JPH0610675B2

JPH0610675B2 - 非蛋白物質分離用充填剤

Info

Publication number: JPH0610675B2
Application number: JP61102826A
Authority: JP
Inventors: 勝夫伏見; 和俊山崎; 芳秀沢田
Original assignee: Sekisui Chemical Co Ltd
Current assignee: Sekisui Chemical Co Ltd
Priority date: 1986-05-02
Filing date: 1986-05-02
Publication date: 1994-02-09
Anticipated expiration: 2009-02-09
Also published as: JPS62259061A

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明は血清など蛋白質を含む試料中の非蛋白物質を測
定するときに用いられる除蛋白カラムの充填剤に関す
る。

（従来の技術）血清などに含まれるアルドステロン、アルドステロンコ
ルチゾール、プレグナンジオール、エストロゲンなどの
ステロイド系ホルモン；カテコールアミン、ポリアミン
などのアミン類；各種薬剤；などの非蛋白質成分を、病
理学的な研究や診断に利用するために液体クロマトグラ
フィーなどにより分析することが広く行われている。血
清などの生体試料中には一般に蛋白質が含まれているた
め、この蛋白質の影響により分析精度や分析カラム機能
が低下したり、該分析カラムの寿命が短くなったりす
る。

そのため、非蛋白質成分の分析においては、あらかじめ
除蛋白操作により蛋白質を除いた試料を用いるのが普通
である。しかし、従来の方法では除蛋白操作に多大の時
間、労力を要するため分析成分が多量に損失したり、変
性したりするという欠点がある。

その対策として、例えば、蛋白質および非蛋白物質を含
む試料液を除蛋白カラムに通して非蛋白成分のみを吸着
させ蛋白成分を通過除去したのち、吸着した非蛋白物質
を溶離させてこれを分析カラムに導く方法が特開昭58-2
23061号公報に開示されている。この方法に用いられる
除蛋白カラムの充填剤としては、アクリル系重合体など
の微粒子が用いられる。アクリル系重合体としては、例
えばトリエチレングリコールジアクリレート、テトラエ
チレングリコールジアクリレートなどの２官能性アクリ
ル系単量体および／またはテトラメチロールメタンテト
ラアクリレート、トリメチロールプロパントリアクリレ
ートなどの３官能以上のアクリル系単量体を重合成分と
する重合体または共重合体が挙げられる。上記微粒子は
表面積が大きいほど吸着効率が高いため多孔質の微粒子
が用いられる。通常、微粒子の粒径が10〜20μｍであ
り、かつ平均孔径が200Å程度の充填剤が用いられる。

上記方法によれば、比較的効果的に蛋白質が除去される
ため非蛋白物質の測定が容易となるが、次の欠点を有す
る；蛋白質と非蛋白質との分離を行うのに長時間を要す
る。例えば血清10μ中の蛋白質を除去するのに、イオ
ン交換水流速1.0ml／分で10分以上を必要とする。

蛋白質が完全には除去されず、数％が充填剤中に残留
するため、これらが時間的に遅れて溶出し、測定の妨害
となる。

蛋白質が完全には除去されず、数％が充填剤中に残留
し徐々に蓄積されるため、除蛋白カラムの圧力が上昇
し、ついには測定が不能となる。

上記、、の現象がおこる原因は、主として血清中
の代表的な蛋白質であるアルブミンに起因すると考えら
れる。アルブミン40Åの短径と140Åの長径とを有する
楕円球状体である。蛋白質は、本来、上記組成の充填剤
には吸着されないが、充填剤微粒子の100〜200Åの細孔
にアルブミンが入り込み、時間的遅れをもって溶出され
るためである。

（発明が解決しようとする問題点）本発明は上記従来の欠点を解決するものであり、その目
的とするところは、蛋白質と非蛋白質とを精度良くかつ
短時間に分離しうるカラム充填剤を提供することにあ
る。本発明の他の目的は、長期間にわたり繰り返し使用
が可能であるため安価に非蛋白物質の測定がなされうる
非蛋白質分離用充填剤を提供することにある。

