JPH0610678B2 - 免疫学的分析方法 - Google Patents
免疫学的分析方法Info
- Publication number
- JPH0610678B2 JPH0610678B2 JP23135984A JP23135984A JPH0610678B2 JP H0610678 B2 JPH0610678 B2 JP H0610678B2 JP 23135984 A JP23135984 A JP 23135984A JP 23135984 A JP23135984 A JP 23135984A JP H0610678 B2 JPH0610678 B2 JP H0610678B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- antibody
- antigen
- labeled
- carrier
- analysis
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 title description 27
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 title description 7
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 35
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 35
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 35
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 19
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 claims description 9
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 18
- 238000000034 method Methods 0.000 description 15
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 12
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 11
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 8
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 7
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 7
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 7
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 7
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 7
- 239000000463 material Substances 0.000 description 7
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 7
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 6
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 5
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 5
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 5
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 4
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 4
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 4
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 101000976075 Homo sapiens Insulin Proteins 0.000 description 3
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 3
- 101710123661 Venom allergen 5 Proteins 0.000 description 3
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 3
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 3
- PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N insulin (human) Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H]2C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3NC=NC=3)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC1=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)=O)CSSC[C@@H](C(N2)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1=CN=CN1 PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N 0.000 description 3
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 3
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 2
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 2
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 2
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 2
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 2
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 239000000941 radioactive substance Substances 0.000 description 2
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 2
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SLXKOJJOQWFEFD-UHFFFAOYSA-N 6-aminohexanoic acid Chemical compound NCCCCCC(O)=O SLXKOJJOQWFEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000700199 Cavia porcellus Species 0.000 description 1
- 102100030497 Cytochrome c Human genes 0.000 description 1
- 108010075031 Cytochromes c Proteins 0.000 description 1
- 102000006395 Globulins Human genes 0.000 description 1
- 108010044091 Globulins Proteins 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 description 1
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 description 1
- 108010005991 Pork Regular Insulin Proteins 0.000 description 1
- 239000003463 adsorbent Substances 0.000 description 1
- 229960002684 aminocaproic acid Drugs 0.000 description 1
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 1
- 150000001718 carbodiimides Chemical class 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 239000007863 gel particle Substances 0.000 description 1
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 239000003456 ion exchange resin Substances 0.000 description 1
- 229920003303 ion-exchange polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000002523 lectin Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000007873 sieving Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 （技術分野） 本発明は免疫学的分析方法に関するものである。
