JPH06107610A - ペプチド合成におけるアリル側鎖保護 - Google Patents

ペプチド合成におけるアリル側鎖保護

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JPH06107610A
JPH06107610A JP4177794A JP17779492A JPH06107610A JP H06107610 A JPH06107610 A JP H06107610A JP 4177794 A JP4177794 A JP 4177794A JP 17779492 A JP17779492 A JP 17779492A JP H06107610 A JPH06107610 A JP H06107610A
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デレク・ハドソン
Matthew H Lyttle
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Abstract

(57)【要約】 【目的】 側鎖官能部分をアリル側鎖保護基で保護し
た、ペプチド合成のためのアミノ酸誘導体を提供するこ
と。 【構成】 アリル側鎖保護基をアリルカルボニル、アリ
ルオキシメチル、アリルエーテル、アリルチオエーテ
ル、アリルエステル、及びアリルアミドからなる群より
選択すること等によって上記のアミノ酸誘導体を提供す
る。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】ペプチドの化学合成方法は、所望
の反応のみが進行するような方法でブロックしたアミノ
酸誘導体の縮合に基づいている。一般に、ペプチドは、
Ｃ末端アミノ酸から開始するペプチド結合縮合の順次的
サイクルを実施することによって構築する。適当なαＮ
−及び側鎖を保護したＣ末端アミノ酸誘導体をαＣ部分
を介して不溶性の樹脂又は支持体に結合させることが出
来る（固相ペプチド合成、即ち、ＳＰＰＳ）。αＮ−保
護部分は除去（脱保護）することが出来、且つ、結合し
たアミノ酸誘導体は続いて、αＮ−及び側鎖を保護した
アミノ酸誘導体と反応することが出来る｛各縮合（カッ
プリング）反応の後にαＮ−脱保護を行なう｝。ペプチ
ド鎖伸長を、溶液中で固体の支持体又は樹脂を用いずに
同様に行うことが出来る。縮合サイクルの必要な回数を
完了したとき、ペプチドを固体支持体から遊離させ（或
は、液相合成においては、αＣ脱保護し）、そして溶液
から回収する。一般に、M. Bodanszky, Peptide Chemis
try: A Practical Textbook, Springer-Verlag (1988),
RSPN No. 0-387-18984-X （Sigma Chemical Co.から入
手可能）を参照されたい。
【０００２】各アミノ酸誘導体のαＮ−及び側鎖官能性
部分に対する保護基の選択は、特定のペプチド配列の構
築の計画において重要な要素である。ペプチド結合縮合
の各回の後で、αＮ保護基は、発生期のペプチド鎖中の
何れのアミノ酸残基の完全性をも変えず又はそれらの何
れの保護された側鎖部分をも脱保護しない条件の下で除
去可能でなければならない。同様に、一度ペプチド鎖を
組み立てたならば、側鎖の保護基はアミノ酸残基の完全
性を変えたり害することなく除去されなくてはならな
い。
【０００３】しばしば、特定のペプチドの合成において
は、指定された条件の下で関係する官能基のみを選択的
に脱ブロック化するために（他の型の保護基は安定なま
までいる）、幾つかの異なる型の保護基を用いることが
必要である。例えば、もしαＮ脱ブロック化を酸性条件
下で進行するように選択したならば、側鎖官能基の脱保
護は酸に対して安定でなければならないが、それでもな
お他の条件下（中性における触媒の存在下等）において
円滑に開裂し得なくてはならない。単一ペプチドの合成
において相互に異なる化学的条件下での脱離が可能な多
くの型の保護基の使用は、“直交保護（orthogonal pro
tection ）”と呼ばれる。G. Barny等、(1987) Int. J.
Pept. Prot. Res. 30:705-739の 709-710頁を参照され
たい。
【０００４】多様なαＮ保護基（異なる化学的条件下で
除去し得る）を記載した（幾つかの代表的な保護基を表
１に列挙する）。これらの幾つかは市販されている。
【０００５】
【表１】 化学名 略号 開裂方法 ｔ−ブチルオキシカルボニル− ｔＢｏｃ− ＴＦＡ中のＨｇ2+ ベンジルオキシカルボニル− ｚ− 水添分解 α，α’−ジメチル−３，５− ジメトキシ−ベンジルオキシ− カルボニル− Ｄｄｚ− 加酸分解 ９−フルオレニルメチルオキシ− カルボニル− Ｆｍｏｃ− ピペリジン／ＤＭＦ ジチアスクシノイル− Ｄｔｓ− チオリシス（ＲＳＨ）
【０００６】αＮ保護基の広い選択と対照的に、ただ２
つの一般的型の側鎖官能部分の保護基が記載されただけ
である。これらの第１のものは、触媒的水素添加、還
元、又は強酸によって除去（脱ブロック又は脱保護）さ
れるベンジル基に基づいている。第２の型は、ｔ−ブチ
ル又はトリフェニルメチル基に基づいている｛トリフル
オロ酢酸（ＴＦＡ）の存在において除去し得る｝。これ
らの基は、アルギニン等の幾つかのアミノ酸とは相容れ
ない。しばしば、置換したフェニル−スルホニル基がこ
のアミノ酸を保護するために用いられてきた（この型の
基は酸性又は還元条件下でのみ除去し得る）。
【０００７】現在入手可能な型の側鎖官能部分の保護基
を用いてペプチドを構築することを探究している者は、
多くの回帰的問題に遭遇してきた。例えば、保護基の除
去はしばしば不完全である。フッ化水素酸（ＨＦ）での
処理は、典型的に、パラ−トルエン−スルホニル（Ｔｏ
ｓ）基をアルギニン残基から完全に除去すること、或は
４−メチルベンジル基をシステイン残基から除去するこ
とが出来ない。同様に、ＴＦＡでの処理は、しばしば、
スレオニン−ｔ−ブチルエーテル又はδＮ−４−メトキ
シ−２，３，６−トリメチルベンゼン−スルホニル−ア
ルギニンの不完全な開裂を生じる。
【０００８】更に、脱保護ステップの脱離生成物はしば
しば望ましくない副反応に参加し得る。例えば、トリプ
トファン、チロシン、メチオニン及びシステイン残基
は、側鎖保護基の加酸分解処理により生成したカルボニ
ウムイオンによるアルキル化を受け易い。G. Barany
等、 (1987) Int. J. Pept. Prot. Res. 30:705-739は、
727-730頁において、幾つかの残基に特異的な望ましく
ない副反応を論じている。
【０００９】巨大な側鎖保護基による立体障害は又、特
に結合されつつあるアミノ酸誘導体上又は構築中のペプ
チドのＮ末端残基上に巨大な基が存在するペプチド結合
のカップリングを有意に遅らせ且つ害する。この効果
は、特に、アスパラギン、グルタミン、ヒスチジン、及
びシステインのトリフェニルメチル（トリチル）誘導体
で目立つ。
【００１０】更に、組み立てたペプチドを固体支持体か
ら回収するための、及び側鎖官能部分の最終的脱保護を
行なうための、並びにペプチドにおける所望の最終的コ
ンホメーションを導くための現在の方法は、自動操作法
又はスケールアップに柔順であるとは証明されていな
い。これらの及び他の考察は、巨大でなく、不適当に反
応性の脱離生成物を生じることなく容易に除去され、且
つ自動式の商業規模のペプチド合成に適合し得る側鎖官
能部分を保護する系は当業者にとって大いに興味がある
ということを示すのに役立つ。
【００１１】
【発明の要約】本発明は、アリル側鎖保護基で側鎖を保
護した、ペプチド合成のためのアミノ酸誘導体に関係す
る。一層特に、本願のアミノ酸誘導体中のアリル側鎖保
護基をアリルオキシカルボニル、アリルオキシメチル、
アリルエーテル、アリルチオエーテル、アリルエステ
ル、及びアリルアミドからなる群より選択する。本願の
アミノ酸誘導体は下記の一般式を有する：
【化１１】 （式中、α炭素はＬ又はＤ配置の何れかであり；Ｙはハ
ロゲン、水酸基、及び活性エステルからなる群より選択
し；Ｘはカルボニル型保護基であり；Ｑはジ−又はトリ
−置換した形態のαアミノ基であり；Ｂは水素又はメチ
ル基であり；そしてＡは上に列挙したアリル側鎖保護基
の１つによって保護されたアミノ酸側鎖である）。
【００１２】この発明は又、ペプチド合成のための側鎖
を保護したアミノ酸誘導体の製造方法にも関係する。本
願の方法において、本発明のアリル側鎖保護基はアミノ
酸の側鎖に結合する。αＮ保護基も又結合する（適当な
αＮ保護基は、アリル側鎖保護基に直交するものであ
る）。ｔ−ブチルオキシカルボニル（ｔＢｏｃ）、９−
フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）等の
カルボニル保護基は特に適当である。
【００１３】この発明は更に、所望のペプチド配列を構
築するために本発明のアミノ酸誘導体を用いる固相ペプ
チド合成法に関係する。支持体に結合したペプチドを組
み立てたときに、アリル側鎖保護基は、例えば、その支
持体に結合したペプチドをテトラキス−トリフェニルホ
