JPH06109729A - アポトーシス検出試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 組織乃至細胞のアポトーシス（apoptosis ）
を検出する新しい方法及び該方法に有用な検出試薬を提
供する。 【構成】 本発明によればＬｅ^Y 糖鎖を認識する抗体を
含有するアポトーシス検出試薬が提供される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、細胞のアポトーシス
（apoptosis ）を検出するための新しい方法及び該方法
に有用な検出試薬に関する。

【０００２】

【従来技術とその課題】アポトーシスは発生学の分野で
はよく知られているが、これまでの病理学では、殊に腫
瘍に関しては、細胞死は壊死（necrosisi ）として認識
されるのが一般的であり、該壊死とアポトーシスの境界
は明らかではなかった。しかるに、アポトーシスは壊死
とは異なり、発生過程や生体の恒常性維持のためにプロ
グラムされた細胞死（programmed cell death ）であ
り、細胞の活性化によってそのプログラムが遂行された
結果の細胞死である。形態的にも細胞質の膨化と膜の破
壊が先行する壊死とは異なり、細胞質の濃縮と核の濃縮
から断片化そしてアポトーシス小体へと変化をする。上
記アポトーシスは、体内での分化や細胞数の制御機構の
一部として、不要となった細胞や標的として排除すべき
細胞が死ぬ時に働いていると考えられており、各種病態
との関連において、近年殊に注目を浴びてきている。

【０００３】しかして、現在上記アポトーシスを検出す
る手段としては、前記の形態学的変化、即ち被検細胞の
細胞質や核の濃縮（condensation）又は分断化の電顕的
確認及びＤＮＡフラグメンテーション（DNA fragmentat
ion ）の確認によってなされているが、その手段、操作
の繁雑性から、これをより簡便に且つ正確に検出するこ
とのできる新しい方法の開発が当業界で望まれている。

【０００４】一方、ルイス（Ｌewis）式血液型糖鎖及び
その関連糖鎖（先駆体、誘導体等）に関する研究が、多
くの研究者によってなされている。例えば組織において
は、特に、発生過程〔（J. Inve. Derm.87 : 81 〜, 19
86），（J. Exp. Med. 159 :506〜，1984），（Bioche
m. Biophys. Res. comm. 158 : 913〜，1989）〕や、癌
化〔食道（病理と臨床 9(11) : 1477 〜, 1991），（日
外会誌 92(9) : 1098〜,1991 ）、胃（日外会誌 92
(9) : 1098〜,1991 ），（日消会誌 84(11) : 2494 〜
, 1987 ），（Can. Res. 49 : 745〜 1989 ），（日外
会誌 92(7) : 813 〜， 1991 ），（細胞（特集） 24
(5) : 207 〜 , 1992 ）、大腸（日外会誌92(9) : 1098
〜,1991 ），（Can. Res. 46 : 5985 〜 , 1986 ）、乳
腺（日外会誌 92(9) : 1098〜,1991 ）、膵臓（日外会
誌92(9) : 1098〜,1991 ）〕に伴う分布変化と合わせ
て、生体組織分布を各種の抗糖鎖モノクローナル抗体や
レクチンで検索した報告が、数多く知られている。本発
明者も既にＬｅ^Y 糖鎖を認識する抗体を用いて、ＡＩＤ
Ｓウイルスや肝炎ウイルス等の各種ウイルス感染患者の
ＣＤ４やＣＤ８Ｔリンパ球上のＬｅ^Y 発現率が変化して
いることを発見している〔（臨床病理 39(6) : 627 〜
, 1991 ），（Proceedings of the 1990 Internationa
l Symposium on Viral Hepatitis and Liver Disease :
289〜 , 1990），（J. Exp. Med., 167 : 323 〜 , 19
88 ）〕。

【０００５】しかしながら、之等の各種細胞上に発現さ
れ検出されているＬｅ^Y 糖鎖の生物学的意義付けは明ら
かにされておらず、該Ｌｅ^Y 糖鎖発現に至る細胞単位で
の変化やメカニズムは勿論のこと、之等がアポトーシス
と関連することを示唆する報告は皆無である。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者は、Ｌｅ^Y 糖鎖
発現の生物学的意義を研究する過程において、アポトー
シス像の見られる細胞が、上記Ｌｅ^Y 糖鎖を特異的に発
現しているという新しい事実を発見し、かかるＬｅ^Y 糖
鎖が細胞のアポトーシスマーカーとして有用であること
を確認し、この知見に基いて本発明を完成するに至っ
た。

【０００７】即ち、本発明によれば、Ｌｅ^Y 糖鎖を認識
する抗体を含有するアポトーシス検出試薬が提供され
る。

【０００８】本発明試薬の有効成分としての抗体は、Ｌ
ｅ^Y 糖鎖を認識する限りにおいて特に限定はなく、例え
ば常法に従ってＬｅ^Y 糖鎖を含む抗原で動物を免疫し、
該動物の抗体産生細胞から細胞融合の手段によってハイ
ブリドーマを得、これから製造されるモノクローナル抗
体等をいずれも良好に利用することができる。かかる抗
体は既に種々知られており、また市販品としても入手す
ることができる。之等の内では特にＢＭ−１として公知
の抗体〔J.Biol.Chem., 258, 11793,(1983) :以下これ
を「ＢＭ−１／ＪＩＭＲＯ」と略記する〕を好ましいも
のとして挙げることができる。

