JPH06125768A - 酵母による異種タンパク質の発現及び生産量増大培養法 - Google Patents
酵母による異種タンパク質の発現及び生産量増大培養法Info
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- JPH06125768A JPH06125768A JP8043592A JP8043592A JPH06125768A JP H06125768 A JPH06125768 A JP H06125768A JP 8043592 A JP8043592 A JP 8043592A JP 8043592 A JP8043592 A JP 8043592A JP H06125768 A JPH06125768 A JP H06125768A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 この発明は酵母による異種タンパク質の発現
及び生産量増大培養法の新規方法の開発を目的とするも
ので、選択培地の研究により、構成酵素のプロモーター
の支配下に異種遺伝子をつないだＹＥｐ型、ＹＩｐ型お
よびＹＣｐ型のいずれのプラスミドを形質導入した株を
用いても、従来の培養法より生産性が少なく共２倍向上
を確認したことを背景とするものである。 【構成】 イーストナイトロゲンベース w／o アミノ
酸、グルコースを主剤とし、これに要求栄養素を添加し
た選択培地により酵母の形質転換株の生産量増大培養を
施す。
及び生産量増大培養法の新規方法の開発を目的とするも
ので、選択培地の研究により、構成酵素のプロモーター
の支配下に異種遺伝子をつないだＹＥｐ型、ＹＩｐ型お
よびＹＣｐ型のいずれのプラスミドを形質導入した株を
用いても、従来の培養法より生産性が少なく共２倍向上
を確認したことを背景とするものである。 【構成】 イーストナイトロゲンベース w／o アミノ
酸、グルコースを主剤とし、これに要求栄養素を添加し
た選択培地により酵母の形質転換株の生産量増大培養を
施す。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明において、栄養培地とはＹ
ＰＤ培地である。本発明は酵母による異種タンパク質の
発現及び生産量増大培養法にかかり、請求項１〜５から
なり、請求項１は温度シフト培養法に関し、請求項２は
低温前培養法に関し、請求項３は請求項１、２の発明の
異質タンパク質を高生産させる宿主の特定に関し、請求
項４は請求項１、２の発明の異種タンパク質を発現及び
生産するプロモーターの特定に関し、請求項５は請求項
１、２の発明の異種タンパク質を発現及び生産する酵母
ベクターの特定に関するもので、従来の培養法に比べ生
産量を数倍高くして酵素産業に貢献するものである。
ＰＤ培地である。本発明は酵母による異種タンパク質の
発現及び生産量増大培養法にかかり、請求項１〜５から
なり、請求項１は温度シフト培養法に関し、請求項２は
低温前培養法に関し、請求項３は請求項１、２の発明の
異質タンパク質を高生産させる宿主の特定に関し、請求
項４は請求項１、２の発明の異種タンパク質を発現及び
生産するプロモーターの特定に関し、請求項５は請求項
１、２の発明の異種タンパク質を発現及び生産する酵母
ベクターの特定に関するもので、従来の培養法に比べ生
産量を数倍高くして酵素産業に貢献するものである。
【０００２】
【従来の技術】従来、酵素産業において酵母等の形質転
換株の分泌生産性を向上させるため培地組成の検討等が
行なわれてきた。しかし従来法は培地のスクリーニング
に多大な時間を要し、生産性として僅か数％の向上がみ
られるのが限度であるから、より有効で簡単な培養法が
要求されている。
換株の分泌生産性を向上させるため培地組成の検討等が
行なわれてきた。しかし従来法は培地のスクリーニング
に多大な時間を要し、生産性として僅か数％の向上がみ
られるのが限度であるから、より有効で簡単な培養法が