スフィンパラジウム（０）等の有機金属触媒で処理する
ことによって除去する。支持体に結合し、脱保護された
ペプチドをそれからそれを固体支持体から遊離させるた
めに十分な薬剤で処理する。
【００１４】本発明は更に、環状ペプチドを製造する固
相法にも関係する。この方法において、所望のペプチド
を上述の方法で固体支持体上に構築する（但し、アリル
保護は、互いに結合して環状構造を形成するアミノ酸残
基に対してのみ用いる）。この配列の構築において用い
る他のアミノ酸誘導体については、アリル基に直交する
側鎖保護基を用いる。支持体に結合して組み立てたペプ
チドをアリル脱保護し且つ、例えばグルタミン酸−リジ
ンの側鎖−側鎖カップリングを誘導するベンゾトリアゾ
リルＮ−オキシトリスジメチルアミノ−ホスホニウムヘ
キサフルオロホスフェート（ＢＯＰ試薬）を含む環化試
薬での処理にかける。その結果生じた環状ペプチドをつ
いで十分脱保護し且つ固体支持体から遊離させる。
【００１５】本願のペプチド合成法において用いるため
の好ましい型の固体支持体は、ポリスチレングラフトコ
ポリマー樹脂である。ポリエチレングリコール−ポリス
チレングラフトコポリマー樹脂は特に好ましい。適当な
樹脂は、１９９０年８月３１日に出願された米国特許出
願第０７／５７６，６３４号及び１９９１年６月１４日
に出願された米国特許出願第０７／７１５，２８９号
［代理人登録簿番号ＭＩＬ９０−０４Ａ］に記載されて
いる（その教示は参考として本明細書中に援用する）。
【００１６】本発明は、アリル基の使用に基づくペプチ
ド合成のためのアミノ酸誘導体に対する側鎖官能部分の
保護システムを提供する。アリル基は巨大でなく且つ、
従って、縮合の間に、ペプチド鎖中の保護されたアミノ
酸に隣接する部位におけるペプチド結合縮合に有害な立
体効果を及ぼさない。アリル基は、カルボニウムイオン
等の不適当に反応性の脱離生成物を生じることなく温和
な条件下で円滑に開裂する。更に、本発明のアリル側鎖
保護システムは、ｔ−ブチルオキシカルボニル（ｔＢｏ
ｃ）、又は９−フルオレニルメチルオキシカルボニウム
（Ｆｍｏｃ）等の広く用いられるαＮ保護カルボニル型
基に完全に直交している。更に、アリル側鎖保護は、自
動式の商業規模のペプチド合成に容易に適合し得る。
【００１７】
【発明の詳細な解説】本発明のアリル側鎖保護されたア
ミノ酸誘導体は下記の一般式を有する：
【化１２】 ｛式中、アルファ炭素はＬ又はＤ配置の何れかであり；
Ｙはハロゲン（フッ素、塩素、臭素、及びヨウ素を含
む）、水酸基、及び活性エステルからなる群より選択
し；Ｘはカルボニル型の保護基であり；Ｑはジー又はト
リー置換した形態のαアミノ基であり；Ｂは水素又はメ
チル基であり；そしてＡは、アリルオキシカルボニル、
アリルオキシメチル、アリルエーテル、アリルチオエー
テル、アリルエステル及びアリルアミドからなる群より
選択するアリル保護基によって保護されたアミノ酸側鎖
である｝。
【００１８】“活性エステル”という用語は、アミノ酸
又はペプチドのカルボキシル基を活性化する化合物を言
う。活性エステルは、カルボキシル基を一層アミノ基と
反応性にすることによって活性化する。ここに記載した
合成物及び方法において用い得る活性エステルは、例え
ば、ペンタフルオロフェニル、ニトロフェニルピラゾー
ル、ベンゾトリアルゾリルオキシ、並びにＯ−アシルイ
ソウレア及び対称性無水物を含むカップリング剤によっ
て生成する活性中間体を含む。本発明と共に用いるのに
適した活性エステルは、１９８９年６月８日に出願され
た米国特許出願第０７／３６２，９８０に一層完全に記
載されている（その教示は本明細書中に参考として援用
する）。
【００１９】本願の合成物のαＮ部分はカルボニル型保
護基によって保護される。適当な保護基は、例えば、ｔ
−ブチルオキシカルボニル（ｔＢｏｃ）、ｔ−アミルオ
キシカルボニル、アダマンタニルオキシカルボニル、９
−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、
２−（３，５−ジメトキシフェニル）−２−プロピルオ
キシカルボニル、ジチアスクシノイル、ビフェニリルイ
ソプロピルオキシカルボニル、及びフェニルイソプロピ
ルオキシカルボニルを含む。そのような基は、アリル側
鎖保護基が安定である条件下で除去（脱保護）すること
が出来る（即ち、直交する）。従って、αＮ保護基は、
例えば、アミノ酸誘導体を適当な塩基｛例えば、ＤＭＦ
中のピペリジン（Ｆｍｏｃを除去する）｝又は適当な酸
｛例えば、ＴＦＡ（ｔＢｏｃを除去する）｝での処理に
かけることによって除去し得る。本発明のＦｍｏｃ及び
ｔＢｏｃアミノ酸誘導体は、固相ペプチド合成に特に有
用である。
【００２０】本発明のアリル保護基は、無極性、極性、
負荷電、又は正荷電したアミノ酸側鎖官能部分に対する
直交保護を供給するために用い得る。一層特に、アリル
オキシカルボニル基は、リジン及びオルニチンの側鎖第
１アミン部分を保護するために用い得る。アリルオキシ
カルボニル基は又、アルギニンのグアニド側鎖官能部分
を保護するためにも用い得る。アリルエーテル基は、セ
リン及びスレオニンの側鎖水酸基部分を保護するために
用い得る。アリルオキシメチル基、アリルエーテル又は
アリルチオエーテルは、メチオニン及びシステインの硫
黄含有側鎖官能部分を保護するために用い得る。アリル
エーテルは又、チロシン中のフェノール部分を保護する
ためにも用い得る。更に、アスパラギン酸、グルタミン
酸、アスパラギン、及びグルタミンのカルボン酸又はア
ミド側鎖官能部分は、アリルエステル又はアリルアミド
によって保護し得る。
【００２１】前述のアリル側鎖保護基のそれぞれにおい
て、アリル部分は下記の一般式のものである：
【化１３】 （式中、Ｒ1 、Ｒ2 、Ｒ3 、Ｒ4 及びＲ5 は独立に、Ｃ
1 〜Ｃ8 の直鎖又は分岐鎖アルキル基、Ｃ6 〜Ｃ10アリ
ール基、Ｃ1 〜Ｃ8 直鎖又は分岐鎖置換アルキル基、及
びＣ6 〜Ｃ10置換アリール基からなる群より選択す
る）。換言すれば、本願のアルキル基又はアリール基
は、置換基として、水酸基、エーテル結合、エステル結
合、チオール、チオエーテル結合、ハロゲン、シアン
基、アミン、ニトロ基、スルホニル基、ホスホニル基等
を含み得る。アリール基は又アルキル基で置換し得且
つ、逆にアルキル基はアリール基を置換基として有する
ことが出来る。一般に、生じるアリル保護基が巨大でな
く且つペプチド合成の間にペプチド結合カップリング反
応において立体障害を生じないので、より小さいＲ基が
好ましい。アリル保護基は、固相ペプチド合成におい
て、支持体に結合した構築中のペプチドに好ましい膨潤
（溶媒和）特性を与え、固相ペプチド合成に特に好まし
い。
【００２２】本発明のアリル保護したアミノ酸誘導体
は、アリル側鎖保護基をアミノ酸の側鎖に付け且つαＮ
保護基をアミノ酸のαアミノ部分に付けることによって
製造する。前記のように、適当なαＮ保護基はアリル基
と直交するものである（カルボニル型保護基が好まし
い）。適当なαＮ保護基をアミノ酸のαアミノ部分に付
けるための方法及び手順は当業者に知られており、M. B
odanszky, Peptide Chemistry: A Practical Textbook,
Springer-Verlag (1988), RSPN No. 0-387-18984-X
（Sigma Chemical Co.より入手可能）に記載されている
（その教示は本明細書に参考として援用する）。例え
ば、Ｆｍｏｃ保護基を付けるために、アミノ酸又はその
アリル誘導体を塩基性条件下で９−フルオレニルメチル
オキシカルボニルスクシネート（Ｆｍｏｃ−ＯＳｕ；Ｎ
−ヒドロキシスクシンイミドのＦｍｏｃ誘導体）に接触
させる。その結果生じる化合物、Ｆｍｏｃ−Ｘａａ−Ｏ
Ｈ又はＦｍｏｃ−Ｘａａ（ＯＡｌ）−ＯＨ（ここに、Ｘ
ａａはアミノ酸を示す）を、その生じたαＮ保護したア
ミノ酸誘導体の沈殿又は好ましくは結晶化を引き起こす
のに十分な条件にかける。これらの手順は実施例１に一
層十分に記載してある。
【００２３】本願の方法の一つの実施態様において、ア
リルアルコールをアリル基の源として又、硫酸を触媒と
して用いる。固体アミノ酸（例えば、粉末又は結晶形
態）をアリルアルコール中のＨ2 ＳＯ4 の溶液に加える
（この混合物は実質的に完全に反応することが出来
る）。この反応の進行は薄層クロマトグラフィー（ＴＬ
Ｃ）によって容易に監視することが出来る。酢酸エチ
ル、ピリジン、水及び酢酸からなる溶媒系は、アルミニ
ウムで裏打ちしたシリカプレート上で行う場合に、アリ
ル誘導体化アミノ酸と出発材料の良い分離を与えること
が見出された。反応が実質的に完了したことが認められ
たときに、アリル誘導体化アミノ酸を、誘導体の沈殿又
は好ましくは結晶化を生じるのに十分な条件にかける。
この方法において、例えば、アスパラギン酸及びグルタ
ミン酸の側鎖アリルエステルを製造することが出来る
（これらの手順は、それぞれ、実施例１（Ａ）及び１
（Ｂ）の主題である）。セリン、スレオニン及びチロシ
ンのフェノール性エーテルも又、システインの側鎖チオ
エーテル及びメチオニンの側鎖アリルオキシメチル誘導
