰返し構造の相関を示す図である。この領域と主コラー
ゲン部位の間にプロテイナーゼによって切断され得るサ
イト（配列表の配列番号１のアミノ酸番号５４１番〜５
４２番、５４６番〜５４７番）が２か所存在する。しか
し、これらのサイトは前述の短い不連続な３重鎖構造に
よって保護され、Ｎ−プロテイナーゼによって切断され
にくい構造となっている。

【００１７】また、この領域には、ラミニンＡ鎖と相同
性を有する配列（配列表の配列番号１のアミノ酸番号１
１１番〜１８２番付近）、及び糖鎖の結合部位（配列表
の配列番号１のアミノ酸番号１７６番〜１７８番）が存
在する。また、α１（Ｖ）は、ペプシンにより配列表の
配列番号１のアミノ酸番号５５５番付近の部位で切断さ
れる。

【００１８】（４）主コラーゲン領域（配列表の配列番
号１のアミノ酸番号５５９番〜１５７２番付近）主コラーゲン領域は３３８個の連続した（Ｇｌｙ−Ｘ−
Ｙ）から構成されている。この領域のアミノ酸配列はα
１（XI）と高い相同性（８２％）を示す。またこの領域
には塩基性領域（ヘパリン、インシュリン結合部位）が
配列表の配列番号１のアミノ酸番号８９７番〜９３３番
付近に存在する。また、細胞接着活性を有する可能性の
あるＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ配列が２か所（配列表の配
列番号１のアミノ酸番号６４５番〜６４７番、６６３番
〜６６５番）に存在する。

【００１９】一方、コラーゲンＩ、II、III 型は生体内
で共通のコラーゲン分解酵素によって切断、代謝される
が、Ｖ型はこの酵素によって分解を受けない〔アニュア
ルレビューオブバイオケミストリー、第４９巻、第
１０６３〜１０７８頁（１９８０）〕。コラーゲンＩ、
II、III 型では、コラーゲン分解酵素によって切断され
る位置のアミノ酸配列はＧｌｙ−Ｉｌｅ／Ｌｅｕである
が、Ｖ型ではＧｌｙ−Ａｓｐ（配列表の配列番号１のア
ミノ酸番号１３３０番〜１３３１番）と変化しており、
これによってコラーゲンＶ型は通常のコラーゲン分解酵
素に対して耐性になっている。

【００２０】（５）Ｃ末端非コラーゲン領域（配列表の
配列番号１のアミノ酸番号１５７３番〜１８３８番付
近）Ｃ末端非コラーゲン領域は他の繊維状コラーゲンのもの
とほぼ同じ大きさで、Ｃ−プロテイナーゼによって切断
される部位はＡｌａ−Ａｓｐ（配列表の配列番号１のア
ミノ酸番号１６０５番〜１６０６番）である。また、こ
の領域もα１（XI) は相同性が高く７７％のホモロジー
を示す。α１（Ｖ）は８個のシステイン残基を含んでい
るが、これらのシステイン残基は生体内で３重鎖構造形
成に重要な役割を果している。他のコラーゲンと比較し
ても、システイン残基の周辺アミノ酸配列が良く保存さ
れていることがわかる。

【００２１】α１（Ｖ）とα１（XI）は高い相同性を示
すが、このシステイン残基の数は異なる。他のコラーゲ
ンの例では、この領域に８個のシステイン残基を有する
α１鎖はホモ型の３重鎖を形成できるが、７個しか有し
ていないα１鎖はホモ型を形成できないことが報告され
ている〔アニュアルレビューオブバイオケミスト
リー、第５９巻、第８３７〜８７２頁（１９９０）〕。
α１（Ｖ）とα１（XI）は相同性が高いが前者は８個、
後者は７個のシステインを有しており、このことはα１
（Ｖ）がホモ型３重鎖の形成能を有することを示す。ま
た、この領域には、２か所の糖鎖結合部位が存在する
（配列表の配列番号１のアミノ酸番号１６７２番〜１６
７４番、及び１７４１番〜１７４３番）

【００２２】（６）特徴的なコドンユーセージ主コラーゲン領域に含まれるグリシン及びプロリン残基
について、それらのコドンユーセージを他のコラーゲン
と比較した（図６及び図７）結果、α１（Ｖ）では他の
繊維状コラーゲン｛すなわちα１（Ｉ）、α２（Ｉ）、
コラーゲンII型α１鎖〔α１（II）〕、コラーゲンＩ型
α３鎖〔α３（Ｉ）〕、α２（Ｖ）、α１（XI）｝とは
全く異なったコドンユーセージの傾向を示し、血管内皮
細胞の基底膜に存在する非繊維状コラーゲンであるα１
（IV）及びα２（IV）に類似している。これらの結果
は、α１（Ｖ）が他の繊維状コラーゲンとは異なった進
化をたどってきたことを示す。

【００２３】すなわち図６及び図７はそれぞれ各コラー
ゲンのコラーゲン領域内のグリシン残基及びプロリン残
基についてのコドンユーセージを示す図である。図６及
び図７において、縦軸は各々の残基をコードするコドン
の３文字目の塩基の使用頻度を示し、横軸において１Ａ
１はα１（Ｉ）、２Ａ１はα１（II）、１Ａ２はα２
（Ｉ）、３Ａ１はα１（III)、５Ａ２はα２（Ｖ）、１
１Ａ１はα１（XI）、４Ａ１はα１（IV）、４Ａ２はα
２（IV）、５Ａ１はα１（Ｖ）の各コラーゲンを示す。

【００２４】以上詳細に説明した様に、本発明によりコ
ラーゲンＶ型の遺伝子が明らかになり、該遺伝子及び遺
伝子の一部を用いて、コラーゲンタンパク質、及び種々
の生理活性を有する生体関連物質の製造が可能となる。
これらは医薬品、化粧料等として有用であり、また生体
適合性材料としても利用しうる。また、コラーゲンＶ型
は他のコラーゲンとは異なった進化をたどってきたこと
より、他のコラーゲンと異なる特有な機能を持つことが
期待される。また本発明の遺伝子配列は、コラーゲンＶ
型の関与する疾病の解明及び遺伝子工学的診断を可能と
するものである。