要求されている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】本発明者らは上記した
情況に鑑み、生産性が数倍向上する簡単な培養法を開発
することを解決する課題として研究した。この解決しよ
うとする課題は本発明の目的でもある。
情況に鑑み、生産性が数倍向上する簡単な培養法を開発
することを解決する課題として研究した。この解決しよ
うとする課題は本発明の目的でもある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】まず、本発明者らは構成
酵素のプロモーターをもつ酵母発現ベクター（ＹＥｐ
型）に麹菌Ａ.oryzaeのα−アミラーゼ（以後タカアミ
ラーゼＡという）ｃＤＮＡと、ヒトリゾチームｃＤＮＡ
をそれぞれ別々につないだプラスミドを作製し酵母へ形
質転換した。この形質転換株を選択培地で前培養し、そ
の菌体ペレットを非選択培地に移植して低温で振とう培
養し、さらに適温で培養するすることにより、タカアミ
ラーゼＡ及びヒトリゾチームをともに長時間振とう培養
する従来の培養法よりも生産性が増大することを見出し
た。
酵素のプロモーターをもつ酵母発現ベクター（ＹＥｐ
型）に麹菌Ａ.oryzaeのα−アミラーゼ（以後タカアミ
ラーゼＡという）ｃＤＮＡと、ヒトリゾチームｃＤＮＡ
をそれぞれ別々につないだプラスミドを作製し酵母へ形
質転換した。この形質転換株を選択培地で前培養し、そ
の菌体ペレットを非選択培地に移植して低温で振とう培
養し、さらに適温で培養するすることにより、タカアミ
ラーゼＡ及びヒトリゾチームをともに長時間振とう培養
する従来の培養法よりも生産性が増大することを見出し
た。
【０００５】また、ＹＩｐ型ベクターにタカアミラーゼ
ｃＤＮＡを連結したプラスミド、あるいはＹＣｐ型ベク
ターにヒトリゾチームｃＤＮＡを連結したプラスミドを
酵母に導入し、得られた形質転換株を上述と同様の温度
シフト培養方法で異種タンパク質の分泌生産を行なった
ところ生産量は増大した。構成酵素のプロモーターの支
配下に異種遺伝子をつないだＹＥｐ型、ＹＩｐ型および
ＹＣｐ型、又は同効型のいずれのプラスミドを形質導入
した株を用いても、従来の培養法より生産性が少なくと
も２倍向上した。
ｃＤＮＡを連結したプラスミド、あるいはＹＣｐ型ベク
ターにヒトリゾチームｃＤＮＡを連結したプラスミドを
酵母に導入し、得られた形質転換株を上述と同様の温度
シフト培養方法で異種タンパク質の分泌生産を行なった
ところ生産量は増大した。構成酵素のプロモーターの支
配下に異種遺伝子をつないだＹＥｐ型、ＹＩｐ型および
ＹＣｐ型、又は同効型のいずれのプラスミドを形質導入
した株を用いても、従来の培養法より生産性が少なくと
も２倍向上した。
【０００６】本発明は前記の研究結果を背景とするもの
で、請求項１の発明は、前記各形質転換株を選択培地で
十分に生育するまで前培養し、その菌体ペレットを栄養
培地に移植して低温で培養した後、さらに酵母がよく生
育する温度で振とう培養を行なうことを特徴とする温度
シフト培養法に係り、請求項２の発明は前記各形質転換
株を前記の選択培地で低い温度により十分生育するまで
前培養した後、その菌体ペレットを栄養培地に移植し、
前記選択培地以上の温度で振とう培養することを特徴と
する低温前培養法に係り、請求項３の発明は請求項１、
２の発明の異質タンパク質を高生産させる宿主の特定に
係り、請求項４の発は請求項１、２の発明の異種タンパ
ク質を発現及び生産するプロモーターの特定に係り、請
求項５の発明は請求項１、２の発明の異種タンパク質を
発現及び生産する酵母ベクターの特定に係るものであ
る。
で、請求項１の発明は、前記各形質転換株を選択培地で
十分に生育するまで前培養し、その菌体ペレットを栄養
培地に移植して低温で培養した後、さらに酵母がよく生
育する温度で振とう培養を行なうことを特徴とする温度
シフト培養法に係り、請求項２の発明は前記各形質転換
