JPH0481428B2 - - Google Patents
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- JPH0481428B2 JPH0481428B2 JP59264965A JP26496584A JPH0481428B2 JP H0481428 B2 JPH0481428 B2 JP H0481428B2 JP 59264965 A JP59264965 A JP 59264965A JP 26496584 A JP26496584 A JP 26496584A JP H0481428 B2 JPH0481428 B2 JP H0481428B2
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Description
（産業上の利用分野）
本発明は組み換えDNA技術によつて育種され
たリゾプス・オリザエ（Rhizopus oryzae）のグ
ルコアミラーゼを生産する酵母を用いたグルコア
ミラーゼ及びエチルアルコールの製造法に関す
る。 （従来技術） グルコアミラーゼはデンプンを非還元末端より
分解しグルコースを生成する酵素で、デンプンよ
りエチルアルコールを生産する工程で、デンプン
を糖化する際に広く用いられている。なかでも糸
状菌リゾプス属が生産するグルコアミラーゼは生
産量及び酵素活性が高く、しかも特に一般のグル
コアミラーゼと違つて、生デンプンにも作用する
こと及び至適PH等種々の酵素化学的性質から醸造
用に最も適したものである。このため、リゾプス
属のグルコアミラーゼは、醸造用のデンプンを、
無蒸煮法または低温蒸煮法（特開昭57−102189号
および特開昭51−61688号参照）で糖化するため
に使用されている。 しかしながら、リゾプス属のグルコアミラーゼ
を生産するためにはふすま等を主成分とした固体
培養法を用いることが多く、タンク培養が可能な
液体培養法に比較して酵素の生産コストが上昇す
る。従つてグルコアミラーゼを利用したアルコー
ル生産においても生産コストの上昇につながると
いう問題がある。 （発明が解決しようとする問題点） 本発明者らは、上記問題を解決するため、リゾ
プスのグルコアミラーゼ遺伝子を発現可能な形で
酵母に導入し、この酵母を直接低温蒸煮でん粉ま
たは生でん粉に作用させれば、デンプンからエチ
ルアルコールを生産する工程で、デンプンの糖化
に必要なリゾプスのグルコアミラーゼの添加量を
減少させるかあるいは全く添加することなくエチ
ルアルコールの生産コストを減少させることがで
きるのではないかとの着想の下に種々の研究を行
い本発明を完成した。 （発明の構成） 本発明はリゾプス属に属する糸状菌由来のグル
コアミラーゼ遺伝子を組込んだ発現可能な組換ベ
クターによつて形質転換された酵母を用いて、澱
粉質原料を糖化・発酵せしめることを特徴とする
アルコールの製造法である。 本発明で使用する澱粉質原料には、穀類、キヤ
ツサバ、カンシヨ、ジヤガイモ等の地下澱粉並び
に精製澱粉が含まれる。 本発明の方法により微生物にリゾプスグルコア
ミラーゼを生産させるには、グルコアミラーゼ生
産性のリゾプス属糸状菌、好ましくはリゾプス・
オリザエのグルコアミラーゼ遺伝子を適当な手段
で調製し、この遺伝子を宿主の形質発現系で認識
されるプロモーター領域やテール領域等の情報発
現機構を含むDNA断片とともに、宿主内で複製
可能なプラスミドベクターに挿入し、このベクタ
ーで宿主を形質転換してやればよい。宿主が酵母
であるときは、形質転換酵母により、リゾプスグ
ルコアミラーゼが生産され菌体外へ放出されるか
ら、でんぷん（無蒸煮であつてもよい）はこの酵
素で糖化され、これを酵母がアルコールへ変化さ
せるため、高価な糖化酵素剤を添加することなく
アルコールが生産される。このように、でん粉を
予め糖化することなく、酵母を作用させてアルコ
ールを生産しうるとは従来全く考えられていなか
つたことである。 アルコールの製造における原料の蒸煮すなわち
糊化工程には、高温蒸煮法（蒸煮温度120℃以
上）、低温蒸煮法（蒸煮温度60℃〜85℃）および
無蒸煮法（蒸煮しない）などが知られているが、
本発明の微生物によるアルコール製造方法は、い
ずれを採用してもよい。 なお、宿主として酵母を用いればアルコールと
リゾプスグルコアミラーゼが同時に生産される
が、後者のみを目的とするときは、宿主として枯
草菌を用いることも可能である。 本発明によれば、グリコアミラーゼをコードす
るDNAの調製法も提供され、かつその塩基配列
も明らかにされた。 即ち、本発明の方法で上記グルコアミラーゼの
生産を可能ならしめるために使用するDNA断片
の塩基配列は、例えばリゾプス・オリザエの染色
体DNAよりクローニングしたグルコアミラーゼ
遺伝子のDNA塩基配列と、リゾプス・オリザエ
のｍ−RNAより調製したグルコアミラーゼｃ−
DNAの塩基配列を適宜組合せて調製できる。な
お酵母内で、当該グルコアミラーゼを発現せしむ
るために、遺伝子組換により、プロモーター領域
および／またはテール領域（3′未非翻訳部分）と
して形質転換微生物に適したものを使用すること
が好ましい（特開昭58−146281号参照）。例えば
酵母内で発現させるために、特開昭59−74986号
および特開昭59−74988号に記載された、グリセ
ルアルデヒド−３−フオスフエイトデハイドロゲ
ナーゼ遺伝子（GAP−DH）のプロモーター領域
（PGAP）、テール領域（TGAP）、抑制性酸性フオス
フアターゼ遺伝子（PHO5）のプロモーター領域
（Ppho5）および３−フオスフオグリセロキナー
ゼ（PGK）のプロモーター領域（PPGK）を後記
実施例に示す如く使用できる。本発明においては
また、前記DNA塩基配列及びDNA断片を持つ複
製可能な種々のプラスミドベクターの構築方法も
提供される。 糸状菌は、リゾプス属に属するものでグルコア
ミラーゼを生産するものであれば、いずれの種で
もよく、リゾプス・オリザエ（Rhizopus
oryzae）、リゾプス・フオルモサエンシス
（Rhizopus formosaensis）、リゾプス・ヤバニカ
ス（Rhizopus javanicus）、リゾプス・サイラン
デンシス（Rhizopus thailandensis）などがあげ
られる。特にリゾプス・オリザエに属する
SAM0034〔微工研菌寄第7960）；本菌株は昭和60
年（1985年）10月23日に国際寄託に移管され、受
託番号：微工研条寄第929号（FERM BP−929）
が付与されている〕は、生澱粉分解に適したグル
コアミラーゼを産生することが本発明者らによつ
て確認されている。 なお、SAM0034の細菌学的性質は次のとおり
である。 培養所見（バレイシヨ・ブドウ糖寒天培地、28
℃、培養） 培養は一日目でコロニーは直径５−5.5mm、コ
ロニーは白色、コロニーの裏面も白色、培養２日
目でコロニーはプレート（直結９cm）の全面にひ
ろがる。コロニーは成熟とともに灰色になる。 匍匐枝は無色又は黄かつ色、仮根はかつ色、胞
子のう柄は一般に仮根から生じるが、匍匐枝から
直接生じることもある。胞子のう柄は単生または
群生、胞子のう枝が二又に分岐することもある。
長さ220−1200μｍ．胞子のうは球形ないし亜球
形、暗かつ色、直径60−150μｍ．柱軸は球形な
いし亜球形。胞子のう胞子は球形、亜球形又は多
角形、表面に筋がある。５−15X3−7μｍ．厚膜
胞子は亜球形又は円筒形、６−13X4−9μｍ、接
合胞子は観察できなかつた。37℃で生育可能。 以上、胞子のう胞子が柱軸を持つ暗かつ色の胞
子のう中に形成され、更に胞子のう柄がかつ色で
あり、また仮根を持つことから、本発明の菌株
（SAM−0034）はRhizopus属に属する真菌であ
ると考えられる。そこでInui、T.、Y.Takeda＆
H.Iizuka、1965.Taxonomical Studies on
genus Rhizopus.Journal of Ceneral and
Applied Microbiology、Vol.11、Supplement、
121pp.Zycha、H.、R.Siepmann and G.
Linnemann、1969。Mucorales.Eine
Beschreibung aller Gattungen und Arten
dieser Pilzgruppe.335pp.Verlag von J.Cramer.
Lehre.Domsch、K.H.、W.Gams and T.−H.
Anderson、1980.Compendium of Soil Fungi.
