JPS6228A - ヒトフォン・ヴィレブランド因子のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするｃＤＮＡ、及び該ｃＤＮＡを含有する宿主細胞 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 フォン・ヴィレブランド因子（ｖＷＦ）は約２２５ｋＤ
の分子量（ＭＷ）を有する明らかに１つの糖たんぱく質
から構成されている大きな多量体プラスマたんぱく質で
ある。これらのサブユニットは、ジスルフィド結合によ
って互いに連結されている。プラスマ内で、ｖＷＦは、
２量体から５０以上のサブユニットよりなる多量体の範
囲で、多量体として環化している。２量体は、恐ら＜Ｃ
−末端において、可撓性の″棒状″領域によって結合さ
れている２つのサブユニットから成っており、多量化に
おけるプロトマーであると考えられている。プロトマー
は、大きな、恐らく末端がＮである球状の領域によって
連結されて、多量体を形成する。

ｖＷＦは、内皮細胞と巨核球とによって合成される。こ
のたんぱく質は、まず、　２６０ｋＤのグリコジル化前
駆体として作られ、次いで、炭化水素処理、硫酸塩化、
二量化、多量化及びたんぱく分解開裂を行ない、完成２
２５ｋＤサブユニツトが生成する（Ｓｐｏｒｎ、　Ｌ、
Ａ、、　ｓｔ　ａｌ、（１９８５）ヒト巨核球における
ｖｌＦたんぱく質の生合成、　Ｊ、　Ｃ１１ｎ。

丁ｎｖｅｓｔ、　　７６、　１１０２−１１０６；　　
Ｗａｇｎｅｒ、’Ｄ、Ｄ、、　　ｅｔ　　ａｌ。

（１９８４）　Ｊ、　ｏｆ　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ
　９９．２１２３−２１３０）。

ｖＷＦは、内皮細胞内のヴアイベルーパラーデ体中に貯
えられていることが示されている。これらの小器官が、
前駆体たんぱく質の処理において、役割を演じているこ
とを否定することはできない。

ｖＷＦは、止血における臨界的段階に関与する。

それは、血管損傷後の血小板−血管壁相互作用に含まれ
、血小板栓を形成することになる。ＶＵＦには、血小板
糖たんぱく質ＩＢ　（Ｊｅｎｋｉｎｓ、　Ｃ，Ｓ。

Ｐ、、ａｔ　ａｌ、（１９７６）Ｊ、Ｃ１１ｎ、Ｉｎｖ
ｅｓｔＪ４１，１２１２−１２２２）、１１Ｂ／ｕＩＡ
（Ｆｕｊｉｍｏｔｏ、　Ｔ、、　ａｔ　ａｌ、　（１９
８２））腺腫ジホスフェートが、フォン・ヴィレブラン
ド因子をヒト血小板に結合させる、Ｎａｔｕｒｅ　２９
７．１５４−１５６）、コラーゲンタイプＩ及び■、並
びに、内皮下層中の未確認の他の成分と特別な相互作用
を示すたんぱく質領域が認められている。これらの確認
は、ｖＷＦの特殊な相互作用を抑制することのできるモ
ノクロナール抗ｖＷＦ抗体に関する研究に基づくもので
ある。ｖＷＦたんぱく質の構造−機能関係の深い解析に
は、全長ｖＷＦｃＤＮＡが不可欠であろう。はっきりと
定められた変異をこのｃＤＮＡに導入し、その変異ｃＤ
ＮＡを適当な宿主内で発現させることによって、ＶνＦ
たんぱく質内の機能領域の詳細な位置確認が行なえるで
あろう。最近１本発明者等は、部分的ＶＬＩＩＦＣＤＮ
Ａ連鎖をクローン形成している（Ｌｙｎｃｈ、　Ｄ、Ｃ
，、ｅｔ　ａｌ、（１９８５）Ｃｅｌｌ　４１．４９−
５６；　Ｇｉｎｓｈｕｒｇｔ　Ｍ、、　ｅｔ　ａｌ、（
１９８５）　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２６０．
３９３１−３９３６；Ｖｅｒｗｅｉｊ、　Ｃ，Ｌ、、　
ｅｔ　ａＬ、（１９８５）Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ
　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　１３．４６９９−４７１７．オラ
ンダ特許出願８５．００９６１に基づ＜　”、５ａｄｌ
ｅｒ、　Ｊ、Ｅ、、　ｅｔ　ａｌ、（１９８５）Ｐｒｏ
ｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８
２．６３９４−６３９８）。

ｖＷＦメツセンジャーＲＮＡに、約９，０００ｎｔに延
びる短かい３′未翻訳領域（１３６ｎｔ）が存在するこ
とから、ＶｖＦ用の前駆体たんぱく質が、報告されてい
る２６０ｋＤよりも可成大きい分子量を持っているもの
と推測される（Ｗａｇｎｅｒ、　Ｄ、Ｄ、、　ａｔ　ａ
ｌ。

（１９８４）　Ｊ、　ｏｆ　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ
　９９．２１２３−２１３０１゜全長ｖＷＦｃＤＮＡに
よって、前駆体の分子量のなぞが解明され、その処理過
程が確認され、そして、基本構造が確立されるであろう
。

本発明は、全ｖＷＦメツセンジャーＲＮＡに及び、全長
機能性ｖＷＦｃＤＮＡに構成されるｃＤＮＡの単離及び
ヌクレオチド連鎖に関する。更に、本発明は、上記ｖＷ
ＦｃＤＮＡを含有するプラスミド及びファージ、並びに
該プラスミド又はファージを含有するバクテリア及び真
菌のような微生物、動物又はヒト細胞に関する。また、
上記宿主を培養することによって調製されたたんぱく質
及び得られたたんぱく質の生物学的活性型のものを含む
薬剤組成物も１本発明の範囲内に含まれる。この点で、
このような薬剤組成物によって、健康な人間の血液サン
プルから回収されたｖＷＦたんぱく質の投与に課せられ
る安全性の問題を打開できることが強調される。

発明の基礎を形成する研究を達成するために、次の物質
及び方法が用いられた。

物質及び方法 ｃＤＮＡクローニング 全ＲＮＡは、ヒトの調帯の静脈から誘導され、試験管内
で培養された内皮細胞から精製された［Ｖｅｒｗａｉｊ
、　Ｃ，Ｌ、、　ｅｔ　ａｌ、（１９８５）Ｎｕｃｌｅ
ｉｃ　Ａｃ１ｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ　１３．４６９９−
４７１７．オランダ特許出願８５゜００９６１に基づく
］プライマ支配ｃＤＮＡは、本質的にプロトコルに従っ
て合成された（Ｇｕｂｌｅｒ、　ＩＪ、ｔ　ｅｔ　ａｌ
、、　（１９８３）　Ｇｅｎｅ　２５．２６３−２６９
；　Ｔｏｏｌｅ、　Ｊ、Ｊ。

、　ａｔ　ａｌ、、　（１９８５）　Ｎａｔｕｒｅ　３
１２．３４２−３４７）。

ｃＤＮＡ合或は、最終濃度がそれぞれ２０ｍＭ及び０．
１％になるまで、ＥＤＴＡとＳＤＳを加えることにより
抑制された。ｃＤＮＡ生成物を、フェノール−クロロホ
ルムで抽出し、次いでエタノールで沈澱させ、セファデ
ックス（Ｓｅｐｈａｄａｘ）　Ｇ−５０でクロマトグラ
フィーにより精製した。ヌクレオチド６９０１から６９
２１までに対して相補性のプライマＡ（５’ＣＡＣＡＧ
ＧＣＣＡＣＡＣＧＴＧＧＧＡＧＣ３’　）で、プライマ
支配ｃＤＮＡを合成する場合は、ｃＤＮＡ生成物をＢｇ
ｌＩＩ　（６８３６及び２１４１位置）及びＫｐｎ　Ｉ
　（４７４８位置）で消化した。次いで、消化ｃＤＮＡ
を、セファローズ（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）ＣＬ−４Ｂコ
ラムでクロマトグラフィーによりサイズ分別した。約６
００ｂＰよりも大きいｃＤＮＡを含む両分を、プラスミ
ドｐＭＢＬ１１に結紮し。

Ｂｇｌ　ｎとＫｇｎ　Ｉで消化した。大腸菌［ＩＨＩ株
を使用して、約１５，０００の個々のコロニーからなる
ｃＤＮＡ集団を作り、それを２つのオリゴヌクレオチド
プローブ（Ｂ及びＣ）でスクリーニングした。プローブ
Ｂ　（５’　ＧＡＧＧＣＡＧＧＡＴＴＴＣＣＧＧＴＧＡ
Ｃ３’　）は、ヌクレオチド４８１９から４８３９まで
に対して相補性であり、プラスミドｐｖＷＦ２０８４の
単離に用いられ。

