JPH0611233B2 - Method for producing L-containing selenium amino acid - Google Patents
Method for producing L-containing selenium amino acidInfo
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Description
【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、トリプトファンシンターゼの存在下にＬ−セ
リンをアルカリ金属二セレン化物またはアルカリ金属セ
レン化水素と反応させ、Ｌ−セレノシスチンを製造する
方法に関する。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION Industrial Field of the Invention The present invention produces L-selenocystine by reacting L-serine with alkali metal diselenide or alkali metal hydrogen selenide in the presence of tryptophan synthase. Regarding the method.
Ｌ−セレノシスチンは、重金属中毒の解毒作用や抗癌作
用を有する有用な化合物である。L-selenocystine is a useful compound having a detoxifying action against heavy metal poisoning and an anticancer action.
（従来の技術） Ｌ−セレノシスチンの代表的製法としては、Ｏ−アセチ
ルホモセリン（チオール）リアーゼ［ＥＣ４．２．９
９．１０］の存在下、Ｏ−アセチルセリンと二セレン化
ナトリウムとを反応させる方法（Agric.Biol.Chem.,Vo
l.49,No.4,p.1143-1150(1985))が知られているが、Ｏ−
アセチルセリンが高価であり、工業的な製法としては必
ずしも有利な方法とは思われない。(Prior Art) A typical method for producing L-selenocystine is O-acetylhomoserine (thiol) lyase [EC 4.2.9].
9.10] in the presence of O-acetylserine and sodium diselenide (Agric.Biol.Chem., Vo
L.49, No.4, p.1143-1150 (1985)) is known.
Acetylserine is expensive and does not seem to be an advantageous industrial production method.
（発明が解決しようとする問題点） このような状況のもとで、本発明者らは、Ｌ−セレノシ
スチンの新しい製造法に関して研究を重ねた結果、トリ
プトファンシンターゼの存在下にＬ−セリンを、アルカ
リ金属二セレン化物またはアルカリ金属セレン化水素と
反応させることにより、Ｌ−セレノシスチンが、生成す
ることを見出し、この知見に基づいて本発明を完成し
た。(Problems to be Solved by the Invention) Under these circumstances, the present inventors have conducted studies on a new production method of L-selenocystine, and as a result, have found that L-serine is present in the presence of tryptophan synthase. It was found that L-selenocystine is produced by the reaction with alkali metal diselenide or alkali metal hydrogen selenide, and the present invention was completed based on this finding.
（問題を解決するための手段） トリプトファンシンターゼは、微生物、高等植物などに
広く存在していることが知られており（例えば、Bacter
iological Reviews,Vol.39,No.2,p.87-120(1975))、本
発明においても酵素源は特に限定されないが、通常は微
生物起源のものが用いられる。トリプトファンシンター
ゼを生産する菌株としては、たとえば、エシェリヒア・
コリ(Escherichia coli)MT-10232(FERM BP-19)、エシエ
リヒア・コリMT-10242(FERM BP-20)、ノイロスポラ・ク
ラッサ(Neurospora crassa)ATCC-14692、サッカロミセ
ス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)ATCC-26787
などがある。エシエリヒア・コリの培養菌体からのトリ
プトファンシンターゼの抽出法については、The Journa
l of Biological Chemistry,Vol.249,No.24,p.7756-776
3(1974年)、ノイロスポラ・クラッサの培養菌体からの
抽出法については、同Vol.250,No.8,p.2941-2946(1975
年)、サッカロミセス・セレビシエの培養菌体からの抽
出法については、European Journal of Biochemistry,V
ol.102,p.159-165(1979年)に記載され知られている。し
かし、本発明に使用されるトリプトファンシンターゼ
は、必ずしも抽出された純粋な物である必要はない。す
なわち、トリプトファンシンターゼ生産菌の培養物、培
養物から遠心分離などの方法によって採取した生菌体、
その乾燥菌体あるいは菌体を磨砕、自己消化、超音波処
理などをすることによって得られる菌体処理物、更に
は、これらの菌体よりの抽出物並びに該抽出物より得ら
れる酵素の粗製物であっても利用できる。もちろん、こ
れらの固定化物でもよい。(Means for Solving Problems) It is known that tryptophan synthase is widely present in microorganisms, higher plants, etc. (for example, Bacter
Iological Reviews, Vol. 39, No. 2, p. 87-120 (1975)), the source of the enzyme is not particularly limited in the present invention as well, but a source of microbial origin is usually used. As a strain producing tryptophan synthase, for example, Escherichia
Escherichia coli MT-10232 (FERM BP-19), Escherichia coli MT-10242 (FERM BP-20), Neurospora crassa ATCC-14692, Saccharomyces cerevisiae ATCC-26787
and so on. For the method of extracting tryptophan synthase from cultured Escherichia coli cells, see The Journa.
l of Biological Chemistry, Vol.249, No.24, p.7756-776
3 (1974), the extraction method from cultured cells of Neurospora crassa, Vol. 250, No. 8, p. 2941-2946 (1975).