体と同様に製造することが出来る。実施例に記載してあ
るように、αＮ保護は、アリル保護より先にしても後に
しても良い：誘導体化の好ましい順序は、製造する特定
のアミノ酸誘導体による。
【００２４】他の実施態様において、まずアミノ酸の銅
錯体を作り、次いでアリルオキシカルボニルクロリドで
処理する。アミノ酸の塩化物塩を塩基性条件下でＣｕＳ
Ｏ4と接触させ、次いで、重炭酸塩の存在下でアリルク
ロロホルメートで処理する。その結果生じた結晶を、硫
化水素で処理して銅を遊離させ、そしてアリル誘導体化
アミノ酸をその誘導体の沈殿又は好ましくは結晶化を生
じるのに十分な条件にかける。この方法において、例え
ば、リジン及びメチオニンの側鎖アリルオキシカルボニ
ル誘導体（即ち、側鎖アミノ基へのアルキルアミドの結
合）が製造される（これらの手順はそれぞれ実施例１
（Ｃ）及び１（Ｄ）の主題である）。アルギニン及びヒ
スチジンのアリルオキシカルボニル誘導体は同様の方法
で製造し得る。しかしながら、ペプチジルアルギニン残
基がアリル保護したオルニチン誘導体から酵素的に調製
し得るということには注意しなければならない。アスパ
ラギン及びグルタミンのアリルアミド誘導体は同様に調
製することが出来る。本願の方法の第１の実施態様とし
て、αＮ保護はアリル保護より先にしても後にしても良
い。
【００２５】固相ペプチド合成における本願のアリル保
護したアミノ酸誘導体の利用を、本願のアリル誘導体を
含む４量体ペプチドを調製することによって初めに示し
た。固相ペプチド合成は典型的に第１のαＮ保護したア
ミノ酸誘導体のカルボキシル末端の固体支持体への共有
結合で開始する。ペプチド合成に有用な固体支持体は、
例えば、膜、多孔質ガラス、シリカ、ポリスチレン、ポ
リジメチルアクリルアミド、綿又は紙を含む。スペーサ
ーアームを付着して有する“グラフトコポリマー”と呼
ばれる固体支持体は、そのような固体支持体はペプチド
結合縮合反応に最小立体効果（マトリックス効果）しか
及ぼさず、好ましい。グラフトコポリマーは、J.K. Inm
an等、 (1977) Solid Phase Methods in Protein Sequen
ce Analysis, INSERM Symp. No. 5, A. Previero and
M.-A. Coletti-Previero 編、 Elsevier-North Holland,
New York, p. 81-94; 及び E. Bayer 等、 (1983) Pept
ides: Structure and Function, Proc. 8th Am. Pept.
Symp., V.J. Hruby and D.H. Rich編、 Pierce Chemical
Co., p. 87-90 に記載されている。１９９０年８月３
１日に出願された米国特許出願第０７／５７６，６３４
号に記載されたポリエチレングリコール−ポリスチレン
グラフトコポリマーは、本願のアリル保護したアミノ酸
誘導体と用いるのに特に好ましい。
【００２６】アミノ酸誘導体のカルボキシル基は、固体
支持体に直接又はスペーサーアームを介して付着したハ
ンドルの部分に共有結合する。“ハンドル”は、合成す
べき配列中の最初のアミノ酸残基を固体支持体に結合さ
せるのに役立つ２官能性スペーサーとして定義される。
ハンドルの一端は円滑に開裂し得る保護基を含み且つ、
他端は固体支持体に、典型的にはアミン官能基を介して
結合する。固相ペプチド合成に利用し得るハンドルは、
例えば、酸不安定性ｐ−アルコキシベンジル（ＰＡＢ）
ハンドル、光不安定性ｏ−ニトロベンジルエステルハン
ドル、及びF. Albericio等、(1990) J. Org. Chem. 55:3
730-3743、１９９０年８月３１日に出願された米国特許
出願第０７／５７６，２３２号、及び同日に出願された
米国特許出願第０７／５７６，２３３号に記載されたよ
うなハンドルを含む。酸不安定性ハンドルを実施例２〜
４に記載した手順において利用する。適当なハンドル
は、アミノ官能化支持体上に単一ステップで定量的に結
合して、ペプチド鎖構築のために明確に定めた構造の一
般的開始点を提供する。Ｃ末端のαＮ保護したアミノ酸
誘導体を、次いで、ハンドルに定量的に結合する。支持
体に結合したアミノ酸誘導体をαＮ脱保護し、支持体を
洗浄し且つ、必要ならば中和する。次いで、ペプチド鎖
伸長合成サイクルが全体的に進行する。
【００２７】この合成サイクルは、一般に、αＣ活性化
し、αＮ保護したアミノ酸誘導体と支持体に結合した伸
長鎖中のαＮ脱保護した末端アミノ酸残基との反応、そ
の後の洗浄、中和及びαＮ脱保護からなる。このサイク
ルを適当なアミノ酸誘導体を用いて繰り返して関心のあ
る配列を形成する。ペプチド結合縮合のための活性化剤
及び反応条件は、G. Barany (1987) Int. J. Pept. Pro
t. Res. 30:705-739の722-724 頁に一般的に記載されて
いる。１−ヒドロキシベンゾトリアゾールを伴うベンゾ
トリアゾリルＮ−オキシトリスジメチルアミノ−ホスホ
ニウムヘキサフルオロホスフェート（ＢＯＰ／ＨＯＢ
Ｔ）は、カップリング反応のための特に好ましい活性化
剤であり、実施例２に記載してある。ＢＯＰ／ＨＯＢＴ
系の利用は、D. Hudson, (1988) J. Org. Chem. 53:617
-624に一層詳細に記載されている（その教示は本明細書
中に参考として援用する）。
【００２８】実施例２の結果は、実施例１で調製したア
リル側鎖を保護したアミノ酸誘導体は固相合成によって
構築したペプチド中に取り込み得るということを示す。
アリル側鎖保護は特に、側鎖保護基が巨大でなくそれ故
鎖中の保護したアミノ酸残基に隣接するペプチド結合の
縮合又はアリル保護したアミノ酸誘導体と支持体に結合
した構築中のペプチドとの縮合に立体障害を与えず、固
相ペプチド合成において有利である。アリル基は、疎水
性のｔＢｏｃ又は巨大な芳香族トリチル側鎖保護基と異
なり、樹脂支持体の膨潤及び支持体に結合したペプチド
の溶媒和を促進する。結果として、鎖伸長中にペプチド
結合縮合が容易に進行する。
【００２９】その結果生成した支持体に結合したペプチ
ドは、モルホリン等の親核受容体の存在下で、テトラキ
ス−トリフェニルホスフィンパラジウム（０）等の適当
な貴金属有機金属触媒の利用によってアリル脱保護する
ことが出来る。アリル基を含む反応のための有機パラジ
ウム触媒の利用は、B.M. Trost (1977) Tetrahedron33:
2615-2649に記載されている。脱保護反応は、支持体に
結合したペプチドを傷つけることのない温和な、中性条
件下で進行する。従って、アリル脱保護は、Ｆｍｏｃ及
びｔＢｏｃ等の他の型の保護基の安定性に影響を与えな
い。逆に、アリル基は、αＮ保護基の脱保護において一
般に遭遇する条件に対して安定であり続けることが見出
された。更に、アリル脱保護は、ｔ−ブチル、ベンジル
又はトリチル基等の側鎖保護基の除去と異なり、反応性
のカルボニウムイオン脱離生成物の形成を生じない。従
って、アリル脱保護は、他の側鎖保護基の利用において
遭遇するチロシン、トリプトファン、システイン又はメ
チオニン残基のアルキル化等の望ましくない副反応の危
険を与えない。
【００３０】アリル脱保護は単純ポリスチレン樹枝上で
ゆっくりと進行することが見出された（この見かけの制
限は、支持体に結合したペプチドを脱保護触媒に繰り返
し又は長時間さらすことによって回避することが出来る
が、それは生成物の完全性がそれらによっては損なわれ
ないからである）。しかしながら、極性又はグラフトコ
ポリマー（前に述べ又、実施例２〜４で用いるポリエチ
レングリコール−ポリスチレングラフトコポリマー等）
は、この影響を及ぼさず、アリル脱保護は急速且つ定量
的に進行する。
【００３１】固相ペプチド合成における、本願のアリル
側鎖保護したアミノ酸誘導体の利用を、更に、９量体ペ
プチド、プロトロンビン１−９の上首尾の構築及び定量
的脱保護によって説明した。これらの結果は、実施例３
に一層完全に記載してある。
【００３２】本発明のアリル保護したアミノ酸誘導体
は、環状又は分岐鎖ペプチド構造を構築する手段を提供
する固相ペプチド合成において更に有用である。これら
の目的のために、本発明によるアリル側鎖保護は、他の
ペプチド製造のための側鎖保護計画と組み合わせること
が出来るが、そこにおいて、選択した側鎖部分は、他の
すべての保護が影響されない間に脱保護し且つ更に誘導
体化することが出来る。この方法において、例えば、全
く異なるペプチド配列をリジンのεＮ部分から構築する
ことが出来る。この方法で構築した分岐したペプチド
は、２つ以上の直鎖状ペプチドエピトープが組み合わさ
って抗原提示を促進し又は非直鎖状エピトープ（例え
ば、蛋白質の折りたたみによって生じる）が構築可能で
あるので、特に抗体の産生のためのペプチド免疫原とし
て有用である。
【００３３】環状ペプチドは又、そのような目的にも有
用であり、且つアリル側鎖保護の計画を用いて、例え
ば、ペプチド内側鎖−側鎖アミド結合を導入すべき部位
に構築することが出来る。A.M. Felix等、 (1988) Int.