２．０８４ｂＰ　Ｂｇｌ　ＩＩ　−ｐｎ　Ｉ　ｖＷＦｃ
ＤＮＡプラグメントを含んでいた。一方、プローブＣ（
５’　ＣＡＧＧＧＡＣＡＣＣＴＴＴＣＣＡＧＧＧＣ３’
　）は２４６７から２４８７までに対して相補性であり
、プラスミドｐｖＶＦ２６００の検出に用いられ、約２
，６００ｂｐのＫｐｎ　Ｉ　−Ｂｇｌ　ＩＩ　ｖすＦｃ
ＤＮＡプラグメントを含有していた。

プライマ支配合成のためにプローブＣを使用して、得ら
れたｃＤＮＡ生成物を２部に分割した。

１部をＣ末端として、前述のようにＧ末端プラスミドｐ
ｕｃ　９に焼鈍した（Ｖｅｒｗｅｉｊ、　Ｃ，Ｌ、、ｅ
ｔ　ａｌ。

（１９８５）　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅ
ａｒｃｈ　１３．４６９９−４７１７、オランダ特許出
願８５．００９６１に基づく〕。そして、大腸菌ＤＨＩ
を転換するのに使用した。６，０００の個々のコロニー
を、ｐｖＷＦ２６００ＤＮＡの“ニック翻訳”５７５ｂ
Ｐ　Ｂｇｌ　ＩＩ　−ＢａｍＨＩ　ｖＷＦｃＤＮＡで雑
種形成した。

最も長い挿入体（約１，８００ｂＰ、　ｐｖＷＦ１８０
０で示される）でプラスミドを含有する陽性クローンを
、更に研究するために選んだ。プライマＣ支配ｃＤＮＡ
生成物を、ＥｃｏＲＩメチラーゼで処理し、次いで、Ｔ
　４−ＤＮＡポリメラーゼとｄＮＴＰで処理して、末端
を純化させた（Ｍａｎｉａｔｉｓ、　Ｔ、、　ｅｔ　ａ
ｌＪ１９８２）分子クローニング研究所マニュアル、コ
ールドスプリングハーバ−研究所（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉ
ｎｇ　Ｈａｒｂ。

ｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ））。リン酸化したＥｃｏＲ
Ｉリンカ−にューイングランドバイオラブズ、ベバリー
、ＭＡ）をｃＤＮＡ生成物の末端に結紮し、未反応成分
を、セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ−５０クロ
マトグラフイによって除去した。ｐｖｗＦ１８００ＤＮ
ＡのｖＷＦｃＤＮＡ挿入体の５′末端の下流測的３５０
ｂＰに位置するＸｈｏ　１部位を他の選択のために使用
した。過剰のＥｃｏＲＩとＸｈｏ　Ｉで消化した後、セ
ファローズ（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）ＣＬ−４Ｂでのクロ
マトグラフィーが、消化したＥｃｏＲＩリンカ−を除去
するのに使用された。最終生成物を、ＥｃｏＲＩとＸｈ
ｏ　Ｉで消化し、大腸菌ＤＨＩを転換するのに使用した
プラスミドｐＭＢＬＩＩＤＮＡに結紮した。約１０，０
００の個々のコロニーの集団を、プラスミドρｖＷＦ１
８００から、″ニック翻訳”３５０ｂＰ　Ｘｈｏ　Ｉ−
）１ｉｎｄＩ［ＩｖＷＦｃＤＮＡフラグメントで雑種形
成した。このフラグメントのＨｉｎｄ　ｍ部位は、ベク
ターρＵＣ９のポリリンカーから誘導されている。最も
長い挿入体（約１，３３０ｂＰ、　ｐｖＷＦ１３３０で
示される）を含有する陽性クローンについて、更に研究
した。

Ｓ１ヌクレア一ゼ保護分析： Ｓ１ヌクレアーゼ保護実験のために、ｖＷＦｃＤＮＡ（
フラグメント■、第１図）で構成されている２゜３９０
ｂＰセグメント（Ｘｈｏ　Ｉ　−Ｋｐｎ　Ｉ　）を含有
するプラスミドｐｖｌＦ２６００からの約５　、３００
ｂＰのＸｈｏ　Ｉ　−ＥｃｏＲＩ（プローブ■）を使用
した。プローブ■は、７３５ｂＰ　Ｘｂａ　Ｉ　−Ｘｈ
ｏ　Ｉ　ｖＷＦｃＤＮＡセグメント（フラグメント■、
第１図）を含有するプラスミドｐｖＷＦ１３３０からの
４，８００ｂＰ　Ｘｂａ　ｌ　−ＥｃｏＲＩフラグメン
トであった。フラグメントの３′末端には、凹部末端を
うめるために、ＤＮＡポリメラーゼ！（大きいフラグメ
ント）にューイングランドバイオラブズ、ベバリー、Ｍ
Ａ）を使用して、標識をつけた（Ｍａｎｉａｔｉｇ、　
Ｔ、、　ｅｔ　ａＬ、（１９８２）分子クローニング研
究所マニュアル、コールドスプリングハーバ−研究所（
Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ））。

次いで、これらのプローブを、０．７％低溶融アガロー
スゲル上で電気泳動により単離し、精製した（Ｉｌｉｅ
ｓｌａｎｄ、　Ｌ、　（１９７９）　Ａｎａｌ、　Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ、　４８゜３０５−３０９）。

３つの他のｖｗＦｃＤＮＡフラグメントを二重鎖Ｍ１３
＋ａｐ１ｇ中でサブクローン形成し、プローブとじて使
用した。その末端に、　ＤＮＡポリメラーゼＩ（大きい
フラグメント）を有する一般的なＭ１３プライマからの
伸長により抗反応性ＤＮＡを均一に標識づけした。サブ
クローン形成フラグメントは、プラスミドｐｖＷＦ１８
００（フラグメント■、第１図）の１，１４４ｂＰ　Ｘ
ｈｏ　Ｉ−Ｈｉｎｄｍフラグメント、プラスミドｐｖＷ
Ｆ１３３０（フラグメントＩ、第１図）の５８５ｂＰ　
Ｘｂａ　Ｉ　−ＥｃｏＲＩフラグメント、及びプラスミ
ドｐｖＷＦ２６００（フラグメント■、第１図）の５７
５ｂｐ　ＢａｍＨｒ　−Ｂｇｌ　ＩＩフラグメントであ
った。Ｍ１３プライマで開始されたＤＮＡ合成が終った
後、二重鎖ＤＮＡを、フラグメント■についてはＨｉｎ
ｄ　ＩＩＩとＰｖｕ　ＩＩとで消化しくプローブ■を生
成）、フラグメント■についてはＸｂａ　ＩとＥｃｏＲ
Ｉとで消化しくプローブ■を形成）、フラグメント■に
ついてはＢａｍＨｌとＰｖｕ　ｎとで消化しくプローブ
■を生成）だ。

プローブ■、■、■及びＶの構造原理は、それらが内皮
ＲＮＡと相補性のないベクターＤＮＡのセグメントを含
有しているということである。例えば、プローブ■及び
■は、Ｍ１３ｍｐ１８から誘導された約２００ｂＰのも
のを含有する。これらのプローブを、５％ポリアクリル
アミド−８Ｍ尿素ゲル上で電気泳動し、主要フラグメン
トを単離した（Ｍａｘａｍ　Ａ、Ｇ、、　ｅｔ　ａｌ、
（１９８０）　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ。

並、　４９９−５６０３゜ ＳＬヌクレアーゼ保護実験を、本質的に文献記載のよう
にして行った（Ｂｅｒｋ、　Ａ、Ｊ、　ａｔ　ａｌ、（
１９７７）Ｃｅｌｌ　１２．７２１−７３２）。１μｇ
のヒト内皮ポリＡＲＮＡを、８０℃で１０分間加熱した
１０，０００−１００，０００力ウント／分の放射性標
識プローブに加え、次いで、プローブＩ、■、■及びＶ
については６０℃で一晩培養し、プローブ■については
５７℃で一晩培養した。２００単位／ｍＱの８１ヌクレ
アーゼ（ベチェスダ研究所、ガイサーズブルグ、Ｍｄ）
で、４５℃にて２０分間消化した。未消化ＤＮＡをエタ
ノールで沈澱させ、ペレットを、０．８％アルカリアガ
ロースゲル又は６％ポリアクリルアミド系ゲル上で電気
泳動させるために、適当な緩衝液に溶解した（Ｍａｎｉ
ａｔｉｓ、　Ｔ、、　ｅｔ　ａｌ、　（１９８２）分子
クローニング研究所マニュアル、コールドスプリングバ
ーバー研究所（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）。始めの方法は、プローブ■及
び■に用いられ、第２の方法は、プローブ■、■及びＶ
に適用された。