Vol.1.859pp.Academic Press.London.に準拠し
て既知のRhizopus属の種類と菌学的性質を比較
すると、本菌株は、37℃で生育可能であり、胞子
のう胞子の表面に筋があり、胞子のう柄が長さ
220−1200μｍ、胞子のうが直径60−150μｍ、胞
子のう胞子が５−15x3−7μｍであることから、
本菌株をRhizopus oryzaeと同定した。 グルコアミラーゼ遺伝子の単離 グルコアミラーゼ遺伝子の単離は、リゾプス属
のｍ−RNAより調製したｃ−DNAとして得る
か、またはリゾプス属の染色体DNAから例えば
クリエールらの方法（Cryer et al、Method in
Cell Biology，Vol.12、p39−44（1975）〕によつ
て得ることができる。 後者の方法は、通常イントロンの配列を含有し
ており、そのまま、大腸菌や酵母を宿主とする場
合は発現できない。これらの宿主中で発現できる
遺伝子を得るには、ｍ−RNAからのｃ−DNAの
一部と、染色体からの遺伝子のイントロンを含ま
ない配列部分のDNAを組み換える方法によつて
も得ることができる。両者を組み換える際に、一
方又は両方のDNA部分に適当な制限酵素切断部
位が存在しない場合には、インビトロミユータジ
エネシスの手法を用いることにより適当な制限酵
素部位を作成しハイブリツドさせることが可能で
ある。 かくして得られるグルコアミラーゼ遺伝子は、
第１図の〔 〕内のアミノ酸配列をコードする
DNAまたはこれと同等の酵素活性を有するアミ
ノ酸に対応する塩基配列である。 すなわちリゾプス属由来のグリコアミラーゼ構
造遺伝子は、第１図のＮ末端から26−604番目の
アミノ酸配列をコードするDNAであり、または、
同図に付した塩基配列の番号190−1962に相当す
る。アミノ酸配列のＮ末端から１−25番に相当す
る部分は、シグナルペプチドに対する領域と考え
られ、宿主の細胞外への分泌に関与するものと考
えられる。 上述のグルコアミラーゼ遺伝子を単離する好適
な方法の例を以下述べる。グルコアミラーゼ生産
菌であるリゾプス属に属する糸状菌から全DNA
を単離する。 単離の方法は、クリエールの方法（先述）を改
変した方法による。まず、リゾプスを胞子形成さ
せ、その胞子を集める。これを破砕し、その後ク
リエールの方法に従つて処理し、最後にゲル過
を行なう。ついでこのDNAを制限酵素Hindを
用いて消化し、公知のベクターpBR322のHind
サイドにクローニングし、リゾプスの遺伝子ライ
ブラリーを大腸菌に作成する。ライブラリーとし
て取得するにはアンピシリン耐性の形質転換体を
得れば良い。 次いで、実施例で述べる様なグルコアミラーゼ
DNA検出用のプローブ（DNAオリゴマー）を作
成し、コロニーハイブリダゼーシヨンを行ない、
このプローブとハイブリダイスするコロニーを増
殖させ、プラスミドDNAを抽出する。 以下に本発明を実施例によつて詳細に説明す
る。 実施例 (a)() DNAの調製とクローニング グルコアミラーゼ生産菌リゾプス・オリザ
エから全DNAを単離した。DNAの単離は、
酵母で用いられているクリエールらの方法
（Cryer et al、Method in Cell Biology、
Vol12、39−44、（1975））を改変して行なつ
た。薄く切つたじやが芋をオートクレーブで
滅菌後、その上にリゾプス・オリザエの菌体
を増殖させ胞子を形成させた。それらの胞子
を集め、0.15MNaCl−0.05M EDTA溶液に
懸濁し、ガラス球を用いた細胞破砕装置ダイ
ノミルを用いて15秒間処理により菌体を破砕
した。その後の操作は、クリエールらの方法
に従つたが、最後にバイオラド社のバイオゲ
ルA5mゲルを用いてゲル過を行ない全
DNAを単離した。このDNAを制限酵素
Hindを用いて消化し、pBR322のHind
サイトにクローニングし、リゾプスの遺伝子
ライブラリーを大腸菌WA802株に作製した。
大腸菌の形質転換は常法を用いた。ライブラ
リーとしてアンピシリン耐性形質転換体を取
得した。 () 形質転換体の選択及びグルコアミラーゼ
遺伝子の特性決定 形質転換体の選択は、ニトロセルロース
紙を用いた通常コロニーハイブリダイゼーシ
ヨンと呼ばれる方法で行なつた。はじめにグ
リコアミラーゼDNA検出用のプローブを作
製する為、精製したリゾプスのグルコアミラ
ーゼを各種プロテアーゼで分解し、生成した
ペプチドを分離精製した。それらのペプチド
についてアミノ酸分析と一次構造決定を常法
に従つて行なつた。その結果、部分構造とし
てAsp−Leu−Thr−Trp−Ser−His−Ala
−Serからなるアミノ酸配列を得た。同時に
このグルコアミラーゼのＮ末端のアミノ酸配
列は、Ala−Ser−Ile−Proであり、さらに
Ｃ末端はAla−Alaである事も見い出した。
次いで目的のプローブ作成のため、前述のア
ミノ酸配列の一部に対応するThr−Trp−
Ser−His−Alaの部分について、そのアミノ
酸に対応するコドンから、5′−
ACNTGGTCNCAQGC−3′の14個の塩基か
らなる32種の合成DNAオリゴマーをトリエ
ステル固相法により合成した。ここでＮは任
意の塩基、ＱはピリミジンのＴあるいはＣを
示す。これらのDNAオリゴマーを〔γ−
32P〕ATPとT4−ポリヌクレオチジルキナ
ーゼを用いて標識し、グルコアミラーゼ遺伝
子の検出用プローブとして用いた。コロニー
ハイブリダイゼーシヨン方法によつて、これ
らのプローブとハイブリダイズする大腸菌の
形質転換体コロニーを増殖させ、この増殖物
からプラスミドDNAを抽出した。抽出物を
各種制限酵素で処理したのちアガロース電気
泳動を行ない、DNAフラグメントの解析を
行なつた。その結果、前記ブローブとハイブ
リダイスするコロニーにおいて、プラスミド
に挿入されたDNA断片は、4.3kbからなり、
BamH、Kpn、Mlu及びSacで一ヶ
所切断され、さらにDraで２ヶ所、Bgl
で３ヶ所切断されるが、Acc、Bal、
Cla、EcoR、Hpa、Pst、Pvu、
ScaおよびXhoでは切断されないことが
判明した。この断片を持つプラスミドを
pRGA39と命名した。 (b)() RNAの調製とcDNAのクローニング リゾプス・オリザエの気中菌糸から全
RNAを単離した。これには、グリニジウム
チオシアネートの使用を含む公知の手順を用
いた。オリゴーdTセルロースクロマトグラ
フイを用い全RNAからポリアデニル化RNA
をｍ−RNA分画として分取した。このｍ−
RNAを用い岡山−バーグ法（Okayama、
H.＆Berg、P.、Mol.Cell.Biol.2.161（1982））
によりcDNAの遺伝子ライブラリーを大腸菌
WA802中に作製した。 () 形質転換体の選択及びグルコアミラーゼ
cDNAの特性決定 目的酵素のcDNAを有する形質転換体の選
択は、前述のコロニーハイブリダイゼーシヨ
ンの方法で行なつた。グルコアミラーゼ
cDNA検出用のプローブとして前記(a)（）
で得たグルコアミラーゼ遺伝子の2.0kb Dra
断片を用いた。この断片を〔α−32P〕
dCTP、DNAポリメーラーゼ及びDNAア
ーゼを使用するニツクトランスレーシヨン
法によつて標識し、グルコアミラーゼcDNA
検出用のプローブとして用いた。このプロー
ブとハイブリダイズする形質転換体コロニー
を増殖させ、プラスミドDNAを抽出した。