（従来技術） 血液、体液等に含まれるグロブリン、酵素等のタンパク
質、またはホルモン、細菌、ウィルス等はその分子構造
が類似していたり、極く微量であるために通常の分析方
法では同定、定量が困難である。そこで、これらの物質
の分析には、一般に抗体、抗原あるいはレクチン等を利
用した免疫学的な分析方法が用いられている。
質、またはホルモン、細菌、ウィルス等はその分子構造
が類似していたり、極く微量であるために通常の分析方
法では同定、定量が困難である。そこで、これらの物質
の分析には、一般に抗体、抗原あるいはレクチン等を利
用した免疫学的な分析方法が用いられている。
このような抗原抗体反応を利用する免疫学的分析方法に
は、大別して標識物質を用いる標識免疫分析法と、標識
物質を用いずに抗原抗体複合物を直接測定する非標識免
疫分析法とがあるが、非標識免疫分析法は簡便であるが
感度、定量性、再現性の点で精密測定としては不充分で
あるため、細菌では標識免疫分析法が主流を成してい
る。この標識免疫分析法は、標識物質の違いによってラ
ジオイムノアッセイ、エンザイムイムノアッセイ、フル
オロイムノアッセイに大別され、また測定系において標
識物質で標識した抗体（抗原）とサンプル中の抗原（抗
体）とが抗原抗体反応を起した抗原抗体複合物（Boun
d）と、抗原抗体反応に関与しない標識抗体（抗原）（F
ree）とを分離する操作、いわゆるＢ−Ｆ分離を必要と
するヘテロジニアス法と必要としないホモジュニアス法
とに分類される。ホモジニアス法はＢ−Ｆ分離を必要と
しないところから操作が簡単であり、したがってそれを
自動的に行なうようにした装置も従来種々提案されてい
るが、ヘテロジニアス法はＢ−Ｆ分離を必要とするとこ
ろから、分析手順が煩雑であり、このためそれを自動的
に行なうようにした装置の提案もホモジニアス法に比べ
て少ない。
は、大別して標識物質を用いる標識免疫分析法と、標識
物質を用いずに抗原抗体複合物を直接測定する非標識免
疫分析法とがあるが、非標識免疫分析法は簡便であるが
感度、定量性、再現性の点で精密測定としては不充分で
あるため、細菌では標識免疫分析法が主流を成してい
る。この標識免疫分析法は、標識物質の違いによってラ
ジオイムノアッセイ、エンザイムイムノアッセイ、フル
オロイムノアッセイに大別され、また測定系において標
識物質で標識した抗体（抗原）とサンプル中の抗原（抗
体）とが抗原抗体反応を起した抗原抗体複合物（Boun
d）と、抗原抗体反応に関与しない標識抗体（抗原）（F
ree）とを分離する操作、いわゆるＢ−Ｆ分離を必要と
するヘテロジニアス法と必要としないホモジュニアス法
とに分類される。ホモジニアス法はＢ−Ｆ分離を必要と
しないところから操作が簡単であり、したがってそれを
自動的に行なうようにした装置も従来種々提案されてい
るが、ヘテロジニアス法はＢ−Ｆ分離を必要とするとこ
ろから、分析手順が煩雑であり、このためそれを自動的
に行なうようにした装置の提案もホモジニアス法に比べ
て少ない。
このヘテロジニアス法を採用する免疫学的分析法とし
て、特開昭５３−１０４９５号公報においてカラムクロ
マトグラフィーを利用してＢ−Ｆ分離を行なうようにし
た自動化に適した分析方が提案されている。この分析法
において、カラムに充填される吸着剤としては溶液中の
遊離抗原を選択的に吸着し、抗原抗体複合物を吸着しな
い、例えばアニオン、カチオンイオン交換樹脂や、分子
ふるい効果のあるゲルクロマトグラフィー用の充填剤を
用いている。しかしながら、ゲルクロマトグラフィーに
よるＢ−Ｆ分離は、競合法によるハプテン、セミハプテ
ン等の低分子抗原の分析においては有効なものの、分子
量数万以上の抗原になると、遊離抗原と抗原抗体複合物
との大きさが近接したり、抗原抗体複合物の大きさや形
状にばらつきがある等して、そのＢ−Ｆ分離が困難とな
る。このため、例えば免疫グロブリン等の試薬として用
いる抗体と同じ分子や、化学的、物理的に類似した分子
の測定には使用できず、分析項目が極めて制限される不
具合がある。
て、特開昭５３−１０４９５号公報においてカラムクロ
マトグラフィーを利用してＢ−Ｆ分離を行なうようにし
た自動化に適した分析方が提案されている。この分析法
において、カラムに充填される吸着剤としては溶液中の
遊離抗原を選択的に吸着し、抗原抗体複合物を吸着しな
い、例えばアニオン、カチオンイオン交換樹脂や、分子
ふるい効果のあるゲルクロマトグラフィー用の充填剤を
用いている。しかしながら、ゲルクロマトグラフィーに
よるＢ−Ｆ分離は、競合法によるハプテン、セミハプテ
ン等の低分子抗原の分析においては有効なものの、分子
量数万以上の抗原になると、遊離抗原と抗原抗体複合物
との大きさが近接したり、抗原抗体複合物の大きさや形
状にばらつきがある等して、そのＢ−Ｆ分離が困難とな
る。このため、例えば免疫グロブリン等の試薬として用
いる抗体と同じ分子や、化学的、物理的に類似した分子
の測定には使用できず、分析項目が極めて制限される不
具合がある。
（発明の目的） 本発明の目的は上述した不具合を解決し、ゲルクロマト
グラフィーによるＢ−Ｆ分離を、分析項目に制限される