【００２５】

【実施例】以下、本発明を実施例により更に具体的に説
明するが、本発明はこれら実施例に限定されない。

【００２６】実施例１（１）２−ステップＰＣＲクローニング法のためのプラ
イマー作製配列表の配列番号２で表されるヒトコラーゲンＶ型α１
鎖の部分アミノ酸配列（前出セイヤーら）と相同性の予
想されるヒトコラーゲンα１（XI）のｃＤＮＡ配列（前
出バーナードら）より配列表の配列番号３で表されるプ
ライマーＰ２及び配列表の配列番号４で表されるプライ
マーＰ４を設定し、アプライドバイオシステムズ社製
のＤＮＡ合成機を用いて合成し、Ｃ１８カラム〔セプ−
パク（ Sep−Pak ) ｔＣ１８、ウォータース社〕で精製
した。ここで、配列表の配列番号４の塩基番号１〜１３
の部分は、クローニングサイトを新しく導入するための
配列である。更に、配列表の配列番号５で表されるヒト
コラーゲンＶ型α１鎖の部分アミノ酸配列より、配列表
の配列番号６で表されるプライマーＰ１を、配列表の配
列番号７で表される同アミノ酸配列より、配列表の配列
番号８で表されるプライマーＰ８を、それぞれ設定し、
同様に合成し、精製した。

【００２７】（２）ＰＣＲ反応ＰＣＲの鋳型となるｃＤＮＡは、ヒト胎盤ｍＲＮＡより
合成した。すなわち、ヒト胎盤ｍＲＮＡ５μｇ（クロー
ンテック社）を５０mMのトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ
８．３）、１００mM ＫＣｌ、１０mM ＭｇＣｌ₂、１
０mM ＤＴＴ、１mM ｄＮＴＰ混合液（ｄＡＴＰ、ｄＣ
ＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）、２μｇのオリゴ（ｄＴ）
プライマー、１０ユニット／５０μｌのＲＡＶ−２逆転
写酵素（宝酒造社製）中で４２℃、１時間反応させ、一
本鎖ｃＤＮＡを合成し、フェノール処理、エタノール沈
殿を行った。このｃＤＮＡの１／１０量について、以下
の条件で配列表の配列番号３及び４で表されるプライマ
ーＰ２及びＰ４を各々１００pmolずつ用いて、ＰＣＲを
行った。ＰＣＲは宝酒造社製ジーンアンプキットを用
い、自動遺伝子増幅装置サーマルサイクラー（宝酒造社
製）９５℃で３０秒→５５℃で３０秒→７２℃で１分の
温度サイクルを３０サイクル行った。反応終了後、反応
液の１／１０量を更に配列表の配列番号６及び８で表さ
れるプライマーＰ１、Ｐ８を用いて同条件で再度ＰＣＲ
を行った。この産物の１／１０量を１％アガロースゲル
電気泳動にかけ、分析したところ、約１８０bpのｃＤＮ
Ａ断片の増幅を確認した。更にこのフラグメントをアガ
ロースより回収し、プラスミドｐＵＣ１１９のHincIIサ
イトにＤＮＡライゲーションキット（宝酒造社製）を用
いてライゲーションし、これにより得られたプラスミド
ＤＮＡを colＶ−２０１−Ａと命名した。本プラスミド
より制限酵素 XbaＩ及びHind IIIで切り出したＤＮＡ断
片を２０１−Ａと命名し、スクリーニング用プローブと
して用いた。

【００２８】（３）ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニ
ングヒト胎盤ｃＤＮＡライブラリーを以下の手順に従って作
製した。ヒト胎盤ｍＲＮＡ（クローンテック社製）か
ら、ランダムプライマーをプライマーとして、前述のグ
ブラーらの方法に従って、ＲＡＶ−２逆転写酵素を用い
て一本鎖ｃＤＮＡを合成した。次に、このＲＮＡ−ＤＮ
Ａハイブリッドを２０mM トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．
５）、１０mM ＭｇＣｌ₂、１０mM （ＮＨ₄）₂ＳＯ
₄、１００mM ＫＣｌ、５０μｇ／ml ＢＳＡを含む緩
衝液中で、２．４ユニット／１５０μｌのRNaseH（宝酒
造社製）及び１１．５ユニット／１５０μｌの大腸菌ポ
リメラーゼＩ（宝酒造社製）を用いて１２℃で６０分
間、２２℃で６０分間、７０℃で１０分間インキュベー
トして２本鎖ＤＮＡとした。更に５０mMトリス−ＨＣｌ
（ｐＨ８．３）、１０mM ＭｇＣｌ₂、１０mM ＤＴ
Ｔ、０．０５mMのｄＮＴＰ混合液を含む緩衝液中で、
６．０ユニットのＴ４ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社
製）を用いて３７℃で１０分間インキュベートして平滑
末端化し、更に５０mM トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．
０）、１００mM ＮａＣｌ、１０mM ＥＤＴＡ、０．２
mg／mlＢＳＡ、０．１mM アデノシルメチオニンを含む
緩衝液中で２０ユニットのEcoRＩメチラーゼ（宝酒造社
製）を用いて３７℃、１時間処理を行った。このｃＤＮ
Ａ断片にEcoRＩリンカーをライゲーションし、EcoRＩ処
理した後に、ファージベクターλｇｔ１０にクローニン
グした。これをλファージパッケージングキット（ギガ
パックコールド；ストラテジーン社）を用いてパッケー
ジングし、大腸菌Ｃ６００ｈｆｌを宿主としてプラーク
を形成させた。すなわち、０．２mM マルトース及び２
mM ＭｇＳＯ₄を含むＬ−ブロス培地中で大腸菌Ｃ６０
０ｈｆｌを３７℃で一晩培養し、これに希釈したファー
ジ液を加え、３７℃で１５分間インキュベートを行った
後に、０．７％アガロースを含むＬ−ブロスと共に１．
５％アガロース含有Ｌ−ブロスプレートに重層し、これ
を３７℃で一晩培養し、プラークを形成させた。約１×
１０⁶個のファージプラークをナイロンメンブラン（ハ
イボンド−Ｎ；アマシャム社製）に移し、ランダムプラ
イマーラベリングキット（宝酒造社製）を用いて〔α−
³²Ｐ〕−ｄＣＴＰ（アマシャム社製）でラベルしたプロ
ーブ２０１−Ａと６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣ：０．１５Ｍ
ＮａＣｌ、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ
７．０）、５×デンハーツ液〔１×デンハーツ液各０．
０２％（ｗ／ｖ）のポリビニルピロリドン、ウシ血清ア
ルブミン〕、及び１００μｇ／mlの変性サケＤＮＡを含
むハイブリダイゼーション溶液中で、６５℃で一晩ハイ
ブリダイズさせた。フィルターの洗浄は２×ＳＳＣ、
０．５％ＳＤＳを含む洗浄液１で６５℃、３０分、次に
０．１×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳを含む洗浄液２で６５
℃、１時間行った。フィルターを増感紙に当てて、一
晩、−７０℃でオートラジオグラフィーを行った。この
結果、λ３０２とλ３０８の２つのポジティブクローン
を得た。この内λ３０２にクローン化されたｃＤＮＡか
ら PstＩ−EcoRＩ及びBamHＩ− NcoＩフラグメントを切
り出し、それぞれを上記の方法によりプローブとして用
い、前出のｃＤＮＡライブラリーからクローンλ４０
１、λ４０２及びλ５０８、λ５１０を得た。