各種制限酵素で処理したのち、アガロース電
気泳動を行ないDNAフラグメントの解析を
行なつた。プローブとハイブリダイズするコ
ロニーのプラスミドが挿入されたDNA断片
は、1.7kbの大きさであつた。このプラスミ
ドをpCGA239と命名した。 (c) DNA配列解析 プラスミドpRGA38及びpCGA239から各種
制限酵素を用いて分解し、アガロースゲルで
DNA断片を単離し、組み換えフアージM13を
用いたジデオキシ法により塩基配列を決定し
た。pRGA39の解析結果この遺伝子には、数十
bpからなるイントロンが４ヶ所存在する事が
確認された（第２図にイントロンの存在部位を
示す）。また、pCGA239は完全長のグルコアミ
ラーゼに対応するcDNAではなく、アミノ酸に
して約50個欠けたものであつた。pRGA−39お
よびpCGA239の遺伝子地図の比較を第４図に
示した。 (d) 発現用グルコアミラーゼDNAの構築 クローン化されたcDNAは、完全長ではな
い。そこでpCGA239とpRGA39を組む換える
ことにより、グルコアミラーゼのプロモーター
（リゾプス由来）を持つ完全長のcDNAを作製
した。その際、組み換えに利用できる適当な制
限酵素サイトがこれらのプラスミド中に存在し
ないため新しく、インビトローミユータジエネ
シスの方法でSalのサイトをpCGA239及び
pRGA39の同じところに新しく作り、組み換え
を行なつた（第５図参照）。インビトロ−シユ
ータジエネシスの方法は、モリナガらの方法
（Morinaga、Y.、etal、BIO／
TECHNOLOGY2、636−639（1984））に従つ
た。 こうして得られたプラスミドpCGA439は、
Salのサイトを作製したためにＮ末から53番
目のアミノ酸コドンが本来のリジンからアスパ
ラギン酸に変わつている。そこで再びインビト
ロ−ミユータジエネシスの方法を用いて、本来
の塩基配列に戻つた完全長のグルコアミラーゼ
DNAを含むプラスミドpCGA449を得た。プラ
スミドpCGA449は工業技術院微生物工業技術
研究所にSAM0039の名称でブタペスト条約の
下に寄託され、受託番号FERM BP−673が付
与されている。pCGA449中の完全長グリコア
ミラーゼDNAは、第２図における矢印左部分
と第３図における矢印右部分が結合したもので
ある。 (e) 酵母における発現ベクターの構築 前記(d)で得たpCGA449を酵母で効率良く発
現させるため特開昭61−56077号に開示された
酸性ホスフアターゼのプロモーター（Ppho5）
を有するpYGIFLm212から、EcoR−Sal
で切り出される約8.3kbの断片を用いた。この
EcoR−SalサイトにpCGA449を組み込む
為にpCGA449のPvuサイトをXhoリンカ
ーを用いてXhoサイトに変更し、プラスミド
pCGA450を作製した（第６Ａ図）。このプラス
ミドをXhoおよびEcoRで切断し、アガロ
ースゲル電気泳動で、2.2kbの断片を分離し、
T4−DNAリガーゼを用いて前述の8.3kb
EcoR−Sal断片にライゲーシヨンし、この
結果得られたPpho5をプロモーターとして含む
プラスミドをpYGA2149と命名した。このプラ
スミドを大腸菌WA802株中で増殖させて分離
した（第６Ａ図参照）。pYGIFLm212の発現プ
ロモーターPpho5とグリセロアルデヒド−３−
リン酸脱水素酵素のプロモーター（PVAP：特開
昭59−74986号参照）に変えたプロスミド
pYGIFLm222を作製し（第６Ｂ図）、上と全く
同じ方法でpYGA2249を作製し（図示せず）、
プラスミドを分離した。 さらにpCGA449の代りにpCGA469を用いて
同様の操作によりpYGIFLm212から
pYGA2169（第６Ａ図右下）、pYGIFLm222か
らpYGA2269（図示せず）を作製し、プラスミ
ドを分離した。その際、pYGIFLm222は、
pYGIFLm212（Escherichiacoli SBM274
FERM Ｐ−7727；本菌株は昭和63年（1988
年）12月26日に国際寄託に移管され、受託番
号：微工研条寄第2216号（FERM BP−2216）
が付与されている）と特開昭59−74986号に開
示されたプラスミドpYgap87（SBM151
FERM BP−382）を用いて作製した（第６Ｂ
図参照）。すなわち、pYGIFLm212中唯一の
BamHサイトをBamHで開裂後、DNAポ
リメラーゼによりフイルインし、Hindリ
ンカーを用いてHindサイトに変更したプラ
スミドpYGIFLm212Hを作製した。また
pYgap87のグリセロアルデヒド−３−リン酸
脱水素酵素の構造遺伝子開始コドンATGの直
前にインビトロ−ミユータジエネシスにより
EcoRのサイトを作り、プラスミド
pYgap87Eを作製した。 pYGIFLm212HをEcoRで切断し、さらに
Hindで部分的に切断後、アガロースゲル電
気泳動で、8.0kbの断片を分離した。また
pYgap87EをEcoRとHindで切断後アガロ
ースゲル電気泳動で1.1kbの断片を分離し、
pYGIFLm212Hの8.0kbの断片とライゲーシヨ
ン後大腸菌を形質転換してプラスミド、
pYGIFLm222を得た。 (f) 酵母におけるグルコアミラーゼ遺伝子の発現 前述のプラスミドpYGA2149を用い酵母
Saccharomyces cerevisiae XS−30−2A
〔MATa、leu2、his3、trp1、ura3〕およびXS
−30−2B〔MATα、leu2、his3、trp1、ura3〕
を形質転換し、トリプトフアンの栄養要求性で
形質転換体を選択した。形質転換は、LiCl2を
用いたイトウらの方法（Ito、H.、etal、J.
Bacteriol.、153、（1983））で行なつた。得ら
れた形質転換体を５mlのYEPD培地（１％酵母
エキス、２％ポリペプトン、２％グルコース）
に一白金耳植菌後48時間後にサンプリングを行
なつた。エツペンドルフチユーブにて
10000rpm5分間の遠心分離により上清とペレツ
トに分け、その上清を用いてグルコアミラーゼ
の活性を測定した。グルコアミラーゼ活性の測
定は可溶でんぷん溶液（1.0％可溶でんぷん−
20ｍＭ酢酸緩衝液PH5.0）800μに前述の上清
200μを加え37℃で反応後の遊離グリコース
の量で求めた。グルコースの量はグリコスタツ
ト（藤沢薬品）を用いて定量した。活性は、２
時間反応で測定したところXS−30−2A中の
pYGA2149では、0.004u／ml、XS−30−2B中
のpYGA2149では、0.008u／mlとなり酵母の性
により２倍の差があつた（第７図参照）。１ユ
ニツトは、１分間に1μmoleのグルコースを遊
離する活性とした。pYGA2149を含まない酵母
では、上清に活性は認められなかつた。 さらにプロモーターとしてPGAPを利用してい
る場合その活性は0.40μ／mlとなり50〜100倍の
グルコアミラーゼ活性が出現した。またプロモ
ーターとして酸性ホスフアターゼPpho5を利用
した場合グルコアミラーゼ活性は、培地中のリ
ン酸濃度に影響され出現した。たとえば、通常
のYPD培地で30℃48時間培養後におけるこの
菌のグリコアミラーゼ活性は０であるが、硫酸
マグネシウムとアンモニア水を用いてYPD中
のリン酸を除いた培地〔Rubin、G.M.Eur.J.
