JPH0613537B2 - グリセリルリン酸エステル化合物誘導体の分離精製方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は合成リン脂質の原料として、またはそれ自体が
生理活性および薬理作用を持つものとして非常に有用な
グリセリルリン酸エステル化合物誘導体の分離精製方法
に関するものである。

〔従来の技術〕

グリセリルリン酸エステル化合物は、ホスファチジルコ
リン（ＰＣ）等のリン脂質の脱アシル化物であり、任意
のアシル基を有する合成リン脂質を合成するための原料
として有用である。

従来このようなグリセリルリン酸エステル化合物として
は、ＰＣの脱アシル化物であるグリセリルホスファチジ
ルコリン（ＧＰＣ）についてのみ、リン脂質からＰＣを
分離精製した上で脱アシル化し、ＧＰＣを得ている。
〔E.Bacr and M.Kates,J.Am.Chem.Soc.70,1394-(194
8)〕。

また分離精製を行わないりん脂質混合物を脱アシル化し
たグリセリルリン酸エステル化合物の分離法としては、
リン脂質の分析法の一つとしてリン脂質の脱アシル化物
をペーパークロマトグラフィーまたはイオン交換クロマ
トグラフィー〔J.N.Hawthorne and G.Ｈｂｓｃｈｅ
ｒ，Biochem.J.71,195-(1959)〕により分画して分析す
る方法が知られている。

さらにＧＰＣを精製する方法として、カドミウム塩等の
重金属塩を不溶性の錯塩を形成させて分離精製する方法
が知られている。

〔発明が解決しようとする問題点〕

しかしながら、これらのうちリン脂質を分離精製した後
脱アシル化する方法は、リン脂質の分離精製が困難であ
る上、分離されたリン脂質ごとに脱アシル化する必要が
あり、工程が複雑になる。

またペーパークロマトグラフィーによる方法は分析程度
の微量の分離には用い得るが、グリセリルリン酸エステ
ル化合物の分取を目的とする大量の処理には不適当で、
スケールアップも困難であるという欠点がある。

イオン交換クロマトグラフィーにより分画する方法は大
量処理も可能ではあるが、イオン交換担体から溶離する
ために無機塩溶液を用いなけらばならない。無機塩の混
入は分離したグリセリルリン酸エステル化合物の使用目
的によっては不適当である上に、共に水溶性の低分子化
合物であることからその除去は著しく困難であるという
欠点がある。

カドミウムをはじめとする重金属と不溶性の錯塩を形成
させて精製する方法は、大量の処理に適しているもの
の、極微量に残留する重金属の完全は除去が不可能であ
るという欠点がある。

リン脂質の分離精製に用いられている液体クロマトグラ
フィーは、グリセリルリン酸エステル化合物が水溶性で
あって有機溶媒に不溶であるため用いることができず、
このため任意のグリセリルリン酸エステル化合物を効率
よく大量に得ることができないという問題点があった。

本発明は上記問題点を解決するためのもので、任意のグ
リセリルリン酸エステル化合物を製造できるとともに、
それ自体生理活性および薬理作用を有するものとして有
用なグリセリルリン酸エステル化合物誘導体を効率よ
く、大量に得ることができるグリセリルリン酸エステル
化合物誘導体の分離精製方法を提案することを目的とし
ている。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明は、下記式(I)の構造を含むグリセリルリン酸エ
ステル化合物誘導体を、有機溶媒により、ケイ酸を分離
剤として分離精製することを特徴とするグリセリルリン
酸エステル化合物誘導体の分離精製方法である。

（式中、Ｘは含窒素アルコール残基またはポリオール残
基、Ｙは容易に着脱可能な導入基、ｎは12以下の自然数
を示す。） 本発明では、リン脂質の脱アシル化物であるグリセリル
リン酸エステル化合物の極性基に適当な導入基（置換
基）を導入して分子全体の極性を低下させることによ
り、有機溶媒への溶解性を付与し、これによりケイ酸を
分離剤として液体クロマトグラフィーによる分離精製を
可能とするものである。