【００２９】（４）ＤＮＡ配列の決定前記の６個のファージプラークをそれぞれ４００μｌの
ＳＭ緩衝液（ＮａＣｌ５．８ｇ、ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ
２ｇ、５０mlの１Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、
５mlの２％ゼラチンを１リットルのオートクレーブ水に
溶解する）に懸濁し、４℃で一晩、ファージを溶出させ
た。６個のプラーク由来のファージ液それぞれ１０μｌ
を前述のように培養した宿主大腸菌Ｃ６００ｈｆｌ培養
液０．５mlに感染させ、１００mlのＬ−ブロス培地中で
４〜６時間培養し溶菌させた。更に溶菌液を遠心し残渣
を除いて、DNase 及び RNase（共に宝酒造社製）を各５
μｇ／mlの濃度で加え、３７℃で３０分処理した。これ
に１／１０量の２．５Ｍ−ＮａＣｌ、２０％ポリエチレ
ングリコール６０００を加え、４℃、１時間放置した
後、ファージを遠心回収した。回収したそれぞれのファ
ージを２mlのＳＭ緩衝液に溶解し、フェノール処理、フ
ェノール−クロロホルム処理及びクロロホルム処理を行
い、更に１／１０量の３Ｍ酢酸ナトリウムと２倍量のエ
タノールを加えた。これを−７０℃、１時間放置し、Ｄ
ＮＡを遠心回収した。これらのＤＮＡをEcoRＩで処理
し、１％アガロースにて泳動し、ファージより切り出さ
れたＤＮＡ断片を回収して、シーケンス用ベクターＭ13
mp18（宝酒造社製）のEcoRＩサイトにライゲーション
し、サブクローニングを行った。次にそれぞれのサブク
ローンについてそのｃＤＮＡ断片のＤＮＡ配列をキロシ
ーケンス法〔前述のヘニコフらの方法、キロシークエン
スデレーションキット（宝酒造社製）〕にて決定した。

【００３０】λ４０１より得られたサブクローンをＭ13
mp18-401と命名し、これを例としてキロベースシーケン
ス法によるＤＮＡ配列決定方法を以下に説明する。Ｍ13
mp18-401をＭ13mp18のマルチクローニングサイトに切断
部位の存在する制限酵素でそれぞれ切断し、挿入断片の
制限酵素地図を作製した。この中で挿入断片がなく、Ｍ
13mp18-401マルチクローニングサイトの挿入断片側を切
断し、かつ５′突出末端を残して切断する XbaＩと、同
じくマルチクローニングサイトのベクター側を３′突出
末端を残して切断する SphＩで処理した。更に、このプ
ラスミドＤＮＡの５′突出末端側だけを削ることのでき
るエキソヌクレアーゼ III（宝酒造社製）で処理（２５
℃）し、１分間ごとに１０分までサンプリングした。す
なわち、１００μｌの５０mM−トリス−ＨＣｌ（ｐＨ
８．０）、１００mM ＮａＣｌ、５mM ＭｇＣｌ₂、１
０mM ２−メルカプトエタノール含有緩衝液に溶解し、
１８０ユニットのエキソヌクレアーゼ IIIを加えて２５
℃でインキュベートし、１０μｌずつ適時サンプリング
した。更に、これらの反応産物を１００μｌの４０mM
酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）、１００mM ＮａＣｌ、
２mM ＺｎＣｌ₂、１０％グリセロール含有緩衝液中
で、５０ユニット／１００μｌのマングビーンヌクレア
ーゼ（宝酒造社製）を加えて３７℃で１時間インキュベ
ートし、更に７mM トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、
０．１mM ＥＤＴＡ、２０mM ＮａＣｌ、７mM ＭｇＣ
ｌ₂、０．１mM ｄＮＴＰ混合液含有緩衝液中で２ユニ
ット／５０μｌのクレノウフラグメントＤＮＡポリメラ
ーゼ（宝酒造社製）を加えて、３７℃で１５分間インキ
ュベートして平滑末端化を行った。次にＴ４リガーゼ
（宝酒造社製）を用いてライゲーションさせた。これを
コンピテントセルＪＭ１０９（宝酒造社製）にトランス
フォーメーションさせ、Ｌ−培地で一晩培養したＪＭ１
０９３００μｌを含む０．７％アガロース含有Ｌ−培
地に加えて、これを１．５％アガロース含有Ｌ−培地プ
レート上に重層した。これを３７℃で一晩培養してプラ
ークを形成させ、これより常法に従い、プラスミドを得
た。この操作により経時的に挿入ＤＮＡ断片がエキソヌ
クレアーゼで削られた１０個のプラスミドを有する大腸
菌株が得られた。これらの大腸菌株より常法に従い、そ
れぞれの１本鎖ＤＮＡを調製し、ダイデオキシターミネ
ーション法（前述サンガーら）にて塩基配列を決定し
た。更にＭ13mp18-401の挿入断片が逆になったプラスミ
ドについても同様にして塩基配列を決定した。

【００３１】以上のようにλ４０１にクローニングされ
たＤＮＡ断片の塩基配列を両方向から決定した。λ５１
０、λ３０２、λ４０２、λ５０８、λ３０８について
も同様の方法で塩基配列を決定し、α１（Ｖ）の全域を
コードするｃＤＮＡの塩基配列を決定した。これらの塩
基配列をＤＮＡ塩基解析装置のＤＮＡＳＩＳ（宝酒造社
製）によって解析し、配列表の配列番号１に示す塩基配
列のオープンリーデングフレーム及びアミノ酸配列を決
定した。

【００３２】

【発明の効果】本発明により得られるα１（Ｖ）のＤＮ
Ａ塩基配列及びアミノ酸配列により、α１（Ｖ）の遺伝
子レベルでの解析が可能となり、ヒトコラーゲンＶ型に
関連する各種の疾病の遺伝子診断に応用できる。また、
本発明により得られるα１（Ｖ）をコードする遺伝子を
用いて、α１（Ｖ）の、及びα１（Ｖ）関連タンパク質
の遺伝子組換体による工業的レベルでの生産が可能とな
り、医薬品、化粧料又は生体適合性材料などとして有用
な種々の生理活性をもつ生体関連物質の製造に利用でき
る。特に、上述した様に、コラーゲンＶ型は他のコラー
ゲンとは異なる特徴を持つことが期待され、この遺伝子
レベルの解析を可能にしたことは非常に有用である。