（問題点を解決するための手段および作用）本発明の非蛋白質分離用充填剤は、蛋白質を吸着せず、
かつ所定の条件下で非蛋白物質を吸着し他の所定の条件
下で該非蛋白物質を脱離させる能力を有する微粒子であ
って、該微粒子は細孔を有する多孔性粒子であり、該細
孔の平均直径が40Å以下であり、そのことにより上記目
的が達成される。

本発明の充填剤の素材は、親水性であり、上記非蛋白物
質の吸着・脱離などの条件を満たすものであれば、いず
れも使用されうる。特に、発明者らが開発したアクリル
系（共）重合体が好適に用いられる。このアクリル系
（共）重合体は、下記式（Ｉ）で示される単量体および
／またはｘメチロールアルカンｙ（メタ）アクリレート
〔ｘ，ｙは整数であり、ｘ≧ｙ≧３〕を重合成分とする
重合体または共重合体である：（Ｒ_１およびＲ_２はそれぞれ水素またはメチル基、ｎは
３〜18の整数である）。

（Ｉ）式で示される単量体としては、例えば、トリエチ
レングリコールジアクリレート、トリエチレングリコー
ルジメタクリレート、テトラエチレングリコールジアク
リレート、テトラエチレングリコールジメタクリレー
ト、ノナエチレングリコールジアクリレート、ノナエチ
レングリコールジメタクリレート、テトラデカエチレン
グリコールジアクリレート、テトラデカエチレングリコ
ールジメタクリレートがある。ｘメチロールアルカンｙ
（メタ）アクリレートには、例えば、テトラメチロール
メタンテトラアクリレート、テトラメチロールメタンテ
トラメタクリレート、テトラメチロールメタントリアク
リレート、テトラメチロールメタントリメタクリレー
ト、トリメチロールメタントリアクリレート、トリメチ
ロールメタントリメタクリレート、トリメチロールプロ
パントリアクリレート、トリメチロールプロパントリメ
タクリレートがある。特に、テトラメチロールメタンテ
トラアクリレート、テトラメチロールメタントリアクリ
レートおよびテトラメチロールメタントリメタクリレー
トが好適である。

そして、本発明充填剤として要求される前記の蛋白質を
吸着せず、かつ所定の条件下で非蛋白物質を吸着し他の
所定の条件下で該非蛋白物質を脱離させるという能力を
有する重合体粒子は、式（Ｉ）で示される単量体と上記
ｘメチロールアルカンｙ（メタ）アクリレートとを通常
１：0.1〜10の重量比で共重合させることにより容易に
得ることができる。

次に、上記単量体を用いた多孔質微粒子の調製は通常水
性媒質中で懸濁重合法により行われうるが、細孔の直径
を40Å以下とするため、特に、次の方法のいずれかを採
用することが推奨される。

水性媒質中で重合される重合体粒子を多孔質化する方
法として、重合性単量体にトルエン、キシレンなどの無
極性溶媒である芳香族炭化水素を溶媒として加えること
が通常行われているが、この重合時の溶媒として、通常
使用される上記芳香族炭化水素などの無極性溶媒に代え
て、高級アルコール（例えば、イソアミルアルコール、
オクチルアルコール）などの極性溶媒を使用する。溶媒
の量は単量体100重量部あたり150重量部以下とするのが
よい。

上記単量体（Ｉ）およびｘメチロールアルカンｙ（メ
タ）アクリレートを含む共重合体を得る場合には、ｘメ
チロールアルカンｙ（メタ）アクリレートの含量を上
げ、架橋密度を上げる。例えば、単量体（Ｉ）に対し、
１〜10倍量のｘメチロールアルカンｙ（メタ）アクリレ
ートを用いのがよい。