株を前記の選択培地で低い温度により十分生育するまで
前培養した後、その菌体ペレットを栄養培地に移植し、
前記選択培地以上の温度で振とう培養することを特徴と
する低温前培養法に係り、請求項３の発明は請求項１、
２の発明の異質タンパク質を高生産させる宿主の特定に
係り、請求項４の発は請求項１、２の発明の異種タンパ
ク質を発現及び生産するプロモーターの特定に係り、請
求項５の発明は請求項１、２の発明の異種タンパク質を
発現及び生産する酵母ベクターの特定に係るものであ
る。
【０００７】本発明に用いた酵母発現ベクターは２μｍ
ＤＮＡをもつＹＥｐ型、染色体へ組込むＹＩｐ型及び酵
母セントロメアＤＮＡをもつＹＣｐ型、または同効果型
の何れかのタイプである。また異種遺伝子を発現させる
ためのプロモーターは構成的に発現している酵素のアル
コールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ１）のプロモーターと
グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ
ＡＰ）のプロモーターである。宿主として酵母サッカロ
マイセス セレビジィエを用いた。
ＤＮＡをもつＹＥｐ型、染色体へ組込むＹＩｐ型及び酵
母セントロメアＤＮＡをもつＹＣｐ型、または同効果型
の何れかのタイプである。また異種遺伝子を発現させる
ためのプロモーターは構成的に発現している酵素のアル
コールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ１）のプロモーターと
グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ
ＡＰ）のプロモーターである。宿主として酵母サッカロ
マイセス セレビジィエを用いた。
【０００８】
【作用】本発明は後記の実施例(１)〜(３)について個々
に説明しているように、請求項１、請求項２の発明によ
り、酵母による異質タンパク質の発現及び生産量増大培
養法に貢献し、請求項３〜５の発明は請求項１及び２の
発明の作用を強化する。
に説明しているように、請求項１、請求項２の発明によ
り、酵母による異質タンパク質の発現及び生産量増大培
養法に貢献し、請求項３〜５の発明は請求項１及び２の
発明の作用を強化する。
【０００９】
【実施例】本実施例の選択培地は、プラスミドＡ〜Ｃ、
Ｅ〜Ｆを形質導入した株については、0.67％イーストナ
イトロゲンベース w／o アミノ酸、2％グルコースを
主剤とし、20mg/l ヒスチジン、20mg/l ウラシル、30
mg/l ロイシン、20mg/lアデニン、30mg/l リジンを添
加したものとする。また、プラスミドＤを形質導入した
株については、ウラシルの代わりに20mg/l トリプトフ
ァンを添加した。異種タンパク質生産のためのプラスミ
ド作成: プラスミドＡ〜プラスミドＦの作製方法を例示
する。なおこれ等の酵母への形質転換はＩtoらの方法
（Ｊ．Ｂa-cteriol.,１５３,１６３（１９８３））に準
じた。また生産したタカアミラーゼＡについてはＡｄａ
ｃｈｉらの方法（Ｊ.Ｆerme-nt.Ｔechnol.,３２,４３
（１９５４））でα−アミラーゼ活性をヒトリゾチーム
についてはＳｕｚｕｋｉらの方法（Ｍol.Ｇen.Ｇenet.,
２１９，５８（１９８９））で、リゾチーム活性を測定
し、生産したタンパク質量を算出した。
Ｅ〜Ｆを形質導入した株については、0.67％イーストナ
イトロゲンベース w／o アミノ酸、2％グルコースを
主剤とし、20mg/l ヒスチジン、20mg/l ウラシル、30
mg/l ロイシン、20mg/lアデニン、30mg/l リジンを添
加したものとする。また、プラスミドＤを形質導入した
株については、ウラシルの代わりに20mg/l トリプトフ
ァンを添加した。異種タンパク質生産のためのプラスミ
ド作成: プラスミドＡ〜プラスミドＦの作製方法を例示