【配列表】

配列番号：１配列の長さ：5676 配列の型：核酸鎖の数：２本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：cDNA to mRNA 配列： GTCCCCATGA CCTCCTAAAG TGGTGCGGTC CCTGCTGAGT GCGCTGCCCG GGCCGTGACC 60 CGCGCCCCTG TGCGTCCCCG CGCGCCTCCG AGCGCCCCTG TGCGCCCCGG CCCGCGCCCC 120 GCCGGC ATG GAC GTC CAT ACC CGC TGG AAA GCG CGC AGC GCG CTC CGC CCG 171 Met Asp Val His Thr Arg Trp Lys Ala Arg Ser Ala Leu Arg Pro 1 5 10 15 GGC GCC CCG CTG CTG CCC CCG CTG CTG CTG CTG CTG CTG TGG GCG 216 Gly Ala Pro Leu Leu Pro Pro Leu Leu Leu Leu Leu Leu Trp Ala 20 25 30 CCG CCT CCG AGC CGC GCA GCT CAG CCA GCA GAT CTC CTG AAG GTT 261 Pro Pro Pro Ser Arg Ala Ala Gln Pro Ala Asp Leu Leu Lys Val 35 40 45 CTA GAT TTT CAC AAC TTG CCT GAT GGA ATA ACA AAG ACA ACA GGC 306 Leu Asp Phe His Asn Leu Pro Asp Gly Ile Thr Lys Thr Thr Gly 50 55 60 TTT TGC GCC ACG CGG CGA TCT TCC AAA GGC CCG GAT GTC GCT TAC 351 Phe Cys Ala Thr Arg Arg Ser Ser Lys Gly Pro Asp Val Ala Tyr 65 70 75 AGA GTC ACC AAA GAC GCG CAG CTC AGC GCA CCC ACC AAG CAG CTG 396 Arg Val Thr Lys Asp Ala Gln Leu Ser Ala Pro Thr Lys Gln Leu 80 85 90 TAC CCT GCG TCT GCA TTT CCC GAG GAC TTC TCC ATC CTA ACA ACT 441 Tyr Pro Ala Ser Ala Phe Pro Glu Asp Phe Ser Ile Leu Thr Thr 95 100 105 GTG AAA GCC AAG AAA GGC AGC CAG GCC TTC CTG GTC TCC ATC TAC 486 Val Lys Ala Lys Lys Gly Ser Gln Ala Phe Leu Val Ser Ile Tyr 110 115 120 AAC GAG CAG GGT ATC CAG CAG ATT GGG CTG GAG CTG GGC CGC TCT 531 Asn Glu Gln Gly Ile Gln Gln Ile Gly Leu Glu Leu Gly Arg Ser 125 130 135 CCC GTC TTC CTC TAC GAG GAC CAC ACG GGG AAG CCT GGC CCG GAA 576 Pro Val Phe Leu Tyr Glu Asp His Thr Gly Lys Pro Gly Pro Glu 140 145 150 GAC TAC CCC CTC TTC CGG GGC ATC AAC CTG TCA GAT GGC AAG TGG 621 Asp Tyr Pro Leu Phe Arg Gly Ile Asn Leu Ser Asp Gly Lys Trp 155 160 165 CAC AGA ATT GCT CTC AGC GTC CAC AAG AAA AAT GTC ACC TTG ATC 666 His Arg Ile Ala Leu Ser Val His Lys Lys Asn Val Thr Leu Ile 170 175 180 CTC GAC TGT AAA AAG AAG ACC ACC AAA TTC CTC GAC CGC AGC GAC 711 Leu Asp Cys Lys Lys Lys Thr Thr Lys Phe Leu Asp Arg Ser Asp 185 190 195 CAC CCC ATG ATC GAC ATC AAT GGC ATC ATC GTG TTT GGC ACC CGG 756 His Pro Met Ile Asp Ile Asn Gly Ile Ile Val Phe Gly Thr Arg 200 205 210 ATC CTG GAT GAG GAG GTG TTT GAG GGT GAC ATC CAG CAG CTG CTC 801 Ile Leu Asp Glu Glu Val Phe Glu Gly Asp Ile Gln Gln Leu Leu 215 220 225 TTT GTC TCG GAC CAC CGG GCA GCT TAT GAT TAC TGT GAG CAC TAC 846 Phe Val Ser Asp His Arg Ala Ala Tyr Asp Tyr Cys Glu His Tyr 230 235 240 AGC CCT GAC TGT GAC ACC GCA GTA CCT GAC ACC CCA CAG TCG CAG 891 Ser Pro Asp Cys Asp Thr Ala Val Pro Asp Thr Pro Gln Ser Gln 245 250 255 GAC CCC AAT CCA GAT GAA TAT TAC ACG GAA GGA GAC GGC GAG GGT 936 Asp Pro Asn Pro Asp Glu Tyr Tyr Thr Glu Gly Asp Gly Glu Gly 260 265 270 GAG ACC TAT TAC TAC GAA TAC CCC TAC TAC GAA GAC CCC GAA GAC 981 Glu Thr Tyr Tyr Tyr Glu Tyr Pro Tyr Tyr Glu Asp Pro Glu Asp 275 280 285 CTA GGG AAG GAG CCC ACC CCC AGC AAG AAG CCC GTG GAA GCT GCC 1026 Leu Gly Lys Glu Pro Thr Pro Ser Lys Lys Pro Val Glu Ala Ala 290 295 300 AAA GAA ACC ACA GAG GTC CCC GAG GAG CTG ACC CCG ACC CCC ACG 1071 Lys Glu Thr Thr Glu Val Pro Glu Glu Leu Thr Pro Thr Pro Thr 305 310 315 GAA GCT GCT CCC ATG CCT GAA ACC AGT GAA GGG GCT GGG AAG GAA 1116 Glu Ala Ala Pro Met Pro Glu Thr Ser Glu Gly Ala Gly Lys Glu 320 325 330 GAG GAC GTC GGC ATC GGG GAC TAT GAC TAC GTG CCC AGT GAG GAC 1161 Glu Asp Val Gly Ile Gly Asp Tyr Asp Tyr Val Pro Ser Glu Asp 335 340 345 TAC TAC ACG CCC TCA CCG TAT GAT GAC CTC ACC TAT GGC GAG GGG 1206 Tyr Tyr Thr Pro Ser Pro Tyr Asp Asp Leu Thr Tyr Gly Glu Gly 350 355 360 GAG GAG AAC CCT GAC CAG CCC ACA GAC CCA GGC GCT GGG GCC GAA 1251 Glu Glu Asn Pro Asp Gln Pro Thr Asp Pro Gly Ala Gly Ala Glu 365 370 375 ATT CCC ACC AGC ACC GCC GAC ACC TCC AAC TCC TCC AAT CCA GCT 1296 Ile Pro Thr Ser Thr Ala Asp Thr Ser Asn Ser Ser Asn Pro Ala 380 385 390 CCG CCT CCA GGG GAA GGT GCG GAT GAC TTG GAG GGG GAG TTC ACT 1341 Pro Pro Pro Gly Glu Gly Ala Asp Asp Leu Glu Gly Glu Phe Thr 395 400 405 GAG GAA ACG ATC CGG AAC CTT GAC GAG AAC TAC TAC GAC CCC TAC 1386 Glu Glu Thr Ile Arg Asn Leu Asp Glu Asn Tyr Tyr Asp Pro Tyr 410 415 420 TAC GAC CCC ACC AGC TCC CCG TCG GAG ATC GGG CCG GGA ATG CCG 1431 Tyr Asp Pro Thr Ser Ser Pro Ser Glu Ile Gly Pro Gly Met Pro 425 430 435 GCG AAC CAG GAT ACC ATC TAT GAA GGG ATT GGA GGA CCT CGG GGC 1476 Ala Asn Gln Asp Thr Ile Tyr Glu Gly Ile Gly Gly Pro Arg Gly 440 445 450 GAG AAA GGC CAA AAG GGA GAA CCA GCG ATT ATC GAG CCG GGC ATG 1521 Glu Lys Gly Gln Lys Gly Glu Pro Ala Ile Ile Glu Pro Gly Met 455 460 465 CTC ATC GAG GGC CCG CCT GGC CCA GAA GGC CCC GCG GGT CTT CCC 1566 Leu Ile Glu Gly Pro Pro Gly Pro Glu Gly Pro Ala