【０００９】上記抗体を含有する本発明検出試薬は、通
常の試薬と同様にして調整することができ、例えば通常
の安定化剤、保存剤、或は本明細書に開示のアポトーシ
スの検出において使用されることのある他の成分、例え
ば二次抗体、標識剤、緩衝液等をいずれも任意に添加配
合することができる。また、上記有効成分としてのＬｅ
^Y 糖鎖を認識する抗体は、凍結乾燥品であってもよく、
この場合該試薬には水又は水性溶媒からなる再構成剤を
配合することができる。

【００１０】以下、本発明検出試薬を使用してアポトー
シスを検出する方法につき詳述する。

【００１１】本発明検出試薬の利用によって、アポトー
シスの検出を行ない得る細胞は、特に限定はなく、ヒト
及び他の動物の各種細胞のいずれであってもよい。かか
る細胞のアポトーシスの検出は、通常の一般的な免疫測
定方法に従って、細胞上に発現されるＬｅ^Y 糖鎖を測定
することにより行なうことができる。前記した通り、各
種細胞におけるＬｅ^Y 糖鎖の発現は、Ｌｅ^Y 糖鎖を認識
する抗体の利用により測定できることが既に知られてお
り、本発明におけるアポトーシスの検出においてもかか
るＬｅ^Y 糖鎖の免疫測定方法を好適に採用することがで
きる。

【００１２】かかる免疫測定方法としては、例えばラジ
オイムノアッセイ法（ＲＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩ
Ａ）、蛍光抗体法（ＦＡＴ）等を挙げることができ、よ
り具体的にはＰＡＰ法、ＡＢＣ法、ＳＡＢＣ法等の酵素
抗体法や蛍光抗体法及びそのフローサイトメトリーでの
検出法等を例示することができる。

【００１３】之等各方法において、使用する抗体の濃度
は、該抗体の種類、検出する組織、細胞の種類、検出方
法等に応じて適宜決定でき、それ自体通常のものと特に
異ならず、例えば１ｍｌの抗体溶液当り、抗体蛋白質と
して１０μｇ〜３０μｇ程度の範囲から選べばよい。測
定系に用いられる緩衝液も、特に限定はなく、一般には
ｐＨ７．２〜７．４程度のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢ
Ｓ）等を好適に利用することができる。

【００１４】被検細胞に結合した抗体は、測定系で採用
した標識剤の活性を測定することにより測定できる。こ
の標識剤の活性測定は、その種類に応じて適宜公知の方
法に従うことができる。

【００１５】かくして被検細胞にＬｅ^Y 糖鎖の発現が測
定される時には、後記実施例で詳述し確認されているよ
うに、かかる細胞はアポトーシスを起こしているか或は
起こそうとしている細胞として判定され得る。従って、
本発明によれば、Ｌｅ^Y 糖鎖の発現の測定結果をアポト
ーシスマーカーとして利用する新しいアポトーシス検出
方法を提供できるものであり、本発明検出試薬は該アポ
トーシスの検出に有効である。

【００１６】

【発明の効果】本発明によれば、新規なアポトーシス検
出試薬が提供される。その利用によれば、被検細胞のア
ポトーシスを、従来技術に比して極めて簡便に且つ正確
に検出することができ、これは発生学、医学等の基礎分
野は勿論のこと、臨床医学や製剤学分野においても非常
に有用である。また被検薬剤と接触前後の細胞のアポト
ーシスを、本発明検出試薬によって検出することによ
り、該被検薬剤のアポトーシス調整作用（増強乃至抑制
作用）を極めて簡便に且つ効率よく判定することもで
き、本発明はかかるアポトーシス調整薬剤のスクリーニ
ングにも有効である。

【００１７】

【実施例】以下、本発明を更に詳しく説明するため、腎
癌症例、胃癌症例及び胸腺におけるアポトーシスの検出
例を実施例１〜３に、またインビトロ（in vitro）で誘
導させたアポトーシスの検出例を実施例４に挙げる。

【００１８】尚、実施例１〜３における組織の標本の作
製及び免疫染色は、以下の方法にて行なった。

【００１９】（１）組織 外科摘出術及び病理解剖によって摘出されたホルマリン
固定−パラフィン包埋ヒト組織を用いて、３〜４μｍの
連続薄切切片を作製し、これを組織標本に使用した。

【００２０】（２）ヘマトキシリンエオジン（ＨＥ）染
色 組織切片を脱パラフィンし、流水水洗し、蒸留水水洗し
た後、ヘマトキシリン染色液で核染色し、流水中で色出
しした。次に、エオジン染色液で細胞質を染色し、アル
コール脱水、キシレン透徹をへてマリノール（封入剤）
で封入した。