,) For the extraction method from cultured cells of Saccharomyces cerevisiae, European Journal of Biochemistry, V.
ol.102, p.159-165 (1979) and is known. However, the tryptophan synthase used in the present invention does not necessarily have to be an extracted pure product. That is, a culture of a tryptophan synthase-producing bacterium, viable cells collected from the culture by a method such as centrifugation,
Treated cells obtained by grinding, autolyzing, or sonicating the dried cells or cells, and a crude product of an extract obtained from these cells and an enzyme obtained from the extract Even things can be used. Of course, these immobilized products may be used.
トリプトファンシンターゼ生産菌を培養するための培地
としては、炭素源、窒素源、無機物および必要に応じて
少量の微量栄養素を含むものであれば、合成培地または
天然培地の何れも使用可能である。培地へ微量のトリプ
トファンまたはインドールを添加することが有効なこと
もある。また、培地へ微量のインドールアクリル酸を添
加することによりトリプトファンシンターゼ生産量が高
まることもある。As the medium for culturing the tryptophan synthase-producing bacterium, either a synthetic medium or a natural medium can be used as long as it contains a carbon source, a nitrogen source, an inorganic substance and, if necessary, a small amount of a micronutrient. It may be useful to add trace amounts of tryptophan or indole to the medium. In addition, the amount of tryptophan synthase produced may be increased by adding a small amount of indole acrylic acid to the medium.
培養は、振盪培養あるいは通気攪拌培養などの好気的条
件下で行う。培養温度は20〜40℃、通常は25〜37℃の範
囲である。培養液のpHは５〜８である。The culture is performed under aerobic conditions such as shaking culture or aeration-agitation culture. The culture temperature is in the range of 20 to 40 ° C, usually 25 to 37 ° C. The pH of the culture solution is 5-8.
トリプトファンシンターゼは、インドール-3-グリセロ
燐酸とL-セリンからL-トリプトファンを合成する反応の
他に種々の反応を触媒する多機能酵素であることは良く
知られている。（例えば、Advances in Enzymology and
Related Areas of Molecular Biology,Vol.49,p.127-1
85(1979))しかしながら、トリプトファンシンターゼに
よる本発明の反応は、本発明者らが初めて見出したもの
である。It is well known that tryptophan synthase is a multifunctional enzyme that catalyzes various reactions in addition to the reaction of synthesizing L-tryptophan from indole-3-glycerophosphate and L-serine. (For example, Advances in Enzymology and
Related Areas of Molecular Biology, Vol.49, p.127-1
85 (1979)) However, the reaction of the present invention by tryptophan synthase was first discovered by the present inventors.
基質であるアルカリ金属二セレン化物としては、例えば
二セレン化ナトリウム、二セレン化カリウム、二セレン
化リチウムなど、アルカリ金属セレン化水素としては、
セレン化水素ナトリウム、セレン化水素カリウム、セレ
ン化水素リチウムなどを用いることができる。Examples of the alkali metal diselenide as the substrate include sodium diselenide, potassium diselenide, lithium diselenide, and the like, and as the alkali metal hydrogen selenide,
Sodium hydrogen selenide, potassium hydrogen selenide, lithium hydrogen selenide and the like can be used.
本発明においては、トリプトファンシンターゼの存在
下、通常pH６〜10の水性媒質中で、L-セリンとアルカリ
金属二セレン化物またはアルカリ金属セレン化水素とを
反応させる。反応温度は20〜60℃が適当である。反応時
間は、酵素力価、基質濃度、その他の条件により異なる
が、回分反応では通常１〜100時間である。反応は、静
置またはゆるやかな攪拌下に行われる。基質であるＬ−
セリンとアルカリ金属二セレン化物またはアルカリ金属
セレン化水素の濃度は特に制限はないが、通常は0.1〜3
0重量％程度である。基質は反応開始時に全量を反応液
に添加しても良いし、反応の進行にともない分割添加す
ることも可能である。反応に際しては、基質の他に補酵
素であるピリドキサル燐酸を微量添加することが望まし
い。In the present invention, L-serine is reacted with an alkali metal diselenide or an alkali metal hydrogen selenide in the presence of tryptophan synthase, usually in an aqueous medium of pH 6-10. A suitable reaction temperature is 20 to 60 ° C. The reaction time varies depending on the enzyme titer, the substrate concentration, and other conditions, but is usually 1 to 100 hours in the batch reaction. The reaction is allowed to stand or with gentle stirring. Substrate L-
The concentrations of serine and alkali metal diselenide or alkali metal hydrogen selenide are not particularly limited, but usually 0.1 to 3
It is about 0% by weight. All of the substrate may be added to the reaction solution at the start of the reaction, or may be added in portions as the reaction progresses. In the reaction, it is desirable to add a small amount of pyridoxal phosphate which is a coenzyme in addition to the substrate.