Ｉ式のグリセリルリン酸エステル化合物誘導体はリン脂
質の脱アシル化物であるグリセリルリン酸エステル化合
物に導入基Ｙを導入した構造になっているが、グリセリ
ルリン酸エステル化合物に直接導入基Ｙを導入すると、
他の水酸基にも導入されやすいため直接導入することは
できない。このためＩ式のグリセリルリン酸エステル化
合物誘導体は、直接合成するか、またはリン脂質に導入
基Ｙを導入して対応するグリセリルリン酸エステル骨格
を有するリン脂質誘導体とした後、メチルエステル化分
解あるいはケン化分解等により脱アシル化することによ
り得られる。本発明において分離精製に用いるＩ式の誘
導体は単一の誘導体を含むものであってもよいが、Ｘの
異なる数種の混合物であってもよい。

Ｉ式において、Ｘで示される含窒素アルコールまたはポ
リオール残基はＹと結合可能なものであり、例えばセリ
ン基、エタノールアミン基、Ｎ−メチルエタノールアミ
ン基、N,N′−ジメチルエタノールアミン基、グリセロ
ール基、アミノアシルグリセロール基、グリセリン酸
基、グリセロリン酸ホスファチジル基、イノシトール
基、イノシトールリン酸基、イノシトールジリン酸基、
単糖、二糖、またはオリゴ糖などがある。

これらの残基を有するグリセリルリン酸エステル化合物
誘導体の原料として用い得るリン脂質としては、天然か
ら抽出したあるいは合成したホスファチジルセリン、ホ
スファチジルエタノールアミン、ホスファチジルN-メチ
ルエタノールアミン、ホスファチジルN,N′−ジメチル
エタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、ホス
ファチジルアミノアシルグリセロール、ホスファチジル
グリセロリン酸、カルジオリピン、ホスファチジルイノ
シトール、ホスファチジルイノシトールジリン酸、ホス
ファチジルイノシトールトリリン酸、糖リン脂質等があ
げられる。これらのリン脂質は天然リン脂質から分離精
製したものを原料としてもよいが、混合状態の天然リン
脂質を原料としてもよい。

Ｉ式において、Ｙで示される容易に着脱できる導入基と
しては、直鎖状、分岐鎖状または環状のアルキル基、直
鎖状、分岐鎖状または環状のアルキロイル基、直鎖状、
分岐鎖状または環状のアルケニル基、直鎖状、分岐鎖状
または環状のアルケロイル基およびアリール基から選ば
れる基を用いることができる。このような基の例として
は、Ｘと結合してアルキルエーテル、アリルエーテル、
ベンジルエーテル、トリアリールメチルエーテル、トリ
アルキルシリルエーテル、テトラヒドロピラニルエーテ
ル等のエーテル類；酢酸エステル、蟻酸エステル、トリ
フルオロ酢酸エステル、安息香酸エステル等のエステル
類；メチレンアセタール、エチリデンアセタール、ベン
ジリデンアセタール、イソプロピリデンアセタール等の
アセタール類などを生成する基をあげることができ、こ
れらは単一のものを用いるのが好ましい。これらの基の
選択については、導入先であるグリセリルリン酸エステ
ル化合物の極性部位の官能基の反応性などにより決定す
ることができ、その反応方法および反応条件等は、この
種の反応に一般に採用されている方法および条件を採用
することができる。

天然リン脂質にＹで示される導入基を導入した後、脱ア
シル化することにより、Ｉ式が誘導体が得られる。脱ア
シル化の方法はリン脂質の脱アシル化に採用されている
方法を採用することができる。合成によりＩ式の誘導体
を得るには、例えばＸ、Ｙの反応物とグリセロリン酸を
反応させることにより、単一のＩ式の誘導体を得ること
ができる。