J. Pept. Prot. Res. 31:231-238は、環化剤としてＢＯ
Ｐを用いることによるアミド結合した環状ペプチド等の
製造方法を記載している。環化と組合せてのアリル側鎖
保護の利用は、実施例４に一層完全に記載してあるが、
そこには、環状ヒト生長ホルモン放出因子ペプチドの合
成の結果を示してある。ペプチド薬剤の回送又は環化は
有利であり、ペプチドの安定な構成が保存し得、一層高
い機能的活性へと導く。更に、環状ペプチドは、分解に
対して一層耐性であり、イン・ビトロにおける治療上の
拡大された半減期を生じる。
【００３４】この発明を、今、下記の実施例によって更
に説明するが、何れにしても、それを制限するものと見
てはいけない。
【００３５】
【実施例】実施例１ ：アリル側鎖保護したαＮ−Ｆｍｏｃアミノ酸
誘導体の合成 Ａ．Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯＡｌ）−ＯＨの合成 各Ｆｍｏｃ−アミノ酸の合成は２つのステップを含ん
だ。アスパラギン酸エステルの場合、アリル側鎖保護基
を最初に付けてＡｓｐ−アリルエステルを形成した。こ
の反応をアリルアルコール中でＨ2 ＳＯ4 を触媒として
用いて行なった：
【化１４】 Ａｓｐ（ＯＡｌ）−ＯＨ：１リットルの無水エーテルを
氷上で３．０Ｌのフラスコ内でアルゴン中で攪拌しなが
ら冷却した。濃Ｈ2 ＳＯ4 ［６０ｍＬ］をフラスコにゆ
っくりと加え、その後アリルアルコール［３００ｍＬ；
４．４モル］（Aldrich Chemical Co.から供給）を加え
た。アスパラギン酸［６０ｇ；０．４５モル］をフラス
コに加え、濁った混合物を一晩攪拌した。翌日、固体が
溶解しているのを見出した。
【００３６】混合物の薄層クロマトグラフィー（ＴＬ
Ｃ、酢酸エチル：ピリジン：水：酢酸の３５：２０：１
１：６の体積比の溶媒系を使用）は、反応が良く進行し
たことを示した（少量の誘導体化しなかったアスパラギ
ン酸が残っただけであった）。
【００３７】攪拌バーをフラスコから除去し、過剰のア
リルアルコールをロータリーエバポレーターによって除
去した。その結果生じた薄茶色のシロップを１．０Ｌの
ＨＰＬＣ等級の水に溶解し、そしてｐＨが５．０になる
までＫＯＨペレットを加えた。生成物（固体沈殿）を濾
過によって除去し、且つ濾液を約５００ｍＬに濃縮し
た。等容量（５００ｍＬ）のメタノールを加え、その結
果生じたスラリーを濾過した。濾液を１２０ｇのタール
にまで濃縮した。
【００３８】調製目的のために、エステル生成物を単離
しなかった。その代わりに、粗生成物を９−フルオレニ
ルメチルオキシカルボニル−スクシネート（Ｆｍｏｃ−
ＯＳｕ；Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドのＦｍｏｃ誘導
体）でｐＨ９で処理した。酸性化及び抽出は、下記のＦ
ｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯＡｌ）−ＯＨを与えた。
【化１５】 Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯＡｌｌ）−ＯＨ：上記のステップ
１で得られたタールを５００ｍＬの希水性ＫＯＨに溶解
し且つ最終的ｐＨを固体ＫＯＨを用いて１０に調整し
た。Ｆｍｏｃ−ＯＳｕ［６８ｇ；０．２０１モル］を少
量ずつ１時間にわたって加えたが、ｐＨは固体ＫＯＨを
用いて８〜１０に維持した。Ｆｍｏｃ−ＯＳｕの最終添
加の後に、反応を更に３０分間攪拌し、且つ５０ｍＬの
濃ＨＣｌを含む２００ｍＬの氷中に注いだ。その結果生
じた白色懸濁液を酢酸エチルで２回抽出し、そして合わ
せた有機相を１．０ＮＨＣｌで１回洗浄し、Ｎａ2 ＳＯ
4 上で乾燥し且つタールにまで濃縮した。この残留物を
シリカカラム（１０×３０ｃｍ）に載せ、塩化メチレン
中の１〜１０％のメタノールの１ステップ勾配（５００
ｍＬ増加）で溶出した。
【００３９】最も純粋な画分（塩化メチレン中の１０％
メタノールの溶媒系においてＴＬＣ上での０．１５の保
持因子（ｒｆ）を有する）は重複し、且つ残留物を酢酸
エチルに溶解して４℃に冷却した。９．５ｇ（９．５ｇ
のアスパラギン酸出発材料の７．３％の収率）の白色結
晶（融点１０５〜１０８℃）を採集した。
【００４０】核磁気共鳴（ＮＭＲ）、フーリエ変換赤外
分光光度法（ＦＴ−ＩＲ）及び組成分析による生成物の
分析は、最初の反応（アリル保護基の付加）が、少量の
αＣ位置異性体（regioisomer ）又は２置換生成物が認
められただけで、著しい選択性を示すということを示し
た。 1Ｈ ＮＭＲ（２００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3 ）、ｐｐｍ ：
８．０−７．０、（多重線、ｍ）８Ｈ；６．５−６．
０、（ｍ）１Ｈ；５．７−５．５、（ｍ）１Ｈ；５．３
−４．９、（ｍ）２Ｈ；４．６−３．９、（ｍ）５Ｈ；
３．０−２．６、（ｍ）１Ｈ。 13Ｃ ＮＭＲ（５０ｍＨｚ，ＣＤＣｌ3 ）ｐｐｍ ：１４
５．７、１３０．８、１２６．８、１２６．１、１２
４、１１８．８、１１７．４、６６．５、６４．９、５
０．９、４６．０、３６．０。ＦＴ−ＩＲ，ｃｍ-1 ：３３９５、３１７１、１７５７、
１７３８、１７１６、１５１４、１２１９、１２１１。 Ｃ22Ｈ21ＮＯ6 の計算による分析： Ｃ、６６．８３。 Ｈ、５．３５。 Ｎ、３．５４。 実測による分析： Ｃ、６６．９７。 Ｈ、５．６６。 Ｎ、３．３８。
【００４１】Ｂ．Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯＡｌ）−ＯＨ。 Ａｓｐについての上述の反応順序は、グルタミン酸エス
テルについては効果的であるとは立証されなかった（Ｆ
ｍｏｃ基を先に付加してＦｍｏｃ−Ｇｌｕ−ＯＨを生成
するのが、より良い計画であることが判明した）。
【化１６】 Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ−ＯＨ。３００ｍＬのテトラヒドロフ
ラン（ＴＨＦ）及び３００ｍＬの水の中にグルタミン酸
［２０ｇ；０．１３６モル］を含む溶液を、ＫＯＨペレ
ット及び１ＭＫＯＨ溶液でｐＨ９に調整した。Ｆｍｏｃ
−ＯＳｕ［４５ｇ；０．１３４モル］を５分割して攪拌
しながら加えた。少量の１ＭＫＯＨ溶液を各添加の５分
後に加えて反応混合物のｐＨを９に戻した。すべてのＦ
ｍｏｃ−ＯＳｕを加えたとき、濁っていた懸濁液が透明
になった。それを、５００ｍＬの氷の中の１００ｍＬの
濃ＨＣｌに注いだ。その結果生じた白い懸濁液を５００
ｍＬの酢酸エチルで抽出し且つＮａ2 ＳＯ4 上で乾燥し
た。この溶液を濾過し且つ蒸発させて２００ｍＬにし、
その上にヘキサンを混合物が濁るまで加えた。この混合
物を冷却して結晶を生成し、それを集めて乾燥し、融点
１８５〜１８８℃の白色結晶３４．５ｇ（グルタミン酸
からの７０％の収率）を与えた。
【００４２】生成物をＮＭＲ、ＩＲ、質量分析及び組成
分析によって分析した（結果を下記に示す）。 13Ｃ ＮＭＲ（５０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3 ）、ｐｐｍ ：２
６．２、３０．２、４６．７、５３．０、６６．０、１
２０．１、１２５．２、１２７．１、１２７．７、１４
０．９、１４３．９、１５６．２、１７３．８、１７
３．４。ＦＴ−ＩＲ、ｃｍ-1 ：３３０６、１７１１、１６９５、