Gly Leu Pro 470 475 480 GGA CCT CCA GGA ACC ATG GGT CCC ACT GGC CAA GTC GGG GAC CCT 1611 Gly Pro Pro Gly Thr Met Gly Pro Thr Gly Gln Val Gly Asp Pro 485 490 495 GGA GAA AGG GGC CCC CCT GGA CGC CCA GGC CTT CCT GGG GCC GAT 1656 Gly Glu Arg Gly Pro Pro Gly Arg Pro Gly Leu Pro Gly Ala Asp 500 505 510 GGC CTG CCC GGT CCT CCA GGA ACC ATG CTC ATG CTG CCC TTC CGG 1701 Gly Leu Pro Gly Pro Pro Gly Thr Met Leu Met Leu Pro Phe Arg 515 520 525 TTT GGA GGT GGC GGC GAT GCG GGC TCC AAA GGC CCC ATG GTC TCA 1746 Phe Gly Gly Gly Gly Asp Ala Gly Ser Lys Gly Pro Met Val Ser 530 535 540 GCC CAG GAG TCC CAG GCG CAA GCC ATT CTC CAG CAG GCC AGG TTG 1791 Ala Gln Glu Ser Gln Ala Gln Ala Ile Leu Gln Gln Ala Arg Leu 545 550 555 GCA CTG AGG GGA CCA GCT GGC CCG ATG GGT CTC ACA GGG AGA CCT 1836 Ala Leu Arg Gly Pro Ala Gly Pro Met Gly Leu Thr Gly Arg Pro 560 565 570 GGC CCT GTG GGT CCC CCT GGG AGC GGA GGT TTG AAG GGC GAG CCG 1881 Gly Pro Val Gly Pro Pro Gly Ser Gly Gly Leu Lys Gly Glu Pro 575 580 585 GGA GAC GTG GGG CCT CAG GGT CCT CGA GGT GTG CAA GGC CCG CCT 1926 Gly Asp Val Gly Pro Gln Gly Pro Arg Gly Val Gln Gly Pro Pro 590 595 600 GGT CCG GCC GGG AAG CCC GGA AGA CGG GGT CGG GCT GGG AGT GAT 1971 Gly Pro Ala Gly Lys Pro Gly Arg Arg Gly Arg Ala Gly Ser Asp 605 610 615 GGA GCC AGA GGA ATG CCT GGA CAA ACT GGC CCC AAG GGT GAC CGG 2016 Gly Ala Arg Gly Met Pro Gly Gln Thr Gly Pro Lys Gly Asp Arg 620 625 630 GGT TTC GAC GGC CTG GCT GGG TTG CCA GGC GAG AAG GGC CAC AGG 2061 Gly Phe Asp Gly Leu Ala Gly Leu Pro Gly Glu Lys Gly His Arg 635 640 645 GGT GAC CCT GGT CCT TCC GGC CCA CCA GGA CCT CCG GGA GAC GAT 2106 Gly Asp Pro Gly Pro Ser Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Asp Asp 650 655 660 GGA GAA AGG GGT GAC GAC GGA GAA GTT GGG CCC AGG GGG CTG CCT 2151 Gly Glu Arg Gly Asp Asp Gly Glu Val Gly Pro Arg Gly Leu Pro 665 670 675 GGG AAG CCC GGG CCA CGT GGT CTG CTT GGG CCG AAA GGG CCC CCA 2196 Gly Lys Pro Gly Pro Arg Gly Leu Leu Gly Pro Lys Gly Pro Pro 680 685 690 GGT CCT CCC GGA CCT CCC GGT GTC ACG GGT ATG GAC GGC CAG CCG 2241 Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Val Thr Gly Met Asp Gly Gln Pro 695 700 705 GGG CCA AAA GGA AAT GTG GGT CCC CAG GGA GAG CCT GGC CCC CCA 2286 Gly Pro Lys Gly Asn Val Gly Pro Gln Gly Glu Pro Gly Pro Pro 710 715 720 GGA CAG CAG GGT AAT CCA GGC GCC CAG GGT CTT CCA GGC CCC CAG 2331 Gly Gln Gln Gly Asn Pro Gly Ala Gln Gly Leu Pro Gly Pro Gln 725 730 735 GGT GCA ATT GGT CCT CCA GGA GAA AAG GGT CCC TTG GGG AAA CCA 2376 Gly Ala Ile Gly Pro Pro Gly Glu Lys Gly Pro Leu Gly Lys Pro 740 745 750 GGC CTT CCA GGA ATG CCC GGT GCT GAC GGA CCC CCG GGA CAC CCT 2421 Gly Leu Pro Gly Met Pro Gly Ala Asp Gly Pro Pro Gly His Pro 755 760 765 GGC AAA GAA GGC CCT CCA GGA GAG AAA GGA GGT CAG GGT CCA CCT 2466 Gly Lys Glu Gly Pro Pro Gly Glu Lys Gly Gly Gln Gly Pro Pro 770 775 780 GGC CCC CAG GGT CCG ATT GGC TAC CCA GGT CCT CGA GGA GTC AAG 2511 Gly Pro Gln Gly Pro Ile Gly Tyr Pro Gly Pro Arg Gly Val Lys 785 790 795 GGG GCC GAT GGC ATC CGT GGT CTG AAG GGC ACA AAG GGC GAG AAG 2556 Gly Ala Asp Gly Ile Arg Gly Leu Lys Gly Thr Lys Gly Glu Lys 800 805 810 GGT GAA GAC GGC TTT CCT GGG TTT AAA GGA GAC ATG GGC ATC AAG 2601 Gly Glu Asp Gly Phe Pro Gly Phe Lys Gly Asp Met Gly Ile Lys 815 820 825 GGT GAT CGG GGG GAG ATC GGC CCA CCC GGT CCC AGG GGA GAA GAT 2646 Gly Asp Arg Gly Glu Ile Gly Pro Pro Gly Pro Arg Gly Glu Asp 830 835 840 GGC CCT GAA GGC CCA AAG GGT CGC GGA GGT CCC AAT GGT GAC CCC 2691 Gly Pro Glu Gly Pro Lys Gly Arg Gly Gly Pro Asn Gly Asp Pro 845 850 855 GGT CCT CTG GGA CCC CCT GGG GAG AAG GGA AAA CTC GGA GTC CCA 2736 Gly Pro Leu Gly Pro Pro Gly Glu Lys Gly Lys Leu Gly Val Pro 860 865 870 GGG TTA CCA GGG TAT CCA GGA AGA CAA GGA CCA AAG GGC TCT ATT 2781 Gly Leu Pro Gly Tyr Pro Gly Arg Gln Gly Pro Lys Gly Ser Ile 875 880 885 GGA TTC CCT GGA TTT CCT GGC GCC AAT GGA GAG AAG GGC GGC AGG 2826 Gly Phe Pro Gly Phe Pro Gly Ala Asn Gly Glu Lys Gly Gly Arg 890 895 900 GGG ACC CCT GGA AAG CCA GGA CCG CGG GGG CAG CGA GGC CCA ACG 2871 Gly Thr Pro Gly Lys Pro Gly Pro Arg Gly Gln Arg Gly Pro Thr 905 910 915 GGT CCG AGG GGT GAA AGA GGC CCC CGG GGC ATC ACT GGG AAG CCT 2916 Gly Pro Arg Gly Glu Arg Gly Pro Arg Gly Ile Thr Gly Lys Pro 920 925 930 GGC CCC AAG GGC AAC TCC GGA GGT GAC GGC CCA GCT GGC CCT CCT 2961 Gly Pro Lys Gly Asn Ser Gly Gly Asp Gly Pro Ala Gly Pro Pro 935 940 945 GGT GAA CGG GGA CCC AAT GGA CCC CAA GGA CCC ACA GGA TTT CCT 3006 Gly Glu Arg Gly Pro Asn Gly Pro Gln Gly Pro Thr Gly Phe Pro 950 955 960 GGA CCA AAG GGC CCC CCT GGC CCT CCA GGC AAG GAT GGA CTC CCA 3051 Gly Pro Lys Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Lys