【００２１】（３）免疫染色 ＳＡＢＣ法（間接法）を用いた酵素抗体法で染色を行な
った。

【００２２】組織切片を脱パラフィンし、０．３％Ｈ₂
Ｏ₂ メタノール溶液（メタノール１５０ｍｌに３０％Ｈ
₂ Ｏ₂ １．５ｍｌを加えたもの（用時調整））に室温下
に、３０分間浸漬して内因性ペルオキシダーゼを失活さ
せ、アルコールを通して水にうつし、ＰＢＳになじませ
た。切片にブロッキング試薬（１０％正常ウサギ血清、
生化学工業）を加え、室温で３０分間浸漬した後、余分
な水分を取り、洗浄せずに一次抗体として、抗Ｌｅ^Y モ
ノクローナルマウス抗体ＢＭ−１／ＪＩＭＲＯを加え、
４℃で一晩浸漬した。ネガティブコントロールには、一
次抗体の代わりにブロッキング試薬を用いた。

【００２３】次にＰＢＳで洗浄した後、二次抗体（ビオ
チン標識抗マウスＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、生化学工
業）を加え、室温で３０分間浸漬した。再度ＰＢＳで洗
浄し、酵素試薬（ペルオキシダーゼ標識ストレプトアビ
ジン、生化学工業）を加え、３０分間浸漬した。ＰＢＳ
で洗浄後、ＤＡＢ−Ｈ₂ Ｏ₂ 溶液（３，３′−ジアミノ
ベンチジン−４ＨＣｌ（和光純薬）３０ｍｇ、蒸留水１
３５ｍｌ、０．５Ｍ Tris-HCl buffer（ｐＨ７．６）１
５ｍｌ及び２．５％Ｈ₂ Ｏ₂ 水溶液０．３ｍｌを用時混
和したもの）に５〜１０分程度浸漬して発色させた。

【００２４】最後に、ヘマトキシリンで核染色し、アル
コール脱水、キシレン透徹をへて封入した。尚、ブロッ
キング試薬、二次抗体及び酵素試薬としては、ヒストフ
ァイン染色キット構成試薬（生化学工業）を用いた。

【００２５】また、上記において一次抗体のＢＭ−１／
ＪＩＭＲＯの代わりに、以下の抗体を用いて、同様にし
て対照試験を実施した。

【００２６】・抗ヒトＰＣＮＡモノクローナルマウス抗
体：DAKO-PCNA, PC10 ダコ社(Dako)製。

【００２７】抗ＰＣＮＡ抗体は、ＤＮＡポリメラーゼＳ
結合蛋白であり、核内増殖抗原（Proliferating Cell N
uclear Antigen）を認識し、Ｇ１期後期から特にＳ期に
ある細胞に強い陽性を示す〔Amer.J.Clin.Patho., 97
(5) : 4 (1992) 〕。

【００２８】・抗ヒトＢ細胞（ＣＤ２０）モノクローナ
ルマウス抗体：L-26(Dako)。

【００２９】Ｌ−２６は、Ｂ細胞（ＣＤ２０）と反応す
る抗体であるが、胸腺髄質の樹状細胞とも強く反応する
〔病理と臨床、5 (11) : 1171 (1987)〕。

【００３０】

【実施例１】腎癌症例 外科摘出術及び病理解剖によって摘出された３０例の腎
癌患者組織を、腎癌取り扱い規約（日本泌尿器学会、日
本病理学会、日本医学放射線学会編）に基づき分類した
所、之等３０例の腎癌患者組織は、以下の通り分類され
た。

【００３１】(1)alveolar type, common type, clear c
ell subtype ２７例、(2)cystic type, common type, c
lear cell subtype １例、(3)tubular type, common ty
pe, clear cell subtype２例。

【００３２】之等の組織を、ヘマトキシリンエオジン染
色及びＳＡＢＣ法（間接法）を用いた酵素抗体法で免疫
染色を行なった。

【００３３】結果を図１〜図１１に示す。各図はいずれ
も生物の形態を示す図面に代わる写真であり、それぞれ
次のことを示す。

【００３４】図１は、癌組織を免疫染色した結果を示
し、染色された部位がＢＭ−１／ＪＩＭＲＯ陽性である
ことを示す。

【００３５】図２は、上記の連続切片にＨＥ染色をした
結果を示し、図１のＢＭ−１／ＪＩＭＲＯ陽性部位に萎
縮した像が観察されることを示す。

【００３６】図３は同連続切片の抗ＰＣＮＡ抗体を用い
た免疫染色（対照）の結果を示し、染色されたＰＣＮＡ
陽性細胞は、ＤＮＡ合成を行なう増殖細胞であることを
示す。

【００３７】図４は、図２のＢＭ−１／ＪＩＭＲＯ陰性
でＰＣＮＡ陽性を示す部位（図２の右部分）の拡大像
（ＨＥ染色）を示し、細胞増殖している腎癌細胞の形態
を示す。

【００３８】図５は図２のＢＭ−１／ＪＩＭＲＯ陽性で
ＰＣＮＡ陰性を示す部位（図２の左部分）の拡大像（Ｈ
Ｅ染色）を示し、アポトーシス初期様の萎縮した形態を
示す。