１５４７、１４４６、１２６９、１０５９。Ｍ／ｅ（相対的強度） ：３７０（４４）、３０７（４
６）、２８９（２５）、２４６（１０）、２１９（２
０）、１９２（１４）、１７９（１００）、１６５（２
４）。 Ｃ20Ｈ19ＮＯ6 の計算による分析： Ｃ、６４．９８。 Ｈ、５．１７。 Ｎ、３．８５。 実測による分析： Ｃ、６４．６１。 Ｈ、４．９８。 Ｎ、３．８４。
【００４３】ステップ１の生成物のアリルアルコール中
でのＨ2 ＳＯ4 での処理は、下記の所望のＦｍｏｃ−Ｇ
ｌｕ（ＯＡｌｌ）−ＯＨの形成を生じた。幾つかの２置
換エステルも又形成され、所望の生成物から酸塩基抽出
によって分離された。
【化１７】 Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（Ａｌ）−ＯＨ。ステップ１からのＦ
ｍｏｃ−Ｇｌｕ−ＯＨ［１０ｇ；２７ミリモル］を１０
０ｍＬのアリルアルコールと攪拌し、そして７ｍＬの濃
Ｈ2 ＳＯ4 を添加した。その混合物を１時間攪拌した
（その時間の間に殆どの固体は溶解した）。エーテル
［５００ｍＬ］を加え、その混合物を５００ｍＬの水で
２回洗った。エーテル層を２００ｍＬの０．１ＭＮａＯ
Ｈ溶液で洗った。この層を、２００ｍＬの氷中の１０ｍ
Ｌの濃ＨＣｌ中に流出させた（白色懸濁液を与えた）。
この物質を２００ｍＬの酢酸エチルで抽出し、Ｎａ2 Ｓ
Ｏ4 上で乾燥し且つ容積を約１００ｍＬに減らした。こ
の溶液が濁るまでヘキサンを加え、そして一晩冷却した
ところ２ｇ（ステップ１の生成物の１８％の収率）の白
色結晶（融点５４〜５７℃）を与えた。
【００４４】生成物を、ＮＭＲ、ＩＲ、質量分析及び組
成分析によって分析した（結果を下記に示す）。 1Ｈ ＮＭＲ（２００ ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3 ） ｐｐ
ｍ ：８．７−８．３、（ｍ）２Ｈ；７．８−７．２、
（ｍ）８Ｈ；６．０−５．２、（ｍ）３Ｈ；４．６−
４．２、（ｍ）６Ｈ；２．６−１．８、（ｍ）４Ｈ。 13Ｃ ＮＭＲ（５０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3 ） ｐｐｍ ：２
７．２、３０．０、４７．２、５３．４、６５．６、６
７．４、１１８．６、１１９．９、１２５．０、１２
７．１、１２７．７、１３１．８、１４１．２、１４
３．５、１５６．２、１７２．７、１７５．７。 ＦＴ−ＩＲ、ｃｍ-1：３３２３、１７３４、１６９１、
１５４０、１２６０、１１７５、１０４２。Ｍ／ｅ（相対的強度） ：４１０（６６）、３５５（１
４）、１８８（１５）、１７０（１００）、１６５（１
６）、１３０（１０）。 Ｃ23Ｈ23ＮＯ6 ・１／２Ｈ2 Ｏの計算による分析： Ｃ、６６．０２。 Ｈ、５．５４。 Ｎ、３．３５。 実測による分析： Ｃ、６５．８５。 Ｈ、５．６６。 Ｎ、３．０４。
【００４５】Ｃ．Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（ＡｌＯＣ）−ＯＨ
の合成。 リジンのεＮ第１アミン部分の保護のために、アミノ酸
の銅錯体を最初に調製し、次いで、アリルオキシカルボ
ニルクロリドで処理した。生成物（青色沈殿）を集め、
Ｈ2 Ｓで処理して銅を除去した。濃縮し、冷却すること
により、リジン−４−アリルオキシカーボンアミド（Ｌ
ｙｓ（ＡｌＯＣ）−ＯＨ）を集めた：
【化１８】 Ｌｙｓ（ＡｌＯＣ）−ＯＨ。リジン塩酸塩［９１．５
ｇ；０．５モル］を１Ｌの水中の１２ｇのＮａＯＨの溶
液に溶かした。これにＣｕＳＯ4 ［６２．４ｇ；０．２
５モル］を加え且つその溶液をすべてのＣｕＳＯ4 が溶
けるまで攪拌した（紺色の溶液を生じた）。固体のＮａ
ＨＣＯ3 ［１５０ｇ］を加え、その後、１００ｍＬのジ
オキサン中のアリルクロロホルメート［６６ｇ；０．５
５モル］の溶液を加えた。その溶液を発泡させ且つ一晩
攪拌した。その混合物を濾過し、そして沈殿をジオキサ
ンで洗うと、空色の固体が残った。別の２０ｇのアリル
クロロホルメートを母液に加え、４時間後に一層青い固
体を得た。合わせた固体を大きい攪拌バーを入れた４Ｌ
の三角フラスコ中に入れ、２Ｌの水を加えた。混合物を
ホットプレート上で攪拌しながら加熱し、且つ（濃ＨＣ
ｌをＦｅＳにゆっくりと加えることによって得た）Ｈ2
Ｓを通気した。混合物は黒色に変色し、２時間後に青色
は見られなかった。その混合物を大きいヒルシュフィル
ター内で注意して紙フィルターを通して濾過し、黄色溶
液を冷却し且つ２４時間ガス抜きした。それを結晶が現
れるまでロータリーエバポレーターで減量し、次いで４
℃に一晩冷却した。白色結晶が得られた。母液を更に２
回濃縮し、結晶の追加の収穫が得られた。これらの結晶
の収穫物は互いに等しいことがＴＬＣ分析によって明ら
かになった（体積比３５：２０：１１：６の酢酸エチ
ル：ピリジン：水：酢酸の溶媒系を使用）。合わせた収
量は３８ｇ（出発材料Ｌｙｓ−ＨＣｌの３３％）であっ
た。この物質の少量を水から再結晶した（融点１８２〜
１９０℃）。
【００４６】生成物をＭＭＲ及び組成分析によって分析
した（結果を下記に示す）。 1Ｈ ＮＭＲ（２００ＭＨｚ，Ｄ2 Ｏ）ｐｐｍ ：６．０
−５．７（ｍ）１Ｈ；５．３−５．０（ｍ）２Ｈ；４．
５−４．４（２重線、ｄ）Ｊ＝６Ｈｚ、２Ｈ；３．７−
３．５（３重線、ｔ）Ｊ＝８Ｈｚ、１Ｈ；３．１−２．
９（ｔ）Ｊ＝７Ｈｚ、２Ｈ；１．９−１．７（ｍ）２
Ｈ；１．５−２．５（ｍ）４Ｈ。 Ｃ10Ｈ16Ｎ2 Ｏ4 の計算による分析： Ｃ、５２．６。 Ｈ、７．８７。 Ｎ、１２．１６。 実測による分析： Ｃ、５１．７２。 Ｈ、８．１１。 Ｎ、 １２．３
５。
【００４７】結晶生成物Ｌｙｓ（ＡｌＯＣ）−ＯＨを、
Ｆｍｏｃ−ＯＳｕとｐＨ９で反応させることによってα
Ｎ保護してＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（ＡｌＯＣ）−ＯＨを生成
した。標準的手順による抽出及び精密検査の後、所望の
生成物を結晶形態で回収した：
【化１９】 Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（ＡｌＯＣ）−ＯＨ。上記のステップ
１の結晶生成物［２８ｇ；０．１２１モル］を５００ｍ
Ｌの水と５００ｍＬのジオキサンの混合物に溶解し、且
つＫＯＨペレットをｐＨが１０に達するまで加えた。こ
の混合物に、Ｆｍｏｃ−ＯＳｕ［３６．５ｇ；０．１０
８モル］を少量ずつ加え、且つ追加のＫＯＨを１Ｍ溶液
から加えてｐＨを９〜１０に維持した。２時間後、最後
のＦｍｏｃ−ＯＳｕを加え、その混合物を２００ｍＬの
氷及び５０ｍＬの濃ＨＣｌに注いだ。この白色混合物を
５００ｍＬの酢酸エチルで２回抽出し、そして合わせた
有機相を５００ｍＬの１ＮＨＣｌで洗い且つＮａ2 ＳＯ
4 上で乾燥した。その溶液をタールにまで減量し、直ち
にシリカカラムを通してクロマトグラフィーにかけ、酢
酸エチルで溶出した。７ｇの純物質（シリカプレート及
び塩化メチレン中の１０％メタノールの溶媒系を用い
て、ＴＬＣ上で０．１のｒｆを有する）を、未反応のＦ
ｍｏｃ−ＯＳｕを含む画分と共に得た。粗生成物をヘキ
サン飽和酢酸エチル（以後、酢酸エチル／ヘキサンと記
す）から結晶化して１１．８ｇの純物質を与えた。総収
量は１８．８ｇ（出発材料Ｆｍｏｃ−ＯＳｕの３８％）
であった。この少量を酢酸エチル／ヘキサンから結晶化
した（融点８０〜８５℃）。
【００４８】生成物をＮＭＲ、ＩＲ、質量分析、及び組