Asp Gly Leu Pro 965 970 975 GGA CAC CCT GGA CAG AGA GGC GAG ACT GGT TTC CAA GGC AAG ACC 3096 Gly His Pro Gly Gln Arg Gly Glu Thr Gly Phe Gln Gly Lys Thr 980 985 990 GGC CCT CCA GGC CCC CCC GGC GTG GTC GGC CCT CAG GGT CCC ACG 3141 Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Val Val Gly Pro Gln Gly Pro Thr 995 1000 1005 GGA GAA ACG GGC CCA ATG GGT GAG CGT GGC CAC CCT GGG CCC CCT 3186 Gly Glu Thr Gly Pro Met Gly Glu Arg Gly His Pro Gly Pro Pro 1010 1015 1020 GGA CCC CCC GGT GAA CAG GGG CTT CCG GGC CTT GCT GGA AAA GAA 3231 Gly Pro Pro Gly Glu Gln Gly Leu Pro Gly Leu Ala Gly Lys Glu 1025 1030 1035 GGG ACG AAG GGT GAC CCA GGC CCT GCA GGC CTC CCT GGG AAA GAT 3276 Gly Thr Lys Gly Asp Pro Gly Pro Ala Gly Leu Pro Gly Lys Asp 1040 1045 1050 GGC CCT CCA GGA TTA CGT GGT TTC CCT GGG GAC CGA GGG CTT CCT 3321 Gly Pro Pro Gly Leu Arg Gly Phe Pro Gly Asp Arg Gly Leu Pro 1055 1060 1065 GGT CCA GTG GGA GCT CTT GGA CTG AAA GGC AAT GAA GGG CCC CCT 3366 Gly Pro Val Gly Ala Leu Gly Leu Lys Gly Asn Glu Gly Pro Pro 1070 1075 1080 GGC CCA CCA GGC CCT GCG GGA TCT CCA GGG GAG AGA GGT CCA GCT 3411 Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Ser Pro Gly Glu Arg Gly Pro Ala 1085 1090 1095 GGA GCC GCT GGG CCC ATC GGA ATT CCA GGG AGA CCT GGG CCC CAG 3456 Gly Ala Ala Gly Pro Ile Gly Ile Pro Gly Arg Pro Gly Pro Gln 1100 1105 1110 GGA CCC CCA GGG CCG GCA GGA GAG AAA GGG GCT CCT GGC GAG AAA 3501 Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Glu Lys Gly Ala Pro Gly Glu Lys 1115 1120 1125 GGC CCA CAA GGC CCA GCT GGC CGA GAC GGT CTC CAG GGG CCT GTG 3546 Gly Pro Gln Gly Pro Ala Gly Arg Asp Gly Leu Gln Gly Pro Val 1130 1135 1140 GGG CTC CCG GGT CCA GCT GGC CCT GTG GGT CCC CCT GGA GAA GAC 3591 Gly Leu Pro Gly Pro Ala Gly Pro Val Gly Pro Pro Gly Glu Asp 1145 1150 1155 GGA GAT AAG GGA GAG ATC GGG GAG CCG GGG CAG AAA GGA AGC AAG 3636 Gly Asp Lys Gly Glu Ile Gly Glu Pro Gly Gln Lys Gly Ser Lys 1160 1165 1170 GGG GAC AAA GGA GAA CAG GGT CCT CCT GGG CCT ACA GGT CCT CAA 3681 Gly Asp Lys Gly Glu Gln Gly Pro Pro Gly Pro Thr Gly Pro Gln 1175 1180 1185 GGC CCC ATC GGA CAG CCA GGC CCC TCT GGA GCT GAC GGC GAG CCG 3726 Gly Pro Ile Gly Gln Pro Gly Pro Ser Gly Ala Asp Gly Glu Pro 1190 1195 1200 GGG CCT CGG GGC CAG CAG GGC CTT TTC GGG CAG AAA GGT GAT GAA 3771 Gly Pro Arg Gly Gln Gln Gly Leu Phe Gly Gln Lys Gly Asp Glu 1205 1210 1215 GGT CCC AGA GGC TTT CCT GGA CCC CCT GGG CCA GTG GGG CTG CAG 3816 Gly Pro Arg Gly Phe Pro Gly Pro Pro Gly Pro Val Gly Leu Gln 1220 1225 1230 GGT TTG CCA GGA CCT CCA GGC GAG AAG GGT GAG ACA GGA GAC GTG 3861 Gly Leu Pro Gly Pro Pro Gly Glu Lys Gly Glu Thr Gly Asp Val 1235 1240 1245 GGC CAG ATG GGC CCC CCG GGT CCC CCT GGC CCC CGA GGA CCC TCC 3906 Gly Gln Met Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Arg Gly Pro Ser 1250 1255 1260 GGA GCT CCA GGT GCT GAT GGC CCA CAA GGT CCC CCA GGT GGA ATA 3951 Gly Ala Pro Gly Ala Asp Gly Pro Gln Gly Pro Pro Gly Gly Ile 1265 1270 1275 GGA AAC CCT GGT GCA GTG GGA GAG AAG GGC GAG CCT GGC GAA GCA 3996 Gly Asn Pro Gly Ala Val Gly Glu Lys Gly Glu Pro Gly Glu Ala 1280 1285 1290 GGT GAG CCT GGC CCT TCC GGG AGA AGC GGC CCC CCG GGA CCC AAA 4041 Gly Glu Pro Gly Pro Ser Gly Arg Ser Gly Pro Pro Gly Pro Lys 1295 1300 1305 GGA GAA AGG GGA GAG AAG GGC GAG TCA GGC CCT TCA GGT GCT GCC 4086 Gly Glu Arg Gly Glu Lys Gly Glu Ser Gly Pro Ser Gly Ala Ala 1310 1315 1320 GGA CCC CCT GGA CCC AAA GGC CCT CCC GGA GAT GAT GGT CCC AAA 4131 Gly Pro Pro Gly Pro Lys Gly Pro Pro Gly Asp Asp Gly Pro Lys 1325 1330 1335 GGC AGC CCT GGC CCA GTG GGT TTT CCT GGA GAT CCT GGC CCC CCC 4176 Gly Ser Pro Gly Pro Val Gly Phe Pro Gly Asp Pro Gly Pro Pro 1340 1345 1350 GGA GAG CCT GGC CCC GCG GGT CAA GAT GGT CCC CCT GGT GAC AAA 4221 Gly Glu Pro Gly Pro Ala Gly Gln Asp Gly Pro Pro Gly Asp Lys 1355 1360 1365 GGA GAT GAT GGT GAA CCC GGG CAG ACG GGA TCC CCC GGC CCT ACT 4266 Gly Asp Asp Gly Glu Pro Gly Gln Thr Gly Ser Pro Gly Pro Thr 1370 1375 1380 GGT GAA CCA GGT CCA TCG GGG CCT CCA GGA AAA AGG GGT CCC CCA 4311 Gly Glu Pro Gly Pro Ser Gly Pro Pro Gly Lys Arg Gly Pro Pro 1385 1390 1395 GGC CCC GCA GGC CCC GAA GGC AGA CAG GGA GAG AAA GGG GCC AAG 4356 Gly Pro Ala Gly Pro Glu Gly Arg Gln Gly Glu Lys Gly Ala Lys 1400 1405 1410 GGA GAA GCC GGC TTG GAA GGC CCT CCT GGG AAG ACT GGC CCC ATC 4401 Gly Glu Ala Gly Leu Glu Gly Pro Pro Gly Lys Thr Gly Pro Ile 1415 1420 1425 GGC CCC CAG GGG GCC CCT GGG AAG CCC GGA CCG GAT GGC CTT CGA 4446 Gly Pro Gln Gly Ala Pro Gly Lys Pro Gly Pro Asp Gly Leu Arg 1430 1435 1440 GGG ATC CCT GGC CCT GTG GGA GAA CAA GGT CTC CCA GGA TCC CCA 4491 Gly Ile Pro Gly Pro Val Gly Glu Gln Gly Leu