【００３９】図６は、図１のＢＭ−１／ＪＩＭＲＯ陽性
細胞の拡大像を示し、陽性細胞の形態と染色様式（細胞
膜に陽性）を示す。

【００４０】図７は、正常腎組織の抗ＰＣＮＡ抗体によ
る免疫染色（対照）の結果を示し、ＰＣＮＡ陽性細胞
（染色された核をもつ細胞）の分布を示す。

【００４１】図８は、正常腎組織を免疫染色した結果を
示し、染色されたＢＭ−１／ＪＩＭＲＯ陽性細胞の分布
及び該陽性部位がネフロン単位で萎縮した部位ならびに
管腔表層であることを示す。

【００４２】図９は、正常腎組織を免疫染色した結果を
示し、ＢＭ−１／ＪＩＭＲＯ陽性を示す尿細管上皮表層
の細胞が上皮細胞の萎縮した細胞であることを示す。

【００４３】図１０及び図１１は、図９で示されるＢＭ
−１／ＪＩＭＲＯ陽性細胞のＨＥ染色の結果を示し、該
細胞の形態がアポトーシス様の像であることを示す。

【００４４】腎組織の癌部位において、ＢＭ−１／ＪＩ
ＭＲＯ陽性細胞（染色された細胞）が２３例（７６．７
％）に観察された。このＢＭ−１／ＪＩＭＲＯ陽性部位
では細胞質の濃縮と好酸性（エオジン好性）変化、核の
濃縮、萎縮像が観察され、これらはアポトーシスの初期
形態変化と一致していた（図４〜図６参照）。更に、Ｂ
Ｍ−１／ＪＩＭＲＯ陽性部位ではＰＣＮＡに微弱陽性か
ら陰性を示し、ＰＣＮＡに強い陽性を示す部位では、Ｂ
Ｍ−１／ＪＩＭＲＯは陰性であった。つまり、ＢＭ−１
／ＪＩＭＲＯ陽性部位ではＧ１〜Ｓ期にある増殖細胞が
極端に少ない（殆んどない）ことが判った（図１〜図３
参照）。一方、壊死といわれる膜の破壊が見られる部位
（溶解壊死巣）では、ＰＣＮＡ及びＢＭ−１／ＪＩＭＲ
Ｏともに陰性であった。

【００４５】癌組織周辺の正常腎組織においては、尿細
管上皮表層にＢＭ−１／ＪＩＭＲＯ陽性を認めた。尿細
管上皮は一層の立方上皮よりなり、ＰＣＮＡ陽性を示す
細胞から、細胞質が萎縮したアポトーシス様細胞まで、
さまざまな段階の細胞が混在していた（図７及び図８参
照）。

【００４６】ＢＭ−１／ＪＩＭＲＯ陽性部位は、この尿
細管上皮の管腔側表層の萎縮した細胞であった。（図９
〜図１１参照）。

【００４７】

【実施例２】胃癌症例 １０例の胃癌組織及びその周辺胃組織切片を作製し、試
験に供した。分化度は低分化腺癌６例、低分化〜中分化
腺癌１例、中分化腺癌２例、高分化腺癌１例であった。
このうち腸上皮化生をともなうものが９例（９０％）あ
り、又、多発性異所性のう胞をともなうものが２例であ
った。

【００４８】結果を前記図１〜図１１と同様にして、図
１２〜図２０（生物の形態を示す図面に代わる写真）に
示す。

【００４９】図１２は、正常胃組織のＨＥ染色像であ
り、腸上皮化生（中央）及びその両側に正常胃組織があ
ることを示す。

【００５０】図１３は、図１２の連続切片の抗ＰＣＮＡ
抗体を用いた免疫染色（対照）の結果であり、ＰＣＮＡ
陽性な細胞増殖帯が、正常胃では腺頸部に、腸上皮化生
では腺底部に存在し、位置が変化していることを示す。

【００５１】図１４は、同連続切片の免疫染色結果であ
り、正常胃では腺深部に向かってＢＭ−１／ＪＩＭＲＯ
陽性強度が増すが、腸上皮化生ではほとんど陰性である
ことを示す。

【００５２】図１５は、胃癌組織のＨＥ染色像であり、
胃中分化腺癌の形態を示す。

【００５３】図１６は、図１５の連続切片の抗ＰＣＮＡ
抗体を用いた免疫染色（対照）の結果であり、同一患者
の同一組織で同一組織型の癌でありながら、ＰＣＮＡ陽
性率に差がある（細胞増殖の強い部位と弱い部位があ
る）ことを示す。

【００５４】図１７は、同連続切片の免疫染色結果であ
り、図１６のＰＣＮＡ陽性率の低い部位（細胞増殖の弱
い部位）でＢＭ−１／ＪＩＭＲＯの陽性が強く、ＰＣＮ
Ａ陽性率の高い部位ではＢＭ−１／ＪＩＭＲＯの陽性が
弱いことを示す。

【００５５】図１８は図１５の拡大像であり、図１６及
び図１７から、ＰＣＮＡ陽性率が高く、ＢＭ−１／ＪＩ
ＭＲＯの陽性が弱いと確認される部位の形態を、また癌
細胞層中心のＢＭ−１／ＪＩＭＲＯ強陽性細胞が、癌細
胞の萎縮したアポトーシス様細胞であることを示す。