成分析によって分析した（結果を下記に示す）。 13Ｃ ＮＭＲ（５０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3 ）ｐｐｍ ：１７
５．７、１４３．７、１４３．５、１４１．１、１３
２．７、１２７．６、１２６．９、１２５．０、１１
９．９、１１７．６、６６．９、６５．５、５３．５、
４６．９、４０．３、３１．６、２９．１、２２．１。Ｍ／ｅ（相対的強度） ：１０７（３７）、１２１（２
０）、１３６（６８）、１５４（６４）、１６５（２
７）、１７８（１００）、１９１（１４）、２３１（１
５）、２９５（１３）、４５３（２１）、４９１（１
９、Ｋ＋塩）。ＦＴ−ＩＲ、ｃｍ-1 ：３３３５、２９４３、１７４３、
１６９５、１６４９、１５３１、１２６３。 Ｃ25Ｈ28Ｎ2 Ｏ6 の計算による分析： Ｃ、６６．３６。 Ｈ、６．２４。 Ｎ、６．１９。 実測による分析： Ｃ、６６．１８。 Ｈ、６．２３。 Ｎ、６．０６。
【００４９】Ｃ．Ｆｍｏｃ−Ｏｒｎ（ＡｌＯＣ）−ＯＨ このアミノ酸誘導体をリジンについて上述した方法で製
造した。Ｏｒｎ（ＡｌＯＣ）−ＯＨ 。オルニチン塩酸塩［６０
ｇ；０．３７５モル］を８００ｍＬの水に溶かして９ｇ
のＮａＯＨを加えた。ＣｕＳＯ4 ［４７ｇ；０．１８７
５モル］をこの溶液に加え、その結果その混合物は深い
青色に変色した（すべての固体が溶解するまでそれを攪
拌した）。次に、１００ｇのＮａＨＣＯ3 を加え、その
後３００ｍＬのジオキサン中のアリルクロロホルメート
［５６．８ｇ；０．４１２５モル］を加えた。その混合
物は泡立ち且つ一晩攪拌した。空色の固体を紙フィルタ
ー上に集め、そして２Ｌの熱水中に再懸濁した。Ｈ2 Ｓ
を３時間通気し、そして黒色懸濁液を濾過し且つ２４時
間静置した。その結果生じた黄色溶液を５００ｍＬにま
で濃縮して一晩冷却した。白色結晶が得られ、それを集
めて冷水で洗った。母液を更に濃縮して結晶の第２の収
穫を与えた。両バッチはＴＬＣ分析（体積比３５：２
０：１１：６の酢酸エチル：ピリジン：水：酢酸の溶媒
系）によって同一であることが判明した。収量は４１．
９ｇ（Ｏｒｎ−ＨＣｌの５１．５％）、融点２６０℃
（分解した）であった。
【００５０】生成物をＮＭＲ及び組成分析によって分析
した（結果を下記に示す）。 1Ｈ ＮＭＲ（２００ＭＨｚ，Ｄ2 Ｏ）ｐｐｍ ：６．０
−５．７（ｍ）１Ｈ；５．３−５．０（ｍ）２Ｈ；４．
５−４．４、（ｄ）Ｊ＝５Ｈｚ、２Ｈ；３．７−３．５
（ｔ）Ｊ＝７Ｈｚ、１Ｈ；３．２−３．０（ｔ）Ｊ＝６
Ｈｚ、２Ｈ；１．９−１．６（ｍ）２Ｈ；１．６−１．
３（ｍ）２Ｈ。 Ｃ8 Ｈ16Ｎ2 Ｏ4 の計算による分析： Ｃ、４９．９９。 Ｈ、７．４５。 Ｎ、１２．９５。 実測による分析： Ｃ、５０．０９。 Ｈ、７．５６。 Ｎ、１３．１４。Ｆｍｏｃ−Ｏｒｎ（ＡｌＯＣ）−ＯＨ 。ステップ１の生
成物［１１ｇ；０．０５１モル］を２００ｍＬの水と２
００ｍＬのジオキサンの混合物中に溶解し、そしてＫＯ
ＨペレットをｐＨが１０に達するまで加えた。Ｆｍｏｃ
−ＯＳｕ［１５ｇ；０．０４５モル］を少量ずつ加え、
そして追加のＫＯＨを１Ｍ溶液として加えてｐＨを９〜
１０に維持した。最後のＦｍｏｃ−ＯＳｕを加えた２時
間後に、混合物を２００ｍＬの氷及び５０ｍＬの濃ＨＣ
ｌ中に注いだ。白色混合物を３００ｍＬの酢酸エチルで
２回抽出し、そして合わせた有機相を２００ｍＬの１Ｎ
ＨＣｌで洗い且つＮａ2 ＳＯ4 上で乾燥した。その溶液
をタールにまで減らし、そして１００ｍＬの酢酸エチル
を、溶液に濁りを生じるのに十分なヘキサンと共に加え
た。濁った溶液を４℃に一晩冷却し、そして白色結晶を
集めて冷酢酸エチルで洗った。総収量は１２．７ｇ（出
発材料としてのＦｍｏｃ−ＯＳｕの５７％）であった。
この生成物の少量を酢酸エチル／ヘキサンから再結晶し
た（融点８２〜８５℃）。
【００５１】生成物をＮＭＲ、ＩＲ、質量分析、及び組
成分析によって分析した（結果を下記に示す）。 1Ｈ ＮＭＲ（２００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3 ）ｐｐｍ ：
７．８−７．１（ｍ）８Ｈ；５．８−５．６（ｍ）１
Ｈ；５．４−５．２（ｍ）２Ｈ；４．６−４．２（ｍ）
５Ｈ；３．４−３．２（ｍ）２Ｈ；２．０−１．３
（ｍ）４Ｈ。 13Ｃ ＮＭＲ（５０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3 ）ｐｐｍ：１５
６．７、１４３．７、１４３．５、１４１．１、１３
２．６、１２７．６、１２６．９、１２５．０、１１
９．８、１１７．７、６７．０、６５．６、５３．８、
４７．０、４０．３、２９．３、２５．８。ＦＴ−ＩＲ、ｃｍ-1 ：３３３１、３０６７、１６９５、
１５３９、１２５５。 Ｃ24Ｈ26Ｎ2 Ｏ6 の計算による分析： Ｃ、６５．７４。 Ｈ、５．９８。 Ｎ、６．３９。 実測による分析： Ｃ、６５．７３。 Ｈ、５．７０。 Ｎ、６．１２。
【００５２】要約：アミノ酸誘導体の特性 上記のアミノ酸誘導体の各々の少量を酢酸エチル／ヘキ
サンから数回再結晶し、そして融点及び組成分析にかけ
た。これらの測定の結果は上記の本文中に記載してあ
り、下記の表２に要約する。更に、誘導体を高圧液体ク
ロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって、下記の溶媒系
を用いてWaters MicrobondTM-pack C18 分析カラム（マ
サチューセッツ州 Bedford在、Millipore 社 Waters ク
ロマトグラフィー部門）：Ａ＝アセトニトリル、Ｂ＝水
中の０．１％ＴＦＡ、２０分間にわたる５〜１００％の
Ｂの直線状勾配）、及びアルミニウムで裏打ちしたシリ
カプレート（EM reagents,カタログ番号５５３４）を使
用した薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）を用いて表に
示した溶媒系を用いて分析した。
【００５３】
【表２】 表２：アミノ酸誘導体の特性 化合物 融点 分子量 保持 ｒｆ ℃ ＨＰＬＣ（分） ＴＬＣ Fmoc-Asp(OAl)-OH 105-108 395.4 16.0 0.47a Fmoc-Glu(OAl)-OH 66-72 409.4 16.5 0.49a Fmoc-Lys(AlOC)-OH 80-85 452.5 15.7 0.65b Fmoc-Orn(AlOC)-OH 82-85 438.4 14.0 0.63b a クロロホルム：メタノール：酢酸（７７．５：１５：７．５）の溶媒系b クロロホルム：メタノール：酢酸（９０：８：２）の溶媒系
【００５４】実施例２：試験用ペプチドの合成及び脱保
護分析 実施例１に記載した保護されたアリル側鎖、αＮ−Ｆｍ
ｏｃ−アミノ酸誘導体を含む試験用ペプチドをMilligen
/Biosearchペプチドシンセサイザーモデル９６００（カ
リホルニア州 Novato 在、Millipore 社、Milligen/Bio
search Division ）にて合成した。カップリングに用い
た活性化剤は、１−ヒドロキシベンゾトリアゾールを伴
うベンゾトリアゾリルＮ−オキシトリスジメチルアミノ
−ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＢＯＰ／
ＨＯＢＴ）であった。D. Hudson,(1988) J. Org. Chem.