Pro Gly Ser Pro 1445 1450 1455 GGC CCG GAC GGT CCC CCC GGC CCC ATG GGT CCC CCA GGA CTT CCC 4536 Gly Pro Asp Gly Pro Pro Gly Pro Met Gly Pro Pro Gly Leu Pro 1460 1465 1470 GGC CTC AAA GGA GAT TCT GGT CCC AAA GGT GAA AAG GGT CAT CCA 4581 Gly Leu Lys Gly Asp Ser Gly Pro Lys Gly Glu Lys Gly His Pro 1475 1480 1485 GGC CTG ATC GGG CTC ATC GGT CCT CCG GGT GAA CAG GGT GAG AAG 4626 Gly Leu Ile Gly Leu Ile Gly Pro Pro Gly Glu Gln Gly Glu Lys 1490 1495 1500 GGC GAC CGT GGT CTC CCT GGC CCC CAG GGC TCC TCC GGT CCT AAG 4671 Gly Asp Arg Gly Leu Pro Gly Pro Gln Gly Ser Ser Gly Pro Lys 1505 1510 1515 GGA GAA CAG GGT ATC ACT GGT CCT TCT GGC CCG ATT GGG CCT CCT 4716 Gly Glu Gln Gly Ile Thr Gly Pro Ser Gly Pro Ile Gly Pro Pro 1520 1525 1530 GGG CCC CCT GGC CTG CCG GGT CCG CCT GGT CCA AAA GGT GCT AAG 4761 Gly Pro Pro Gly Leu Pro Gly Pro Pro Gly Pro Lys Gly Ala Lys 1535 1540 1545 GGC TCC TCG GGT CCA ACT GGC CCG AGG GGT GAG GCA GGC CAC CCA 4806 Gly Ser Ser Gly Pro Thr Gly Pro Arg Gly Glu Ala Gly His Pro 1550 1555 1560 GGA CCC CCA GGC CCC CCG GGC CCC CCG GGA GAG GTC ATC CAG CCC 4851 Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Glu Val Ile Gln Pro 1565 1570 1575 CTG CCA ATC CAG GCA TCC AGG ACG CGG CGG AAC ATC GAC GCC AGC 4896 Leu Pro Ile Gln Ala Ser Arg Thr Arg Arg Asn Ile Asp Ala Ser 1580 1585 1590 CAG CTG CTG GAC GAC GGG AAT GGC GAG AAC TAC GTG GAC TAC GCG 4941 Gln Leu Leu Asp Asp Gly Asn Gly Glu Asn Tyr Val Asp Tyr Ala 1595 1600 1605 GAC GGC ATG GAA GAG ATC TTC GGC TCT CTC AAC TCT CTG AAG CTG 4986 Asp Gly Met Glu Glu Ile Phe Gly Ser Leu Asn Ser Leu Lys Leu 1610 1615 1620 GAG ATT GAG CAG ATG AAA CGG CCC CTG GGC ACG CAG CAG AAC CCC 5031 Glu Ile Glu Gln Met Lys Arg Pro Leu Gly Thr Gln Gln Asn Pro 1625 1630 1635 GCC CGC ACC TGC AAG GAC CTG CAG CTC TGC CAC CCC GAC TTC CCA 5076 Ala Arg Thr Cys Lys Asp Leu Gln Leu Cys His Pro Asp Phe Pro 1640 1645 1650 GAT GGT GAA TAC TGG GTC GAT CCT AAC CAA GGA TGC TCC AGG GAT 5121 Asp Gly Glu Tyr Trp Val Asp Pro Asn Gln Gly Cys Ser Arg Asp 1655 1660 1665 TCC TTC AAG GTT TAC TGC AAC TTC ACA GCC GGG GGG TCG ACA TGC 5166 Ser Phe Lys Val Tyr Cys Asn Phe Thr Ala Gly Gly Ser Thr Cys 1670 1675 1680 GTC TTC CCT GAC AAG AAG TCC GAA GGG GCC AGA ATC ACT TCT TGG 5211 Val Phe Pro Asp Lys Lys Ser Glu Gly Ala Arg Ile Thr Ser Trp 1685 1690 1695 CCC AAA GAA AAC CCG GGC TCC TGG TTC AGT GAA TTC AAG CGT GGG 5256 Pro Lys Glu Asn Pro Gly Ser Trp Phe Ser Glu Phe Lys Arg Gly 1700 1705 1710 AAA CTG CTC TCC TAT GTG GAC GCC GAG GGC AAC CCT GTG GGT GTG 5301 Lys Leu Leu Ser Tyr Val Asp Ala Glu Gly Asn Pro Val Gly Val 1715 1720 1725 GTA CAG ATG ACC TTC CTG CGG CTG CTG AGC GCC TCT GCC CAC CAG 5346 Val Gln Met Thr Phe Leu Arg Leu Leu Ser Ala Ser Ala His Gln 1730 1735 1740 AAC GTC ACC TAC CAC TGC TAC CAG TCA GTG GCC TGG CAG GAC GCA 5391 Asn Val Thr Tyr His Cys Tyr Gln Ser Val Ala Trp Gln Asp Ala 1745 1750 1755 GCC ACG GGC AGC TAC GAC AAG GCC CTC CGC TTC CTG GGC TCC AAC 5436 Ala Thr Gly Ser Tyr Asp Lys Ala Leu Arg Phe Leu Gly Ser Asn 1760 1765 1770 GAC GAG GAG ATG TCC TAT GAC AAC AAC CCC TAC ATC CGC GCC CTG 5481 Asp Glu Glu Met Ser Tyr Asp Asn Asn Pro Tyr Ile Arg Ala Leu 1775 1780 1785 GTG GAC GGC TGT GCT ACC AAG AAA GGC TAC CAG AAG ACG GTT CTG 5526 Val Asp Gly Cys Ala Thr Lys Lys Gly Tyr Gln Lys Thr Val Leu 1790 1795 1800 GAG ATC GAC ACC CCC AAA GTG GAG CAG GTG CCC ATC GTG GAC ATC 5571 Glu Ile Asp Thr Pro Lys Val Glu Gln Val Pro Ile Val Asp Ile 1805 1810 1815 ATG TTC AAT GAC TTC GGT GAA GCG TCA CAG AAA TTT GGA TTT GAA 5616 Met Phe Asn Asp Phe Gly Glu Ala Ser Gln Lys Phe Gly Phe Glu 1820 1825 1830 GTG GGG CCG GCT TGC TTC ATG GGC TAGGAGCCGC CGAGCCCGGG 5660 Val Gly Pro Ala Cys Phe Met Gly 1835 CTCCCGAGCC GAATTC 5676 配列番号：2 配列の長さ：10 配列の型：アミノ酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチドフラグメント型：中間型フラグメント配列の特徴：2,5 S hydroxyproline 配列番号：3 配列の長さ：29 配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）アンチセンス：NO 配列の特徴：1-29 E primer 配列： CCTGGAATTC CTCCTGGTGA TGATGGAGA 29 配列番号：4 配列の長さ：35 配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）アンチセンス：YES 配列の特徴：1-35 E primer 配列： TACGGAATTC TAATCCACGT TGCCCAGGGT GTCCT 35 配列番号：5 配列の長さ：8 配列の型：アミノ酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチドフラグメント型：中間型フラグメント配列の特徴：2,8 S hydroxyproline 配列番号：6 配列の長さ：23 配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）アンチセンス：NO 配列の特徴：1-23 E primer 3,6 E i 配列： GCNCCNGGTA TGGAYGGCCA RCC 23 配列番号：7 配列の長さ：7 配列の型：アミノ酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチドフラグメント型：中間型フラグメント配列番号：8 配列の長さ：20 配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）アンチセンス：YES 配列の特徴：1-23 E primer 3,6,9 E i 配列： GGNCCNTTNG CNCCNGGCAT 20