【００５６】図１９は図１５の拡大像であり、ＰＣＮＡ
陽性率が低く、ＢＭ−１／ＪＩＭＲＯの陽性が強い部位
の形態を示し、アポトーシス様の細胞にＢＭ−１／ＪＩ
ＭＲＯの陽性が強いことを示す。

【００５７】図２０は図１７の拡大像であり、図１９で
認められるアポトーシス様細胞に、ＢＭ−１／ＪＩＭＲ
Ｏが強陽性であることを示す。

【００５８】ＢＭ−１／ＪＩＭＲＯの陽性分布を見る
と、非癌部については胃底腺、幽門腺ともに強陽性であ
り、粘膜上皮細胞では弱陽性から陰性を示した。胃底腺
では壁細胞が特に強い陽性を示し、幽門腺、胃底腺とも
に腺の底部（基底側）にいくほど強陽性を示した。正常
胃では腺頸部にＰＣＮＡ陽性の増殖帯が存在し、ＢＭ−
１／ＪＩＭＲＯは腺頸部で反応が弱く、そこから腺、上
皮へと成熟・分化する過程でＢＭ−１／ＪＩＭＲＯ陽性
へと変化して行くように観察された。このうち、疫学的
調査より前癌病変として考えられる腸上皮化生は、癌周
辺組織に高頻度に認められた。腸上皮化生の細胞増殖帯
は胃の正常腺とは異なり腺底部に存在し、ＰＣＮＡ染色
標本で見ると、正常腺の腺底部の中に腸上皮化生だけが
島状に陽性を示した（図１３参照）。

【００５９】一方、ＢＭ−１／ＪＩＭＲＯは腸上皮化生
は弱陽性から陰性を示し、特に腺底部ではほとんど陰性
で、上皮側（管腔側）に行くほど腸性細胞が増加した。
よってＢＭ−１／ＪＩＭＲＯ染色標本では、ＰＣＮＡと
は逆に、強陽性な正常腺の中で腸上皮化生だけが島状に
陰性を示した（図１４参照）。形態的には特にアポトー
シス様の像は観察されなかったが、腎癌での結果と同様
に、ＰＣＮＡとＢＭ−１／ＪＩＭＲＯの染色態度は逆転
していた（図１３及び図１４参照）。

【００６０】癌細胞のＢＭ−１／ＪＩＭＲＯの染色態度
は一様ではなく、組織型にかかわらずモザイク様に陽性
を示し、小エリアに区切って陽性細胞の多い部分と陰性
細胞の多い部分で比較すると、やはりＰＣＮＡの陽性細
胞数はＢＭ−１／ＪＩＭＲＯの染色態度と対象的な分布
をしていることが判った（図１５〜図２０参照）。

【００６１】

【実施例３】胸腺 Ｔ細胞の分化・増殖の場として知られており、アポトー
シスが起きているであろう臓器としても知られている胸
腺（臨床免疫 24 (1) :52〜 , 1992 、臨床免疫 24
(7) :1039〜 , 1992 ）について、実施例１及び実施例
２と同様にして試験を行なった。

【００６２】種々の年齢の胸腺細胞組織切片を試験に供
し、ＢＭ−１／ＪＩＭＲＯの組織における分布を診断し
た。本試験においては、本来Ｂ細胞（ＣＤ２０）と反応
するモノクローナル抗体であるが、胸腺髄質の樹状細胞
（interdigitating reticulum cell）とも強く反応する
（病理と臨床 5(11)： 1171 〜, 1987）抗ヒトＢ細胞(C
D 20) モノクローナルマウス抗体（ダコ社製DAKO）（N.
Y. Sprinn. Ver 2:109 〜, 1986）Ｌ−２６も一次抗体
として使用した。これを対照とした。

【００６３】結果を前記各図と同様にして図２１〜図３
４（生物の形態を示す図面に代わる写真）に示す。

【００６４】図２１〜図２４は、同一組織の連続切片で
あり、図２１はＨＥ染色、図２２は本発明による免疫染
色、図２３はＬ−２６を用いた免疫染色（対照）及び図
２４は抗ＰＣＮＡ抗体を用いた免疫染色（対照）をそれ
ぞれ示す。

【００６５】之等の図より、ハツサル小体とその周辺の
髄質胸腺細胞（リンパ球）が、ＢＭ−１／ＪＩＭＲＯ陽
性を示し、Ｌ−２６ではハツサル小体周囲の髄質に存在
する樹状細胞が陽性を示し、この樹状細胞の分布がＢＭ
−１／ＪＩＭＲＯ陽性胸腺細胞と髄質局所で拮抗してい
ることが判った。

【００６６】また、胸腺皮質の胸腺細胞がほとんどＰＣ
ＮＡ陽性であるのに対して、髄質の胸腺細胞はほとんど
ＰＣＮＡ陰性であることが判った。

【００６７】図２５〜図２８は、胸腺の形態とＢＭ−１
／ＪＩＭＲＯの陽性様式を認識するものであり、新生児
（心臓奇形児：生後３日）の胸腺組織のＨＥ染色像（図
２５）及び同本発明に係わる免疫染色の結果（図２６〜
図２８）を示す。