こうして得られるＩ式の誘導体は導入基Ｙの導入によ
り、全体の極性が低下して有機溶媒に可溶となり、液体
クロマトグラフィーによる分離が可能となる。この場合
Ｙとして単一の基を導入すると、リン脂質の雑多なアシ
ル基は除去されているため、Ｘの違いによりカラムクロ
マトグラフィーによる分離精製が可能となる。またＸが
単一の基である場合には、バッチ方式で水溶性成分を除
去することにより、Ｉ式の誘導体を分離精製することが
できる。

分離剤として使用するケイ酸としては、破砕形のもので
もゲル状のもの（シリカゲル）でもよく、粒径10〜800
μｍ、細孔径0.25〜10μｍの範囲のものが好ましく、市
販品を用いることもでき、例えばClarkson Chemicals C
o.製Unisil、和光純薬工業（株）製ワコーゲル、Merck
社製Silica Gel 60、（株）ヤトロン製イアトロビーズ
（いずれも商標）等が分離性能等の面で好適である。高
速液体クロマトグラフィー用として市販されているケイ
酸は、分離性能では一段優れてはいるが、コスト的には
高くなる。その他の製品でも、使用前に粒径を揃える等
の精製を十分に行えば、使用可能である。

分離の方法としては、上述のケイ酸を使用する公知のカ
ラムクロマトグラフィーまたはバッチ式に準じた方式を
採用することができる。すなわち、グリセリルリン酸エ
ステル化合物誘導体が吸着し得る低極性溶媒でケイ酸を
前処理した後、同様の低極性溶媒に溶かしたグリセリル
リン酸エステル化合物誘導体を含む試料を加えてケイ酸
に吸着させ、不用物等を洗い流した後、高極性の溶媒を
用いてグリセリルリン酸エステル化合物誘導体を溶離さ
せる。吸着剤から不用物を洗い流す洗浄効果を高めるた
めには、化合物が溶離しない程度に極性の高い溶媒を用
いることが望ましい。

このような溶媒系としては、例えば以下のような組合せ
を示すことができる。高極性溶媒としては、炭素数１〜
10の直鎖状、分岐鎖状もしくは環状の脂肪族アルコール
またアルデヒド等および水あるいはそれらの混合物など
があり、これらは分子内にエーテル結合、エステル結合
または二重結合などを有していてもよく、またアルキル
基、シアン基、アミン基等の官能基を有していてもよ
く、例としてメタノール、３％含水イソプロパノール、
アセトニトリル、酪酸プロピルおよびこれらのうち２種
以上の混合系などがあげられる。低極性溶媒としては、
炭素数１〜10の直鎖状、分岐鎖状もしくは環状の炭化水
素化合物または炭素数１〜２のハロゲン化炭化水素化合
物、あるいはこれらと上記高極性溶媒群から選ばれる１
種以上との混合物などがあり、これらは分子内に二重結
合またはエーテル結合などを有していてもよく、またア
ルキル基等の官能基を有していてもよく、例として、ｎ
−ヘキサン、イソオクタン、ジエチルエーテル、ジイソ
プロピルエーテル、シクロヘキサン、ベンゼン、キシレ
ン、クロロホルム、四塩化炭素、ジクロロエタン、イソ
オクタン−クロロホルム（３：７）、ｎ−ヘキサン−ベ
ンゼン（４：７）、クロロホルム−メタノール−水（６
５：２５：４）などがあげられる。

このようにして分離精製したグリセリルリン酸エステル
化合物誘導体は、それ自体生理活性および薬理作用を有
しているため、溶媒が適当なものであればそのまま目的
に応じて使用することができる。また溶媒を留去等によ
り容易に除去することにより、精製されたＩ式の誘導体
として得ることもできる。さらにこの誘導体から導体基
を脱離させれば、対応するグリセリルリン酸エステル化
合物を得ることができ、任意のアシル基を導入して合成
リン脂質を合成するための原料として利用することがで
きる。

こうして本発明の方法により、従来事実上不可能であっ
た任意のグリセリルリン酸エステル化合物誘導体の入手
が容易に可能となり、また本発明の分離精製方法を導入
することにより、リン脂質の合成原料となる任意の構造
のグリセリルリン酸エステル化合物の供給の途が開かれ
る。