Biochem.41、197−202、（1974）〕ではPGAPの
場合と同程度のグルコアミラーゼ活性が出現す
る。培養後の上清についてSDSポリアクリルア
ミドゲル電気泳動を行なつた場合、グルコアミ
ラーゼ蛋白は、全菌体外蛋白質の50％以上であ
る。 さらにそれらの活性がリゾプス由来のグルコ
アミラーゼによるものである事を免疫学的手法
により確認した。精製したグルコアミラーゼを
用い、ウサギによる抗体を作製した。この抗体
を用い通常ウエスタンブロツテイングと呼ばれ
る方法で、検出した。これには、前述の活性を
測定した48時間培養後の上清1.5mlを濃縮して
用いた。その３分の１の量を10％ポリアクリル
アミド電気泳動し、泳動後、ゲル中のたんぱく
質を電気泳動的にニトロ−セルロース紙上に
移動させ、固定した。こうして得られたニトロ
セルロース紙を酵素免疫実験法の手法を用い
パーオキシダーゼの反応で検出した。その結果
リゾプスのグルコアミラーゼと分子量的にほぼ
同じ位置にグルコアミラーゼの抗体と反応する
バンドが存在し、たしかに、リゾプス由来のグ
リコアミラーゼが酵母により発現している事を
確認した。その結果を第８図に示した。 (g) でんぷんを炭素源とした場合の増殖 酵母XS−30−2B株についてpYGA2149の有
無について炭素源を変えた場合の増殖について
検討した。XS−30−2BをYPD培地で、XS−
30−2B〔pYGA2149〕を１％カザミノ酸及びウ
ラシルを含む最少培地（0.67％Difco
Yeastnitrogene base、２％グルコース）で24
時間30℃で振とう培養し前培とした。500mlの
坂口フラスコにYPD培地または、YPS培地
（１％酵母エキス、２％ポリペプトン、２％可
溶性でんぷん）を100ml作製し、オートクレー
ブ滅菌後30℃にて前培溶液を１ml加え、その後
の増殖を660nｍの吸光度によつて比較した。
その結果、プラスミドpYGA2149を保持しない
XS−30−2B株は、YPS培地では、ほとんど増
殖しないが、pYGA2149を保持する株は、
YPS培地でもYPD培地と同程度の増殖速度で
増殖しうる。この事実は、明らかにXS−30−
2B〔pYGA2149〕がグルコアミラーゼを生産
し、でんぷんを分解して利用している結果であ
る（第９図参照）。 (h) 形質転換酵母によるアルコールの生産 () 可溶性でんぷんを用いたアルコール発酵
培地はYPS（１％酵母エキス、２％ポリペプ
トン、１％、２％または５％可溶性でんぷ
ん）200mlを500mlマイヤー中で121℃、15分
間オートクレーブ滅菌したものを用いた。 酵母は次のものを使用した： XS−30−2B（グルコアミラーゼ遺伝子
を持たぬコントロール） XS−30−2B〔pYGA2149で形質転換〕
この酵母はリゾプスのプロモーターを持
つ。 XS−30−2B〔pYGA2169で形質転換〕
この酵母はPho5プロモーターを持つ。 XS−30−2B〔pYGA2269で形質転換〕
この酵母はPGAPプロモーターを持つ。 酵母の前々培を得るため、１％カザミノ
酸、ウラシル、アデニンを含む最少培地５ml
に１白金耳植菌し、28℃で20時間振とう培養
した。次いでこの前々培をYPD培地に２％
植菌し、28℃で24時間静置培養して前培とし
た。但し、の酵母については、Pho5を誘
導するために低リン酸YPD培地で培養した。
この前培をYPS培地に５％植菌し、28℃で
静置培養してエタノールの生産を調べた。な
おの酵母については低リン酸YPS培地で
行つた。各酵母について１、２及び５％ので
んぷんでのエタノールの生産並びに酵母の増
殖を測定した。その結果を次表１および２に
示す。
たリゾプス・オリザエ（Rhizopus oryzae）のグ
ルコアミラーゼを生産する酵母を用いたグルコア
ミラーゼ及びエチルアルコールの製造法に関す
る。 （従来技術） グルコアミラーゼはデンプンを非還元末端より
分解しグルコースを生成する酵素で、デンプンよ
りエチルアルコールを生産する工程で、デンプン
を糖化する際に広く用いられている。なかでも糸
状菌リゾプス属が生産するグルコアミラーゼは生
産量及び酵素活性が高く、しかも特に一般のグル
コアミラーゼと違つて、生デンプンにも作用する
こと及び至適PH等種々の酵素化学的性質から醸造
用に最も適したものである。このため、リゾプス
属のグルコアミラーゼは、醸造用のデンプンを、
無蒸煮法または低温蒸煮法（特開昭57−102189号
および特開昭51−61688号参照）で糖化するため
に使用されている。 しかしながら、リゾプス属のグルコアミラーゼ
を生産するためにはふすま等を主成分とした固体
培養法を用いることが多く、タンク培養が可能な
液体培養法に比較して酵素の生産コストが上昇す
る。従つてグルコアミラーゼを利用したアルコー
ル生産においても生産コストの上昇につながると
いう問題がある。 （発明が解決しようとする問題点） 本発明者らは、上記問題を解決するため、リゾ
プスのグルコアミラーゼ遺伝子を発現可能な形で
酵母に導入し、この酵母を直接低温蒸煮でん粉ま
たは生でん粉に作用させれば、デンプンからエチ
ルアルコールを生産する工程で、デンプンの糖化
に必要なリゾプスのグルコアミラーゼの添加量を
減少させるかあるいは全く添加することなくエチ
ルアルコールの生産コストを減少させることがで
きるのではないかとの着想の下に種々の研究を行
い本発明を完成した。 （発明の構成） 本発明はリゾプス属に属する糸状菌由来のグル
コアミラーゼ遺伝子を組込んだ発現可能な組換ベ
クターによつて形質転換された酵母を用いて、澱
粉質原料を糖化・発酵せしめることを特徴とする
アルコールの製造法である。 本発明で使用する澱粉質原料には、穀類、キヤ
ツサバ、カンシヨ、ジヤガイモ等の地下澱粉並び
に精製澱粉が含まれる。 本発明の方法により微生物にリゾプスグルコア
ミラーゼを生産させるには、グルコアミラーゼ生
産性のリゾプス属糸状菌、好ましくはリゾプス・
オリザエのグルコアミラーゼ遺伝子を適当な手段
で調製し、この遺伝子を宿主の形質発現系で認識
されるプロモーター領域やテール領域等の情報発
現機構を含むDNA断片とともに、宿主内で複製
可能なプラスミドベクターに挿入し、このベクタ
ーで宿主を形質転換してやればよい。宿主が酵母
であるときは、形質転換酵母により、リゾプスグ
ルコアミラーゼが生産され菌体外へ放出されるか
ら、でんぷん（無蒸煮であつてもよい）はこの酵
素で糖化され、これを酵母がアルコールへ変化さ
せるため、高価な糖化酵素剤を添加することなく
アルコールが生産される。このように、でん粉を
予め糖化することなく、酵母を作用させてアルコ
ールを生産しうるとは従来全く考えられていなか
つたことである。 アルコールの製造における原料の蒸煮すなわち
糊化工程には、高温蒸煮法（蒸煮温度120℃以
上）、低温蒸煮法（蒸煮温度60℃〜85℃）および
無蒸煮法（蒸煮しない）などが知られているが、
本発明の微生物によるアルコール製造方法は、い
ずれを採用してもよい。 なお、宿主として酵母を用いればアルコールと
リゾプスグルコアミラーゼが同時に生産される
が、後者のみを目的とするときは、宿主として枯
草菌を用いることも可能である。 本発明によれば、グリコアミラーゼをコードす
るDNAの調製法も提供され、かつその塩基配列
も明らかにされた。 即ち、本発明の方法で上記グルコアミラーゼの
生産を可能ならしめるために使用するDNA断片
の塩基配列は、例えばリゾプス・オリザエの染色
体DNAよりクローニングしたグルコアミラーゼ
遺伝子のDNA塩基配列と、リゾプス・オリザエ
のｍ−RNAより調製したグルコアミラーゼｃ−
DNAの塩基配列を適宜組合せて調製できる。な
お酵母内で、当該グルコアミラーゼを発現せしむ
るために、遺伝子組換により、プロモーター領域
および／またはテール領域（3′未非翻訳部分）と
して形質転換微生物に適したものを使用すること
が好ましい（特開昭58−146281号参照）。例えば
酵母内で発現させるために、特開昭59−74986号
および特開昭59−74988号に記載された、グリセ
ルアルデヒド−３−フオスフエイトデハイドロゲ
ナーゼ遺伝子（GAP−DH）のプロモーター領域
（PGAP）、テール領域（TGAP）、抑制性酸性フオス
フアターゼ遺伝子（PHO5）のプロモーター領域
（Ppho5）および３−フオスフオグリセロキナー
ゼ（PGK）のプロモーター領域（PPGK）を後記
実施例に示す如く使用できる。本発明においては
また、前記DNA塩基配列及びDNA断片を持つ複
製可能な種々のプラスミドベクターの構築方法も
提供される。 糸状菌は、リゾプス属に属するものでグルコア
ミラーゼを生産するものであれば、いずれの種で
もよく、リゾプス・オリザエ（Rhizopus
oryzae）、リゾプス・フオルモサエンシス
（Rhizopus formosaensis）、リゾプス・ヤバニカ
ス（Rhizopus javanicus）、リゾプス・サイラン
デンシス（Rhizopus thailandensis）などがあげ
られる。特にリゾプス・オリザエに属する
SAM0034〔微工研菌寄第7960）；本菌株は昭和60
年（1985年）10月23日に国際寄託に移管され、受
託番号：微工研条寄第929号（FERM BP−929）
が付与されている〕は、生澱粉分解に適したグル
コアミラーゼを産生することが本発明者らによつ
て確認されている。 なお、SAM0034の細菌学的性質は次のとおり
である。 培養所見（バレイシヨ・ブドウ糖寒天培地、28
℃、培養） 培養は一日目でコロニーは直径５−5.5mm、コ
ロニーは白色、コロニーの裏面も白色、培養２日
目でコロニーはプレート（直結９cm）の全面にひ
ろがる。コロニーは成熟とともに灰色になる。 匍匐枝は無色又は黄かつ色、仮根はかつ色、胞
子のう柄は一般に仮根から生じるが、匍匐枝から
直接生じることもある。胞子のう柄は単生または
群生、胞子のう枝が二又に分岐することもある。
長さ220−1200μｍ．胞子のうは球形ないし亜球
形、暗かつ色、直径60−150μｍ．柱軸は球形な
いし亜球形。胞子のう胞子は球形、亜球形又は多
角形、表面に筋がある。５−15X3−7μｍ．厚膜
胞子は亜球形又は円筒形、６−13X4−9μｍ、接
合胞子は観察できなかつた。37℃で生育可能。 以上、胞子のう胞子が柱軸を持つ暗かつ色の胞
子のう中に形成され、更に胞子のう柄がかつ色で
あり、また仮根を持つことから、本発明の菌株
（SAM−0034）はRhizopus属に属する真菌であ
ると考えられる。そこでInui、T.、Y.Takeda＆
H.Iizuka、1965.Taxonomical Studies on
genus Rhizopus.Journal of Ceneral and
Applied Microbiology、Vol.11、Supplement、
121pp.Zycha、H.、R.Siepmann and G.