【図面の簡単な説明】

【図１】α１（Ｖ）の遺伝子と本発明で用いられるプラ
イマーの位置の関係を示す図である。

【図２】α１（Ｖ）の遺伝子の制限酵素地図及び各クロ
ーンの関係を示す図である。

【図３】α１（Ｖ）タンパク質の模式的構造を示す図で
ある。

【図４】α１（Ｖ）とα１（XI）の構造の比較図であ
る。

【図５】各コラーゲンのＮ末端非コラーゲン領域中の
（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）配列の繰返し構造の相関を示す図で
ある。

【図６】各コラーゲンのコラーゲン領域中のグリシン残
基についてのコドンユーセージを示す図である。

【図７】各コラーゲンのコラーゲン領域中のプロリン残
基についてのコドンユーセージを示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者岡本伸子滋賀県大津市瀬田３丁目４番１号寳酒造株式会社中央研究所内 (72)発明者野田晃弘滋賀県大津市瀬田３丁目４番１号寳酒造株式会社中央研究所内 (72)発明者矢追義人神奈川県横浜市港北区箕輪町１−30−１− 212 (72)発明者加藤郁之進滋賀県大津市瀬田３丁目４番１号寳酒造株式会社中央研究所内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】配列表の配列番号１で表されるＤＮＡ配
列であることを特徴とするヒトコラーゲンＶ型遺伝子。