上記単量体以外にも例えば、ジビニルベンゼンを単量体
（Ｉ）の共重合成分として用いて平均40Å以下の細孔を
有する（共）重合体微粒子を調製することが可能であ
り、これらも本発明の充填剤として使用可能である。そ
してこの場合は単量体（Ｉ）に対し、４〜15倍量のジビ
ニルベンゼンを共重合成分として用いるのが、重合体微
粒子の細孔を40Å以下となし、かつ本発明で要求される
前述の吸着・脱離能力を満足させるために好ましい。

このようにして得られた充填剤を蛋白質および非蛋白物
質を含有する試料（例えば血清）に、例えば、所定のpH
で接触させると、非蛋白物質が効果的に充填剤に吸着さ
れ、蛋白質は吸着されない。ここで、本発明の多孔性微
粒子からなる充填剤の平均細孔径は、40Å以下であるた
め、血清蛋白質の大部分を占めるアルブミンが細孔内に
入り込むことがない。アルブミン以外の血清蛋白質とし
てはグロブリンなどがあるが、これらはいずれもアルブ
ニンよりも大分子であるため充填剤の細孔内に入り込ま
ない。そのため、例えば、このような充填剤を充填した
除蛋白カラムに非蛋白物質を含む血清試料を流すと蛋白
成分がカラム内に捕捉されることなく速やかに除去され
る。

次に、本発明の充填剤を用い非蛋白質の検出を行う方法
を説明する。第１図は、その分析装置の一例であり、接
続端Ａ〜Ｆを有する六方バルブ４に、除蛋白カラム５が
接続端Ｂ・Ｅを介して接続されている。水槽１中のイオ
ン交換水もしくは緩衝液がポンプ２によって試料インジ
ェクター３および接続端Ａ、Ｂを経て除蛋白カラム５に
送られ、そこから接続端Ｅ、Ｆを通り系外に排出され
る。カラム５には本発明の充填剤が充填されている。こ
の充填剤は、一定の条件、例えば水またはある特定のpH
の緩衝液中では非蛋白物質である分析目的物質を吸着
し、蛋白質を吸着しない。そして他の条件、例えば上記
と異なったpHの緩衝液中では、カラムに吸着した上記非
蛋白分析目的物質を溶離する性質を有する。

試料としては、例えば、除蛋白処理の行われていない血
清試料が用いられ、前記試料インジェクター３より系内
へ注入される。注入された試料はポンプによりイオン交
換水もしくは緩衝液と共に移送されて除蛋白カラム５に
達する。ここで血清試料中の非蛋白分析目的物質は該カ
ラムの充填剤に吸着される。他方、該試料中の蛋白質は
吸着されないでカラム５を通過し、六方バルブ４の接続
端Ｅ、Ｆを経て系外に排出される。

溶離液槽６中の溶離液はポンプ７により、接続端Ｄおよ
びＣを経由して液体クロマトグラフィーの分析カラム８
へ送られる。次いで、第２図に示すように、六方バルブ
４を切り換えて接続端ＤをＥに接続すると、ポンプ７に
より溶離液槽６中の上記吸着物質の溶離条件を備えた溶
離液が接続端ＤおよびＥを経て除蛋白カラム５に供給さ
れる。溶離液がカラム５を通過することにより、吸着さ
れた非蛋白物質が溶離され溶離液と共に接続端Ｂおよび
Ｃを経て分析カラム８に達する。分析目的物質は分析カ
ラム８で分離され、分析カラム８以降に設けられた図外
の適宜な検出器により検出される。