全　ＶすＦｃＤＮＡの　み立て ３′未翻訳領域（８５６２位置）内で、Ｈｉｎｄ　ｍ部
位（２２３５位置）からＳａｃ　１部位へ延びる約６，
３３１ｂＰの連続ＶすＦｃＤＮＡセグメントを含むプラ
スミドｐＳＰ６３３０ｖＷＦの構成について、次のｖＷ
ＦｃＤＮＡを単離した。

：ｐｖＷＦ２６００ＤＮＡからの２，５１７ｂＰ　Ｈｉ
ｎｄＩ［Ｉ−Ｋｐｎ　Ｉフラグメント（２２３６位置か
ら４７５３位置まで）、ｐｖＷＦ２０８４ＤＮＡからの
２．０８４ｂＰ　Ｋｐｎ　Ｉ　−Ｂｇｌ　ＩＩフラグメ
ント（４７５３位置から６８３７位置まで）、及びｐｖ
ＷＦ２２８０ＤＮＡからの１，７３０ｂＰ　Ｂｇｌ　Ｉ
Ｉ　−５ａｃ　Ｉフラグメント（６８３７位置から８５
６７位置まで）、これら３つのｖＶＦｃＤＮＡフラグメ
ントは、同時に、ベクターｐＳＰ６４中に結紮され（Ｍ
ｅｌｔｏｎ、　Ｄ、Ａ、、　ａｔ　ａｌ、（１９８４）
　Ｎｕｃｌ。

Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　１２．７０３５−７０
５６）、Ｈｉｎｄ　ｍとＳａｃ■とで消化された。得ら
れた転換体の約半分は、制限酵素分析によって証明され
るように、約６゜３３１ｂＰの所望のｖｌｉｌＦｃＤＮ
Ａ挿入体を有するプラスミド（ｐＳＰ６３３０ｖＷＦで
示される）を含有していた。

全長ｖＷＦｃＤＮＡを含むプラスミドｐＳＰ８８００ｖ
ｌｉｌＦを構成するために、次のフラグメントを単離し
た。

プラスミドｐＳＰ６３３０ｖｗＦの６，３３０ｂＰ　Ｈ
ｉｎｄｌ［［−ＥｃｏＲＩ挿入体（ＥｃｏＲ１部位は、
ベクターに存在するポリリンカーから誘導される。）、
ｐｖＷＦ１８００からの１，０４４ｂＰ　Ｘｈｏ　ｌ−
Ｈ１ｎｄｌＩＩフラグメント（１０９２位置から２２３
６位置まで）、及びｐｖＷＦ１３３０からの１゜３２７
ｂＰ　ＥｃｏＲＩ　−Ｘｈｏ　Ｉフラグメント（−２３
６位置から１０９２位置まで）。

これら３つのフラグメントの５倍モル過剰を、それぞれ
、再度、同時に、ベクターｐＰＰ６５ＤＮＡで結紮し、
ＥｃｏＲＩで開裂し、子牛の腸のアルカリホスファター
ゼ（ボーエリンガー、マンハイム、ＢＲＤ）で処理した
。得られたコロニーの約３０％には、制限酵素分析及び
ヌクレオチド連鎖分析によって証明されるように、約８
　、７９５ｂＰの所望の全長ｖＷＦｃＤＮＡ挿入体を有
するプラスミドが含まれていた。

び ＳＰ　６　ＲＮＡポリメラーゼにューイングランドニュ
ークリアー、ドライアイヒ、ＢＲＤ）による線状のＳＰ
６をベースにしたＤＮＡテンプレートの試験管内転写は
、０．１ｍＭのＵＴＰ、　ＣＴＰ及びＡＴＰ、０．０５
ａ＋ＭのＧＴＰ、並びに２ｍＭのｍ７Ｇ（５’　）ＰＰ
Ｐ（５’　）Ｇ（ファーマシア、アップサラ、スエーデ
ン）の存在下で行なわれ、末端がキャップされたメツセ
ンジャーＲＮＡを得た（Ｍｅｌｔｏｎ、　Ｄ、Ａ、、　
ｅｔ　ａｌ、（１９８４）Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒ
ｅ５ｅａｒｃｈ　１２．７０３５−７０５６）。この５
′をキャップしたメツセンジャーＲＮＡの試験管内翻訳
は、うさぎの赤血球溶解産物系にューイングランドニュ
ークリアー、ドライアイヒ、ＢＲＤ）で製造業者の説明
書に従って行なわれた。

試験管内翻訳生成物の分析は、８％ＳＯ３−ポリアクリ
ルアミドゲル上での電気泳動によって行なわれた（Ｌａ
ｅｍｍｌｉ、　Ｕ、に、（１９７０）　Ｎａｔｕｒｅ　
２２７．６５０−６５５）。

及−一一末 部　ｖＷＦｃＤＮＡクローンの構成　び全長ｖＷＦｃＤ
ＮＡの星ノリＬ１： 以前、本発明者等は、全長ヒトｖＷＦｃＤＮＡの部分を
含有するプラスミドの構成について報告した（Ｖｅｒｗ
ｅｉｊ、　Ｃ，Ｌ、、　ｅｔ　ａｌ、　（１９８５）　
ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　１３．
４６９９−４７１７、オランダ特許出願８５．００９６
１に基づ＜　；Ｌｙｎｃｈ、　Ｄ、Ｃ，＋　ｅｔ　ａｌ
。

（１９８５）　Ｃｅ１ｌ　４１．４９−５６：　Ｇｉｎ
ｓｂｕｒｇ、　Ｍ、、　ｅｔ　ａｌ。

（１９８５）　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、　２６０
．３９３１−３９３６　；５ａｄｌｅｒ、　Ｊ、Ｅ、、
　ｅｔ　ａｌ、　（１９８５）　Ｐｒｏｃ、　Ｎｕｃｌ
、　Ａｃｏｄ。

Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８２．６３９４−６３９８）。本発
明者が、オリゴ（ｄＴ）を主としたヒト内皮ｃＤＮＡ集
団から得た最も延展されたｖＷＦｃＤＮＡは、約２．２
８０ｂＰのもの（ｐｖＷＦ２２８０）を含んでいた。ヌ
クレオチド連鎖分析によって、このｃＤＮＡ挿入体が、
ｖＷＦメツセンジャー　ＲＮＡのポリＡ尾部において開
始されていることが明らかとなった。全長ｖＷＦｃＤＮ
Ａを構成するために、本発明者、はｐｖＷＦ２２８０の
上流に位置する付加的な重複ｖＷＦｃＤＮＡ連鎖を単離
した。この目的のために、２つの生化学選別を用いて、
ｖｉｃＤＮＡ含有プラスミドの数を増加させた。第１に
、部分ヌクレオチド連鎖（Ｓａｄｄｌｅｒ、　Ｊ、Ｅ、
、　ｅｔ　ａｌ。

（１９８５）　Ｐｒｏｃ、　Ｎｕｃｌ、　Ａｃａｄ、　
Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８２．６３９４−６３９８）から誘
導されたオリゴヌクレオチドプライマーを、ｃＤＮＡを
合成するために、基質としてヒト内皮ポリＡＲＮＡを用
いて合成した。第２に、ｃＤＮＡ生成物を、特定数の部
位でｖＩｉＦｃ　ＤＮＡを分割させることが知られてい
る特殊な制限エンドヌクレアーゼで消化させた（Ｇｉｎ
ｓｂｕｒｇ、　Ｍ、、　ａｔ　ａｌ。