ことなく低分子から高分子に至るまで常に確実に行なう
ことができ、所要の分析を高精度でかつ高速にできる免
疫学的分析方法を提供しようとするものである。
グラフィーによるＢ−Ｆ分離を、分析項目に制限される
ことなく低分子から高分子に至るまで常に確実に行なう
ことができ、所要の分析を高精度でかつ高速にできる免
疫学的分析方法を提供しようとするものである。
（発明の概要） 本発明の免疫学的分析方法は、サンプルと、所定の物質
で標識した標識抗原または抗体と、表面に固相化した抗
原または抗体を有し、少く共前記標識抗原または抗体よ
りも大きさまたは分子量が大きい担体とを反応させた
後、その反応液中の前記担体に結合した標識抗原または
抗体と、結合しないそれとをゲルクロマトグラフィーに
より分離することを特徴とするものである。
で標識した標識抗原または抗体と、表面に固相化した抗
原または抗体を有し、少く共前記標識抗原または抗体よ
りも大きさまたは分子量が大きい担体とを反応させた
後、その反応液中の前記担体に結合した標識抗原または
抗体と、結合しないそれとをゲルクロマトグラフィーに
より分離することを特徴とするものである。
本発明において、抗体または抗原を固相化する担体とし
ては、標識抗体または抗原よりも大きさが大きく、かつ
粒経の均一なラッテクス粒子、あるいは標識抗原または
抗体よりも分子量が大きく、かつ均一なポリスチレン、
デキストラン、チトクロムｃ等の巨大分子等を用いるこ
とができるが、好適には形状および大きさを均一にしや
すいラテックス粒子が有効である。ラテックス粒子の大
きさは分析項目やゲルクロマトグラフィーにおける充填
剤等の条件によって異なるが、粒径が0.08μｍ〜５μｍ
程度までの任意の大きさのものが使用でき、また材質や
表面の化学的性状も同様に種々選択できる。この担体に
固相化する抗原または抗体は、例えばサンプル中の抗原
を、これを介して担体と標識抗体とを結合させるいわゆ
るサンドイッチ法により分析する場合には、抗体として
モノクローナル抗体のFabもしくはF(ab′) 2フラグメン
トが望ましく、これを物理的吸着や共有結合等の代学的
結合によって固相化する。また、この場合の標識抗体と
しては、モノクローナルもしくはポリクローナル抗体の
Fabフラグメントが望ましく、これを酵素、螢光物質、
放射性物質、色素、金属等の所定の標識物質に結合させ
る。なお、例えば抗体に酵素を標識する場合には、抗体
および酵素の分子を１分子ずつ結合させることが望まし
い。また、Ｂ−Ｆ分離を行なうゲルクロマトグラフィー
におけるゲルは、分析項目、担体等によって適宜選択で
き、そのゲル粒子の材質、大きさ、分子分画範囲等は任
意にコントロールできる。
ては、標識抗体または抗原よりも大きさが大きく、かつ
粒経の均一なラッテクス粒子、あるいは標識抗原または
抗体よりも分子量が大きく、かつ均一なポリスチレン、
デキストラン、チトクロムｃ等の巨大分子等を用いるこ
とができるが、好適には形状および大きさを均一にしや
すいラテックス粒子が有効である。ラテックス粒子の大
きさは分析項目やゲルクロマトグラフィーにおける充填
剤等の条件によって異なるが、粒径が0.08μｍ〜５μｍ
程度までの任意の大きさのものが使用でき、また材質や
表面の化学的性状も同様に種々選択できる。この担体に
固相化する抗原または抗体は、例えばサンプル中の抗原
を、これを介して担体と標識抗体とを結合させるいわゆ
るサンドイッチ法により分析する場合には、抗体として
モノクローナル抗体のFabもしくはF(ab′) 2フラグメン
トが望ましく、これを物理的吸着や共有結合等の代学的
結合によって固相化する。また、この場合の標識抗体と
しては、モノクローナルもしくはポリクローナル抗体の
Fabフラグメントが望ましく、これを酵素、螢光物質、
放射性物質、色素、金属等の所定の標識物質に結合させ
る。なお、例えば抗体に酵素を標識する場合には、抗体
および酵素の分子を１分子ずつ結合させることが望まし
い。また、Ｂ−Ｆ分離を行なうゲルクロマトグラフィー
におけるゲルは、分析項目、担体等によって適宜選択で
き、そのゲル粒子の材質、大きさ、分子分画範囲等は任
意にコントロールできる。
（実施例） 第１実施例 第１実施例としてヒトIgEの分析について説明する。第
１図はヒトIgEを分析する際の反応模式図である。本例
では、担体１として粒径が0.41μｍのポリスチレンラテ
ックスを使用し、この担体１に固相抗体２としてモノク
ローナル抗ヒトIgE抗体を物理的吸着により固相化す
る。また、標識抗体３として担体１よりも大きさの小さ
いヤギ抗ヒトIgE抗体のFabフラグメントを使用し、これ
に標識物質４としてフルオレセインイソチオシアネート
（FITC）の螢光物質を結合させる。先ず、上記の固相抗
体２を有する担体１を含むラテックス試薬５０μと、
標識物質４で標識された標識抗体３を含む標識試薬５０
μと、サンプル抗原５を含むヒトIgE溶液１０μと
を、0.01Ｍりん酸緩衝液（ＰＢＳ）ＰＨ＝7.5／0.1Ｍ
NaCl／0.1％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）／0.02％ NaN
3より成る２００μの反応用緩衝液に添加して、サン