Linnemann、1969。Mucorales.Eine
Beschreibung aller Gattungen und Arten
dieser Pilzgruppe.335pp.Verlag von J.Cramer.
Lehre.Domsch、K.H.、W.Gams and T.−H.
Anderson、1980.Compendium of Soil Fungi.
Vol.1.859pp.Academic Press.London.に準拠し
て既知のRhizopus属の種類と菌学的性質を比較
すると、本菌株は、37℃で生育可能であり、胞子
のう胞子の表面に筋があり、胞子のう柄が長さ
220−1200μｍ、胞子のうが直径60−150μｍ、胞
子のう胞子が５−15x3−7μｍであることから、
本菌株をRhizopus oryzaeと同定した。 グルコアミラーゼ遺伝子の単離 グルコアミラーゼ遺伝子の単離は、リゾプス属
のｍ−RNAより調製したｃ−DNAとして得る
か、またはリゾプス属の染色体DNAから例えば
クリエールらの方法（Cryer et al、Method in
Cell Biology，Vol.12、p39−44（1975）〕によつ
て得ることができる。 後者の方法は、通常イントロンの配列を含有し
ており、そのまま、大腸菌や酵母を宿主とする場
合は発現できない。これらの宿主中で発現できる
遺伝子を得るには、ｍ−RNAからのｃ−DNAの
一部と、染色体からの遺伝子のイントロンを含ま
ない配列部分のDNAを組み換える方法によつて
も得ることができる。両者を組み換える際に、一
方又は両方のDNA部分に適当な制限酵素切断部
位が存在しない場合には、インビトロミユータジ
エネシスの手法を用いることにより適当な制限酵
素部位を作成しハイブリツドさせることが可能で
ある。 かくして得られるグルコアミラーゼ遺伝子は、
第１図の〔 〕内のアミノ酸配列をコードする
DNAまたはこれと同等の酵素活性を有するアミ
ノ酸に対応する塩基配列である。 すなわちリゾプス属由来のグリコアミラーゼ構
造遺伝子は、第１図のＮ末端から26−604番目の
アミノ酸配列をコードするDNAであり、または、
同図に付した塩基配列の番号190−1962に相当す
る。アミノ酸配列のＮ末端から１−25番に相当す
る部分は、シグナルペプチドに対する領域と考え
られ、宿主の細胞外への分泌に関与するものと考
えられる。 上述のグルコアミラーゼ遺伝子を単離する好適
な方法の例を以下述べる。グルコアミラーゼ生産
菌であるリゾプス属に属する糸状菌から全DNA
を単離する。 単離の方法は、クリエールの方法（先述）を改
変した方法による。まず、リゾプスを胞子形成さ
せ、その胞子を集める。これを破砕し、その後ク
リエールの方法に従つて処理し、最後にゲル過
を行なう。ついでこのDNAを制限酵素Hindを
用いて消化し、公知のベクターpBR322のHind
サイドにクローニングし、リゾプスの遺伝子ライ
ブラリーを大腸菌に作成する。ライブラリーとし
て取得するにはアンピシリン耐性の形質転換体を
得れば良い。 次いで、実施例で述べる様なグルコアミラーゼ
DNA検出用のプローブ（DNAオリゴマー）を作
成し、コロニーハイブリダゼーシヨンを行ない、
このプローブとハイブリダイスするコロニーを増
殖させ、プラスミドDNAを抽出する。 以下に本発明を実施例によつて詳細に説明す
る。 実施例 (a)() DNAの調製とクローニング グルコアミラーゼ生産菌リゾプス・オリザ
エから全DNAを単離した。DNAの単離は、
酵母で用いられているクリエールらの方法
（Cryer et al、Method in Cell Biology、
Vol12、39−44、（1975））を改変して行なつ
た。薄く切つたじやが芋をオートクレーブで
滅菌後、その上にリゾプス・オリザエの菌体
を増殖させ胞子を形成させた。それらの胞子
を集め、0.15MNaCl−0.05M EDTA溶液に
懸濁し、ガラス球を用いた細胞破砕装置ダイ
ノミルを用いて15秒間処理により菌体を破砕
した。その後の操作は、クリエールらの方法
に従つたが、最後にバイオラド社のバイオゲ
ルA5mゲルを用いてゲル過を行ない全
DNAを単離した。このDNAを制限酵素
Hindを用いて消化し、pBR322のHind
サイトにクローニングし、リゾプスの遺伝子
ライブラリーを大腸菌WA802株に作製した。
大腸菌の形質転換は常法を用いた。ライブラ
リーとしてアンピシリン耐性形質転換体を取
得した。 () 形質転換体の選択及びグルコアミラーゼ
遺伝子の特性決定 形質転換体の選択は、ニトロセルロース
紙を用いた通常コロニーハイブリダイゼーシ
ヨンと呼ばれる方法で行なつた。はじめにグ
リコアミラーゼDNA検出用のプローブを作
製する為、精製したリゾプスのグルコアミラ
ーゼを各種プロテアーゼで分解し、生成した
ペプチドを分離精製した。それらのペプチド
についてアミノ酸分析と一次構造決定を常法
に従つて行なつた。その結果、部分構造とし
てAsp−Leu−Thr−Trp−Ser−His−Ala
−Serからなるアミノ酸配列を得た。同時に
このグルコアミラーゼのＮ末端のアミノ酸配
列は、Ala−Ser−Ile−Proであり、さらに
Ｃ末端はAla−Alaである事も見い出した。
次いで目的のプローブ作成のため、前述のア
ミノ酸配列の一部に対応するThr−Trp−
Ser−His−Alaの部分について、そのアミノ
酸に対応するコドンから、5′−
ACNTGGTCNCAQGC−3′の14個の塩基か
らなる32種の合成DNAオリゴマーをトリエ
ステル固相法により合成した。ここでＮは任
意の塩基、ＱはピリミジンのＴあるいはＣを
示す。これらのDNAオリゴマーを〔γ−
32P〕ATPとT4−ポリヌクレオチジルキナ
ーゼを用いて標識し、グルコアミラーゼ遺伝
子の検出用プローブとして用いた。コロニー
ハイブリダイゼーシヨン方法によつて、これ
らのプローブとハイブリダイズする大腸菌の
形質転換体コロニーを増殖させ、この増殖物
からプラスミドDNAを抽出した。抽出物を
各種制限酵素で処理したのちアガロース電気
泳動を行ない、DNAフラグメントの解析を
行なつた。その結果、前記ブローブとハイブ
リダイスするコロニーにおいて、プラスミド
に挿入されたDNA断片は、4.3kbからなり、
BamH、Kpn、Mlu及びSacで一ヶ
所切断され、さらにDraで２ヶ所、Bgl
で３ヶ所切断されるが、Acc、Bal、
Cla、EcoR、Hpa、Pst、Pvu、
ScaおよびXhoでは切断されないことが
判明した。この断片を持つプラスミドを
pRGA39と命名した。 (b)() RNAの調製とcDNAのクローニング リゾプス・オリザエの気中菌糸から全
RNAを単離した。これには、グリニジウム
チオシアネートの使用を含む公知の手順を用
いた。オリゴーdTセルロースクロマトグラ
フイを用い全RNAからポリアデニル化RNA
をｍ−RNA分画として分取した。このｍ−
RNAを用い岡山−バーグ法（Okayama、
H.＆Berg、P.、Mol.Cell.Biol.2.161（1982））
によりcDNAの遺伝子ライブラリーを大腸菌
WA802中に作製した。 () 形質転換体の選択及びグルコアミラーゼ
cDNAの特性決定 目的酵素のcDNAを有する形質転換体の選
択は、前述のコロニーハイブリダイゼーシヨ
ンの方法で行なつた。グルコアミラーゼ
cDNA検出用のプローブとして前記(a)（）
で得たグルコアミラーゼ遺伝子の2.0kb Dra
断片を用いた。この断片を〔α−32P〕
dCTP、DNAポリメーラーゼ及びDNAア
ーゼを使用するニツクトランスレーシヨン
法によつて標識し、グルコアミラーゼcDNA
検出用のプローブとして用いた。このプロー
ブとハイブリダイズする形質転換体コロニー
を増殖させ、プラスミドDNAを抽出した。
各種制限酵素で処理したのち、アガロース電
気泳動を行ないDNAフラグメントの解析を
行なつた。プローブとハイブリダイズするコ
ロニーのプラスミドが挿入されたDNA断片
は、1.7kbの大きさであつた。このプラスミ
ドをpCGA239と命名した。 (c) DNA配列解析 プラスミドpRGA38及びpCGA239から各種
制限酵素を用いて分解し、アガロースゲルで
DNA断片を単離し、組み換えフアージM13を
用いたジデオキシ法により塩基配列を決定し
た。pRGA39の解析結果この遺伝子には、数十
bpからなるイントロンが４ヶ所存在する事が
確認された（第２図にイントロンの存在部位を
示す）。また、pCGA239は完全長のグルコアミ
ラーゼに対応するcDNAではなく、アミノ酸に
して約50個欠けたものであつた。pRGA−39お
よびpCGA239の遺伝子地図の比較を第４図に
示した。 (d) 発現用グルコアミラーゼDNAの構築 クローン化されたcDNAは、完全長ではな
い。そこでpCGA239とpRGA39を組む換える
ことにより、グルコアミラーゼのプロモーター
（リゾプス由来）を持つ完全長のcDNAを作製
した。その際、組み換えに利用できる適当な制
限酵素サイトがこれらのプラスミド中に存在し
ないため新しく、インビトローミユータジエネ
シスの方法でSalのサイトをpCGA239及び
pRGA39の同じところに新しく作り、組み換え
を行なつた（第５図参照）。インビトロ−シユ
ータジエネシスの方法は、モリナガらの方法
（Morinaga、Y.、etal、BIO／
TECHNOLOGY2、636−639（1984））に従つ
た。 こうして得られたプラスミドpCGA439は、
Salのサイトを作製したためにＮ末から53番
目のアミノ酸コドンが本来のリジンからアスパ
ラギン酸に変わつている。そこで再びインビト
ロ−ミユータジエネシスの方法を用いて、本来
の塩基配列に戻つた完全長のグルコアミラーゼ
DNAを含むプラスミドpCGA449を得た。プラ
スミドpCGA449は工業技術院微生物工業技術
研究所にSAM0039の名称でブタペスト条約の
下に寄託され、受託番号FERM BP−673が付
与されている。pCGA449中の完全長グリコア
ミラーゼDNAは、第２図における矢印左部分
と第３図における矢印右部分が結合したもので
ある。 (e) 酵母における発現ベクターの構築 前記(d)で得たpCGA449を酵母で効率良く発
現させるため特開昭61−56077号に開示された
酸性ホスフアターゼのプロモーター（Ppho5）
を有するpYGIFLm212から、EcoR−Sal
で切り出される約8.3kbの断片を用いた。この
EcoR−SalサイトにpCGA449を組み込む
為にpCGA449のPvuサイトをXhoリンカ
ーを用いてXhoサイトに変更し、プラスミド
pCGA450を作製した（第６Ａ図）。このプラス
ミドをXhoおよびEcoRで切断し、アガロ
ースゲル電気泳動で、2.2kbの断片を分離し、
T4−DNAリガーゼを用いて前述の8.3kb
EcoR−Sal断片にライゲーシヨンし、この
結果得られたPpho5をプロモーターとして含む
プラスミドをpYGA2149と命名した。このプラ
スミドを大腸菌WA802株中で増殖させて分離
した（第６Ａ図参照）。pYGIFLm212の発現プ
ロモーターPpho5とグリセロアルデヒド−３−
リン酸脱水素酵素のプロモーター（PVAP：特開
昭59−74986号参照）に変えたプロスミド
pYGIFLm222を作製し（第６Ｂ図）、上と全く
同じ方法でpYGA2249を作製し（図示せず）、
プラスミドを分離した。 さらにpCGA449の代りにpCGA469を用いて
同様の操作によりpYGIFLm212から
pYGA2169（第６Ａ図右下）、pYGIFLm222か
らpYGA2269（図示せず）を作製し、プラスミ
ドを分離した。その際、pYGIFLm222は、
pYGIFLm212（Escherichiacoli SBM274
FERM Ｐ−7727；本菌株は昭和63年（1988
年）12月26日に国際寄託に移管され、受託番
号：微工研条寄第2216号（FERM BP−2216）
が付与されている）と特開昭59−74986号に開
示されたプラスミドpYgap87（SBM151
FERM BP−382）を用いて作製した（第６Ｂ
図参照）。すなわち、pYGIFLm212中唯一の
BamHサイトをBamHで開裂後、DNAポ
リメラーゼによりフイルインし、Hindリ
ンカーを用いてHindサイトに変更したプラ
スミドpYGIFLm212Hを作製した。また
pYgap87のグリセロアルデヒド−３−リン酸
脱水素酵素の構造遺伝子開始コドンATGの直
前にインビトロ−ミユータジエネシスにより
EcoRのサイトを作り、プラスミド
pYgap87Eを作製した。 pYGIFLm212HをEcoRで切断し、さらに
Hindで部分的に切断後、アガロースゲル電
気泳動で、8.0kbの断片を分離した。また
pYgap87EをEcoRとHindで切断後アガロ
ースゲル電気泳動で1.1kbの断片を分離し、
pYGIFLm212Hの8.0kbの断片とライゲーシヨ
ン後大腸菌を形質転換してプラスミド、
pYGIFLm222を得た。 (f) 酵母におけるグルコアミラーゼ遺伝子の発現 前述のプラスミドpYGA2149を用い酵母
Saccharomyces cerevisiae XS−30−2A
〔MATa、leu2、his3、trp1、ura3〕およびXS
−30−2B〔MATα、leu2、his3、trp1、ura3〕
を形質転換し、トリプトフアンの栄養要求性で
形質転換体を選択した。形質転換は、LiCl2を
用いたイトウらの方法（Ito、H.、etal、J.
Bacteriol.、153、（1983））で行なつた。得ら
れた形質転換体を５mlのYEPD培地（１％酵母
エキス、２％ポリペプトン、２％グルコース）
に一白金耳植菌後48時間後にサンプリングを行
なつた。エツペンドルフチユーブにて
10000rpm5分間の遠心分離により上清とペレツ
トに分け、その上清を用いてグルコアミラーゼ
の活性を測定した。グルコアミラーゼ活性の測
定は可溶でんぷん溶液（1.0％可溶でんぷん−
20ｍＭ酢酸緩衝液PH5.0）800μに前述の上清
200μを加え37℃で反応後の遊離グリコース
の量で求めた。グルコースの量はグリコスタツ
ト（藤沢薬品）を用いて定量した。活性は、２
時間反応で測定したところXS−30−2A中の
pYGA2149では、0.004u／ml、XS−30−2B中
のpYGA2149では、0.008u／mlとなり酵母の性
により２倍の差があつた（第７図参照）。１ユ
ニツトは、１分間に1μmoleのグルコースを遊
離する活性とした。pYGA2149を含まない酵母
では、上清に活性は認められなかつた。 さらにプロモーターとしてPGAPを利用してい
る場合その活性は0.40μ／mlとなり50〜100倍の
グルコアミラーゼ活性が出現した。またプロモ
ーターとして酸性ホスフアターゼPpho5を利用
した場合グルコアミラーゼ活性は、培地中のリ
ン酸濃度に影響され出現した。たとえば、通常
のYPD培地で30℃48時間培養後におけるこの
菌のグリコアミラーゼ活性は０であるが、硫酸
マグネシウムとアンモニア水を用いてYPD中
のリン酸を除いた培地〔Rubin、G.M.Eur.J.
Biochem.41、197−202、（1974）〕ではPGAPの
場合と同程度のグルコアミラーゼ活性が出現す
る。培養後の上清についてSDSポリアクリルア
ミドゲル電気泳動を行なつた場合、グルコアミ
ラーゼ蛋白は、全菌体外蛋白質の50％以上であ
る。 さらにそれらの活性がリゾプス由来のグルコ
アミラーゼによるものである事を免疫学的手法
により確認した。精製したグルコアミラーゼを
用い、ウサギによる抗体を作製した。この抗体
を用い通常ウエスタンブロツテイングと呼ばれ
る方法で、検出した。これには、前述の活性を
測定した48時間培養後の上清1.5mlを濃縮して
用いた。その３分の１の量を10％ポリアクリル
アミド電気泳動し、泳動後、ゲル中のたんぱく
質を電気泳動的にニトロ−セルロース紙上に
移動させ、固定した。こうして得られたニトロ
セルロース紙を酵素免疫実験法の手法を用い
パーオキシダーゼの反応で検出した。その結果
リゾプスのグルコアミラーゼと分子量的にほぼ
同じ位置にグルコアミラーゼの抗体と反応する
バンドが存在し、たしかに、リゾプス由来のグ
リコアミラーゼが酵母により発現している事を
確認した。その結果を第８図に示した。 (g) でんぷんを炭素源とした場合の増殖 酵母XS−30−2B株についてpYGA2149の有
無について炭素源を変えた場合の増殖について
検討した。XS−30−2BをYPD培地で、XS−
30−2B〔pYGA2149〕を１％カザミノ酸及びウ
ラシルを含む最少培地（0.67％Difco
Yeastnitrogene base、２％グルコース）で24
時間30℃で振とう培養し前培とした。500mlの
坂口フラスコにYPD培地または、YPS培地
（１％酵母エキス、２％ポリペプトン、２％可
溶性でんぷん）を100ml作製し、オートクレー
ブ滅菌後30℃にて前培溶液を１ml加え、その後
の増殖を660nｍの吸光度によつて比較した。
その結果、プラスミドpYGA2149を保持しない
XS−30−2B株は、YPS培地では、ほとんど増
殖しないが、pYGA2149を保持する株は、
YPS培地でもYPD培地と同程度の増殖速度で
増殖しうる。この事実は、明らかにXS−30−
2B〔pYGA2149〕がグルコアミラーゼを生産
し、でんぷんを分解して利用している結果であ
る（第９図参照）。 (h) 形質転換酵母によるアルコールの生産 () 可溶性でんぷんを用いたアルコール発酵
培地はYPS（１％酵母エキス、２％ポリペプ
トン、１％、２％または５％可溶性でんぷ
ん）200mlを500mlマイヤー中で121℃、15分
間オートクレーブ滅菌したものを用いた。 酵母は次のものを使用した： XS−30−2B（グルコアミラーゼ遺伝子
を持たぬコントロール） XS−30−2B〔pYGA2149で形質転換〕
この酵母はリゾプスのプロモーターを持
つ。 XS−30−2B〔pYGA2169で形質転換〕
この酵母はPho5プロモーターを持つ。 XS−30−2B〔pYGA2269で形質転換〕
この酵母はPGAPプロモーターを持つ。 酵母の前々培を得るため、１％カザミノ
酸、ウラシル、アデニンを含む最少培地５ml
に１白金耳植菌し、28℃で20時間振とう培養
した。次いでこの前々培をYPD培地に２％
植菌し、28℃で24時間静置培養して前培とし
た。但し、の酵母については、Pho5を誘
導するために低リン酸YPD培地で培養した。
この前培をYPS培地に５％植菌し、28℃で
静置培養してエタノールの生産を調べた。な
おの酵母については低リン酸YPS培地で
行つた。各酵母について１、２及び５％ので
んぷんでのエタノールの生産並びに酵母の増
殖を測定した。その結果を次表１および２に
示す。
【表】
【表】
() 低温蒸煮法（LTC）によるアルコール発
酵 粉砕とうもろこし140ｇを仕込水402ml中に
加え、さらにα−アミラーゼ製剤（ターマミ
ル）0.5ｇを増粘防止剤として、メタ重亜硫
酸カリ160ppmを殺菌剤として添加し、80℃
〜82℃に５分間保持した後急冷した。 酵母の前々培及び前培は（）と同じ菌を
用いて同様に行ない、この前培を酒母として
上記低温蒸煮でんぷんに加え、28℃で培養し
た。培養は、他の成分を添加しないもの、カ
ザミノ酸、ウラシル、アデニンを補つたも
の、および更に0.4％ベルコースを加えたも
のの３水準について行い、CO2減少量による
発酵の進行状態およびアルコール生成量を調
べた。コントロールは、リゾプスグルコアミ
ラーゼを通常量で用いた非形質転換酵母の場
合も調べた。結果を表３、表４および第１０
図に示す。これらの結果から判るとおり、本
発明の酵母によれば、リゾプスグルコアミラ
ーゼ製剤を添加することなく、無蒸煮又は低
温蒸煮でんぷんから直接アルコールを製造す
ることが可能である。
酵 粉砕とうもろこし140ｇを仕込水402ml中に
加え、さらにα−アミラーゼ製剤（ターマミ
ル）0.5ｇを増粘防止剤として、メタ重亜硫
酸カリ160ppmを殺菌剤として添加し、80℃
〜82℃に５分間保持した後急冷した。 酵母の前々培及び前培は（）と同じ菌を
用いて同様に行ない、この前培を酒母として
上記低温蒸煮でんぷんに加え、28℃で培養し
た。培養は、他の成分を添加しないもの、カ
ザミノ酸、ウラシル、アデニンを補つたも
の、および更に0.4％ベルコースを加えたも
のの３水準について行い、CO2減少量による
発酵の進行状態およびアルコール生成量を調
べた。コントロールは、リゾプスグルコアミ
ラーゼを通常量で用いた非形質転換酵母の場
合も調べた。結果を表３、表４および第１０
図に示す。これらの結果から判るとおり、本
発明の酵母によれば、リゾプスグルコアミラ
ーゼ製剤を添加することなく、無蒸煮又は低
温蒸煮でんぷんから直接アルコールを製造す
ることが可能である。
【表】
＊ リゾプスグルコアミラーゼ
【表】
＊ リゾプスグルコアミラーゼ
第１図は、本発明のグルコアミラーゼのイント
ロンを含まない構造遺伝子の塩基配列をジグナル
ペプチド領域とともに示す図であり、第２図はリ
ゾプス・オリザエの染色体DNAよりクローニン
グしたグルコアミラーゼ遺伝子のDNA塩基配列
を示す図であり、第３図はリゾプス・オリザエの
ｍ−RNAより得たcDNAをクローニングしたグ
ルコアミラーゼ遺伝子のＣ末端側の塩基配列を示
す図であり、第４図は、リゾプス・オリザエの染
色体DNAよりクローニングしたグルコアミラー
ゼ遺伝子と、リゾプス・オリザエのｍ−RNAよ
り調製したグルコアミラーゼ遺伝子との比較図で
あり、第５図、第６Ａ図および第６Ｂ図は、第４
図の二つの遺伝子を組合せて、プラスミドベクタ
ー中にて、イントロンのない完全長のcDNAを構
成し、さらに酵母中で効率良く発現させるため
に、プロモーター及びテールを組込む方法を示す
一連の流れ図であつて、第５図はpCGA469に到
るまでの図、第６Ａ図はpYGA2149および
pYGA2169に到るまでの図、そして第６Ｂ図は
pYGIFLm222に到るまでの図であり、第７図は
形質転換酵母によるグルコアミラーゼの生産を示
すグラフであり、第８図は、形質転換酵母の生産
したグルコアミラーゼの電気泳動図であり、第９
図は、でんぷん炭素源とした場合の形質転換酵母
の増殖曲線グラフであり、第１０図は、形質転換
酵母によるアルコールの生産を示すグラフであ
る。
ロンを含まない構造遺伝子の塩基配列をジグナル
ペプチド領域とともに示す図であり、第２図はリ
ゾプス・オリザエの染色体DNAよりクローニン
グしたグルコアミラーゼ遺伝子のDNA塩基配列
を示す図であり、第３図はリゾプス・オリザエの
ｍ−RNAより得たcDNAをクローニングしたグ
ルコアミラーゼ遺伝子のＣ末端側の塩基配列を示
す図であり、第４図は、リゾプス・オリザエの染
色体DNAよりクローニングしたグルコアミラー
ゼ遺伝子と、リゾプス・オリザエのｍ−RNAよ
り調製したグルコアミラーゼ遺伝子との比較図で
あり、第５図、第６Ａ図および第６Ｂ図は、第４
図の二つの遺伝子を組合せて、プラスミドベクタ
ー中にて、イントロンのない完全長のcDNAを構
成し、さらに酵母中で効率良く発現させるため
に、プロモーター及びテールを組込む方法を示す
一連の流れ図であつて、第５図はpCGA469に到
るまでの図、第６Ａ図はpYGA2149および
pYGA2169に到るまでの図、そして第６Ｂ図は
pYGIFLm222に到るまでの図であり、第７図は
形質転換酵母によるグルコアミラーゼの生産を示
すグラフであり、第８図は、形質転換酵母の生産
したグルコアミラーゼの電気泳動図であり、第９
図は、でんぷん炭素源とした場合の形質転換酵母
の増殖曲線グラフであり、第１０図は、形質転換
酵母によるアルコールの生産を示すグラフであ
る。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 澱粉質原料からのアルコールの製造法におい
て、下記のアミノ酸配列（）を有するポリペプ
チドをコードするグルコアミラーゼ遺伝子を組み
込んだ発現ベクターにより形質転換された酵母を
用いて、澱粉質原料を糖化・発酵せしめることを
特徴とするアルコールの製造法： 【表】 【表】 【表】
Priority Applications (8)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59264965A JPS61141890A (ja) | 1984-12-15 | 1984-12-15 | アルコ−ルの製造法 |
| CA000497522A CA1267373A (en) | 1984-12-15 | 1985-12-12 | Process for producing alcohol |
| BR8506271A BR8506271A (pt) | 1984-12-15 | 1985-12-13 | Processo para produzir etanol |
| AT85115912T ATE67518T1 (de) | 1984-12-15 | 1985-12-13 | Verfahren zur herstellung von alkohol. |
| EP85115912A EP0185327B1 (en) | 1984-12-15 | 1985-12-13 | Process for producing alcohol |
| DE8585115912T DE3584149D1 (de) | 1984-12-15 | 1985-12-13 | Verfahren zur herstellung von alkohol. |
| MX000957A MX166006B (es) | 1984-12-15 | 1985-12-16 | Procedimiento para producir alcohol |
| US07/338,395 US5084385A (en) | 1984-12-15 | 1989-04-14 | Process for producing alcohol using yeast transformed by rhizopus glucoamylase gene |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59264965A JPS61141890A (ja) | 1984-12-15 | 1984-12-15 | アルコ−ルの製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61141890A JPS61141890A (ja) | 1986-06-28 |
| JPH0481428B2 true JPH0481428B2 (ja) | 1992-12-24 |
Family
ID=17410660
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59264965A Granted JPS61141890A (ja) | 1984-12-15 | 1984-12-15 | アルコ−ルの製造法 |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5084385A (ja) |
| EP (1) | EP0185327B1 (ja) |
| JP (1) | JPS61141890A (ja) |
| AT (1) | ATE67518T1 (ja) |
| BR (1) | BR8506271A (ja) |
| CA (1) | CA1267373A (ja) |
| DE (1) | DE3584149D1 (ja) |
| MX (1) | MX166006B (ja) |
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|---|---|---|---|---|
| FR2599755B1 (fr) * | 1986-06-10 | 1990-04-20 | Transgene Sa | Bloc d'expression d'une amyloglucosidase dans une levure, levure transformee et procede de preparation d'enzyme |
| DK293787A (da) * | 1986-06-10 | 1987-12-11 | Transgene Sa | Ekspression af en amyloglucosidase |
| US5151354A (en) * | 1986-08-21 | 1992-09-29 | Cornelius Hollenberg | Fermentation processes using amylolytic enzyme producing microorganisms |
| EP0260404B1 (en) * | 1986-08-21 | 1995-05-31 | VAN DEN BERG, Robert | Amylolytic enzymes producing microorganisms constructed by recombinant DNA technology and their use for fermentation processes |
| EP0257115A1 (en) * | 1986-08-21 | 1988-03-02 | Heineken Technisch Beheer B.V. | Amylolytic enzyme producing microorganisms, constructed by recombinant DNA technology, and their use in fermentation processes |
| GB8621118D0 (en) * | 1986-09-01 | 1986-10-08 | Whitbread & Co Plc | Stabilised polypeptides |
| JP2607509B2 (ja) * | 1987-03-31 | 1997-05-07 | サントリー株式会社 | グルコアミラーゼ生産形質転換酵母によるアルコールの生産方法 |
| US5270175A (en) * | 1991-07-12 | 1993-12-14 | Dna Plant Technology Corporation | Methods and compositions for producing metabolic products for algae |
| US5604128A (en) * | 1991-08-13 | 1997-02-18 | Sankyo Company, Limited | Isolated cultures of Pestalotiopsis funerea IFO 5427 and Pestalotiopsis negleta FERM BP-3501 |
| EP0528612A3 (en) * | 1991-08-13 | 1993-06-23 | Sankyo Company Limited | Amylase capable of digesting raw starch |
| US5322778A (en) * | 1991-10-31 | 1994-06-21 | Genencor International, Inc. | Liquefaction of granular starch slurries using an antioxidant with alpha amylase |
| US5665585A (en) * | 1992-09-03 | 1997-09-09 | Alko-Yhiot Oy | Recombinant production of glucoamylase P in trichoderma |
| US5514584A (en) * | 1993-06-11 | 1996-05-07 | Midwest Research Institute | Cloning of cellulase genes from acidothermus cellulolyticus |
| US6468662B1 (en) * | 1996-05-07 | 2002-10-22 | Reichhold, Inc. | Low monomer containing laminating resin compositions |
| WO2003066826A2 (en) * | 2002-02-08 | 2003-08-14 | Genencor International, Inc. | Methods for producing ethanol from carbon substrates |
| US20030203454A1 (en) * | 2002-02-08 | 2003-10-30 | Chotani Gopal K. | Methods for producing end-products from carbon substrates |
| US20040063184A1 (en) * | 2002-09-26 | 2004-04-01 | Novozymes North America, Inc. | Fermentation processes and compositions |
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| US20050239181A1 (en) * | 2004-03-10 | 2005-10-27 | Broin And Associates, Inc. | Continuous process for producing ethanol using raw starch |
| US7019391B2 (en) | 2004-04-06 | 2006-03-28 | Bao Tran | NANO IC packaging |
| US20070037267A1 (en) * | 2005-05-02 | 2007-02-15 | Broin And Associates, Inc. | Methods and systems for producing ethanol using raw starch and fractionation |
| US7919289B2 (en) | 2005-10-10 | 2011-04-05 | Poet Research, Inc. | Methods and systems for producing ethanol using raw starch and selecting plant material |
| CN101680006A (zh) * | 2007-05-08 | 2010-03-24 | 诺维信公司 | 发酵方法 |
| US8450094B1 (en) | 2009-03-03 | 2013-05-28 | Poet Research, Inc. | System for management of yeast to facilitate the production of ethanol |
| US9068206B1 (en) | 2009-03-03 | 2015-06-30 | Poet Research, Inc. | System for treatment of biomass to facilitate the production of ethanol |
| MX2011009269A (es) * | 2009-03-03 | 2011-09-26 | Poet Res Inc | Fermentacion de biomasa para la produccion de etanol. |
| WO2010102060A2 (en) * | 2009-03-03 | 2010-09-10 | Poet Research, Inc. | System for pre-treatment of biomass for the production of ethanol |
| BR112020019257A2 (pt) * | 2018-03-27 | 2021-01-12 | Cargill, Incorporated | Métodos para produção de etanol usando levedura manipulada |
| CN115867651A (zh) | 2020-04-17 | 2023-03-28 | 丹尼斯科美国公司 | 葡糖淀粉酶及其使用方法 |
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| US4615974A (en) * | 1981-08-25 | 1986-10-07 | Celltech Limited | Yeast expression vectors |
| JPH0716432B2 (ja) * | 1982-10-20 | 1995-03-01 | サントリー株式会社 | 酵母の高発現ベクタープラスミドを用いたペプチドの生産方法 |
| JPS5974988A (ja) * | 1982-10-20 | 1984-04-27 | Suntory Ltd | 酵母の誘導発現型プラスミドベクタ−およびその利用方法 |
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| JPH0630586B2 (ja) * | 1984-12-15 | 1994-04-27 | サントリー株式会社 | グルコアミラ−ゼ遺伝子 |
-
1984
- 1984-12-15 JP JP59264965A patent/JPS61141890A/ja active Granted
-
1985
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- 1985-12-13 EP EP85115912A patent/EP0185327B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1985-12-13 DE DE8585115912T patent/DE3584149D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1985-12-13 AT AT85115912T patent/ATE67518T1/de not_active IP Right Cessation
- 1985-12-13 BR BR8506271A patent/BR8506271A/pt not_active IP Right Cessation
- 1985-12-16 MX MX000957A patent/MX166006B/es unknown
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1989
- 1989-04-14 US US07/338,395 patent/US5084385A/en not_active Expired - Fee Related
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