このようにして反応を行うと、反応液中にはＬ−セレノ
シスチンが生成する。When the reaction is carried out in this way, L-selenocystine is produced in the reaction solution.
反応液からＬ−セレノシスチンを採取するには、イオン
交換樹脂を用いる方法等の通常の手法を用いることがで
きる。To collect L-selenocystine from the reaction solution, a usual method such as a method using an ion exchange resin can be used.
Ｌ−セレノシスチンの定量は、液体クロマトグラフィー
で行った。生成したセレノシスチンがＬ−体であること
は、光学異性体分離用カラムを用いた液体クロマトグラ
フィーにより確認した。The quantification of L-selenocystine was performed by liquid chromatography. It was confirmed by liquid chromatography using a column for separating optical isomers that the produced selenocistin was in the L-form.
（実施例） 以下、実施例により本発明を具体的に説明する。(Examples) Hereinafter, the present invention will be specifically described with reference to Examples.
実施例１ 肉エキス１％、ペプトン0.5％、酵母エキス0.1％、KH2P
O40.2％、pH 7.0の液体培地にエシェリヒア・コリMT-10
242(FERM BP-20)を接種し、30℃にて20時間振盪培養し
た。培養終了後、遠心分離して菌体を集め、O.Adachiら
の方法(The Journal of Biological Chemistry,Vol.24
9,No.24,p.7756-7763(1974年))に従って精製操作を行
い、比活性が9.2単位／mgの力価のトリプトファンシン
ターゼを取得し、この酵素を用いて以下の反応を行っ
た。トリプトファンシンターゼの活性は、C.Yanofskyら
の方法（Methods in Enzymology,Vo15,P.801-807(196
2))により測定し、pH7.8、37℃において１μｍｏｌ／mi
nのトリプトファンをＬ−セリンとインドールから合成
する酵素量を１単位とした。Example 1 1% meat extract, 0.5% peptone, 0.1% yeast extract, KH 2 P
Escherichia coli MT-10 in liquid medium containing 0.2% O 4 and pH 7.0
242 (FERM BP-20) was inoculated and cultured at 30 ° C. for 20 hours with shaking. After the completion of the culture, the cells were collected by centrifugation and collected by the method of O. Adachi et al. (The Journal of Biological Chemistry, Vol.
9, No. 24, p.7756-7763 (1974)), to obtain tryptophan synthase with a specific activity of 9.2 units / mg, and perform the following reaction using this enzyme. . The activity of tryptophan synthase is determined by the method of C. Yanofsky et al. (Methods in Enzymology, Vo15, P.801-807 (196
2)), 1 μmol / mi at pH 7.8, 37 ℃
The amount of enzyme that synthesizes n tryptophan from L-serine and indole was defined as 1 unit.
Ｌ−セリン50mM、第１表に示したアルカリ金属二セレン
化物またはアルカリ金属セレン化水素15mM、ピリドキサ
ール燐酸1mMおよびトリプトファンシンターゼ10単位を
含む100mMトリスアミノメタン−HCl緩衝液（pH8.5）10m
lを、35℃で１時間ゆるやかに振盪した。反応は窒素シ
ール下で行った。L-serine 50 mM, 100 mM trisaminomethane-HCl buffer (pH 8.5) containing 10 mM of alkali metal diselenide or alkali metal hydrogen selenide shown in Table 1, pyridoxal phosphate 1 mM, and 10 units of tryptophan synthase (pH 8.5)
l was shaken gently at 35 ° C. for 1 hour. The reaction was performed under a nitrogen blanket.
反応液中には第１表に示した濃度のＬ−セレノシスチン
が生成した。The concentration of L-selenocystine shown in Table 1 was produced in the reaction solution.
Claims (1)
セリンをアルカリ金属二セレン化物またはアルカリ金属
セレン化水素と反応させることを特徴とするＬ−セレノ
シスチンの製造法。1. L-in the presence of tryptophan synthase
A process for producing L-selenocystine, which comprises reacting serine with an alkali metal diselenide or an alkali metal hydrogen selenide.
Priority Applications (1)
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| JP8698286A JPH0611233B2 (en) | 1986-04-17 | 1986-04-17 | Method for producing L-containing selenium amino acid |
Applications Claiming Priority (1)
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| Publication Number | Publication Date |
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| JPS62244387A JPS62244387A (en) | 1987-10-24 |
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- 1986-04-17 JP JP8698286A patent/JPH0611233B2/en not_active Expired - Fee Related
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