する。なおこれ等の酵母への形質転換はＩtoらの方法
（Ｊ．Ｂa-cteriol.,１５３,１６３（１９８３））に準
じた。また生産したタカアミラーゼＡについてはＡｄａ
ｃｈｉらの方法（Ｊ.Ｆerme-nt.Ｔechnol.,３２,４３
（１９５４））でα−アミラーゼ活性をヒトリゾチーム
についてはＳｕｚｕｋｉらの方法（Ｍol.Ｇen.Ｇenet.,
２１９，５８（１９８９））で、リゾチーム活性を測定
し、生産したタンパク質量を算出した。
【００１０】◎ プラスミドＡの作成方法: ２μmＤＮ
Ａ、ＡＤＨ１プロモーター、ＣＹＣ１ターミネーターと
選択マーカーとしてＴＲＰ１をもつ酵母ベクターｐＹｃ
ＤＥ−１をＥcoＲＩで消化した後、アルカリフォスファ
ターゼで脱リン酸を行なう。これにタカアミラーゼｃＤ
ＮＡを含む約１．８ｋｂのＥcoＲＩ断片を前記プロモー
ターと方向性が一致するように連結し、酵母発現プラス
ミドｐＹＴＡ−１を作製した。図１はプラスミドＡの前
記した作製の模図である。
Ａ、ＡＤＨ１プロモーター、ＣＹＣ１ターミネーターと
選択マーカーとしてＴＲＰ１をもつ酵母ベクターｐＹｃ
ＤＥ−１をＥcoＲＩで消化した後、アルカリフォスファ
ターゼで脱リン酸を行なう。これにタカアミラーゼｃＤ
ＮＡを含む約１．８ｋｂのＥcoＲＩ断片を前記プロモー
ターと方向性が一致するように連結し、酵母発現プラス
ミドｐＹＴＡ−１を作製した。図１はプラスミドＡの前
記した作製の模図である。
【００１１】◎ プラスミドＢの作製方法: プラスミ
ドＡの作製方法と同様に酵母ベクターｐＹｃＤＥー１の
ＥcoＲＩサイトに、ヒトリゾチームｃＤＮＡ約０.５kb
のＥｃｏＲＩ断片を連結し、ｐＹＨＡ−１を作製した。
図２はプラスミドＢの前記した作製の模図である。
ドＡの作製方法と同様に酵母ベクターｐＹｃＤＥー１の
ＥcoＲＩサイトに、ヒトリゾチームｃＤＮＡ約０.５kb
のＥｃｏＲＩ断片を連結し、ｐＹＨＡ−１を作製した。
図２はプラスミドＢの前記した作製の模図である。
【００１２】◎ プラスミドＣの作製方法: ＴＲＰ１
遺伝子を持つｐＴＲＰ１１をＢamＨＩで消化した後、ア
ルカリフォスファターゼで脱リン酸を行なう。これにｐ
ＹＴＡ−１よりＢamＨＩで切り出した約３.４kbの断片
（ＡＤＨ１プロモーターとタカアミラーゼｃＤＮＡを含
む）を連結し、酵母染色体組込み型プラスミドｐＴＡＴ
−１１を作製した。図３はプラスミドＣの前記した作製
の模図である。
遺伝子を持つｐＴＲＰ１１をＢamＨＩで消化した後、ア
ルカリフォスファターゼで脱リン酸を行なう。これにｐ
ＹＴＡ−１よりＢamＨＩで切り出した約３.４kbの断片
（ＡＤＨ１プロモーターとタカアミラーゼｃＤＮＡを含
む）を連結し、酵母染色体組込み型プラスミドｐＴＡＴ
−１１を作製した。図３はプラスミドＣの前記した作製
の模図である。
【００１３】◎ プラスミドＤの作製方法: ＣＥＮ
６、ＡＤＨ１プロモーター、ＣＹＣ１ターミネーターと
選択マーカーとしてＵＲＡ３をもつ酵母セントロメアベ
クターｐＲＳ３１６−ＡＣをＥcoＲＩで消化した後、ア
ルカリフォスファターゼで脱リン酸を行なう。これにヒ
トリゾチームｃＤＮＡを含む０.５kbのＥcoＲＩ断片を
前記プロモーターと方向性が一致するように連結し、酵
母セントロメアプラスミドｐＣＨＡ−１を作製した。図
４はプラスミドＤの前記した作製の模図である。
６、ＡＤＨ１プロモーター、ＣＹＣ１ターミネーターと
選択マーカーとしてＵＲＡ３をもつ酵母セントロメアベ
クターｐＲＳ３１６−ＡＣをＥcoＲＩで消化した後、ア
ルカリフォスファターゼで脱リン酸を行なう。これにヒ
トリゾチームｃＤＮＡを含む０.５kbのＥcoＲＩ断片を
前記プロモーターと方向性が一致するように連結し、酵
母セントロメアプラスミドｐＣＨＡ−１を作製した。図
４はプラスミドＤの前記した作製の模図である。
【００１４】◎ プラスミドＥの作製方法: ２μｍＤ
ＮＡ、ＧＡＰプロモーター、ＰＧＫターミネーターと選
択マーカーとしてＴＲＰ１をもつ酵母ベクターｐＧ−３