〔発明の効果〕

本発明によれば、特定のグリセリルリン酸エステル化合
物誘導体を、ケイ酸により有機溶媒を使用して分離精製
するようにしたため、任意のグリセリルリン酸エステル
化合物製造の原料になるとともに、それ自体が生理活性
および薬理作用を有するグリセリルリン酸エステル化合
物誘導体を、簡便かつ容易に、効率よく高純度かつ高収
率で、大量に得ることができ、経済性に優れるなどの効
果がある。

〔実施例〕

以下、実施例に基づいて本発明を具体的に説明する。実
施例中、化合物の同定は、主として後述条件でのＴＬＣ
分析により標準物質と比較して行ったが、必要に応じて
質量分析を行った。

実施例１ ホスファチジルグリセロールのグリセロール残基にベン
ジル基を導入した後、クロロホルム溶液中で１M NaOHメ
タノール溶液を用いてアルカリ加水分解し、脱アシル化
した。

得られたジベンゾイルグリセリルホスファチジルグリセ
ロール2.38ミリモルを含む反応混液にメタノールと水を
加え、Folchらの方法〔J.Folch,et.al.,J.Biol.Chem.22
6,497-(1957)〕で水洗した。クロロホルム層と取り、Na
₂SO₄で脱水した後、減圧乾固したものをｎ−ヘキサン約
５mlに溶かした。

ケイ酸としてClarkson Chemical Co.製Unisilを充填
し、ｎ−ヘキサンで前処理したカラム（径４cm×56cm）
に上述の試料を加え、ｎ−ヘキサン−エタノール（１：
１）1500mlでカラムを洗浄し、さらにカラムに95%エタ
ノールを流し、溶出して来た初めの200mlを集めた。

ｎ−ヘキサン−エタノール（１：１）溶出画分およびエ
タノール溶出分を、ＴＬＣで分析した。すなわちMerck
社製NO.5717プレートに20〜100μｇの試料を直径３〜５
mmにスポットし、クロロホルム−メタノール−水（６
５：２５：４）で展開した。展開溶媒を風乾後、50%硫
酸をスプレーし、120℃で20分間加熱して発色させた。
その結果、ｎ−ヘキサン−エタノール（１：１）溶出画
分には遊離脂肪酸と未分解のジベンゾイル化ホスファチ
ジルグリセロールが検出され、エタノール溶出画分には
ジベンゾイルグリセリルホスファチジルグリセロールの
みが検出された。

エタノール溶出画分を濃縮し、910mg（2.28ミリモル）
のジベンゾイルグリセリルホスファチジルグリセロール
を得た（回収率95.8％）。

実施例２ ホスファチジルイノシトールのイノシトール残基にニコ
チン酸を導入した後、ｎ−ヘキサンに溶かし、ホスフォ
リパーゼＡ_１およびホスフォリパーゼＡ_２を用いて、ア
シル基を加水分解した。

得られたグリセリルホスファチジルイノシトールニコチ
ン酸エステル0.64ミリモルを含むｎ−ヘキサン層を分取
し、Na₂SO₄で脱水した後、減圧乾固したものを２mlのベ
ンゼンに溶かした。

ケイ酸として和光純薬工業（株）製ワコーゲルC300を充
填し、イソオクタン−ベンゼン（９：１）前処理したカ
ラム（径４cm×48cm）に上記試料を加え、カラムをイソ
オクタン−アセトン（３：２）1200mlで洗浄後、イソオ
クタン−アセトン（２：８）で溶出した。

実施例１と同様にしてＴＬＣで分析したところ、イソオ
クタン−アセトン（３：２）画分には脂肪酸と未分解の
ホスファチジルイノシトールニコチン酸エステルおよび
そのリゾ体た含まれ、イソオクタン−アセトン（２：
８）画分にはグリセリルホスファチジルイノシトールニ
コチン酸エステルのみが検出された。