（１９８５）　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２６０
．３９３１−３９３６；　５ａｄｌｅｒ、　Ｊ、Ｅ、、
　ａｔ　ａｌ、　（１９８５）　Ｐｒｏｃ、　Ｎｕｃｌ
、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８２．６３９４−６３９８３゜これ
らの制限部位は、つづいて、全長ｖＷＦｃＤＮＡを組み
立てるのに用いられることができる。クローニング戦略
は、第１Ａ図にその概略が示されている。隣接ｖＷＦｃ
ＤＮＡ連鎖を含むプラスミドを、ｐｖＷＦ１３３０、ｐ
ｖｗＦ１８００、ｐｖｗＦ２６００、ｐｖＷＦ２０８４
及びｐｖＷＦ２２８０で示した。ｐｖＷＦ１３３０ＤＮ
Ａの５′部分のヌクレオチド連鎖（ｖｗＦメツセンジャ
ーＲＮ＾の５′末端に対応する）によって、３つの読み
取り枠のすべてに、無意味なコドンが存在していること
が明らかになった。この発見から、本発明者はｐｖＶＦ
１３３０ＯＮＡが、翻訳開始コドンを越えて延びている
と結論づける。

ヒト内皮ＲＮＡでの８１ヌクレアーゼ保護実験は、種々
のｖｌＩＩＦｃＤＮＡ挿入体が、　ｖＷＦメツセンジャ
ーＲＮＡを十分相補するものであることを証明するため
に行なわれた。プローブの構成及び用いられた条件は、
′物質と方法″′の項で述べた通りである。結果を第２
図に示す６すべての場合において、保護フラグメントの
長さが、種々のプローブの予想長さと一致している。こ
れらのデータから、本発明者は、ｐｖＷＦ１３３０、ｐ
ｖＷＦ１８００及びｐｖ１１Ｆ２６００ＤＮＡの各ｖＩ
ＪＦｃＤＮＡ挿入体が、　ｖＷＦメツセンジャーＲＮＡ
に対して完全に相補性を有していると結論ずける。残り
のプラスミドｐｖＷＦ２０８４及びｐｖＷＦ２２８０の
ｃＤＮＡ挿入体のヌクレオチド連鎖は、公表された連鎖
に対応して、以前に示されている（Ｓａｄｌｅｒ、　Ｊ
、Ｅ、、　ｅｔ　ａｌ、（１９８５）　Ｐｒｏｃ、　Ｎ
ｕｃｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８２．６３９４−６３
９８）。その結果、種々の隣接ｖＷＦｃＤＮＡ連鎖は、
ｖＶＦメツセンジャーＲＮＡの真のコピーである。

本発明者が作ったｖＷＦｃＤＮＡ連鎖は、約８　、９０
０ｂＰの長さである。この長さは、ヒトの内皮（ポリＡ
）ＲＮＡのノーザン（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ）プロット分析
によって測定したｖＷＦメツセンジャーＲＮＡの長さと
一致する（Ｖｅｒｗｅｉｊ、　Ｃ，Ｌ、、　ｅｔ　ａｌ
、　（１９８５）　ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ　Ｒｅ５
ｅａｒｃｈ　１３．４６９９−４７１７．オランダ特許
出願８５．００９６１に基づく〕。全長ｖＩＪＦｅＤＮ
Ａの組み立ての詳細な説明は、″物質と方法″″の項に
述べられている。組み立てられた全長ｖＷＦｃＤＮＡの
正しい組成は、制限酵素分析によって確認された。

全長ννＦｃＤＮＡのヌクレオチド連鎖ｖＷＦｃＦＤＮ
Ａフラグメン°トのヌクレオチド連鎖分析を、化学分解
法（Ｍａｘａｍ、　Ａ、Ｍ、、　ｅｔ　ａｌ、、　１９
７７）及びジデオキシ連鎖停止法（Ｓａｎｇｅｒ、　Ｆ
、、　ｅｔ　ａｌ。

（１９７７）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　
Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７４．５４６３−５４６７）の２方
法で、第１Ａ図に概略を示した模−大凶に従って行った
。第３図に、ｖＶＦメツセンジャーＲＮＡの５′末端か
ら延びる約８８０６残基のヌクレオチド連鎖及び対応す
る予想アミノ酸連鎖が示されている。ｖＷＦメツセンジ
ャーＲＮＡの３′部分の残りのヌクレオチド連鎖は、先
に報告されている（Ｓａｄｄｌｅｒ、　Ｊ、Ｅ、、　ｅ
ｔ　ａｌ、（１９８５）　Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８２．６
３９４−６３９８；Ｖｅｒｗｅｉｊ、　Ｃ，Ｌ、、　ａ
ｔ　ａｌ、（１９８５）Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　
Ｒｅ５ｅａｒｃｈ旦、　４６９９−４７１７．オランダ
特許出願８５．００９６１に基づく〕。一般に、我々の
ＶすＦｃＤＮＡのヌクレオチド連鎖と５ａｄｌｅｒ、　
Ｊ、Ｅ、　ｅｔ　ａｌ、、　（１９８５）　Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８２．６
３９４−６３９８のそれとの重複部分には、差異はなか
った。しかし、この著者等によって作られた、ファージ
ｌａｍｂｄａ−Ｈｖ１ｉ１Ｆｌ上のｖｌ＋ｌＦｃＤＮＡ
の５′末端における最初の１２ヌクレオチド（２２１７
位置及び２２２９位置に対応）は、３つの個々の重複ｃ
ＤＮＡ挿入体について確認されている我々の連鎖とは、
完全に相違している。

別の不一致も、　２３０９位置で観察された。我々の分
析によれば、Ｃ残基が認められ、一方。

５ａｄｄｌｅｒ、　Ｊ、Ｅ、、　ａｔ　ａｌ、（１９８
５）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ｔ
ｌｓＡ　８２．６３７４−６３９８は、その特定位置に
おいて、それぞれプロリン及びヒスチジンとなるＡ残基
を報告している。完成ｖＩＪＦたんぱく質の自動アミノ
酸連鎖分析によって、プロリン残基が単独に確認されて
はいる（Ｈｅｓｓｅｌ、　Ｂ、　ａｔａｌ、、（１９８
４）Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　３５．
６３７−６５１）が、この相違は、　ｖＷＦ遺伝子の多
形性によるものであろう。

隣接ｖＷＦｃＤＮＡ連鎖で測定された全長は、ｖＷＦメ
ツセンジャーＲＮＡのポリ八尾部を除いて、８，８１４
ｂｐである。翻訳開始部位は、（１位置から４位置まで
）で示され、ＴＡＧの無意味はコドン（−７５位置から
一８２位置まで）の下流側の最初の開始コドンであって
、８，４３９ヌクレオチドの“開放″翻訳読み取り枠が
それに続いているＡＴＧコドンに対応していた〔我々の
連鎖データ及び５ａｄｄｌｅｒ、　Ｊ。

Ｅ、、　ｅｔ　ａｌ、（１９８５）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａ
ｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８２．６３９
４−６３９８（７）連鎖データから推論〕。この対応は
、予測される２２Ｎ末端アミノ酸残基が、信号ペプチッ
ドの特徴を示すことが認められることによって、支持さ
れる。最大の可能性をもって、信号ベプチターゼ用とな
る開裂部位は、それぞれ２２位置と２３位置とにおける
グリシン残基とアラニン残基との間に位置している（Ｖ
ｏｎ　Ｈｅ１ｊｎｅ、（１９８３）　Ｅｕｒ、　Ｊ、　
Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１３３．１７−２１）。

提案されている翻訳開始コドンは、少なくとも２３０ｎ
ｔの未翻訳領域に付随している。

８．４３９ｂＰの連続ｖＶＦｃコーディング連鎖によっ
て、３０９ｋＤの計算分子量を有する２、８１３アミノ
酸残基のポリペプチッドの合成をプログラムすることが
できる。本発明者等の知る限りでは、これが、今日まで
測定された最長のコーディング連鎖を示している。他の
たんぱく質と共に、ＮＩＨたんぱく質連鎖データバンク
内に入れられている（部分）均でアミノ酸連鎖を、コン
ピュータによって研究したが、他のたんぱく質との大き
な同一性は認められなかった。更に、完成ｖＷＦたんぱ
く質が、約１５％の炭水化物残基を含有する糖たんぱく
質であることが報告されている（Ｓｏｄｅｔｚ、　Ｊ、
Ｍ、　ａｔ　ａｌ、、　（１９７９）　Ｊ、　Ｂｉｏｌ
、　Ｃｈｅｍ。

２５４、１０７５４−１０７６０）。炭化水素成分が、
前駆ｖＶＦの計算分子量に対して約１５重量％となり、
前駆ｖＷＦの分子量は、約３５０ｋＤとなるであろうと
考えられる。