をＢａｍＨＩで消化した後、平滑末端処理を行なう。こ
れに平滑末端にしたタカアミラーゼｃＤＮＡを含む約
１.８kbの断片を前記プロモーターと方向性が一致する
ように連結して、酵母発現プラスミドｐＹＧＴＡＡを作
製した。図５はプラスミドＥの前記した作製の模図であ
る。
ＮＡ、ＧＡＰプロモーター、ＰＧＫターミネーターと選
択マーカーとしてＴＲＰ１をもつ酵母ベクターｐＧ−３
をＢａｍＨＩで消化した後、平滑末端処理を行なう。こ
れに平滑末端にしたタカアミラーゼｃＤＮＡを含む約
１.８kbの断片を前記プロモーターと方向性が一致する
ように連結して、酵母発現プラスミドｐＹＧＴＡＡを作
製した。図５はプラスミドＥの前記した作製の模図であ
る。
【００１５】◎ プラスミドＦの作製方法: プラスミ
ドＥの作製法と同様に、酵母ベクターｐＧ−３のＢamＨ
Ｉを平滑末端化したものに、平滑末端にしたヒトリゾチ
ームｃＤＮＡ約０.５kbの断片を連結し、ｐＹＧＨＬＹ
を作製した。図６はプラスミドＦの前記した作製の模図
である。
ドＥの作製法と同様に、酵母ベクターｐＧ−３のＢamＨ
Ｉを平滑末端化したものに、平滑末端にしたヒトリゾチ
ームｃＤＮＡ約０.５kbの断片を連結し、ｐＹＧＨＬＹ
を作製した。図６はプラスミドＦの前記した作製の模図
である。
【００１６】◆ 異種タンパク質を生産させるための酵
母形質転換体の作製 タカアミラーゼＡ、ヒトリゾチームを分泌生産させる前
記のプラスミドＡ〜Ｆを前記Ｉｔｏらの方法により形質
転換した。すなわち、酵母（ＹＰＨ２５０）を１０mlの
栄養培地（１％酵母エキス、２％ポリペプトン、２％グ
ルコース）中で３０℃で振とう培養し、対数増殖期に遠
心分離により集菌した。ＴＥ緩衝液で洗浄後同じ緩衝液
に２ｘ１０7 セル／mlの濃度で懸濁した。この０.５ml
を小試験管に移し、等容量の０.２Ｍ酢酸リチウム溶液
を添加し、３０〜６０分間３０℃で振とうした。この中
から０.１mlを１.５mlのエッペンドルフチューブに移
し、プラスミドＤＮＡ溶液５μｌ（２μg/μl）を加え
３０℃、３０分間静置培養した。次に、殺菌した７０％
ＰＥＧ−４０００、１５０μｌを加えよく混合した。３
０℃で６０分間静置した後、エッペンドルフチューブを
４７℃の恒温槽で１０分間静置後、菌体を直ちに室温ま
で冷却し、殺菌水で洗浄し、選択培地で生育させた形質
転換体を得た。プラスミドＣについては制限酵素Ｓｔｕ
Iで処理し、直鎖状にしたＤＮＡ溶液１０μｌ（５μg/
μl）について上述の形質転換を行なった。
母形質転換体の作製 タカアミラーゼＡ、ヒトリゾチームを分泌生産させる前
記のプラスミドＡ〜Ｆを前記Ｉｔｏらの方法により形質
転換した。すなわち、酵母（ＹＰＨ２５０）を１０mlの
栄養培地（１％酵母エキス、２％ポリペプトン、２％グ
ルコース）中で３０℃で振とう培養し、対数増殖期に遠
心分離により集菌した。ＴＥ緩衝液で洗浄後同じ緩衝液
に２ｘ１０7 セル／mlの濃度で懸濁した。この０.５ml
を小試験管に移し、等容量の０.２Ｍ酢酸リチウム溶液
を添加し、３０〜６０分間３０℃で振とうした。この中
から０.１mlを１.５mlのエッペンドルフチューブに移
し、プラスミドＤＮＡ溶液５μｌ（２μg/μl）を加え
３０℃、３０分間静置培養した。次に、殺菌した７０％
ＰＥＧ−４０００、１５０μｌを加えよく混合した。３
０℃で６０分間静置した後、エッペンドルフチューブを
４７℃の恒温槽で１０分間静置後、菌体を直ちに室温ま
で冷却し、殺菌水で洗浄し、選択培地で生育させた形質
転換体を得た。プラスミドＣについては制限酵素Ｓｔｕ
Iで処理し、直鎖状にしたＤＮＡ溶液１０μｌ（５μg/
μl）について上述の形質転換を行なった。
【００１７】◆実施例(１) 酵母形質転換体による異種タンパク質の生産を増加させ
る培養法 プラスミドＥおよびＦを導入した形質転換株を選択培地
１０mlで３０℃２４時間前培養した後集菌した。得られ
た菌体ペレットを栄養培地に移植し、１０〜３０℃で４