このような本発明の充填剤を用いた分析装置を採用する
と次の利点が得られる。

除蛋白が速やかになされる。

蛋白質が確実に除去されるため、非蛋白物質の検出が
正確になされうる。

蛋白成分がカラム内に捕捉されることがないためカラ
ムの長時間にわたる使用が可能であり、その結果、非蛋
白物質の検出が安価になされうる。

（実施例）以下に本発明を実施例につき説明する。

実施例１冷却器、攪拌機、温度計および滴下ロートを備えた５
のセパラブルフラスコを準備した。４重量％ポリビニル
アルコール水溶液400ml；重合性単量体としてテトラエ
チレングリコールジメタクリレート40ｇおよびテトラメ
チロールメタントリアクリレート10ｇ；有機溶媒として
イソアミルアルコール40ｇ；そして重合開始剤としてベ
ンゾイルパーオキサイド1.5ｇの混合液を調製し、上記
フラスコに供給した。これに窒素ガスを150ml／分の流
量で供給しながら150r.p.mの攪拌速度で攪拌しつつ80℃
に昇温し、10時間重合反応を行った。冷却後、重合生成
物を母液から分離し、熱水およびアセトンで順次洗浄し
て粒子径が10〜50μｍの多孔性ポリマーを得た。得られ
た多孔性ポリマーの細孔分布を、B.E.T.法により調べた
ところ、その平均細孔径は10Åであった。

この多孔性ポリマーのうち微粒子および粗粒子を取り除
いて得られた粒子径25〜35μｍの充填剤200mgを40mlの
蒸留水に分散し、内径４mm、長さ20mmのステンレス製カ
ラムに高圧定流量ポンプにより蒸留水を２ml／分の流速
で圧送して充填し、除蛋白カラムを得た。

高圧六方バルブ４に、上記除蛋白カラム５および液体ク
ロマトグラフィー（ウォーターズ、モデル6000A）に組
み込まれた分析カラム８などを第１図に示すように接続
した。分析試料として、除蛋白処理をしていない正常男
子血清（副腎皮質ホルモンであるプレドニゾロンを10pp
mの割合で添加）を準備した。ポンプ２により水槽１中
のイオン交換水を1.0ml／分の流速で六方バルブ４の接
続端Ａ，Ｂを経て除蛋白カラム５に流しながら、試料イ
ンジェクター３から上記試料血清10μを注入した。５
分後に、六方バルブ４を切り換え第２図に示すように接
続した。ポンプ７により、溶離液槽６中からメタノール
対水が70：30の溶離液を0.5ml／分の流速で六方バルブ
接続端Ｄ，Ｅ、除蛋白カラム５、そして六方バルブ接続
端Ｂ，Ｃを経て液体クロマトグラフィーの分析カラム８
へ通した。上記溶離液の流通により溶離した非蛋白物質
（プレドニゾロン）の分析を行った。使用した分析カラ
ムはSHANDON社製HYPERSIL-ODS（商品名：カラムサイズ
内径６mm；長さ10cm）であり、検出は240nmの吸収強度
によって行った。得られたクロマトグラムを第３図
（Ａ）に示す。第３図（Ａ）において11はプレドニゾロ
ンのピークである。

上記測定をカラムを取り替えずに300回繰り返して行っ
た。300検体目のクロマトグラムを第３図（Ｂ）に示
す。第３図（Ａ）および（Ｂ）はほぼ同一のパターンで
あり、検出時の蛋白質混入による妨害は認められず、除
蛋白カラムの性能が低下していないことがわかる。

本実施例、後述の実施例２〜３、および比較例１〜３の
重合時の仕込組成、得られた重合体粒子の平均細孔径な
どをまとめて下表に示す。

比較例１イソアミルアルコールの代わりにトルエン40ｇを用いた
こと以外は実施例１と同様に操作し粒子径が10〜50μｍ
の多孔性ポリマーを得た。得られた多孔性ポリマーの細
孔分布を、B.E.T.法により調べたところ、その平均細孔
径は140Åであった。

この多孔性ポリマーのうち微粒子および粗粒子を取り除
いて得られた粒子径25〜35μｍの充填剤を実施例１と同
様の方法で充填して除蛋白カラムを得た。これを用い、
実施例１と同様に血清の分析を行った。第１回目の測定
では、第３図（Ａ）と同様のクロマトグラムが得られた
が、測定を繰り返すに従い、徐々に除蛋白カラムの圧力
が上昇するとともにピーク11がブロードとなった。15検
体目ではカラム内圧力が50kg／cm²であり、第３図
（Ｃ）に示すクロマトグラムが得られ、測定が困難とな
った。