寸　ｖＷＦのアミノ　“　の 予測されたアミノ酸連鎖（第３図）と完成ｖＷＦたんぱ
く質の確認Ｎ末端アミノ酸連鎖（Ｈｅｓｓｅｌ＋Ｂ、　
ａｔ　ａｌ、、　（１９８４）Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ　
Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　３５゜６３７−６５１）との比較に
よって、ＶυＦ前駆たんぱく質が、報告されている２６
０ｋＤの糖たんぱく質（Ｖａｇｎｅｒ、Ｄ、Ｄ、、　ａ
ｔ　ａｌ、（１９８３）　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　ＣｈｅＯ
Ｉ。

μｉ８．２０６５−２０６７）よりも可成大きいという
我々の先の仮定（Ｖｅｒｗｅｉｊ、　Ｃ，Ｌ、、　ａｔ
　ａｌ、（１９８５）Ｎａｔｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒ
ｅ５ｅａｒｃｈ　１３．４６９９−４７１７．オランダ
特許出願８５．００９６１に基づく〕が確かめられた。

予測されたアミノ酸連鎖が完成（２２５ｋＤ）ｖＶＦた
んぱく質のＮ端末連鎖と一直線になっていることは、完
成ｖＷＦたんぱく質に対してコードを行うヌクレオチド
連鎖が、２２９０位置で開始することを示している。こ
の結論は、ｖＷＦ前駆体たんぱく質が、完成たんぱく質
よりも大きい７６３アミノ酸残基であることを意味する
。明らかに、この前駆連鎖（計算分子量８１ｋＤ）は、
たんぱく質処理によって除去されて、約２２５ｋＤの分
子量を有する完成ｖＶＦ糖たんぱく質を生成する。

ｖＷ前駆たんぱく質のアミノ酸連鎖を相同マトリックス
比較することによって、約３５０のアミノ酸残基の長さ
を有する４つの領域（Ｄｉ、Ｄ２、Ｄ３、Ｄ４）が作ら
れていることが明らかとなる。

この領域の部分（Ｄ′、約９６のアミノ酸）は、完成Ｖ
すＦのＮ末端に存在するように見える。第４Ａ図は、整
列したこれらのくり返し領域を示す。

前駆連鎖の顕著な特徴は、それが、主にＤ領域ＣＤＩ、
Ｄ２）の複製からなっているということである。このく
り返しは、くり返しの構造的同一性を示すシスティン残
基の位置が著しく保持されていることを示している。興
味あることに、前駆連鎖は、６９８９８位置７０２０２
位置において、アルギニン−グリシン−アスパラギン酸
連鎖（“ＲＧＤ”連ｆＩＡ）を有している。上記アミノ
酸連鎖を有するテトラペプチッドが、同じ連鎖を含有し
、細胞結合内に含まれているたんぱく質を競合すること
か示されている（Ｐｉｅｒｓｃｈｂａｃｈｅｒ、　Ｍ、
Ｄ。

ｅｔ　ａｌ、、　（１９８４）　Ｎａｔｕｒｅ　３０９
．３Ｏ−３３）。完成ｖＶＦたんぱく質のＣ末端部内に
、別のＲＧＤ連鎖が存在していることが注目されている
（Ｓａｄｌｅｒ、　Ｊ、Ｅ、　ｅｔ　ａｌ、（１９８５
）Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ
ＳＡ８２、６３９４−６３９８３゜ ｖＶＦメツセンジャーＲＮＡの　　管 約３００ｋＤの分子量を有するグリコジル化されていな
い前駆体たんぱく質に対して、コーディング能力を示す
ようにするために、全長ｖＷＦｃＤＮＡを組み立てた。

全長ｖＶＦｃＤＮＡをプラスミドｐＳＰ６５内へ挿入し
た。このプラスミドは、特に５Ｐ６ＲＮＡポリメラーゼ
によって支配されるクローン化ＤＮＡ連鎖の試験管内″
ランオフ″転写を行わせるニス、ティフィムリウム　バ
クテリオファージ（Ｓ、　Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ　Ｂ
ａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ）ＳＰ６プロモータを含有し
ている（Ｍｅｌｔｏｎ、　Ｄ、Ａ、　ａｔ　ａｌ、、（
Ｉｎ２）Ｎａｔｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　
１２．７０３５−７０５）。このようなメツセンジャー
ＲＮＡ生成物は、赤血球溶解産物を用いて、有効に翻訳
されることができる。

まず、連続６，３３１ｂＰｖＶＦｃＤＮＡ連鎖を含んで
いるプラスミドｐＳＰ６３３０ｖＷＦ　（第１Ｂ図）を
作った。このプラスミドは、完成ｖＷＦに対するすべて
のコーディング連鎖、更に前駆連鎖のＣ端末部から、１
８アミノ酸残基に対してコードを行う連鎖を含有してい
る。ｐＳＰ６３３０ｖＷＦＤＮＡから転写されたＲＮＡ
によって支配されるたんぱく質合成の開始は、完成ｖｗ
ＦのＮ末端の下流側８アミノ酸のメチオニンコドンにお
いて生ずる。次いで試験管内合成ｖｗＦメツセンジャー
ＲＮＡの翻訳によって、２２０ｋＤの計算分子量を有す
る（グリコジル化されていない）ポリペプチッドが生成
するであろう、その結果、前駆ｖｗＦに対する完全なコ
ーディング連鎖を含んでいるｐＳＰ８８００ｖＷＦ　（
第１Ｂ図）が構成された。このプラスミドは、計算分子
量が３０９゜２５０Ｄであるたんぱく質をコード化する
であろう、プラスミドｐＳＰ６３３０ｖＶＦ及びｐＳＰ
８８００ｖｗＦは、それぞれ、ＥｃｏＲＩ及びＳａｌ　
Ｉで直線化され、試験管内で転写される０種のｖＷＦメ
ツセンジャーＲＮＡの試験管内翻訳の結果を、第５図に
示す。ｐＳＰ６３３０ｖＷＦＤＮＡによってコード化さ
れたポリペプチッドは、約２００ｋＤの分子量を示す、
この分子量と計算分子量（２２０ｋＤ）との不一致は、
恐らく、これらのゲル中の大きなたんぱく質の分子量測
定が、不正確であることによるものであろう。

ｐＳＰ８８００ｖＷＦの完全なコーディング連鎖は、２
００ｋＤよりも実質的に大きい分子量を有するポリペプ
チッドに翻訳される。この異常に長いポリペプチッドに
ついて、より正確に分子量を測定するために、我々は、
全長ＶｗＦＣＤＮＡの選択部分から誘導した。部分的な
重複ポリペプチッドを作成した。そのために、ｐＳＰ８
８００ｖＷＦＤＮＡ　ｔｔ　ＢａｍＨＩで消化し、転写
体（長さ２８５５ｎｔ）を翻訳した。この転写体の３′
末端における４０５ｎｔが、ＥｃｏＲＩで開裂されたｐ
ＳＰ６３３０ｖＷＦから作られた転写体の５′末端を構
成するということは注目されるべきである。それ故、上
記ポリペプチッドの分子量計算は、共通たんぱく領域を
引いて、約３０９ｋＤの分子量になるべきである。Ｂａ
ｗｌ（Ｉ消化テンプレートから誘導されたたんぱく質は
、約１００の測定分子量を有し、一方、先に示したよう
に、ＥｃｏＲ（で開裂さ終たｐＳＰ６３３９ｖＷＦテン
プレートは、約２００ｋＤの生成物を生ゼしめる。これ
らの分子量計算及び共通領域（１５ｋＤ）を差し引くこ
とによって、測定分子量は、３０９，２５０Ｄの計算分
子量と一致する２８５ｋＤとなる。更に、Ｘｈｏ　Ｉ消
化されたｐＳＰ８８００ｖＷＦＤＮＡから誘導された転
写体（１３２０ｎｔ）の翻訳によって、分子量が３９ｋ
Ｄのポリペプチッドが明らかとなる。この結果は、１位
置から４位置までにおける翻訳開始サイドの対応と一致
する。

これらのデータから、２，８１３アミノ酸残基から成る
前駆体ｖＷＦたんぱく質の合成をプログラムする８、４
３９ｂＰのコーディング連鎖を持った全長ｖＷＦｃ［ｌ
ＮＡが構成されていると結論づけられる。