イソオクタン−アセトン（２：８）画分を濃縮し、グリ
セリルホスファチジルイノシトールニコチン酸エステル
505mg（0.53ミルモル）を得た（回収率83.6％）。

実施例３ グリセロリン酸とセロビオースヘプタアセテートを公知
の方法でリン酸エステル化させ、グリセリルホスファチ
ジルセロビオースヘプタアセテートを合成した。

得られたグリセリルホスファチジルセロビオースヘプタ
アセテート6.33ミリモルを含む反応混液をFolchらの方
法で水洗し、実施例１と同様にしてジイソプロピルエー
テル50mlに溶かした試料を調製した。

ジイソプロピルエーテル−アセトニトリル（８：２）で
緩衝化したMerck製Silica Gel 60 2.3kgに上記試料を加
えバッチ式で処理した。ゲルを同じ溶媒2.5で５回洗
浄した後、ジイソプロピルエーテル−アセトニトリル
（２：８）２．５で３回溶出した。

実施例１と同様にしてＴＬＣ分析したところ、ジイソプ
ロピルエーテル−アセトニトリル（２：８）溶出画分に
は、グリセリルホスファチジルセロビオースヘプタアセ
テートのみが検出された。

ジイソプロピルエーテル−アセトニトリル（２：８）溶
出画分を濃縮し、グリセリルホスファチジルセロビオー
スヘプタアセテート3.89g（4.83ミリモル）を得た（回
収率76.3％）。

実施例４ リン脂質混合物（ホスファチジルコリン48%，ホスファ
チジルエタノールアミン44%，ホスファチジン酸８％）
を公知の方法でエチルビニルエーテルと反応させた。

エチルビニルエーテル化したリン脂質混合物５ｇを実施
例１と同様にしてアルカリ加水分解後水洗し、クロロホ
ルム溶液とした。

クロロホルム緩衝化した（株）ヤトロン製イアトロビー
ズGRS-80100カラム（径2.5cm×50cm）に試料を加え、ク
ロロホルム−メタノール−水（６５：２５：４）500ml
カラムを洗浄後、10％含水メタノールで溶出した。

10％含水メタノール溶出画分を濃縮し、グリセリルホス
ファチジル−N,N′−ジ（２−エトキシエチル）エタノ
ールアミン0.48gを得た。

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】下記式(I)の構造を含むグリセリルリン酸
   エステル化合物誘導体を、有機溶媒により、ケイ酸を分
   離剤として分離精製することを特徴とするグリセリルリ
   ン酸エステル化合物誘導体の分離精製方法。 （式中、Ｘは含窒素アルコール残基またはポリオール残
   基、Ｙは容易に着脱可能な導入基、ｎは12以下の自然数
   を示す。）
2. 【請求項２】Ｘがセリン基、エタノールアミン基、Ｎ−
   メチルエタノールアミン基、N,N′−ジメチルエタノー
   ルアミン基、グリセロール基、アミノアシルグリセロー
   ル基、グリセロリン酸基、グリセロリン酸ホスファチジ
   ル基、イノシトール基、イノシトールリン酸基、イノシ
   トールジリン酸基、単糖、二糖またはオリゴ糖である特
   許請求の範囲第１項記載の分離精製方法。
3. 【請求項３】Ｙが直鎖状、分岐鎖状または環状のアルキ
   ル基、アルキロイル基、アルケニル基、アルケロイル基
   またはアリール基である特許請求の範囲第１項または第
   ２項記載の分離精製方法。
4. 【請求項４】分離剤としてのケイ酸が粒径10〜800μ
   ｍ、細孔径0.25〜10μｍである特許請求の範囲第１項な
   いし第３項のいずれかに記載の分離精製方法。
5. 【請求項５】極性の低い溶媒の存在下にグリセリルリン
   酸エステル化合物誘導体を分離剤に吸着させ、分離剤を
   洗浄後、極性の高い溶媒で目的とするグリセリルリン酸
   エステル化合物誘導体を溶離する特許請求の範囲第１項
   ないし第４項のいずれかに記載の分離精製方法。