53:617-624 （その教示は本明細書中に参考として援用
する）。G. Barany 等 (1987) Int. J. Pept. Prot. Re
s. 30:705-739 の 722-723頁、及び A.M. Felix 等 (19
88) Int. J. Pept. Prot. Res. 31:231-238 の 232頁を
参照されたい。ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰ
ＣＤＩ）活性化も又用いた（Barany等の 722頁を参
照）。
【００５５】各試験用ペプチドに対して、１ｇのＦｍｏ
ｃ−ＰＡＬ−ＰＥＧ−ＭＢＨＡ樹脂、［５’−（４’’
−（９−フルオレニルメチルオキシカルボニル）アミノ
エチル−３，５−ジメトキシフェノキシ）吉草酸］−ポ
リエチレングリコール−ｐ−メチルベンズヒドリルアミ
ンポリスチレン樹脂（１９９０年８月３１日に出願した
同時係属中の米国特許出願第０７／５７６，６３４号に
記載されており、その教示を本明細書中に参考として援
用する）を、樹脂１ｇ当りペプチド０．１３−０．１７
ミリモルのロード比で用いた。アリル保護したアミノ酸
誘導体を試験配列イソロイシン−アラニン−（アリル誘
導体化したアミノ酸残基）−グリシン［Ｉｌｅ−Ａｌａ
−Ｘａａ（Ａｌ）−Ｇｌｙ］に、完全な組込みを確実に
するために４時間のカップリング時間を用いて組み込ん
だ。４つの試験用ペプチドのそれぞれをＣ末端アミドと
して調製し、且つその試験配列をアミノ酸分析（ＡＡ
Ａ）によって確認した。
【００５６】Ｎ末端Ｆｍｏｃ保護基を未だ有しているペ
プチドに結合した樹脂の試料（１００〜５００ｍｇ）を
ぴたりと合うキャップを有する５ｍＬのプラスチック瓶
内に入れた。２５０ｍｇのトリフェニルホスフィンを各
瓶に加え、その後０．２ｍＬのモルホリン（還流させ且
つＣａＨ2 から蒸留したもの）を加えた。続いて、３ｍ
Ｌの乾燥（Ｎａ／ベンゾフェノンから新たに蒸留した）
ＴＨＦを加え、その後５０ｍｇの触媒、テトラキストリ
フェニルホスフィンパラジウム（０）（Alfa Chemical
Co. ）を加えた。B.M. Trost (1977) Tetrahedron 33:2
615-2649。H. Kunz, (1987) Angew. Chem. Int. Ed. En
gl. 26:294-308の304-306 頁、及び H.Kunzと H. Waldm
ann, (1984) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 23:71-72
をも参照されたい。混合物を一晩震盪し、そしてジメチ
ルホルムアミド（ＤＭＦ）中の２０％ピペラジンでＮ末
端Ｆｍｏｃ基を除去する前に樹脂をＴＨＦで数回洗浄し
た。続いて、４量体ペプチドを支持体樹脂からＴＦＡを
用いて開裂させ、溶液から回収した。
【００５７】アリル誘導体化アミノ酸残基の脱保護の広
さ（円滑さ）を、アルミニウムで裏打ちしたシリカプレ
ート上での薄層クロマトグラフィー（使用溶媒系は、酢
酸エチル：ピリジン：水：酢酸、体積比 ３５：２０：
１１：６）によって分析した。対照用の脱保護したペプ
チド４量体を、ｔＢｏｃ側鎖誘導体化アミノ酸を用いて
標準的方法によって製造し、そしてそれを用いて脱保護
した試験用ペプチドに対するｒｆ値を確立した。保護し
そして脱保護した４量体ペプチドについてのＲｆ値を表
３に示す。
【００５８】
【表３】 表３：試験用４量体ペプチドのＲｆ値 保護 ｒｆ 脱保護 ｒｆ Ile-Ala-Asp(OAl)-Gly 0.78 Ile-Ala-Asp-Gly 0.28 Ile-Ala-Glu(OAl)-Gly 0.62 Ile-Ala-Glu-Gly 0.47 Ile-Ala-Lys(AlOC)-Gly 0.78 Ile-Ala-Lys-Gly 0.07 Ile-Ala-Orn(AlOC)-Gly 0.71 Ile-Ala-Orn-Gly 0.07 各４量体のパラジウム触媒アリル除去の後に、ＴＬＣ分
析においては保護されたペプチドの目に見える痕跡は残
らなかった。パラジウム処理した４量体ペプチドの高速
原子衝撃（ＦＡＢ）質量分析は、アリル保護基がもはや
ペプチドと結合していないことを確実にした（除去の効
率が９５％より良いことを示している）。
【００５９】ペプチドの構築中に、Ｆｍｏｃ脱保護の反
復サイクルの間にアリル保護基が同じ場所に残っている
ことを確認するために、アリル誘導体化アミノ酸の試料
を２４時間の適切なピペリジン処理にかけ、次いでＴＬ
Ｃで分析した。それぞれの場合において、観察された主
要スポットは完全なアリル誘導体によるものであった。
ペプチド伸長の間のアリルアミノ酸誘導体の完全性はＦ
ＡＢ−ＭＳ及びＡＡＡ分析において分岐が観察されない
ことによって確認した。
【００６０】実施例３：アリル保護したアミノ酸誘導体
を用いたプロトロンビン１−９の合成 配列Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ
−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−ＮＨ2 を有する９量体ペプ
チドプロトロンビン１−９を、実施例１に記載したＦｍ
ｏｃ−Ｇｌｕ（Ｏａｌｌ）−ＯＨ及びＦｍｏｃ−Ｌｙｓ
（Ａｌｌｏｃ）−ＯＨアミノ酸誘導体を用いて合成し
た。実施例２で詳述した合成計画を用いた：ＢＯＰ／Ｈ
ＯＢｔがペプチド結合縮合を媒介し、その後にアリル脱
保護し、Ｎ末端Ｆｍｏｃを除去し、そして樹脂からＴＦ
Ａ開裂した。その結果生じた９量体ペプチドをＦＡＢ−
ＭＳ及び逆相ＨＰＬＣで分析した。ＨＰＬＣ溶出プロフ
ィルは９０％を超える純度のペプチドが得られたことを
示したが、質量分析は配列の構築に用いた３つのアリル
基全部が完全に除去されたことを示した。
【００６１】実施例４：アリル保護したアミノ酸誘導体
を用いた環状ペプチドヒト生長ホルモン放出因子１−２
９［Ａｓｐ２７−Ｌｙｓ１８］の合成 ヒト生長ホルモン放出因子１−２９、Ｔｙｒ−Ａｌａ−
Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｓ
ｅｒ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌ
ｙ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ
−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｍｅｔ−Ｓｅｒ−
Ａｒｇ−ＮＨ2 を、Ａｓｐ２７及びＬｙｓ１８以外のす
べてのアミノ酸側鎖官能部分のｔ−ブチル保護したＦｍ
ｏｃ誘導体を用いて合成した（実施例１に記載したアリ
ル誘導体を用いた）。実施例２で記載したのと類似の合
成計画を用い、そしてアリル脱保護の後に樹脂に結合し
たペプチドをＢＯＰ試薬での処理にかけ、A.M. Felix
等、(1988) Int. J. Pept. Prot. Res. 31:231-238に従
って［Ａｓｐ２７：Ｌｙｓ１８］側鎖−側鎖カップリン
グを誘導した。樹脂からのＴＦＡ媒介開裂の後に、その
結果生じた環状ペプチドを、標準的手順に従って、ＦＡ
Ｂ−ＭＳ及びエドマン分解（Ｎ−末端配列分析）によっ
て分析した。配列プロフィルは、１８位及び２７位の残
基の喪失を示した（エドマンペプチド配列反応により生
成したフェニルチオヒダントインの付加した（２７）及
び修飾した（１８）性質に基づく）。ＢＯＰ試薬での処
理にかけなかった試料から生じた配列プロフィルは２７
位のＡｓｐ残基及び１８位のＬｙｓ残基を含むことが見
出された。質量分析の結果は、環状化ペプチドの配列中
の見かけのギャップは不完全なアリル脱保護によるより
は側鎖−側鎖カップリングによるものであることを示し
た。
【００６２】当業者は、常例的実験以上のものを用いな