ドイッチ法により３７℃、１０分間抗原抗体反応を起さ
せる。なお、各溶液は全て同時に添加してもよいし、先
ず固相抗体２とサンプル抗原５とを反応させた後、サン
プル抗原５と標識抗体３とを反応させるように各溶液を
順次添加してもよい。
１図はヒトIgEを分析する際の反応模式図である。本例
では、担体１として粒径が0.41μｍのポリスチレンラテ
ックスを使用し、この担体１に固相抗体２としてモノク
ローナル抗ヒトIgE抗体を物理的吸着により固相化す
る。また、標識抗体３として担体１よりも大きさの小さ
いヤギ抗ヒトIgE抗体のFabフラグメントを使用し、これ
に標識物質４としてフルオレセインイソチオシアネート
（FITC）の螢光物質を結合させる。先ず、上記の固相抗
体２を有する担体１を含むラテックス試薬５０μと、
標識物質４で標識された標識抗体３を含む標識試薬５０
μと、サンプル抗原５を含むヒトIgE溶液１０μと
を、0.01Ｍりん酸緩衝液（ＰＢＳ）ＰＨ＝7.5／0.1Ｍ
NaCl／0.1％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）／0.02％ NaN
3より成る２００μの反応用緩衝液に添加して、サン
ドイッチ法により３７℃、１０分間抗原抗体反応を起さ
せる。なお、各溶液は全て同時に添加してもよいし、先
ず固相抗体２とサンプル抗原５とを反応させた後、サン
プル抗原５と標識抗体３とを反応させるように各溶液を
順次添加してもよい。
その後、上記の反応液中の抗原抗体複合物すなわちBoun
d６と、抗原抗体反応に関与しなかった標識物質４を有
する標識抗体３すなわちFree７とを、第２図に示すクロ
マト装置でＢ−Ｆ分離してサンプル抗原濃度を測定す
る。第２図に示すクロマト装置は、ゲルクロマトグラフ
ィー用カラム１１の入口をインジェクタ１２およびポン
プ１３を介して溶出液タンク１４に連結し、出口を検出
器１５を介して廃液タンク１６に連結して、検出器１５
の出力を記録計１７で記録するようにしたもので、本例
では、溶出液タンク１４に0.01ＭPBSpH＝7.5／0.1Ｍ N
aClより成る溶出液を収容し、またカラム１１への充填
剤としてはセルロファインＧＣＬ−２０００sf（商品
名；生化学工業株式会社製）を用いる。このクロマト装
置のカラム１１にインジェクタ１２から上記の反応液を
注入してポンプ１３により溶出液を供給すると、Bound
６は標識抗体３よりも大きい担体１を有するから高速に
溶出し、遅れてFree７が溶出してＢ−Ｆ分離が確実に行
なわれる。したがって、検出器１５において散乱光およ
び透過光量の変化を螢光強度と同時に検出して記録計１
７で記録すると、第３図に示すように最初にBound６の
きわめてシャープな螢光ピークａが得られ、遅れてFree
７の螢光ピークｂが得られるから、最初の螢光ピークａ
に基いて、予じめ既知濃度抗原から求めた螢光強度と抗
原濃度との関係を表わす検量線から、サンプル抗原濃度
を高精度かつ高速に求めることができる。
d６と、抗原抗体反応に関与しなかった標識物質４を有
する標識抗体３すなわちFree７とを、第２図に示すクロ
マト装置でＢ−Ｆ分離してサンプル抗原濃度を測定す
る。第２図に示すクロマト装置は、ゲルクロマトグラフ
ィー用カラム１１の入口をインジェクタ１２およびポン
プ１３を介して溶出液タンク１４に連結し、出口を検出
器１５を介して廃液タンク１６に連結して、検出器１５
の出力を記録計１７で記録するようにしたもので、本例
では、溶出液タンク１４に0.01ＭPBSpH＝7.5／0.1Ｍ N
aClより成る溶出液を収容し、またカラム１１への充填
剤としてはセルロファインＧＣＬ−２０００sf（商品
名；生化学工業株式会社製）を用いる。このクロマト装
置のカラム１１にインジェクタ１２から上記の反応液を
注入してポンプ１３により溶出液を供給すると、Bound
６は標識抗体３よりも大きい担体１を有するから高速に
溶出し、遅れてFree７が溶出してＢ−Ｆ分離が確実に行
なわれる。したがって、検出器１５において散乱光およ
び透過光量の変化を螢光強度と同時に検出して記録計１
７で記録すると、第３図に示すように最初にBound６の
きわめてシャープな螢光ピークａが得られ、遅れてFree
７の螢光ピークｂが得られるから、最初の螢光ピークａ
に基いて、予じめ既知濃度抗原から求めた螢光強度と抗
原濃度との関係を表わす検量線から、サンプル抗原濃度
を高精度かつ高速に求めることができる。
なお、本実施例ではサンプル抗原をサンドイッチ法によ
り分析するようにしたが、標識抗原と適切なカラム充填
剤とを用いることによって、ハプテン等の分析において
適用される競合法によっても分析することができる。
り分析するようにしたが、標識抗原と適切なカラム充填
剤とを用いることによって、ハプテン等の分析において
適用される競合法によっても分析することができる。
第２実施例 第２実施例としてヒトインシュリンの分析について説明
する。本例では、担体として粒径が0.22μｍのポリスチ
レンラテックスを使用し、この担体に固相抗体としてモ
ルモット抗ヒトインシュリン抗体を物理的吸着により固
相化する。また、標識抗原として担体よりも大きさの小
さいブタインシュリンを用い、これをFITCの螢光物質で