考　　　　察 本発明は、全長ｖＷＦｃＤＮＡを含有するプラスミドの
構成を規定する。ヌクレオチド連鎖分析〔本特許出願；
Ｖｅｒｗｅｉｊ、　Ｃ，Ｌ、、　ａｔ　ａｌ、　（１９
８５）Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ
　１３．４６９９−４７１７．オランダ特許出願８５．
００９６１に基づ＜　；５ａｄｌｅｒ、　Ｊ、Ｅ、ｅｔ
　ａｌ、、（１９８５）　Ｐｒｏｃ、　　Ｎａｔｌ、　
　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　　ＵＳＡ８２、６３９４−６
３９８３　ニよッテ、ポリＡ尾部が誘導されたｃＤＮＡ
を除いて、構成されたｖｗＦｃＤＮＡの長さが、８，８
０５ｂＰになることが明らかになった。この結果は、内
皮（ポリＡ）ＲＮＡのノーザーン（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ）
プロット分析（Ｖｅｒｗｅｉｊ、　Ｃ，Ｌ、、　ｅｔａ
ｌ、　（１９８５）　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒ
ｅ５ｅａｒｃｈ　１３．４６９９−４７１７．オランダ
特許出願８５．００９６１に基づく〕によって測定した
ｖＷＦメツセンジャーＲＮＡの長さく約９，０ＯＯｎｔ
）と一致する。前駆体ｖＷＦたんぱく質についての全体
のコーディング連鎖は、８，４３９ｂｐであり、分子量
が約３０９ｋＤのグリコジル化されていないポリペプチ
ッドに対応している。このたんぱく質についての翻訳開
始部位は、１位置から４位置までにおけるＡＴＧコドン
に対応させられることができる（第３図参照）。この対
応は、ＳＰ６転写系で生じた全長ｖＷＦメツセンジャー
ＲＮＡでの試験管内翻訳実験の結果と一致する。

グリコジル化たんぱく質は、信号ペプチツドを除去した
後でも、　３００ｋＤよりも可成大きくなるであろう。

完成ｖＷＦの前駆体糖たんぱく質による分子量は、２６
０ｋＤを示すということが報告されている（Ｖａｇｎｅ
ｒ、Ｄ、Ｄ、、　ｅｔ　ａｌ、（１９８３）　Ｊ、　Ｂ
ｉｏｌ。

Ｃｈｅｗ、　２５８．２０６５−２０６７）。本発明者
等が前駆体たんぱく質に対応させた分子量との不一致は
、大きな（糖）たんぱく質に固有の、５Ｏ５−ポリアク
リルアミドゲル電気泳動による分子量測定の不正確さに
よるものであろう。

完成ｖＷＦをコード化する連鎖、は、完成ｖＷＦの確認
されたＮ末端アミノ酸連鎖（Ｈｅｓｓｅｌ、Ｂ、　ａｔ
　ａｌ、。

（１９８４）Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ
　３５．６３７−６５１１が。

予測アミノ酸連鎖（第３図）と直線をなすことから推測
されるように、翻訳開始コドンの下流側の２．２８６ｂ
ｐにおいて開始する。この２．２８６ｂＰの長さの前駆
連鎖が、計算分子量が８３ＫＤであるポリペプチッドを
コード化できることが示された。

従って、前駆ｖｌｌｌＦたんぱく質をプロテアーゼに処
理すると、２つの異ったポリペプチツドを生成するであ
ろう、７６３位置と７６４位置におけるアルギニン残基
とセリン残基との間の特定の開裂が、内皮細胞のヴアイ
ベルーバラーデ体内で多分起っているであろう。何故な
らば、プロテアーゼ禁止剤（ｐＭｓＦ）の存在下では、
フォン・ヴィレブランド抗原１１（ｖすＡｇＩＩ）で示
される別の糖たんぱく質を有する完成ｖＷＦのこれら小
器官内で、複合体が検出されるからである（Ｍｏｎｔｇ
ｏｍｅｒｙ　、　Ｒ。

Ｒｏ及びＺｉｍｍｅｒｍａｎ　Ｔ、Ｓ、　１９７８　Ｊ
、　Ｃ１１ｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ。

６４、１４９８−１５０７）。前駆体ｖＶＦたんぱく質
の前駆連鎖が、ｖＶＡｇ　ＩＩと同じのようであること
を示すいくつかの議論を進めることができる。

ｉ）　グリコジル化されていない前駆連鎖の分子量（８
３ＫＯ）が、ｖＶＡｇ　ＩＦ糖たんぱく質の分子量９８
ＫＤと合致する。

ｉｉ）　　ｖＷＦ及びｖｖＡｇ　ＩＦの両者は、培養内
皮細胞によって合成され、１−デスアミノ−８−Ｄ−ア
ルギニンパップレシン（ＤＤＡＶＰ）での刺激によって
、これらのたんぱく質が同時に放出されることが示され
ている（Ｍｃ　Ｃａｒｒｏｌｌ、　Ｄ、Ｒ，ａｔ　ａｌ
、　１９８４Ｂｌｏｏｄ　６３．５３２−５３５）。

ｍ）　　免疫蛍光検査法を使用すると、両たんぱく質が
核周辺領域内及びヴアイベルーパラーデ体内で局在化す
ることが示されている（Ｍｅ　Ｃａｒｒｏｌｌ、　Ｄ、
Ｒ，ａｔ　ａｌ、　（１９８５）、Ｊ、Ｃｌ１ｎ、　Ｉ
ｎｖｅｓｔ、　７５゜１０８９−１０９５）。

ｉｖ）　　ｖＷＦ及びｖＶＡｇ　ｎは、共に血小板中に
存在し、血小板活性化によって共に放出される。

ｖ）　　ｖＶＦ及びｖＶＡｇ　ＩＩたんぱく質の量がプ
ラスマ内で直線的に関連しており、重症フォン・ヴィレ
ブランド病患者のプラスマと血小板には、両たんぱく質
が欠乏している。

ｖｉ）　　前述の如く、ｖｌＦとｖｖＡｇ　Ｉｆとの複
合体が、セリンプロテアーゼ禁止剤（ＰＭＳＦ）の存在
下では検出されるが、禁止剤が存在しない場合は検出さ
れない。

前駆連鎖の予測アミノ酸連鎖は、顕著な構造を示す、そ
れは、約３５０のアミノ酸残基の長さの複製セグメント
から成っている。これ等の２つのセグメントは、３７％
のアミノ酸同族を共有している。更に、それらは、同じ
ように位置するシスティン残基を相当に保持しているこ
とを示しており、これらの直接くり返しの中に、構造的
特徴が保持されて、いることを示している。

前駆連鎖の中のこのくり返しの２つのコピーは、完成ｖ
ＶＦ中にも存在し、一方、このくり返しの部分は、完成
ｖＷＦのＮ末端に存在する。内部相同領域についても、
５ａｄｌｅｒ、Ｊ、Ｅ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ　Ｓ　Ａ、　８２
．６３９４−６３９８（１９８５）によって報告されて
おり、そのうちの２つは、２つに複製されていたが、１
つは、３つの複製の形で存在した（第４Ｂ図）。これら
のくり返し連鎖は、完成ｖｗＦたんぱく質内において、
約１０７０のアミノ酸残基の長さを有している。本発明
者が発見したくり返し構造は、　５ａｄｌａｒ　Ｊ、Ｅ
、ｅｔ　ａｌ、　Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、Ｕ　Ｓ　Ａ　８２．
６３９４−６３９８（１９８５）によって報告されてい
るものとは無関係のものである。これらのデータから、
約９０％の前駆体ｖＷＦたんぱく質は、くり返し領域で
構成されており、前駆体ｖＷＦ遺伝子が、少なくとも４
つの異なった領域の一連の複製過程から発展しているこ
とを示していると結論づけられる。

前駆連鎖は、ｖＷＦＺ量体から成る大きな多量体の形成
に関与しているであろう（Ｖａｇｎｅｒ、　Ｄ、　Ｄ。

及びＭａｒｄｅｒ、　Ｖ、　Ｊ、　１９８４．Ｊ、　ｏ
ｆ　Ｃａ１ｌ　Ｂｉａｌｏｇｙ９９、２１２３−２１３
０：　Ｌｙｎｃｈ、　Ｄ、　Ｅ、　ｅｔ　ａｌ、　（１
９８３）。

Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ
　Ｃｈｃｖ＋１ｓｔｒｙ　２５８゜１２７５７−１２７
６０）、この点で、たんぱく質のＮ及びＣ末端部に主に
存在する結晶において、前駆ｖＷＦが非常に富んでいる
（８．１％）ことに注目するのは適切であろう、前駆連
鎖のシスティン含有量は高い（８，６％）、ｖｌｊＦの
Ｃ末端におけるジスルフィド結合は、２つのサブユニッ
トを結合する棒状領域を形成する必要があることが示さ
れている（Ｆｔ、ｗｌｅｒ、　ｕ、　Ｅ、　ｅｔ　ａｌ
、　Ｊ、　Ｃ１１ｍ、　Ｉｎｖｅｓｔ、　７旦、　１４
９１−１５００（１９８５）、多量体は、多分Ｎ末端に
おいてジスルフィド架橋によって、これらの２量体を結
合し、球状領域を作ることによって形成されるのであろ
う、前駆連鎖におけるシスティン残基のフリーのスルフ
ヒドリル基は、恐らく、多量体の形成にとって、欠くこ
とのできないものであろう。

前駆連鎖内にＲＧＤ（Ｃ）″アミノ酸連鎖が存在するこ
とが、このたんぱく質の別の機能について示すことにな
ろう。フィブロネクチンやヴイトロネクチンのようなた
んぱく質のＲＧＤ含有領域が、細胞表面の受容体との相
互作用において、決定的な役割を演することが示されて
いる（Ｐｉｅｒｓｃｈｂａｃｈｅｒ、　Ｍ、　Ｄ、及び
Ｒｕａｓｌａｈｔｉ、　Ｅ。

（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ　３０９．３０−３３；　Ｐ
ｙｔｅｌａ、　Ｒ，ａｔ　ａｌ。

Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、Ｕ　Ｓ　Ａ
　８２，５７６６−５７７０１゜これらの相互作用は、
　ＲＧＤ含有ペプチッドによって抑制される。完成ｖＶ
Ｆの活性化血小板との相互作用も、ＲＧＤ含有ペプチッ
ドによって抑制され、ｖＷＦのこの領域が血小板結合に
含まれていることを示唆している（Ｇｉｎｓｂｕｒｇ、
　Ｍ、　１９８５　Ｊ。

Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２６０．３９３１−３９３６
；　Ｈａｖｅｒｓｔｉｃｋ、　Ｐ。

Ｍ、　ａｔ　ａｌ、　１９８５．　Ｂｌｏｏｄ）。完成
ｖｌｉｌＦ及び前駆連鎖において、共にＲＧＤ連鎖が存
在し、それはｖＶＡｇｎについても同等であろうと思わ
れ、更にこれら２つのたんぱく質の間の注目すべき相同
性と構造保存に基づいて、特定の細胞表面受容体との特
定の相互作用において、前駆連鎖は、完成ｖＶＦと同じ
機能を持っているものと推測される。

図面の説明 第１Ａ及び１８図は、ｖＶＦ、ｃＤＮＡの構成、全長ｖ
ｖＦｃＤＮＡの組み立て及びヌクレオチド連鎖の測定の
ための方策 Ａ）　　ｖｗＦメツセンジャーＲＮＡはバーで示される
。

空白帯、信号ペプチッドコーディング領域；斜線帯、前
駆連鎖コーディング領域；中実帯、完成ｖＶＦコーディ
ング領域 オリゴヌクレオチド（２０量体）Ａ　（６９０１−６９
２１）、Ｂ（４８１９−４８３９）及びＣ（２４６７−
２４８７）、プライマ支配ｃＤＮＡ合成用及び／又は雑
種形成用プローグとして使用されたもので、小さいバー
で示されている。コロニースクリーニング用プローグと
して用いられた５７５ｂＰＢＧＩ　ＩＩ　−ＢａｍＨＩ
及び３５０ｂＰ）ｔｉｎｄｍ−ＸｈｏＩフラグメントは
、空白バーで示されている。　ｖＶＦメツセンジャーＲ
ＮＡの模式標示の下に、全長ｖＷＦｃＤＮＡの組み立と
ヌクレオチド連鎖のために用いられた５つの部分隣接ｖ
ＶＦｃＤＮＡが示されている。　Ｓｌヌクレアーゼ保護
実験に使用されたフラグメントＩ、ｎ、Ｉ［［、ＩＶ、
及び■が、それらが誘導されたｖＷＦｃＤＮＡ挿入体の
上に示されている。矢印は、ヌクレオチド連鎖方策を示
す。

マクサムとギルバート（１９７７）の方法によって連鎖
解析を行う場合は、放射性標式の位置が、矢印端部の短
かい垂直線によって示される。矢印端部のスラッジは、
端部標識が、ベクターＤＮＡによって指定された末端に
あったことを意味する。本研究において適切な制限エン
ドヌクレアーゼ部位のみが示されている。Ｂ　−Ｂａｍ
ＨＩ　；　Ｂｇ、ＢｇｌＩＩ；Ｅ、　ＥｃｏＲＩ　；Ｈ
，Ｈｉｎｄｍ；　Ｋ、　ＫｐｎＩ　；　Ｍ、　ＭｓｔＩ
　；　Ｎ、Ｎａｒｌ　；　Ｐ、　ＰｖｕＩ［；Ｓ、　５
ａｌｌ　；　Ｓｃ、　５ａｃｌ　；Ｘ、Ｘｂａ　Ｉ　；
Ｘｈ、Ｘｈｏ　Ｉ　。

Ｂ）　全長ｖＷＦｃＤＮＡの組み立て、プラスミドｐＳ
Ｐ６３３０ｖＷＦは、Ｈｉｎｄ　ｍ部位（２２３５位置
）からＳａｃ　１部位（８５６２位置）まで、延びてお
り、ベクターＰＳＰ６４内でサブクローン化されている
、６，３３１ｂＰｖＶＦｃＤＮＡＡ連鎖を含んでいる。

プラスミドｐＳＰ８８００ｖｉは、ＥｃｏＲ１部位（パ
ネルＡ参照）からＳａｃ　１部位（８５６２位置）まで
延びており、ベクターｐＳＰ６５内でサブクローン化さ
れている全長ｖｗＦｃＤＮＡを含んでいる。全長ｖＶＦ
ｃＤＮＡの組み立てに使用されるフラグメントの限界を
定める制限エンドヌクレアーゼ部位は、アストリックス
で示されている。ｐｖｗＦ１３３０ＤＮＡの構成に使用
される全長ｖＷＦｃＤＮＡの５′端部におけるＥｅｏＲ
１部位は、ＥｃｏＲＩリンカ−から始まる。　５Ｐ６Ｒ
ＮＡポリメラーゼによる試験管内″ランオフ″転写のた
めに、プラスミドＤＮＡを直線化させるのに用いられた
制限酵素用部位は、ドツトで示されている。プラスミド
ｐＳＰ８８００ｖＷＦ内のＳａｌ　Ｉ部位及びプラスミ
ドＰＳＰ６３３０ｖＶＦ内のＥｃｏＲＩ部位は、　ｐＳ
Ｐ型ベクターのポリリンカーに存在する。

第２図は、ＳＩヌクレアーゼ保護分析、内皮ポリＡ＋Ｒ
ＮＡを、ｖＷＦｃＤＮＡ連鎖を含む（３２Ｐ）標識プロ
ーブで雑種形成した。種々のプローグの構成及び用いら
れた条件は、″実験方法″の項に述べられている。プロ
ーブ中に存在するＶすＦｃＤＮＡセグメントは、第１図
に示されている。パネルＡは、０．８％アルカリアガロ
ースゲル中のサンプルを電気泳動した後の結果を示すも
のである。パネルＢは、６％ポリアクリルアミド−８Ｍ
尿素ゲル中で電気泳動した後の結果を示している。レー
ン１：１，４４４ｂｐｖυＦｃＤＮＡフラグメント■（
第１図）を含むプローブ■での雑種形成。レーン２：２
，４００ｂｐｖＶＦｃＤＮＡフラグメントＶ（第１図）
を含むプローブＶでの雑種形成、レーン３　：　５８５
ｂｐｖＷＦｃＤＮＡフラグメント■（第１図）と同等の
プローグ１での雑種形成。レーン４　：　５６５ｂｐｖ
ＷＦｃＤＮＡフラグメント■（第１図）を含むプローブ
■での雑種形成。レーン５ニア６５ｂｐｖＶＦｃＤＮＡ
フラグメント■（第１図）を含むプローブ■での雑種形
成。符号ニー、Ｓｌヌクレアーゼ不存在下での雑種形成
成分の培養；＋、Ｓｌヌクレアーゼ存在下で雑種形成成
分の培養；ｃ、内皮ポリＡ↓ＲＮＡの不存在下での雑種
形成した後、Ｓ１ヌクレアーゼと共に、サンプルを培養
；Ｍ１個の標準ＤＮＡ長さのマーカー。