【００６８】図２７は、図２６の髄質の拡大像であり、
図２８は発達した典型的なハツサル小体を示す。

【００６９】之等の図から、新生児では、ハツサル小体
が未発達で小さく、ＢＭ−１／ＪＩＭＲＯ陽性リンパ球
がその周辺に多くみられ、発達したハツサル小体では、
その中心部は紡錘型の上皮系細胞がアポトーシス様の変
化の後、二次的変性を起こし、それらがＢＭ−１／ＪＩ
ＭＲＯ陽性であることが判る。

【００７０】図２９は生後６日の超未熟児の胸腺組織の
本発明に係わる免疫染色の結果であり、皮膜直下の皮質
胸腺細胞と髄質胸腺細胞が、ＢＭ−１／ＪＩＭＲＯ陽性
であることを示している。

【００７１】図３０は生後５ケ月の乳児突然死症候群の
胸腺組織の本発明免疫染色による結果であり、図２９と
比べて、ＢＭ−１／ＪＩＭＲＯ陽性な髄質胸腺細胞が減
少し、皮膜直下の胸腺細胞においては、該陽性細胞が完
全に消失していることを示す。

【００７２】図３１は、５才の胸腺組織の本発明免疫染
色による結果であり、図２９及び図３０と比べて、髄質
のＢＭ−１／ＪＩＭＲＯ陽性胸腺細胞が激減しているこ
とを示す。

【００７３】図３２は図２９と同一組織のＬ−２６によ
る免疫染色（対照）の結果であり、未熟な胸腺では陽性
細胞（樹状細胞）が少ないことを示す。

【００７４】図３３は同様に図３０の、図３４は同様に
図３１のそれぞれ対応するＬ−２６免疫染色（対照）の
結果を示す。該図３３では図３２に比べて樹状細胞が増
加していることが、図３４では図３２及び図３３に比べ
て更に樹状細胞が増加していることが判る。之等から、
加齢による樹状細胞とＢＭ−１／ＪＩＭＲＯ陽性胸腺細
胞の変化が拮抗していることが判る。

【００７５】リンパ球（Thymocyte ）の密な皮質はほと
んどがＰＣＮＡ陽性で、髄質のリンパ球はＰＣＮＡに大
半が陰性である（図２４参照）。ＢＭ−１／ＪＩＭＲＯ
の染色態度は組織提供者の年齢によって多少変化が見ら
れた。症例数は少ないが、ハツサル小体周囲の髄質に存
在するＢＭ−１／ＪＩＭＲＯ陽性リンパ球は、加齢にと
もなって減少する傾向を示し、４才、５才の幼児胸腺の
ＢＭ−１／ＪＩＭＲＯ陽性細胞数は、生後１カ月未満の
新生児胸腺と比べて極くわずかとなっていた。超未熟児
の胸腺では、皮膜直下の皮質最外層に、やや細胞質に富
んだ大きめの細胞にＢＭ−１／ＪＩＭＲＯ陽性を認めた
（図２９〜図３１参照）。ハツサル小体は表層の細胞か
ら中心部の角化変性した部位までＢＭ−１／ＪＩＭＲＯ
強陽性を示す。又、ハツサル小体と連結する様に網目状
に存在する髄質上皮細胞にも陽性細胞を認めた（図２８
参照）。

【００７６】樹状細胞はＬ−２６によってその形態を明
らかにできる。樹状細胞はクラスIIＭＨＣを含む自己抗
原を豊富に発現しており、自己抗原反応Ｔ細胞の選別・
除去に何らかの役割をはたしていると考えられており、
特にアポトーシスによるＴ細胞のネガティブセレクショ
ン（ Negative Selection ）への関与が示唆されている
（Annual Review 免疫 1990 P131〜139 ）。実際のＬ−
２６陽性細胞は、髄質と皮質との境界部に小数あったも
のが加齢にともなってその数を増やし、ハツサル小体付
近まで浸出している様な傾向が観察された。

【００７７】

【実施例４】インビトロでのマウス胸腺細胞のアポトー
シス誘導とその検出 デキサメタゾン処理によりマウス胸腺細胞にアポトーシ
スを誘導し、二重染色フローサイトメトリーによりＢＭ
−１／ＪＩＭＲＯ陽性細胞とアポトーシスの関係を検討
した〔J.Immunol., 132 (1), 38 (1984)〕。

【００７８】〈細胞懸濁液の作製〉ＢＤＦ１５週令マウ
ス（チャールズリバー）１匹を頸椎脱臼後、胸腺を摘出
し、ＲＰＭＩ−１６４０中で処理し細胞懸濁液を作製し
た。これを洗浄・濾過（カーゼ）し、５％ＦＣＳと１０
ｍＭヘペスバッファー（Hepes buffer）を含むＰＲＭＩ
−１６４０中で１．５×１０⁶ 個／ｍｌに調整した。こ
の２ｍｌ（３×１０⁶ 個／２ｍｌ）の胸腺細胞を、１０
^-7Ｍのデキサメタゾン（デカトロン注射液、万有製薬）
とともに３７℃で１８時間インキュベートした。コント
ロールとしてデキサメタゾンを加えずに同様の処理を行
なった。