標識する。上記の固相抗体を有する担体を含むラテック
ス試薬を５０μと、FITCで標識した標識抗原を含む標
識試薬５０μと、サンプル抗原のヒトインシュリン溶
液１０μとを、0.01Ｍ PBSpH＝7.0／0.1Ｍ NaCl／
0.1％ BSA／0.02％ NaN3より成る２００μの反応用
緩衝液に添加して、競合法による抗原抗体反応を３７℃
で１０分間行なわせた後、第１実施例と同様に第２図に
示す構成のクロマト装置によりＢ−Ｆ分離を行なって、
BoundとFreeとのそれぞれの螢光強度を測定し、それら
の螢光強度に基いてサンプル中のインシュリン濃度を求
める。なお、本例においては、カラムの充填剤としてセ
ルロファインＧＣ−２００ｍ（商品名；生化学工業株式
会社製）を用いる。
する。本例では、担体として粒径が0.22μｍのポリスチ
レンラテックスを使用し、この担体に固相抗体としてモ
ルモット抗ヒトインシュリン抗体を物理的吸着により固
相化する。また、標識抗原として担体よりも大きさの小
さいブタインシュリンを用い、これをFITCの螢光物質で
標識する。上記の固相抗体を有する担体を含むラテック
ス試薬を５０μと、FITCで標識した標識抗原を含む標
識試薬５０μと、サンプル抗原のヒトインシュリン溶
液１０μとを、0.01Ｍ PBSpH＝7.0／0.1Ｍ NaCl／
0.1％ BSA／0.02％ NaN3より成る２００μの反応用
緩衝液に添加して、競合法による抗原抗体反応を３７℃
で１０分間行なわせた後、第１実施例と同様に第２図に
示す構成のクロマト装置によりＢ−Ｆ分離を行なって、
BoundとFreeとのそれぞれの螢光強度を測定し、それら
の螢光強度に基いてサンプル中のインシュリン濃度を求
める。なお、本例においては、カラムの充填剤としてセ
ルロファインＧＣ−２００ｍ（商品名；生化学工業株式
会社製）を用いる。
本実施例においても、Boundは標識抗原よりも大きい担
体を有するから、その反応液を第２図に示す構成のクロ
マト装置に通すと、最初にBoundが高速に溶出し、遅れ
てFreeが溶出してＢ−Ｆ分離が確実に行なわれ、第３図
と同様な螢光強度が得られる。したがって、Boundのピ
ーク値とFreeのピーク値とに基いてサンプル中のインシ
ュリン濃度を高精度かつ高速に求めることができる。
体を有するから、その反応液を第２図に示す構成のクロ
マト装置に通すと、最初にBoundが高速に溶出し、遅れ
てFreeが溶出してＢ−Ｆ分離が確実に行なわれ、第３図
と同様な螢光強度が得られる。したがって、Boundのピ
ーク値とFreeのピーク値とに基いてサンプル中のインシ
ュリン濃度を高精度かつ高速に求めることができる。
第３実施例 第３実施例としてヒトIgGの分析について説明する。本
例では、担体として分子量３０万のデキストランを用
い、これを臭化シアン（CNBr）で活性化して過剰量の６
・アミノカプロン酸を反応させることにより、デキスト
ラン分子内にカルボキシル基を導入し、更にカルボジイ
ミドを用いてデキストランとモノクローナル抗ヒトIgG
抗体のFabフラグメントを架橋する。また標識抗体とし
て担体よりも分子量の小さいヤギ抗ヒトIgGのFabフラグ
メントを使用し、これをFITCの螢光物質で標識する。上
記の固相抗体を有する担体を含むデキストラン試薬５０
μと、FITCで標識した標識抗体を含む標識試薬５０μ
と、サンプル抗原のヒトIgG溶液５μとを、0.01Ｍ
PBSpH＝7.5／0.2Ｍ NaCl／0.1％ BSA／0.05％ Tw-
een２０／0.02％ NaN3より成る２００μの反応用緩
衝液に添加して、サンドイッチ法による抗原抗体反応を
３７℃で５分間行なわせた後、第１実施例と同様に第２
図に示す構成のクロマト装置によりＢ−Ｆ分離を行なっ
て、BoundとFreeとのそれぞれの螢光強度を測定し、サ
ンプル中のIgG濃度を求める。なお、本例においては、
カラムの充填剤としてセルロファインＧＣ−７００ｍ
（商品名；生化学工業株式会社製）を用いる。
例では、担体として分子量３０万のデキストランを用
い、これを臭化シアン（CNBr）で活性化して過剰量の６
・アミノカプロン酸を反応させることにより、デキスト
ラン分子内にカルボキシル基を導入し、更にカルボジイ
ミドを用いてデキストランとモノクローナル抗ヒトIgG
抗体のFabフラグメントを架橋する。また標識抗体とし
て担体よりも分子量の小さいヤギ抗ヒトIgGのFabフラグ
メントを使用し、これをFITCの螢光物質で標識する。上
記の固相抗体を有する担体を含むデキストラン試薬５０
μと、FITCで標識した標識抗体を含む標識試薬５０μ
と、サンプル抗原のヒトIgG溶液５μとを、0.01Ｍ
PBSpH＝7.5／0.2Ｍ NaCl／0.1％ BSA／0.05％ Tw-
een２０／0.02％ NaN3より成る２００μの反応用緩
衝液に添加して、サンドイッチ法による抗原抗体反応を
３７℃で５分間行なわせた後、第１実施例と同様に第２
図に示す構成のクロマト装置によりＢ−Ｆ分離を行なっ
て、BoundとFreeとのそれぞれの螢光強度を測定し、サ
ンプル中のIgG濃度を求める。なお、本例においては、
カラムの充填剤としてセルロファインＧＣ−７００ｍ
（商品名；生化学工業株式会社製）を用いる。
