JPH03151896A - 標本中の抗菌化合物の存在をアッセイする方法及びキット - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、特に食品業界及び酪農業界で有用な微生物ア
ッセイキット、及び標本中の抗菌化合物を検出する方法
、に関する。

技術的背景 抗菌化合物を検出するための現在の方法は、次の二つの
主要なカテゴリーに分けられる：１）当該抗菌物質に対
する特定レセプタに基ずく特定されたアッセイ方法。こ
のカテゴリーに属する方法の場合、一定量のラベルされ
た（通常放射線ラベル）抗菌物質が、ミルク標本中の分
析物の、限定された数のレセプタ部位に適合する。これ
らの方法の利点は、その速度である。主たる難点は、個
別抗生物質に対するそれぞれの方法の特異性である。従
ってこのような方法では、意図しない抗菌物質に対して
は検出することができない。

別の難点は、放射性トレーサの使用であって、このため
、このようなアッセイ法の採用は資格のある実験室或い
は封鎖された自動機器類に限定されてしまう。

２）微生物学的、非特定アッセイ法は、感受性のある微
生物の代謝作用を抑制する抗菌物質の能力に基礎をおく
。代謝活性は、例えば、感受性のある微生物が酸を生じ
る能力によってあられされ、この酸は、生育培地におけ
る酸／塩基の色を変化させる。

微生物学的アッセイ法の主たる利点は、理論的にはあら
ゆる抗菌物質を検出しうることである。

難点は、検出した抗菌物質の性質に関する情報が欠けて
いること、及びアッセイに比較的長時間かかること、で
ある。デルボテスト（Ｄｅｌｅｌｌ、ｅｌｌ　。

オランダ、ギストのプロカーデス　エヌ　ブイ社の登録
商標で、市販されている）は、ミルク中の抗菌物質の微
生物学的アッセイキットの一つの例である。微生物学的
アッセイによる低濃度（＜７ｍＩＵ／ｍｌ）のペニシリ
ンＧの検出には、極めて長時間（２，５〜３時間）の標
本と指標微生物の培養期間が必要である。これは、一般
的にすべてのＢ−ラクタム抗菌物質、特にペニシリン、
の作用の独特のメカニズムによる。これら抗菌物質は細
胞壁生成を抑制するが、細菌細胞代謝はまったく干渉し
ない。抗菌物質で処理された細胞は代謝作用を継続し、
或いは増大作用すらみられる。この場合、抗菌処理細胞
の子孫は細胞壁の量が減少する。抗菌物質の存在下に繁
殖した数世代後では、細胞壁は実質的に消失する。この
段階においてのみ細胞膜が影響を受け、細胞代謝が抑制
される。

ミルク中にペニシリンその他の抗菌物質の存在により、
酪農産業におけるミルクの処理が干渉される。抗菌物質
は、抗菌処理め牛によりミルク中に導入される。従って
、微生物学的醗酵処理によりミルクを加工する酪農作業
（ヨーグルト、チーズ、酸クリーム、酸乳等の製造）に
おいては、得られるミルクの各パッチについて、ペニシ
リンと共に（なぜなら獣医学的薬剤として広範な使用を
有する主たる薬剤−安価かつ効果があるーとして利用で
きるから）抗菌物質の存在がモニターされる。

しかし現在の、ペニシリンの存在を検出するための微生
物学的アッセイ法は長時間にわたるため、酪農産業上実
施が困難である。新しく到着するミルク荷は、遅い微生
物学的試験が完了するまで別に保蔵しておかなければな
らない。完了後になって始めてミルクは更に加工処理に
回すようにできるか、或いは抗菌活性が検出される場合
にはそのように処理することができるようになる。

一般的に抗菌活性、特にペニシリン活性の検定のための
迅速な微生物学的アッセイが可能な場合には、ミルク荷
が積みおろされる前に広い域のスペクトル試験が可能に
なる。更に、もしその試験が専門家でない人（例えば運
転手、農民等）にでも行うことができるほどに簡単なも
のであれば、ミルク輸送車上でアッセイを行い、試験結
果はミルク荷が酪農加工場に到着する時には既にわかっ
ているようにするならば、ミルク加工時間を更に短縮す
ることができる。簡単で有用なアッセイは、あらかじめ
抗菌処理されため牛のミルク中の残余抗菌レベルを検定
してその結果からそのミルクが使用することができるか
、或いは場合により破棄しなければならないかの決定を
するために、酪農家には極めて必要である。

従って迅速で感受性の高い微生物学的アッセイは、食品
産業界、特に酪農加工業界で待望されている。

本発明の要件 本発明の発明者により、抗菌活性を全所要時間が３０分
或いはそれ以下の微生物学的アッセイにより検出する、
というおどろくべき結果が提示された。ペニシリンその
他の抗菌化合物に対するこのアッセイ法の感受性は、市
販されている試験法に比肩するか、或いはより良好であ
る。アッセイ手順は簡単であり、キットの型の進展に適
合しゃすい。