【００７９】プロピジウム ヨーダイド（Propidium Io
dide）によるＤＮＡラベリングと、ＦＩＴＣを標識した
ＢＭ−１／ＪＩＭＲＯ（ＢＭ−１／ＪＩＭＲＯ−ＦＩＴ
Ｃ）による二重染色フローサイトメトリー解析法は、以
下のようにして行なった。

【００８０】即ち、上記のコントロールとデキサメタゾ
ン投与した胸腺細胞１×１０⁶ 個／１５０μｌに、１０
０μｌのＢＭ−１／ＪＩＭＲＯ−ＦＩＴＣを添加し、４
℃下に暗所で１時間反応させた後、ＰＢＳで洗浄した。

【００８１】次に、氷上冷却した５０％エタノールで暗
所、３時間（４℃）固定し、再度細胞を集め（１３００
ｒｐｍ、１０分、４℃）、１ｍｌのＰＢＳで洗浄後、
０．５ｍｌのＰ．Ｉ．溶液〔Propidium Iodide溶液、用
時調整したＰＮａｓｅ（シグマ社製（ＳＩＧＭＡ）Ｐ−
５５０３）１ｍｇ／ｍｌＰＢＳ１容量に対し、２容量の
Propidium Iodide １００μｇ／ｍｌＰＢＳと１容量の
ＰＢＳを加え混和してＰ．Ｉ．溶液とする〕を添加して
室温、暗所で１５分間反応させた後、フロサイトメータ
ーで解析した。

【００８２】結果を図３５に示す。

【００８３】図３５は上段にコントロール（ＤＥ
Ｘ^-）、下段にデキサメタゾン投与した（ＤＥＸ⁺）胸腺
細胞の結果を示し、左端のチャート（ＳＳ／ＦＳ）は、
縦軸に前方散乱の、横軸に側方散乱の強度をとり、円で
囲んだ部分をリンパ球として解析したものである。

【００８４】左より２つめのチャート（ＢＭ−１）は、
縦軸に細胞数、横軸に蛍光強度（ＢＭ−１／ＪＩＭＲＯ
−ＦＩＴＣ）を示し、ＢＭ−１／ＪＩＭＲＯが結合する
ことによるリンパ球の蛍光強度別（ＢＭ−１／ＪＩＭＲ
Ｏ陽性強度別）のヒストグラムである。

【００８５】右より２つめのチャート（Ｐ．Ｉ．）は、
縦軸に細胞数、横軸にＰ．Ｉ．蛍光強度を示し、１〜４
のそれぞれのエリア（Ｇ０〜Ｇ１、Ｇ２、Ｓ、フラグメ
ンテーション）である細胞周期別のヒストグラムであ
る。

【００８６】右端のチャート（ＢＭ−１／Ｐ．Ｉ．）
は、縦軸にＢＭ−１／ＪＩＭＲＯ−ＦＩＴＣ、横軸に
Ｐ．Ｉ．のそれぞれの蛍光強度を示し、上記細胞周期別
のＢＭ−１／ＪＩＭＲＯ陽性強度を知るものである。

【００８７】図３５の左より２つめのチャートでは、縦
軸に細胞数、横軸に蛍光強度（ＢＭ−１／ＪＩＭＲＯ−
ＦＩＴＣ）を示しているが、デキサメタゾン投与（ＤＥ
Ｘ⁺）でＢＭ−１／ＪＩＭＲＯと強く反応する細胞が増
加したことが判る。

【００８８】図３５の右より２つめのチャートでは、Ｄ
ＥＸ投与（ＤＥＸ⁺）で、Ｇ１、Ｇ０期にあった細胞
（P.I.エリア１）の多くが、ＤＮＡフラグメンテーショ
ン（アポトーシス）を起こし、（P.I.エリア４）へ移動
したことが判る。

【００８９】図３５の右端のチャートでは、縦軸にＢＭ
−１／ＪＩＭＲＯ−ＦＩＴＣ、横軸にＰ．Ｉ．蛍光強度
をとったものであるが、ＤＥＸ投与（ＤＥＸ⁺）でＤＮ
Ａフラグメンテーション（アポトーシス）を起こした細
胞に、ＢＭ−１／ＪＩＭＲＯが反応していることが判
る。

【００９０】以上の結果により、下記１〜４のことが結
論付けられる。

【００９１】１．ＢＭ−１／ＪＩＭＲＯは、抗ＰＣＮＡ
抗体を用いた免疫組織化学的解析により、細胞増殖の低
下した細胞に強く反応することが判った。

【００９２】２．ＢＭ−１／ＪＩＭＲＯは、ヒト腎癌・
腎組織、ヒト胃癌・胃組織、ヒト胸腺ハツサル小体等で
組織学的に萎縮変性したアポトーシス像の見られる細胞
に強く反応することが判った。