本実施例においては、Boundは標識抗体よりも分子量が
大きい担体を有するから、その反応液を第２図に示す構
成のクロマト装置に通すと、最初にBoundが高速に溶出
し、遅れてFreeが溶出してＢ−Ｆ分離が確実に行なわ
れ、第３図と同様な螢光強度が得られる。したがって、
本例においてもサンプル中のIgG濃度を、上述した実施
例と同様に高精度かつ高速に求めることができる。
大きい担体を有するから、その反応液を第２図に示す構
成のクロマト装置に通すと、最初にBoundが高速に溶出
し、遅れてFreeが溶出してＢ−Ｆ分離が確実に行なわ
れ、第３図と同様な螢光強度が得られる。したがって、
本例においてもサンプル中のIgG濃度を、上述した実施
例と同様に高精度かつ高速に求めることができる。
なお、本発明は上述したヒトIgE、ヒトインシュリン、
ヒトIgGの分析のみでなく、酵素等のタンパク質、ホル
モン、細菌、ウイルス等の種々の分析にも有効に適用す
ることができると共に、標識物質も螢光物質に限らず、
酵素、放射性物質、色素、金属等の種々のものを用いる
ことができる。
ヒトIgGの分析のみでなく、酵素等のタンパク質、ホル
モン、細菌、ウイルス等の種々の分析にも有効に適用す
ることができると共に、標識物質も螢光物質に限らず、
酵素、放射性物質、色素、金属等の種々のものを用いる
ことができる。
（発明の効果） 以上述べたように、本発明によればゲルクロマトグラフ
ィーによりＢ−Ｆ分離を行なう標識免疫分析法におい
て、標識抗原または抗体よりも大きさまたは分子量の大
きい担体を用いるようにしたから、分析項目に制限され
ることなく低分子から高分子に至るまで常に確実にＢ−
Ｆ分離することができ、これにより所要の分析を高精度
かつ高速に行なうことができる。
ィーによりＢ−Ｆ分離を行なう標識免疫分析法におい
て、標識抗原または抗体よりも大きさまたは分子量の大
きい担体を用いるようにしたから、分析項目に制限され
ることなく低分子から高分子に至るまで常に確実にＢ−
Ｆ分離することができ、これにより所要の分析を高精度
かつ高速に行なうことができる。
第１図は標識免疫分析法の一例の反応模式図、第２図は
本発明によってＢ−Ｆ分離を行なうクロマト装置の一例
の構成を示す図、 第３図は第２図に示すクロマト装置から得られる出力波
形の一例を示す図である。 １……担体、２……抗体 ３……標識抗体、４……標識物質 ５……サンプル抗原、６……Bound ７……Free、11……カラム 12……インジェクタ、13……ポンプ 14……溶出液タンク、15……検出器 16……廃液タンク、17……記録計
本発明によってＢ−Ｆ分離を行なうクロマト装置の一例
の構成を示す図、 第３図は第２図に示すクロマト装置から得られる出力波
形の一例を示す図である。 １……担体、２……抗体 ３……標識抗体、４……標識物質 ５……サンプル抗原、６……Bound ７……Free、11……カラム 12……インジェクタ、13……ポンプ 14……溶出液タンク、15……検出器 16……廃液タンク、17……記録計
Claims (1)
- 【請求項１】サンプルと、所定の物質で標識した標識抗
原または抗体と、表面に固相化した抗原または抗体を有
し、少く共前記標識抗原または抗体よりも大きさまたは
分子量が大きい担体とを反応させた後、その反応液中の
前記担体に結合した標識抗原または抗体と、結合しない
それとをゲルクロマトグラフィーにより分離することを
特徴とする免疫学的分析方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP23135984A JPH0610678B2 (ja) | 1984-11-05 | 1984-11-05 | 免疫学的分析方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP23135984A JPH0610678B2 (ja) | 1984-11-05 | 1984-11-05 | 免疫学的分析方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61110059A JPS61110059A (ja) | 1986-05-28 |
| JPH0610678B2 true JPH0610678B2 (ja) | 1994-02-09 |
Family
ID=16922381
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP23135984A Expired - Lifetime JPH0610678B2 (ja) | 1984-11-05 | 1984-11-05 | 免疫学的分析方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0610678B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2008185529A (ja) * | 2007-01-31 | 2008-08-14 | Japan Advanced Institute Of Science & Technology Hokuriku | 被検物質の検出方法及び検出デバイス |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0734015B2 (ja) * | 1988-04-25 | 1995-04-12 | 和光純薬工業株式会社 | 微量成分の新規測定法 |