実施例２重合性単量体としてジエチレングリコールジメタクリレ
ート70ｇおよびテトラメチロールメタントリアクリレー
ト200ｇ；有機溶媒としてトルエン200ｇ；そして重合開
始剤としてベンゾイルパーオキサイド5.0ｇを用い、実
施例１に準じて重合反応を行い、粒子径が10〜50μｍの
多孔性ポリマーを得た。得られた多孔性ポリマーの細孔
分布を、B.E.T.法により調べたところ、その平均細孔径
は35Åであった。

この多孔性ポリマーのうち微粒子および粗粒子を取り除
いて得られた粒子径25〜35μｍの充填剤を実施例１と同
様に充填し、除蛋白カラムを得た。

上記除蛋白カラムを用い、実施例１と同様の装置を組み
立てた。分析試料として除蛋白処理をしていない。正常
男子血清（胆汁酸の一種であるコール酸を200ng／mlの
割合で添加）を準備した。

ポンプ２により水槽１中のイオン交換水を1.0ml／分の
流速で六方バルブ４の接続端Ａ，Ｂを経て除蛋白カラム
５に流しながら、試料インジェクター３から上記試料血
清10μを注入した。10分後に六方バルブ４を切り換え
第２図に示すように接続した。ポンプ７により、溶離液
槽６中から0.3％炭酸アンモニウム水溶液対アセトニト
リルが14：４の溶離液を1.0ml／分の流速で六方バルブ
接続端Ｄ，Ｅ、除蛋白カラム５そして六方バルブ接続端
Ｂ，Ｃを経て液体クロマトグラフィーの分析カラム８へ
通した。上記溶離液の流通により溶離した非蛋白物質
（コール酸）の分析を行った。使用した分析カラムはウ
ォーターズ社製μ−Bandapak Phenyl（商品名：カラム
サイズ内径3.9mm；長さ30cm）であり、検出は254nmの吸
収強度によって行った。得られたクロマトグラムを第４
図（Ａ）に示す。第４図（Ａ）において、コール酸のピ
ーク12が明確に確認される。

比較例２重合性単量体としてジエチレングリコールジメタクリレ
ート300ｇおよびテトラメチロールメタントリアクリレ
ート40ｇ；有機溶媒としてトルエン150ｇ；そして重合
開始剤としてベンゾイルパーオキサイド5.0ｇを用い、
実施例１に準じて重合反応を行い、粒子径が10〜50μｍ
の多孔性ポリマーを得た。得られた多孔性ポリマーの細
孔分布をB.E.T.法により調べたところ、その平均細孔径
は155Åであった。

この除蛋白カラムを用い、実施例２と同様の操作でコー
ル酸の分析を行った。得られたクロマトグラムを第４図
（Ｂ）に示す。第４図（Ｂ）から、この比較例では、血
清蛋白質の混入のためコール酸の正確な分析が困難であ
ることがわかる。

実施例３重合性単量体としてノナエチレングリコールジメタクリ
レート30ｇ、ジビニルベンゼン250ｇ；有機溶媒として
トルエン300ｇ；そして重合開始剤としてベンゾイルパ
ーオキサイド5.0ｇを用い、実施例１に準じて重合反応
を行い、粒子径が10〜50μｍの多孔性ポリマーを得た。
得られた多孔性ポリマーの細孔分布を、B.E.T.法により
調べたところ、その平均細孔径は20Åであった。この多
孔性ポリマーのうち微粒子および粗粒子を取り除いて得
られた粒子径25〜35μｍの充填剤を実施例１と同様に充
填し、除蛋白カラムを得た。

上記除蛋白カラムを用い、実施例１と同様の装置で組み
立てた。分析試料として除蛋白処理をしていない正常男
子血清（喘息薬であるテオフィリンを100ng／mlの割合
で添加）を準備した。