第３Ａ〜３Ｊ図は、　ｖｗＦメツセンジーＶ　−ＲＮＡ
の５′末端から誘導されたｖｗＦｃＤＮＡの８８０６ｂ
ｐのヌクレオチド連鎖。番号は、推定ＡＴＧ翻訳開始コ
ドンから出発する。予想アミノ酸連鎖は、ヌクレオチド
連鎖の下に示されており、別個に番号が付けられていて
、推定メチオニン翻訳開始コドンから再度出発する。ポ
テンシャルなＮ結合グリコジル化部位にはアンダーライ
ンを施し、トリペプチッド　アルギニン−グリセリン−
アスパラギン酸は、枠でかこんである。

第４Ａ及び４Ｂ図は、　ｖｗＦ用前駆体内の内部相同性 Ａ）　　４つのくり返し領域Ｄ４、Ｄ２、Ｄ３、Ｄ４及
びＤ′のアミノ酸連鎖の直線性。−字表示が用いられ、
アミノ酸は、第３図に示したように番号がっけられる。

４個又は５個のくり返しの中で同じものは枠でかこんで
ある。

Ｂ）前駆ｖＷＦ内の内部相同領域の模式表示。

３個複製領域Ａ（Ａｌ、Ａ２及びＡ３）、５ａｄｉｅｎ
　ｅｔ　ａｌ。

（１９８５）によって報告されているような２個複製領
域Ｂ（Ｂｌ及びＢ２）並びにＣ（Ｃ１及びＣ２）、４個
複製領域Ｄ（ＤＩ、Ｄ２．　Ｄ３、及びＤ４）が示され
ている。

これらのくり返しの数字位置は次の通りである：Ａｔ（
１２４２−１４８０）、Ａ２（１４８０−１６７３）、
Ａ３（１６７３−１８７５）、Ｂｌ　（２２９６−２３
３１）、Ｂ２（２３７５−２４００）、　ＣＩ（２４０
０−２５１６）、Ｃ２（２５４４−２６６３）、Ｄｉ（
３４−３８７）、　Ｄ２（３８７−７４６）、Ｄ３（８
６６−１２４２）、Ｄ４（１９４７−２２９９）及びＤ
’　（７６９−８６６）。

第５図は、ｖＷＦメツセンジャーＲＮＡの試験管内翻訳 “実験方法”の項で述べたように、５Ｐ６ＲＮＡポリメ
ラーゼでの″ランオフ”転写を使って、試験管内でキャ
ップされたｖｖＦメツセンジャーＲＮＡを作った。ＲＮ
Ａ生成物を（３５Ｓ）−メチオニンを含有する赤血球溶
解産物翻訳系に加え、ポリペプチッドを９０分間合成し
た。ポリペプチッドを、８％５Ｏ５−ポリアクリルアミ
ドゲル上で分別し、蛍光間接撮影に付した０Ｍ：分子量
マーカーたんぱく質、Ｅ：内因的に合成したポリペプチ
ド（ＲＮＡを添加せずに）、レーン１　：　ｐＳＰ６３
３０ｖＶＦＤＮＡから転写されたｖＷＦｌｌ上ンジャー
ＲＮＡによってコード化され、ＥｃｏＲＩで消化したポ
リペプチッド、レーン２：ｐＳＰ８８００ｖＷＦから転
写されたｖｖＦメツセンジャーＲＮＡによりコード化さ
れ、Ｓａｌ　ｌで消化したポリヘフチット、Ｌ、ｔ−：
／　３：ｐＳＰ８８００ｖＶＦＤＮＡ　カら転写された
ｖＷＦｌｌ上ンジャーＲＮＡによってコード化され、Ｂ
ａｍＨＩで消化したポリペプチッド、レーン４：ｐＳＰ
８８００ｖＷＦＤＮＡから転写されたｖｗＦメツセンジ
ャーＲＮＡによってコード化され、Ｘｈｏ　Ｉで消化し
たポリペプチッド。

大腸菌ＤＩＩ株における組換えＤＮＡプラスミドｐＳＰ
８８００ｖｌのサンプルは、オランダ国、バーン（Ｂａ
ａｒｍ）の菌培養中央局（Ｃｅｎｔｒａａｌａｂｕｒｅ
ａｕ　ｖｏｏｒＳｃｈｉｍｍｅｌ　ｃｕｌｔｕｒｅｓ）
にＣＢＳ番号１６３．８６として、１９８６年３月２６
日に寄託した。

【図面の簡単な説明】

第１Ａ及び１８図は、ｖＶＦ、ｃＤＮＡの構成、全長ｖ
ＷＦｃＤＮＡの組み立て及びヌクレオチド連鎖の測定の
仕方を示す説明図、第２図は、ＳＩヌクレアーゼ保護分
析、内皮ポリＡ＋ＲＮＡを、ｖｖＦｃＤＮＡ連鎖を含む
（３２Ｐ）標識プローブで雑種形成の状況を示す説明図
、第３Ａ〜３Ｊ図は、　ｖＷＦメツセンジー？−ＲＮＡ
の５′末端から誘導されたｖＷＦｃＤＮＡの８８ｏ６ｂ
ｐのヌクレオチド連鎖を示す説明図、第４Ａ及び４Ｂ図
はｖｗＦ用前駆体内の内部相同性の説明図、第５図は、
ｖ！ＩＦメツセンジャーＲＮＡの試験管内翻訳の説明図
である。 ａ　＠　−２８４８ ・−１１３３ −−静−７８０ ４１１＆　−４８５ ・−４５２ ・−４１０ ・−３６４ ・−３４３ ｎｕｃｌ。 Ｏ Ｃ（＋−（（（ｔ。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ｃＤＮＡフラグメントが、ヒトのフォン・ヴィレブ
   ランド因子の生物学的活性に対してコードを行う遺伝子
   に、少なくとも部分的に対応していることを特徴とする
   組換えｃＤＮＡプラスミド又はファージに導入すること
   のできるｃＤＮＡフラグメント。 ２、該ｃＤＮＡフラグメントが、第３図に示したヌクレ
   オチド連鎖又はその一部を有している特許請求の範囲第
   １項記載のｃＤＮＡフラグメント。 ３、その中に導入されたｃＤＮＡフラグメントが、フォ
   ン・ヴィレブランド因子に対してコードを行う遺伝子に
   、少なくとも部分的に対応していることを特徴とする組
   換えｃＤＮＡプラスミド又はファージ。 ４、導入されたｃＤＮＡフラグメントが、第３図に示し
   たヌクレオチド連鎖又はその一部を有している特許請求
   の範囲第３項記載の組換えｃＤＮＡプラスミド又はファ
   ージ。 ５、プラスミドが、ベクターｐＳＰ６５を含有している
   特許請求の範囲第３項又は第４項記載の組換えｃＤＮＡ
   プラスミド。 ６、特許請求の範囲第３項〜第５項のうちのいずれか１
   項に規定された組換えｃＤＮＡプラスミド又はファージ
   を含有する微生物、動物細胞又はヒト細胞。 ７、微生物が、大腸菌である特許請求の範囲第６項の微
   生物。 ８、微生物が、大腸菌ＤＨＩ株である特許請求の範囲第
   ７項記載の微生物。 ９、オランダ国、バーン（Ｂａａｒｎ）の菌培養中央局
   （Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ　ｖｏａｒ　Ｓｃｈｉ
   ｍｍｅｌ−Ｃｕｌｔｕｒｅｓ）に、Ｃ．Ｂ．Ｓ．番号１
   ６３．８６として寄託した組換えｃＤＮＡプラスミドｐ
   ＳＰ８８００ｖＷＦを含有する大腸菌ＤＨＩ株。 １０、特許請求の範囲第６項〜第９項のうちのいずれか
   １項に規定された宿主を培養することを特徴とする微生
   物、動物細胞又はヒト細胞の培養によりたくぱく質を製
   造する方法。 １１、特許請求の範囲第１０項記載の方法によって得ら
   れた糖たんぱく質。 １２、第３図に示した２５１８−８６６７のヌクレオチ
   ド連鎖に対応するアミノ酸連鎖を有するｖＷＦ糖たんぱ
   く質。 １３、第３図に示した２９５−２５１７のヌクレオチド
   連鎖に対応するアミノ酸連鎖を有する糖たんぱく質。 １４、特許請求の範囲第１０項記載の方法によって製造
   された一つ以上の生物学的活性糖たんぱく質を含有する
   薬剤組成物。 １５、特許請求の範囲第１２項又は第１３項記載の生物
   学的活性糖たんぱく質を含有する薬剤組成物。