【００９３】３．ＢＭ−１／ＪＩＭＲＯはヒト胸腺髄質
のリンパ球と反応し、このＢＭ−１／ＪＩＭＲＯ陽性リ
ンパ球は、同じ胸腺髄質に存在する樹状細胞との強い関
連性が示唆された。樹状細胞は、ネガティブセレクショ
ン過程でのアポトーシスによる自己反応性Ｔ細胞の除去
と強い関連性があることが示唆されており、また Negat
ive Selection （アポトーシスによる）が胸腺髄質で起
こるとする報告等もあることから、ＢＭ−１／ＪＩＭＲ
Ｏのアポトーシスとの関連が示唆された。

【００９４】４．ＢＭ−１／ＪＩＭＲＯは、インビトロ
でのデキサメタゾン投与によるマウス胸腺細胞のアポト
ーシス誘導で、フラグメンテーション（アポトーシス）
を起こした細胞に反応した。

【００９５】従って、本発明検出試薬の利用によれば、
アポトーシスを起こした細胞あるいは起そうとしている
細胞を有利に検出できることが明らかである。

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例１に従う癌組織を免疫染色した結果を示
す。

【図２】実施例１に従う癌組織連続切片にＨＥ染色をし
た結果を示す。

【図３】実施例１に従う癌組織連続切片の抗ＰＣＮＡ抗
体を用いた免疫染色（対照）の結果を示す。

【図４】図２のＢＭ−１／ＪＩＭＲＯ陰性でＰＣＮＡ陽
性を示す部位の拡大像（ＨＥ染色）を示す。

【図５】図２のＢＭ−１／ＪＩＭＲＯ陽性でＰＣＮＡ陰
性を示す部位の拡大像（ＨＥ染色）を示す。

【図６】図１のＢＭ−１／ＪＩＭＲＯ陽性細胞の拡大像
を示す。

【図７】実施例１に従う正常腎組織の抗ＰＣＮＡ抗体に
よる免疫染色（対照）の結果とＰＣＮＡ陽性細胞（染色
された核をもつ細胞）の分布を示す。

【図８】実施例１に従う正常腎組織を免疫染色した結果
を示す。

【図９】実施例１に従う正常腎組織を免疫染色した結果
を示す。

【図１０】図９のＢＭ−１／ＪＩＭＲＯ陽性細胞のＨＥ
染色の結果を示す。

【図１１】図９のＢＭ−１／ＪＩＭＲＯ陽性細胞のＨＥ
染色の結果を示す。

【図１２】実施例２に従う正常腎組織のＨＥ染色像を示
す。

【図１３】図１２の連続切片の抗ＰＣＮＡ抗体を用いた
免疫染色（対照）の結果を示す。

【図１４】図１２の同連続切片の免疫染色結果を示す。

【図１５】実施例２に従う胃癌組織のＨＥ染色像を示
す。

【図１６】図１５の連続切片の抗ＰＣＮＡ抗体を用いた
免疫染色（対照）の結果を示す。

【図１７】図１５の連続切片の免疫染色結果を示す。

【図１８】図１５の拡大像を示す。

【図１９】図１５の拡大像を示す。

【図２０】図１７の拡大像を示す。

【図２１】実施例３に従う組織連続切片のＨＥ染色結果
を示す。

【図２２】実施例３に従う組織連続切片の本発明免疫染
色結果を示す。

【図２３】実施例３に従う組織連続切片のＬ−２６を用
いた免疫染色結果（対照）を示す。

【図２４】実施例３に従う組織連続切片の抗ＰＣＮＡ抗
体を用いた免疫染色結果（対照）を示す。

【図２５】実施例３に従う、新生児（心臓奇形児：生後
３日）の胸腺組織のＨＥ染色像を示す。

【図２６】実施例３に従う、新生児（心臓奇形児：生後
３日）の胸腺組織の本発明に係わる免疫染色像（髄質の
拡大像）を示す。

【図２７】実施例３に従う、新生児（心臓奇形児：生後
３日）の胸腺組織の本発明に係わる免疫染色像（発達し
た典型的なハツカル小体）を示す。

【図２８】実施例３に従う、新生児（心臓奇形児：生後
３日）の胸腺組織の本発明に係わる免疫染色像を示す。

【図２９】実施例３に従う、生後６日の超未熟児の胸腺
組織の本発明に係わる免疫染色の結果を示す。

【図３０】実施例３に従う、生後５ケ月の乳児突然死症
候群の胸腺組織の本発明免疫染色の結果を示す。

【図３１】実施例３に従う、５才の胸腺組織の本発明免
疫染色の結果を示す。

【図３２】図２９と同一組織のＬ−２６による免疫染色
（対照）の結果を示す。

【図３３】図３０と同一組織のＬ−２６による免疫染色
（対照）の結果を示す。

【図３４】図３１と同一組織のＬ−２６による免疫染色
（対照）の結果を示す。

【図３５】実施例４に従うインビトロでのマウス胸腺細
胞のアポトーシス誘導とその検出のためのフローサイト
メトリーの結果を示すグラフである。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 Ｌｅ^Y 糖鎖を認識する抗体を含有するア
   ポトーシス検出試薬。