８時間さらに３０℃４０〜５０時間、好ましくは４８時
間振とう培養を行なった。培養液を遠心分離することに
より培養上清を得、それぞれについてα−アミラーゼ活
性、リゾチーム活性を測定し、タンパク質の生産量を調
べた。図７はタカアミラーゼ生産量及びヒトリゾチーム
生産量と低温培養時の温度℃の関係を示したグラフであ
る。
る培養法 プラスミドＥおよびＦを導入した形質転換株を選択培地
１０mlで３０℃２４時間前培養した後集菌した。得られ
た菌体ペレットを栄養培地に移植し、１０〜３０℃で４
８時間さらに３０℃４０〜５０時間、好ましくは４８時
間振とう培養を行なった。培養液を遠心分離することに
より培養上清を得、それぞれについてα−アミラーゼ活
性、リゾチーム活性を測定し、タンパク質の生産量を調
べた。図７はタカアミラーゼ生産量及びヒトリゾチーム
生産量と低温培養時の温度℃の関係を示したグラフであ
る。
【００１８】◆実施例(２) 温度シフト培養法及び低温前培養法を用いた異種タンパ
ク質の生産 プラスミドＥおよびＦを導入した形質転換株を選択培地
１０ml、３０℃で十分生育するまで前培養した後集菌
し、得られた菌体ペレットを栄養培地に移植した後、１
５℃で４０〜５０時間、好ましくは４８時間培養し、さ
らに３０℃で４０〜５０時間、好ましくは４８時間振と
う培養を行なった。(温度シフト培養法：請求項１参照) 前記の形質転換株を選択培地１０mlで１５℃３日間ある
いは１日間十分生育するまで前培養した後集菌した。得
られた菌体ペレットを栄養培地に移植した後、３０℃で
９０〜１００時間、好ましくは９６時間振とう培養し
た。（低温前培養法：請求項２参照）
ク質の生産 プラスミドＥおよびＦを導入した形質転換株を選択培地
１０ml、３０℃で十分生育するまで前培養した後集菌
し、得られた菌体ペレットを栄養培地に移植した後、１
５℃で４０〜５０時間、好ましくは４８時間培養し、さ
らに３０℃で４０〜５０時間、好ましくは４８時間振と
う培養を行なった。(温度シフト培養法：請求項１参照) 前記の形質転換株を選択培地１０mlで１５℃３日間ある
いは１日間十分生育するまで前培養した後集菌した。得
られた菌体ペレットを栄養培地に移植した後、３０℃で
９０〜１００時間、好ましくは９６時間振とう培養し
た。（低温前培養法：請求項２参照）
【００１９】以上の二培養法のそれぞれの培養液を遠心
分離することにより培養上清を得、それぞれについてα
−アミラーゼ活性、リゾチーム活性を測定し、タンパク
質の生産量を調べた。ここで対照として、プラスミドＡ
およびＢ形質転換株を前培養後、３０℃９６時間培養し
た培養上清を用いた。表１は温度シフト培養法及び低温
前培養法を用いた異種タンパク質の生産を示したもので
ある。
分離することにより培養上清を得、それぞれについてα
−アミラーゼ活性、リゾチーム活性を測定し、タンパク
質の生産量を調べた。ここで対照として、プラスミドＡ
およびＢ形質転換株を前培養後、３０℃９６時間培養し
た培養上清を用いた。表１は温度シフト培養法及び低温
前培養法を用いた異種タンパク質の生産を示したもので
ある。
【表１】
【００２０】◆実施例(３) 温度シフト培養法を用いた異種タンパク質の生産に対す
る酵母発現ベクターの影響 プラスミドＡ〜Ｆを導入した形質転換株を選択培地で前
記の温度シフト培養法に準じて得られた培養上清のα−
アミラーゼ活性とリゾチーム活性を測定し生産量を調べ
た。ここで対照としては、各形質転換株を３０℃で前培
養後、３０℃９０〜１００時間、好ましくは９６時間培
養した培養上清を用いた。表２は温度シフト培養法を用
いた異種タンパク質の生産に対する酵母発現ベクターの
影響を示したものである。
る酵母発現ベクターの影響 プラスミドＡ〜Ｆを導入した形質転換株を選択培地で前
記の温度シフト培養法に準じて得られた培養上清のα−
アミラーゼ活性とリゾチーム活性を測定し生産量を調べ
た。ここで対照としては、各形質転換株を３０℃で前培