ポンプ２により水槽１中のイオン交換水を1.0ml／分の
流速で六方バルブ４の接続端Ａ，Ｂを経て除蛋白カラム
５に流しながら、試料インジェクター３から上記試料血
清10μを注入した。６分後に、六方バルブ４を切り換
え第２図に示すように接続した。ポンプ７により、溶離
液槽６中からアセトニトリル対精製水が８：92の溶離液
を1.0ml／分の流速で六方バルブ接続Ｄ，Ｅ、除蛋白カ
ラム５そして六方バルブ接続端Ｂ，Ｃを経て液体クロマ
トグラフィーの分析カラム８へ通した。上記溶離液の流
通により溶離した非蛋白物質（テオフィリン）の分析を
行った。使用した分析カラムはケムコ社製NUCLEOSIL 5C
18（商品名：カラムサイズ内径４mm；長さ150mm）であ
り、検出は254nmの吸収強度によって行った。得られた
クロマトグラムを第５図（Ａ）に示す。第５図（Ａ）に
おいて、テオフィリンのピーク13が明確に確認される。

比較例３重合性単量体としてジビニルベンゼン300ｇ、メタクリ
ル酸80ｇ；有機溶媒としてトルエン350ｇ；そして重合
開始剤としてベンゾイルパーオキサイド5.0ｇを用い、
実施例１に準じて重合反応を行い、粒子径が10〜50μｍ
の多孔性ポリマーを得た。得られた多孔性ポリマーの細
孔分布をB.E.T.法により調べたところ、その平均細孔径
は100Åであった。この多孔性ポリマーのうち微粒子お
よび粗粒子を取り除いて得られた粒子径25〜35μｍの充
填剤を実施例１と同様に充填し、除蛋白カラムを得た。

この除蛋白カラムを用い、実施例３と同様の操作でテオ
フィリンの分析を行った。得られたクロマトグラムを第
５図（Ｂ）に示す。第５図（Ｂ）から、この比較例で
は、血清蛋白質の混入のためテオフィリンの正確な分析
が困難であることがわかる。

次に、新たな装置を用い、試料注入後六方バルブ４を切
り換えるまでの時間を延長し、水槽１からのイオン交換
水が長時間にわたり除蛋白カラム５内を通過するように
した。時間を21分まで延長したところ第５図（Ａ）と同
一パターンのクロマトグラムが得られた。これは実施例
３の６分に比較して３倍以上であり、除蛋白に長時間を
必要とすることがわかる。

（発明の効果）本発明によれば、このように蛋白質と非蛋白物質とを精
度良くかつ短時間のうちに分離しうるカラム充填剤が得
られる。このような充填剤は、例えば、、血清中の非蛋
白物質の検出や定量に好適に利用される。充填剤は長期
間にわたる使用が可能であるため、非蛋白物質の検出な
どが安価になされうる。

【図面の簡単な説明】

第１図および第２図は本発明の充填剤を用いた分析装置
の一例を示す接続図；第３図（Ａ）および（Ｂ）、第４
図（Ａ）、そして第５図（Ａ）は本発明の充填剤を用い
て非蛋白物質の測定を行って得られたクロマトグラム；
第３図（Ｃ）、第４図（Ｂ）、そして第５図（Ｂ）は従
来の充填剤を用いて非蛋白質の測定を行って得られたク
ロマトグラムである。１……水槽、２，７……ポンプ、３……試料インジェク
ター、４……六方バルブ、５……除蛋白カラム、６……
溶離液槽、８……分析カラム。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】蛋白質を吸着せず、かつ所定の条件下で非
蛋白物質を吸着し他の所定の条件下で該非蛋白物質を脱
離させる能力を有する微粒子であって、該微粒子は細孔を有する多孔性粒子であり、該細孔の平均直径が40Å以下である、非蛋白物質分離用充填剤。
【請求項２】前記微粒子が下記式（Ｉ）で示される単量
体および／またはｘメチロールアルカンｙ（メタ）アク
リレート〔ｘ，ｙは整数であり、ｘ≧ｙ≧３〕を重合成
分とする重合体または共重合体からなる特許請求の範囲
第１項に記載の非蛋白物質分離用充填剤：（Ｒ_１およびＲ_２はそれぞれ水素またはメチル基、ｎは
３〜18の整数である）。