いで、多くのここに記した発明の特定の実施態様と同等
のものを認め又は突きとめることができるであろう。こ
れらの及び他のすべてのそのような同等物は前記の特許
請求の範囲に含まれる。

Claims (23)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 側鎖官能部分をアリル側鎖保護基で保護
    した、ペプチド合成のためのアミノ酸誘導体。
  2. 【請求項２】 アリル側鎖保護基をアリルオキシカルボ
    ニル、アリルオキシメチル、アリルエーテル、アリルチ
    オエーテル、アリルエステル、及びアリルアミドからな
    る群より選択する、請求項１に記載の側鎖保護したアミ
    ノ酸誘導体。
  3. 【請求項３】 下記の一般式の化合物： 【化１】 （式中、α炭素はＬ又はＤ配置の何れかであり；Ｙはハ
    ロゲン、水酸基、及び活性エステルからなる群より選択
    し；Ｘはカルボニル型保護基であり；Ｑはジ−又はトリ
    −置換した形態のαアミノ基であり；Ｂは水素又はメチ
    ル基であり；そしてＡはアリル側鎖保護基によって保護
    されたアミノ酸側鎖である）。
  4. 【請求項４】 活性エステルをペンタフルオロフェニ
    ル、ニトロフェニルピラゾール、ベンゾトリアゾリルオ
    キシ、及びＯ−アシルイソウレア及び対称性無水物を含
    むカップリング剤によって生成した活性中間体からなる
    群より選択する、請求項３に記載の化合物。
  5. 【請求項５】 カルボニル型保護基をｔ−ブチルオキシ
    カルボニル、ｔ−アミルオキシカルボニル、アダマンタ
    ニルオキシカルボニル、９−フルオレニルメチルオキシ
    カルボニル、２−（３，５−ジメトキシフェニル）−２
    −プロピルオキシカルボニル、ジチアスクシノイル、ビ
    フェニリルイソプロピルオキシカルボニル、及びフェニ
    ルイソプロピルオキシカルボニルからなる群より選択す
    る、請求項３に記載の化合物。
  6. 【請求項６】 アリル保護したアミノ酸側鎖が下記の一
    般式で表される、請求項３に記載の化合物： 【化２】 （式中、ｎは１〜４の整数であり、Ｒ1 、Ｒ2 、Ｒ3 、
    Ｒ4 及びＲ5 は独立に、水素、Ｃ1 〜Ｃ8 の直鎖又は分
    岐鎖アルキル基、Ｃ6 〜Ｃ10アリール基、Ｃ1 〜Ｃ8 直
    鎖又は分岐鎖置換アルキル基、及びＣ6 〜Ｃ10置換アリ
    ール基からなる群より選択する）。
  7. 【請求項７】 アミノ酸をリジン及びオルニチンからな
    る群より選択し、側鎖保護基がアリルオキシカルボニル
    基である、請求項１に記載のアミノ酸誘導体。
  8. 【請求項８】 アリル保護したアミノ酸側鎖が下記の一
    般式で表される、請求項３に記載の化合物： 【化３】 （式中、Ｒ1 、Ｒ2 、Ｒ3 、Ｒ4 及びＲ5 は独立に、Ｃ
    1 〜Ｃ8 の直鎖又は分岐鎖アルキル基、Ｃ6 〜Ｃ10アリ
    ール基、Ｃ1 〜Ｃ8 直鎖又は分岐鎖置換アルキル基、及
    びＣ6 〜Ｃ10置換アリール基からなる群より選択す
    る）。
  9. 【請求項９】 アミノ酸をセリン及びスレオニンからな
    る群より選択し、側鎖保護基がアリルエーテルである、
    請求項１に記載のアミノ酸誘導体。
  10. 【請求項１０】 アリル保護したアミノ酸側鎖が下記の
    一般式で表される、請求項３に記載の化合物： 【化４】 （式中、ｎは０又は１であり、Ｒ1 、Ｒ2 、Ｒ3 、Ｒ4
    及びＲ5 は独立に、水素、Ｃ1 〜Ｃ8 の直鎖又は分岐鎖
    アルキル基、Ｃ6 〜Ｃ10アリール基、Ｃ1 〜Ｃ8直鎖又
    は分岐鎖置換アルキル基、及びＣ6 〜Ｃ10置換アリール
    基からなる群より選択する）。
  11. 【請求項１１】 アミノ酸をメチオニン及びシステイン
    からなる群より選択し、側鎖保護基をアリルオキシメチ
    ル、アリルエーテル及びアリルチオエーテルからなる群
    より選択する、請求項１に記載のアミノ酸誘導体。
  12. 【請求項１２】 アリル保護したアミノ酸側鎖が下記の
    一般式で表される、請求項３に記載の化合物： 【化５】 （式中、Ｒ1 、Ｒ2 、Ｒ3 、Ｒ4 及びＲ5 は独立に、水
    素、Ｃ1 〜Ｃ8 の直鎖又は分岐鎖アルキル基、Ｃ6 〜Ｃ
    10アリール基、Ｃ1 〜Ｃ8 直鎖又は分岐鎖置換アルキル
    基、及びＣ6 〜Ｃ10置換アリール基からなる群より選択
    する）。
  13. 【請求項１３】 アリルエーテル保護したチロシン誘導
    体を含む、請求項１に記載のアミノ酸誘導体。
  14. 【請求項１４】 アリル保護したアミノ酸側鎖が下記の
    一般式で表される、請求項３に記載の化合物： 【化６】 （式中、ｎは１又は２であり、ＺはＯ又はＮＨであり、
    Ｒ1 、Ｒ2 、Ｒ3 、Ｒ4及びＲ5 は独立に、水素、Ｃ1
    〜Ｃ8 の直鎖又は分岐鎖アルキル基、Ｃ6 〜Ｃ10アリー
    ル基、Ｃ1 〜Ｃ8 直鎖又は分岐鎖置換アルキル基、及び
    Ｃ6 〜Ｃ10置換アリール基からなる群より選択する）。
  15. 【請求項１５】 アミノ酸残基をアスパラギン酸、グル
    タミン酸、アスパラギン及びグルタミンからなる群より
    選択し、側鎖保護基がアリルエステル又はアリルアミド
    である、請求項１に記載のアミノ酸誘導体。
  16. 【請求項１６】 アリル保護したアミノ酸側鎖が下記の
    一般式で表される、請求項３に記載の化合物： 【化７】 ｛式中、Ｖは、独立に、水素及び 【化８】 （式中、Ｒ1 、Ｒ2 、Ｒ3 、Ｒ4 及びＲ5 は独立に、水
    素、Ｃ1 〜Ｃ8 の直鎖又は分岐鎖アルキル基、Ｃ6 〜Ｃ
    10アリール基、Ｃ1 〜Ｃ8 直鎖又は分岐鎖置換アルキル
    基、及びＣ6 〜Ｃ10置換アリール基からなる群より選択
    する）からなる群より選択する｝。
  17. 【請求項１７】 モノ−アリルオキシカルボニル保護し
    たアルギニン誘導体又はビス−アリルオキシカルボニル
    保護したアルギニン誘導体を含む、請求項１に記載のア
    ミノ酸誘導体。
  18. 【請求項１８】 アリル保護したアミノ酸側鎖が下記の
    一般式で表される、請求項３に記載の化合物： 【化９】 ｛式中Ｆは 【化１０】 （式中、Ｔはカルボニル基又はメチレン基であり、Ｒ
    1 、Ｒ2 、Ｒ3 、Ｒ4 及びＲ5 は独立に、水素、Ｃ1 〜
    Ｃ8 の直鎖又は分岐鎖アルキル基、Ｃ6 〜Ｃ10アリール
    基、Ｃ1 〜Ｃ8 直鎖又は分岐鎖置換アルキル基、及びＣ
    6 〜Ｃ10置換アリール基からなる群より選択する）であ
    る｝。
  19. 【請求項１９】 アミノ酸がヒスチジンであり、側鎖保
    護基がアリルオキシメチル基又はアリルオキシカルボニ
    ル基である、請求項１に記載のアミノ酸誘導体。
  20. 【請求項２０】 側鎖がアリル側鎖保護基で保護された
    αＮ保護したアミノ酸誘導体を結合して有する固相ペプ
    チド合成のための固体支持体。
  21. 【請求項２１】 アリル側鎖保護基をアリルオキシカル
    ボニル、アリルオキシメチル、アリルエーテル、アリル
    チオエーテル、アリルエステル及びアリルアミドからな
    る群より選択する、請求項２０に記載の側鎖保護したア
    ミノ酸誘導体。
  22. 【請求項２２】 ポリスチレングラフトコポリマー樹脂
    である、請求項２０に記載の固体支持体。
  23. 【請求項２３】 ポリエチレングリコール−ポリスチレ
    ングラフトコポリマー樹脂を含む、請求項２２に記載の
    固体支持体。
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