養後、３０℃９０〜１００時間、好ましくは９６時間培
養した培養上清を用いた。表２は温度シフト培養法を用
いた異種タンパク質の生産に対する酵母発現ベクターの
影響を示したものである。
【表２】
【００２１】
【発明の効果】本発明の請求項１〜５の発明は酵母によ
る異種タンパク質の発現及び生産量増大により寄与し、
もしくは寄与効果を向上するもので、従来方法による生
産量の少なくとも２倍の生産量を挙げることができる顕
著な効果をもつ。
る異種タンパク質の発現及び生産量増大により寄与し、
もしくは寄与効果を向上するもので、従来方法による生
産量の少なくとも２倍の生産量を挙げることができる顕
著な効果をもつ。
【図１】プラスミドＡ作製の模図
【図２】プラスミドＢ作製の模図
【図３】プラスミドＣ作製の模図
【図４】プラスミドＤ作製の模図
【図５】プラスミドＥ作製の模図
【図６】プラスミドＦ作製の模図
【図７】実施例(１)のタカアミラーゼ生産量およびヒト
リゾチーム生産量とを、低温培養時の温度℃の関係を示
したグラフ
リゾチーム生産量とを、低温培養時の温度℃の関係を示
したグラフ
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/62 // Ｃ１２Ｎ 15/56 (Ｃ１２Ｎ 1/16 Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｎ 9/30 Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｎ 9/36 Ｃ１２Ｒ 1:865） (72)発明者 五味 勝也 東京都北区滝野川２−６−30 国税庁醸造 試験所内 (72)発明者 山本 綽 愛知県安城市昭和町19番10号 新日本化学 工業株式会社内 (72)発明者 長島 直 愛知県安城市昭和町19番10号 新日本化学 工業株式会社内
Claims (5)
- 【請求項１】 形質転換株を、イーストナイトロゲンベ
ース w／o アミノ酸、グルコースを主剤とし、これに
要求栄養素を添加した選択培地（以下単に選択培地とい
う）で十分に生育するまで適温で前培養し、その菌体ペ
レットを栄養培地に移植して低温で培養した後、さらに
酵母がよく生育する温度で振とう培養を行なうことを特
徴とする温度シフト培養法。 - 【請求項２】 形質転換株を選択培地で十分生育するま
で低温で前培養した後、その菌体ペレットを栄養培地に
移植し、前記選択培地による前培養以上の温度で振とう
培養することを特徴とする低温前培養法。 - 【請求項３】 異種タンパク質を高生産させる宿主を微
生物中の酵母とすることを特徴とする請求項１の温度シ
フト培養法又は請求項２の低温前培養法。 - 【請求項４】 異種タンパク質を発現及び生産するプロ
モーターを、構成的に発現している酵素のプロモーター
とすることを特徴とする請求項１の温度シフト培養法又
は請求項２の低温前培養法。 - 【請求項５】 酵母により異種タンパク質を発現及び生
産するための酵母ベクターを２μｍＤＮＡをもつＹＥｐ
型又は染色体に組込むＹＩｐ型若しくは酵母セントロメ
アＤＮＡをもつＹＣｐ型若しくは同効型の何れか１種と
することを特徴とする請求項１の温度シフト培養法又は
請求項２の低温前培養法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8043592A JPH0783709B2 (ja) | 1992-03-02 | 1992-03-02 | 酵母による異種タンパク質の発現及び生産量増大培養法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8043592A JPH0783709B2 (ja) | 1992-03-02 | 1992-03-02 | 酵母による異種タンパク質の発現及び生産量増大培養法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06125768A true JPH06125768A (ja) | 1994-05-10 |