| JPH0731202B2 (ja) * | 1990-01-26 | 1995-04-10 | 和光純薬工業株式会社 | 微量成分の新規な分別測定方法 |
| JPH0765988B2 (ja) * | 1990-01-09 | 1995-07-19 | 和光純薬工業株式会社 | 微量成分の分別測定方法 |
| JP5222906B2 (ja) * | 2010-07-20 | 2013-06-26 | 株式会社日立ハイテクノロジーズ | 生体試料の分析方法 |
-
1984
- 1984-11-05 JP JP23135984A patent/JPH0610678B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2008185529A (ja) * | 2007-01-31 | 2008-08-14 | Japan Advanced Institute Of Science & Technology Hokuriku | 被検物質の検出方法及び検出デバイス |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS61110059A (ja) | 1986-05-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP1075661B1 (en) | Ligand binding assay and kit with a separation zone for disturbing sample components | |
| Moser et al. | Immunoaffinity chromatography: an introduction to applications and recent developments | |
| US4425438A (en) | Assay method and device | |
| Sportsman et al. | Chromatographic properties of silica-immobilized antibodies | |
| JPH08101197A (ja) | 制御された感度の免疫クロマトグラフィー検定 | |
| US4865997A (en) | Assay for ligands by separating bound and free tracer from sample | |
| JPH0445785B2 (ja) | ||
| JP2001502795A (ja) | 血液型抗原および抗体の検出に有用な方法および装置 | |
| JP2677753B2 (ja) | 凝集イムノアッセイ法 | |
| WO1992016838A1 (en) | Separation method | |
| JPH0610678B2 (ja) | 免疫学的分析方法 | |
| NO164135B (no) | Immunometrisk metode for bestemmelse av et hapten, samt analysesett for utfoerelse av metoden. | |
| US20030073126A1 (en) | Competitive immunoassay using complexed analyte derivatives02 | |
| EP0253270A2 (en) | Method for diagnostic immunoassay by solid phase separation | |
| CA2104596A1 (en) | Multi-test immunochemical reagent and method to use same | |
| JP3098970B2 (ja) | タンパクのペプチド溶離免疫測定方法 | |
| JP2709296B2 (ja) | 免疫学的分析方法 | |
| JPS59210365A (ja) | 均一系免疫試験法ならびにそれに用いるための試薬系、試験キツトおよび試験具 | |
| AU2003200222B2 (en) | Ligand binding assay and kit with a separation zone for disturbing analytes | |
| GB2261948A (en) | Analysis | |
| JPS61132869A (ja) | 免疫学的分析方法 | |
| JPH0588422B2 (ja) | ||
| GB2270976A (en) | Immunoassay/separation process using an auxiliary species on a support | |
| Venn | Immunoassay techniques | |
| JPH0588423B2 (ja) |