この方法により得られる速度及び感受性は、以下の原理
に基ずく本発明の利用及び組合せの結果である： （ａ）当該微生物系から可能なもつとも高い信号の発生
。このことは、細菌を標本にさらしている間もっとも良
好な生育条件を保持し、かつ特定細菌に豊富であること
が知られている代謝マーカーを選ぶことにより、可能で
ある。例えばストレプトコックス　テルモフィラス（Ｓ
Ｈｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ＋ｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）は
、テトラゾリウム化合物を還元しそれにより色を生ずる
能力によって検出可能な酵素であるラクテート　デヒド
ロゲナーゼに富む。

デヒドロゲナーゼ活性は、この細胞の代謝活性のマーカ
ーである。このバクテリアの天然の生育培地はミルクで
ある。従って、過剰な酵素、ミルク中の理想的な生育、
及び最も感受性の高い市販テトラゾリウム色素により、
高い信号を生じさせることが可能になる。細菌系からの
高い信号は、細菌細胞の数を増加させることによっても
得られる。

（ｂ）抗菌化合物の作用のメカニズムにかかわるストレ
スに細菌をさらすことにより、及び／或いは抗菌化合物
により影響さる信号発生代謝系を選ぶことにより生ずる
当該抗菌化合物に対する細菌の感受性誘発。例えばペニ
シリンは細胞壁生成を抑制し、細胞膜のぜい弱性を促進
する。ペニシリンにさらしている間に細胞を高浸透圧培
地にさらし、信号発生時に浸透圧ショックを与えること
により、少い細胞壁及び膜であっても、損傷が増大し溶
解現象及び細胞死滅が生ずる。デヒドロゲナーゼもまた
通常、細胞膜と関係しており、その活性を発揮するため
には完全な膜がなければならない。従ってこれら酵素は
、僅かの膜損傷にも影響されてペニシリンアッセイに対
し高い感受性を示す。

本発明の態様の一つでは、その微生物学的アッセイ法は
以下のステップからなる： １、生育可能な細菌細胞懸濁液（指標菌株）を適当な生
育培地、好ましくはミルク中で培養する。

この細菌は好ましくはグラム陽性菌であり、好ましくは
Ｓｔ＋ｃｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕ
ｓ　（ＡＴＣＣ１４４８５）或いはＢｘｃｉｌｌｕｓ　
５ｌｅａ＋ｏｔｈｅ＋ｍｏｐｈｉｌｕｓ　（ＡＴＣＣ１
０１４９）の菌株である。

２、この細菌細胞懸濁液を、抗菌化合物を有しているこ
とが疑われる標本、及び抗菌化合物を含んでいないこと
が既に知られている比較標本、とに添加する。イースト
エキスとトリプトースの混合物を標本に添加することが
好ましく（指標菌株混合物）、それにより最終濃度がそ
れぞれ０．１乃至０．４％、好ましくは０．２５％のも
のを得る。

３、標本、細菌、イーストエキス及びトリプトースの混
合物を３０分間までの時間、好ましくは１０〜２５分間
、当該指標菌株に最適の温度及び爆気条件（Ｓｌｅｅｐ
、　　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓについて振とうせず４
２’Ｃ；　Ｂ、　　５ｊｅａｒｏ＋ｈｅｔｍｏｐｈｉｌ
ｕｓについて振とうしながら５５℃）で培養する。

４、上記の段階３の終りに、混合物を、０，５％グルコ
ースとテトラゾリウム塩、好ましくはＭＴＴ　（３−［
４，５−ジメチルチアゾール−２−イル］−２，５ジフ
ェニルテトラゾリウムブロマイド）、の混合物の０．０
３５〜１１．３５０■／ｍｌ、好ましくは０．１７５■
／ｍｌの濃度の水溶液で、１：１〜１：１０に希釈する
。或いは、０．５％グルコースとｐＨ指示薬、好ましく
はブロモクレゾール紫或いはプロモチモルブルー、の水
溶液を使用してもよい。

更に別の場合には、この混合物を水により１：１〜１：
ｌＯに希釈し、市販のＡＴＰ　（アデノシン三りん酸塩
）定量試薬キットを用いて細菌細胞内外のＡＴＰを測定
する。このようなＡＴＰ定量試薬キットはシグマ　ケミ
カル社、米国モンタナ州セトンルイス、或いはルマック
　ＢＶ社、オランダ国うンドグラーフ、から入手できる
。このほかに、生育性、代謝活性（同化或いは異化活性
）、膜統合性、などの信号の発生についても、種々の感
受性、使用しやすさ及び速度に応じ採用することができ
る。

５、比較標本懸濁液と試験標本懸濁液について、上記の
段階４で得られた結果を比較する。テトラゾリウム色素
の場合、標本の明るい色は抗菌活性を示す。ｐＨ指示薬
の場合、異なる色は抗菌活性を示す。ＡＴＰ定量の場合
、ＡＴＰが異なったレベルである場合には、抗菌活性を
示す。

本発明の別の態様では、指標細菌菌株の培養（上記段階
１）は、ショ糖を加えると最終濃度を０．６〜１．２Ｍ
、好ましくは０．８Ｍの高浸透圧とした培地で行うこと
ができる。本発明の更に別の態様では、アッセイ培地は
、ショ糖を標本に加え最終濃度を０．６〜１．２Ｍ、好
ましくは０．８Ｍに調整して高浸透圧にされる。更に別
の態様では、細菌は培養後（段階１）、凍結乾燥し、使
用前に再水和する。

別の態様では、細菌懸濁液に生成する色素（段階５）は
、フルオロカーボン基の有機溶剤、好ましくはＡｔｋｌ
ｏｎｅ−Ｐ　（Ｉ　ＣＩの登録商標）を用いて、或いは
例えば１−ブタノールなどの他の有機溶剤を用いて抽出
することができる。フレオン抽出の場合、遠心分離処理
後、色素は溶剤と水性相との境界域に集まる。ブタノー
ルの場合、短時間（１〜２分）の遠心分離後、色素は、
水性層の上に位置する溶剤相に集まる。ブタノール相の
色素濃度は、５７０ｎｍに設定された分光光度計により
測定することができる。

本発明はまた、好ましくはミルクである種々標本中の抗
菌化合物の検出のための試薬キットに関わる。一つの態
様では、キットは、細菌懸濁質、信号発生のための試薬
（即ち色素原酵素基体、ｐＨ指示薬、ＡＴＰ検出のため
の発光系）、を含む。キットの好ましい例では、細菌は
凍結乾燥され、信号発生試薬は乾燥状態で供給される。

従ってキットは長期間の保蔵に耐える。キットは更に、
小びん、試験管及び定量器具を含んでもよい。

本発明の詳細 細菌の代謝活性は、毒性及び／抗菌活性を調べるための
一般的に採用される指標である。これは、廃物処理系に
おける毒性物質をモニターするために使用される（Ａｎ
ｄｅｔｓｏｎほかの論文’Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆ　
ｍ１ｃｒｏｂｉｉｌ　ｘｓｓｘ７　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ
ｓ　ｆａｔ　ｅｗＮｕａｊｉＢ１ｏｘｉｃＨ７ｏｌ　ｏ
ｔｇｘｎ：ｃｓ　ｉｎ　１ａｄｕｓｔｔｉｘｌ　ｖｘｓ
ｔｅｓ’。

Ｌｉｎ及びＤｕｊｋａによる’Ｔｏｘｉｃｉｔｙ　Ｓｃ
ｒｅｃｎｉｎｇ　Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ　Ｕｓｉｎｇ　
Ｂｘｃｊｅｒｉｘｌ　Ｓ７Ｓ７５ｔｅ’所収、Ｍａｔｃ
ｅｌＤｅｋｋｅｔ社、Ｎ、Ｙ、　　１９８４年、２１５
−２３２ページ：Ｒｅ１ｎｈｘｒｔｔの米国特許第４．
７７４．１７３号；　Ｂｕｌｉｃｈ及び［ｓｅｎｂｃｔ
ｇ、　　入ｄｖ、　　ＩｎｓＨｕｍ、　　３５　；　　
３５−４０．　　１９８Ｑ　　年）　。

Ｒｅ１ｎｈ！ｒｊｓは米国特許第４．７７４．１７３号
において、種々の毒性物質に対する感受性を増大させる
ためには、指標細菌を当該毒性質物にさらす前に、−種
或いは数種の毒性処理を施せばよい、ことを開示してい
る。凍結乾燥及び浸透圧ショックは、そのような有効な
ストレス処理であることが確かめられた。

指標細菌の代謝活性は種々の単純な方法により測定或い
はモニターすることができ、活性のもっとも注目すべき
変動は、生育培地のｐＨ，或いはテトラゾリウム塩の減
少（Ｓｘｃｋｓの米国特許第２、９６７、１３２号）で
あって、後者は細菌細胞中のデヒドロゲナーゼ（脱水素
酵素）の指標となりつる。

最近、色素基体を有する新規合成酵素の活性が代謝活性
の尺度として採用され（Ｑｏｉｌｌｕｄｅｔほか、）’
＋ｏｃ、　　Ｈａｌｌ、　　入ｅａｄ、　Ｓｃｉ、、　
　υＳＡ、　　７９　　号、　　５９７１−５９７５ペ
ージ）、高い理論的感受性及び速度を示す。

Ｒｅｉ！ｌｈａ＋Ｎ　　（米国特許４．７７４．１７３
号）は、種々の毒性物質及び抗菌物質に対する高い感受
性を示す代謝活性尺度として、新規合成酵素（β−ガラ
クトシダーゼ）を採用している。

本発明においてはグラム陽性の指標細菌株が、ペニシリ
ンその他のβ−ラクタム抗菌薬剤に対する高い感受性の
ため、採用することができる。テトラゾリウム色素（特
にＭＴＴ）の減少、或いはｐＨの変化が、代謝活性の尺
度として選ばれる。

短時間アッセイにおけるペニシリンに対する必要な感受
性は、指標細菌を、抗菌物質と共に培養した後浸透圧シ
ョックにさらすことにより、得られる。細菌壁合成が抗
菌物質により抑制された細胞は、より脆弱であり、浸透
圧ショックにより膜損傷或いは完全な溶菌を生じやすい
。このような細胞の代謝は終了する一方、細胞壁合成が
抗菌物質にさらされることより混乱しない細菌では、浸
透圧ショックにより影響を受けない。浸透圧ショックを
受けることにより、ペニシリンその他β−ラクタム抗菌
物質の毒性効果は、細菌細胞の相互作用の初期段階にあ
られれる。

本発明の実施例を以下に示す： 例１ 抗菌性アッセイのためのストレブトコッヵステルモフィ
リス（Ｓｊｒｅｐｔｏｃｏｃｏｓ　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉ
ｌｕｓ）の培養 （ａ）　５ｊｔｅｐｊｏｃｏｃｃｕｓ　ｌｈｅｔｍｏｐ
ｈｉｌｕｓ　（ＡＴＣＣ１４４８５）の懸濁液を、１０
％のデイフコ（Ｄｉｆｃｏ）スキムミルク、０．５％の
デイフコイーストエキス、蒸溜水に溶かした２％の寒天
、を含む固形培地で画線培養した。明瞭なコロニーが、
４２℃で一晩培養した後視れた。

（ｂ）１０％のデイフコスキムミルク及び０．５％のデ
イフコイーストエキスを水に溶かした液体培地（培地Ａ
）　１０ｍ１中に、コロニーを懸濁した。懸濁液を４２
℃で一晩、１２ｍ１容のプラスチック製、使い捨て遠心
試験管中で培養した。

（ｃ）生成した懸濁液を培地Ａ中に１：１０に希釈し、
４２℃で、培地のｐＨが５．０になるまで培養した（約
２時間）。生成する生育細胞濃度は１−２Ｘ１０”／ｍ
ｌであった。

（ｄ）細胞濃度は、ｐＨが６．２になるまでＩＮのＮ　
ａ　ＯＨ，溶液を添加し、ｐＨ値が再度５．０に低下す
るまで培養を継続することにより、増加させることがで
きた。このサイクルは、培養体が１−２Ｘ１０９／細胞
数／　ｍｌで安定するまで、５〜７回繰り返すことがで
きた。

（ｅ）細胞濃度をｌＸｌ０’細胞数／ｍｌに調整し、６
〜１０℃で２４時間まで、抗菌アッセイに使用するよう
保蔵した。これと別に、懸濁液２ｍ１分をそれぞれ１２
ｍ１ペニシリンびん（２４Ｘ４５ｍｍ）に入れ、液体窒
素中で凍結し、閉止可能でプログラム化できる凍結乾燥
用冷凍棚で、４８〜７２時間のプログラムを設定して乾
燥させた。

例２ リンの検出 （ａ）例１に記載されているように調製された乾燥１１
ｔｅｐ、　　ｔｈｅ＋ｍｏｐｈｉｌｕｓ細胞のそれぞれ
のびんに、２ｍｌの蒸溜水を加えた。Ｉ×１０８細胞／
　ｍｌの新たに培養した５ｔｒｅｐ、　　＋ｈｕｍｏｐ
ｈｉｌｕを、何等の処理を加えることなく使用した。

（ｂ）　ミルク標本中の抗菌活性の検出のための反応混
合物を、０．４ｍｌ細胞懸濁液（新しい液又は再加水さ
れた凍結乾燥物）、１．６ｍｌのミルク標本、０、ｌ１
５ｍ１の１０％デイフコイーストエキス及び０．０５ｍ
１の１０％デイフコトリプトース、を用いて作った。

抗菌アッセイ法を採用する場合、抗菌薬剤を含まないこ
とが知られている少なくとも一種の比較ミルク標本をつ
くるようにした。

（ｃ）比較ミルク標本及び未知ミルク標本を２５分間、
４２℃で培養した。

（ｄ）培養が完了すると、全反応混合物の０．４ｍ１分
を、水に溶かした１、６ｍｌの０．５％グルコース、Ｑ
、１７５■／ｍｌのＭＴＴ　（３−［４，５−ジノタル
チアゾール−２−イル］　−２，５ジフエニルテトラゾ
リウムプロミド）と混合し、５分間培養した。

ＭＴＴ還元により生ずる色の量を、例３に記載した方法
の一つにより測定することができる。

７ｍ１Ｕ／ｍｌのペニシリンＧを含むミルク標本を試験
し、ブタノール抽出法（例３に記載）を用いて色の量を
測定することにより、得られた結果を第１表に示す。

第１表 新しいＳｔ＋ｔｐ、　　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ細胞
及び凍結乾燥細胞を用いたミルク中のペニシリンＧの検
出新しい細胞　０．１９５　　　　０．０８８　　　　
５５乾燥細胞０．１５６　　　０．０６２　　　６０乾
燥細菌は、再加水後デヒドロゲナーゼ（脱水素酵素）活
性の大部分を回復し、新しく生育する細胞よりも７ｍ１
Ｕ／ｍｌペニシリンＧに対する感受性が僅かに高くなる
ことが観察される。

例３ ミルク中に生成する還元ＭＴＴ色素測定方法ミルク抗菌
物質アッセイにおける反応混合物は、ミルクの存在によ
り不透明である。更に、還元フォルマザン色素は水溶液
から分離沈澱しがちであって、従って、色の光度測定に
干渉する。この還元フォルマザン色素の肉眼による或い
は機械的な測定のための種々の方法が開発された。

（ａ）直接肉眼分析 ブルー−レッド還元ＭＴＴ色素は、反応混合物の直接的
な観察により視認できる。抗菌処理標本は、比較例標本
よりも色素が少い。

（ｂ）ろ過による色素の収集 反応混合物全体をガラスフィルター紙サークル（例えば
Ｗｈａｊｍａｎ　ＧＦ／Ｆ、　　２．５ａｎ直径）を通
してろ過した。色は目でも評価でき、あるいは反射型濃
度計、例えばＧｔｅｔａｇ、　０１８２型（ＧｒｅｔＢ
社、スイス国ＣＨ−８１０５レーゲンスドルフ）を用い
て測定できる。

（ｃ）溶剤／洗剤処理による反応混合物の部分的清澄化 ２ｍｌの反応混合物に、５０％の１−ブタノールと、１
０％のＳＤＳを水に溶かした４ｍｌを添加した。渦巻き
ミキサーで３０秒強く撹拌した後、懸濁液は部分的に清
澄化した。色濃度を、５７Ｑｎｍに調整した分光光度計
で測定した。

（ｄ）ＭＴＴ色素のブタノール抽出 反応混合物の０．７５ｍ１を２ｍｌのマイクロ遠心試験
管に移した。０．７５ｍ１の１−ブタノールを添加した
。

渦巻きミキサーで１５秒間撹拌した。この懸濁液を１０
、０００ｘｇで２．５分間遠心分離した。０８６ｍ１の
上部の、明るい着色相を、０．６ｍｌの１−ブタノール
を入れた透明なマイクロ遠心試験管に移した。渦巻きミ
キサーで１５秒間撹拌した。この懸濁液を１０、０００
ｘｇで２．５分間遠心分離した。１ｍｌの上部の、明る
い着色相を澄明なキュベツトに移した。色濃度を５７１
１ｍｍで測定した。

この方法は再現性が高くかつきわめて感受性が高い。

（ｅ）ＭＴＴ色素のフルオロカーボン抽出２ｍｌの反応
混合物に０．５ｍｌのフルオロカーボン１１３（ＩＣＩ
社のＡｒｋｌｏｎ−Ｐ）を添加した。渦巻きミキサーで
１５秒間強力に撹拌した。ＭＴＴ色素は底部相に集中し
、従って、色素の感度及び清澄度は増大する。色素は視
認できる。色素の濃厚化は、フルオロカーボン標本混合
物を１０秒間マイクロ遠心分離機（例えばエッペンドル
フマイクロ遠心機）で遠心することにより可能である。

ＭＴＴ色素は水性相とフルオロカーボン相の境界で濃厚
化する。

例４ ＭＴＴ色素色素中、低浸透培地が重要であることの証明 ３．５或いは７ｍｌ［Ｉ／ｍｌのペニシリンＧを含有す
るミルク標本を、例２に記載するような凍結乾燥５ｊｒ
ｅｐＬ　　ｔｈｅ＋ａｕ＋ｐｈｉｌｕｓ菌を用いて試験
した。夫々の抗菌濃度の色素現象を、低浸透性である例
２の工程（ｄ）記載のＭＴＴ溶液、或いは同じ溶液であ
るがこれにスフローゼを添加して０．３Ｍの最終濃度の
等浸透圧液、を用いて実施した。

生じたＭＴＴ色素の量は、反応混合物（例３（ｄ））か
ら得たブタノールエキスの光学濃度を測定することによ
り決定した。

結果を第２表に示す。

第２表 Ｍ　Ｔ　Ｔ溶液　ペニシリン濃度　光学濃度　抑制率ｆ
ｍｌＵ／ｍｌ）　　　　（５７０ｎｍ）　　　（Ｘ）等
浸透圧　　　　　Ｑ　　　　　　Ｏ，＋１７　　　０４
　　　　　０．１１３　　　３ ７　　　　　０．０７７　　３４ 低浸透圧　　　　　０　　　　　０．１＋８　　　０４
　　　　　０．０５２　　５６ ７　　　　　０．０３１　　７４ 上記の結果は、おそらく「技術的背景」の欄に記載した
メカニズムにより、低浸透圧ＭＴＴ色素溶液がペニシリ
ンの抑制効果を増大させることを示している。

例５ 凍結乾燥細菌を用いたミルクペニシリンアッセイ法の感
受性 １〜１４ｍ１ｌｌ／ｍｌのペニシリンＧを含むミルク標
本を、凍結乾燥細菌について例２に記載のように試験し
た。生じた色素濃度を例３（ｄ）に記載のように測定し
、第３表に要約した。

第３表 ペニシリン濃度　　　光学濃度　　　抑制率（ｍｌＵ／
ｍｌ）　　　　　　（５７０ｎｍ）　　　　　（％）０
　　　　　　０．１１８　　　　　０１　　　　　　０
、０９８　　　　　１？２　　　　　　０、０８Ｇ　　
　　　　３２４　　　　　　０、０５２　　　　　５６
７　　　　　　０、０３１　　　　　　？４１４　　　
　　　０、０２４　　　　　８０本発明によれば、ミル
ク中のペニシリンＧ濃度が１ｍ１Ｕ／ｍｌの低さであっ
ても検出できる。

例６ ペニシリンアッセイの感受性に及ぼす培養期間の効果 凍結乾燥５ｔｒｅｐ、　ｔｈｅｔｍｏｐｈｉｌｕｓにつ
いて、例２に記載したように、７ｍ１Ｕ／ｍｌのペニシ
リンＧを含有するミルク標本を試験し、ｐＨ調整により
高濃度に培養した。この指標細菌を含むミルク標本の培
養時間を１０分乃至２５分の間とした。ＭＴＴ溶液によ
る培養は５分乃至１０分の間とした。得られたＭＴＴ色
素の量を、反応混合物（例３ｄ）よりつくられたブタノ
ールエキスの光学濃度を測定することにより決定した。

種々の組合せによる得られた抑制値を第４表に要約する
。

第４表 ペニシリンＧの抑制効果に及ぼすアッセイ時間の効果 第一培養時間　ＭＴＴＩ：！！培養　全アッセイ　抑制
率（分）　　時間（分）　時間（分）　　　（％）１０
　　　　　　５　　　　　１５　　　　７１５　　　　
　　５　　　　　２０　　　　２１２０　　　　　　５
　　　　　２５　　　　　？？２５　　　　　　５　　
　　　３０　　　　６２１（１１０２０４２ １５１Ｇ　　　　、２５　　　　４２ ２０　　　　　　１０　　　　　３０　　　　５３２５
　　　　　　１０　　　　　３５　　　　５？第４表の
データから得られる結論は、７ｍ１Ｕ／ｍｌのペニシリ
ンＧの検出のため、標本細菌をミルク標本に１０分間さ
らし更に１０分間色素現像することにより、全アッセイ
時間が２０分間に短縮できることである。得られる抑制
率４０％は、７ｍＵｌ／ｍｌあるいはこれ以上のペニシ
リンの再現可能な検出のためには十分に高い値である。

例７ 本の色と比べる。比較例の色よりも色濃度が低い場合、
標本中の抗菌活性の存在を示す。

第５表は、抗菌物質を含まないミルク標本に添加される
種々抗菌薬剤の肉眼アッセイの感受性、を要約したもの
である。

第５表 （ａ）　　２．５％トリプトース及び・２．５％イース
トエキスを含む溶液２ｍｌを乾燥５ｔｅｅｐ、　　ｊｈ
ｅｔｍｏｐｈｉｌｕ＄細胞のびんに加え、培養して高細
胞濃度とする（例１．ｄ）。使用するまで冷凍保存する
。

（ｂ）１ｍｌのミルク標本又は比較標本のそれぞれに、
０．０５３グラムのグルコース及び上記（ａ）で得られ
る再加水細菌懸濁液０，１ｍｌを添加する。

これを混合し、４２℃で２５分間培養する。

（ｃ）水に溶かした０、５％グルコース及び０．１７５
■／ｍ１ＭＴＴを含む色素混合物２ｍｌを、標本及び比
較標本それぞれに添加する。混合し、５分間４２℃で培
養する。

（ｄ）夫々の標本の色を肉眼で検査し、比較標ペニシリ
ンＧ　　　　　　　　３．５ｍ１Ｕ／　ｍｌアンピシリ
ン　　　　　　　　２ｎｇ／ｍｌクロキサシリン　　　
　　　　２ｎｇ／ｍｌクロルアンフエニコル　　　２．
５ｖｇ／ｍｌテトラサイクリン　　　　　　０．２ｕｇ
／ｍｌオキシテトラサイクリン　　０．４ｕｇ／ｍｌポ
リミキシン　　　　　　　　ｌＯｕｇ／ｍｌスルファジ
アジン’　　　　　　　２０ｕｇ／ｍｌ“肉眼で検出で
きる急減少をもたらす最低濃度５ミルク標本に添加した
ｌＧｕｇ／ｍｌ）リメトプリムの存在下に行った試験。

阿（８） Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌ
ｕｓによるミルク中（ａ）　Ｂ、　　５ｔｅａ＋ｏｔｈ
ｅ＋ｍｏｐｈｉｌｕｓ　（ＡＴＣＣ１０１４９）を、水
に溶かした１０％デイフコ（Ｄｉｆｃｏ）スキムミルク
及び０．５％デイフコイーストエキスからなる液体培地
に接種する。５５℃で１８時間、定常的に振とうしつつ
培養する。

（ｂ）−晩かけた培養物を新しい液体培地に１：２０に
希釈し、５５°Ｃで２時間、振とうをつづける（ｃ）０
．８Ｍサクローズを加えた液体培地に１：１０に希釈し
、５５℃で２．５時間振とうをつづける（感受性のため
スフローズの重要性は、例８で示されている）。直ちに
使用するか或いは継続する状態になるまで氷の上に保存
する。

（ｄ）ミルク標本を含む夫々のペニシリンを、上記（ｃ
）で得られたＢ、　　ｓｊｅａｒｏｊ４ｅｒｍｏｐｈｉ
ｌｕｓ懸濁液の等量と共に混合する。３０分間５５℃で
振とうする。

（ｅ）例２（ｄ）に記載したようなＭＴＴ溶液を加え、
１０分間５５℃で振とうをつづける。

（ｆ）例３（ｂ）で記載したようにＭＴＴ色素の量を測
定する。

この実験の結果は第６表に示される。

第６表 ペニシリンＧ濃度 （ｍｌＵ／ｍｌ） ６ ２ 光学濃度 （５７０ｎｍ） Ｑ、３８０ ０、２５［１ ０，１５５ 抑制率 （％） ４ ９ 例９ 対数的なり、　　５ｊｅａｔｏ＋ｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕ
ｓ、（ＡＴＣＣ１０１４９）細胞の増大は、０．８Ｍス
クロースを含む或いは含まないデイフコトリプシンしょ
う油肉汁（旧１ｃｏ　ｂ７ｐｊｉｃ　５ＩＩＩＦ　ｂｏ
ｏｔｈｊ中で停止し、５５℃で１時間振とうした。この
細菌懸濁液の部分標本を、４０ｍ１Ｕ／ｍｌのペニシリ
ンＧもしくはｌｏｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含む等
量のデイフコトリプシンしょう油肉汁と混合した。比較
反応混合物を、細胞懸濁液とデイフコトリプシンしょう
油肉汁を用いてつくった。３０分間５５℃で培養した後
、すべての反応混合物を、水に溶かした１７５ｍｇ／ｍ
１ＭＴＴＳＯ，５％グルコース中に、１：５に希釈し、
培養を５分間継続した。得られた色素懸濁液を、その０
．５ｍ１部分を０．０４Ｎ塩酸を含む０．７ｍｌのイソ
アミルアルコールで強く混合することにより、清澄化し
た。清澄化した混合物の光学濃度を５７０ｎｍで測定し
、比較標本に対する色形成の抑制率を計算し、第７表に
示した。

第７表 高浸透圧培地で予備培養することにより、ペニシリンの
毒性効果に対する細菌感受性が増大することがわかった
。細胞壁合成に関与しない抗菌物質であるテトラサイク
リンに対しては、予備培養の影響はなかった。

最後に本発明は特定の手段及び実施例と関連して説明し
たけれども、本発明は記載した態様にのみ限定されるも
のではなく、特許請求の範囲に記載のすべての均等物に
及ぶことが理解されるべきである。

等張圧 ０ ５

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、標本中の抗菌化合物の存在及び／もしくは量をアッ
   セイもしくは検出する方法であって： （ａ）前記標本に、前記抗菌化合物に対し高い感受性を
   示す生育菌を添加混合して混合物をつくり； （ｂ）前記混合物の最適生育条件下で培養し； （ｃ）前記細菌中に存在する少くとも一種の代謝マーカ
   ーを検出するように選ばれた信号発生試薬の水溶液によ
   り、前記混合物を希釈し； （ｄ）前記信号が検出されるために十分な時間、前記混
   合物（ｃ）を培養し； （ｅ）前記混合物（ｃ）の前記信号を測定もしくは検出
   し； （ｆ）前記抗菌化合物を含まず前記（ａ）〜（ｅ）の処
   理を前記標本と同時に施された比較標本と、前記信号を
   比較する段階；を含む方法。 ２、前記抗菌化合物が毒性もしくは抗菌性化合物である
   請求項１記載の方法。 ３、前記細菌がグラム陽性菌である請求項１記載の方法
   。 ４、前記細菌が、桿菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属からなる
   群より選ばれる請求項１記載の方法。 ５、前記細菌が、Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｔｅａｒｏｔｈｅ
   ｒｍｏｐｈｉｌｕｓ種からなる群より選ばれる請求項１
   記載の方法。 ６、前記細菌が、連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕ
   ｓ）属からなる群より選ばれる請求項１記載の方法。 ７、前記細菌が、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｔｈｅｒ
   ｍｏｐｈｉｌｕｓ種からなる群より選ばれる請求項１記
   載の方法。 ８、前記高い感受性は、前記細菌にストレスを与えるこ
   とにより得られる請求項１記載の方法。 ９、前記ストレスは、前記細菌の浸透圧を高くすること
   により得られる請求項８記載方法。 １０、請求ストレスは、十分な量のスクロースを添加す
   ることにより得られる請求項９記載の方法。 １１、前記高い感受性は、前記細菌を凍結乾燥すること
   によって生ずる請求項１記載の方法。 １２、前記最適生育条件は、栄養物を添加することを含
   む請求項１記載の方法。 １３、前記栄養物がイーストエキス及び／もしくはトリ
   プトースである請求項１２記載の方法。 １４、前記信号発生試薬が発色化合物である請求項１記
   載の方法。 １５、前記発色化合物がテトラゾリウム塩である請求項
   １４記載の方法。 １６、前記信号発生試薬がｐＨ指示薬である請求項１記
   載の方法。 １７、グルコースが添加される請求項１５もしくは１６
   記載の方法。 １８、段階（ｃ）において、前記混合物が更に水により
   希釈され、また前記段階（ｅ）における検出は、アデノ
   シン三りん酸塩の定量により行われる請求項１記載の方
   法。 １９、前記検出を濃度計或いは光度計により行われる請
   求項１記載の方法。 ２０、前記検出を、溶剤抽出により行う請求項１記載の
   方法。 ２１、前記溶剤がブタノール或いはフルオロカーボンで
   ある請求項２０記載の方法。 ２２、標本中の抗菌化合物の存在もしくは量の検出に使
   用する指標細菌の調整方法であって： （ａ）前記標本がもっとも有利な成育培地となる細菌を
   選択し； （ｂ）前記指標細菌に豊富な代謝マーカーを選択し； （ｃ）前記抗菌化合物に対する感受性を高めるためのス
   トレスを、前記指標細菌に加える；ことを含む方法。 ２３、ミルク中の抗菌物質の存在及び／もくしは量のア
   ッセイ或いは検出方法であって：（ａ）前記ミルクをＳ
   ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ菌
   と混合して混合物を生成し； （ｂ）最終濃度が０．１乃至０．４％となるようにイー
   ストエキス及びトリプトースを添加することによる最適
   生育条件下で、前記混合物を培養し； （ｃ）前記混合物（ｂ）を、０．５％グルコースとテト
   ラゾリウム塩との水溶液で希釈し； （ｄ）前記混合物（ｃ）を十分な期間培養し；そして、 （ｅ）生成する色を検出し、前記抗菌物質を含まず前記
   （ａ）−（ｅ）の処理をミルクと同時に施された比較標
   本の色と比較する、ことを含む方法。 ２４、標本中の抗菌化合物の存在及び／もしくは量をア
   ッセイ又は検出するために使用するキットであって： （ａ）生育菌； （ｂ）前記抗菌化合物に対する前記細菌の感受性を高め
   る試薬； （ｃ）前記細菌の生育促進培地； （ｄ）信号発生試薬；を含むキット。 ２５、前記抗菌化合物を含まない比較標本を含む請求項
   ２４記載のキット。 ２６、抗菌化合物に対する高い感受性を有する生育菌と
   、生長促進及び信号発生試薬とを含む混合物。 ２７、抗菌化合物の存在をアッセイするために使用する
   標本と比較標本とを含む請求項２６記載の混合物。