| JPH0783709B2 JPH0783709B2 (ja) | 1995-09-13 |
Family
ID=13718190
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8043592A Expired - Lifetime JPH0783709B2 (ja) | 1992-03-02 | 1992-03-02 | 酵母による異種タンパク質の発現及び生産量増大培養法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0783709B2 (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0737546A3 (en) * | 1995-04-10 | 1997-01-29 | Matsushita Electric Industrial Co Ltd | Holding device for a substrate and method and device for polishing a substrate |
| US6739958B2 (en) | 2002-03-19 | 2004-05-25 | Applied Materials Inc. | Carrier head with a vibration reduction feature for a chemical mechanical polishing system |
| JP2005538711A (ja) * | 2002-09-13 | 2005-12-22 | コリア リサーチ インスティチュート オブ バイオサイエンス アンド バイオテクノロジー | 酵母表面提示ベクターを利用して改良型酵素活性を有するリパーゼをスクリーニングする方法及びそのリパーゼ |
-
1992
- 1992-03-02 JP JP8043592A patent/JPH0783709B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0737546A3 (en) * | 1995-04-10 | 1997-01-29 | Matsushita Electric Industrial Co Ltd | Holding device for a substrate and method and device for polishing a substrate |
| US6739958B2 (en) | 2002-03-19 | 2004-05-25 | Applied Materials Inc. | Carrier head with a vibration reduction feature for a chemical mechanical polishing system |
| JP2005538711A (ja) * | 2002-09-13 | 2005-12-22 | コリア リサーチ インスティチュート オブ バイオサイエンス アンド バイオテクノロジー | 酵母表面提示ベクターを利用して改良型酵素活性を有するリパーゼをスクリーニングする方法及びそのリパーゼ |
| JP4927332B2 (ja) * | 2002-09-13 | 2012-05-09 | コリア リサーチ インスティチュート オブ バイオサイエンス アンド バイオテクノロジー | 酵母表面提示ベクターを利用して改良型酵素活性を有するリパーゼをスクリーニングする方法及びそのリパーゼ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0783709B2 (ja) | 1995-09-13 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |