JPH0614045B2 - 末端デオキシヌクレオチジル転移酵素の測定法 - Google Patents
末端デオキシヌクレオチジル転移酵素の測定法Info
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- JPH0614045B2 JPH0614045B2 JP58208437A JP20843783A JPH0614045B2 JP H0614045 B2 JPH0614045 B2 JP H0614045B2 JP 58208437 A JP58208437 A JP 58208437A JP 20843783 A JP20843783 A JP 20843783A JP H0614045 B2 JPH0614045 B2 JP H0614045B2
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Description
【発明の詳細な説明】 末端デオキシヌクレオチジル転移酵素(TdT)はデオキシ
ヌクレオチドモノホスフェートをテンプレートの不存在
下にＤＮＡに付加させるＤＮＡポリメラーゼである。Td
Tは造血系の未熟なリンパ球の副集団の通常の構成成分
である。TdTは通常約６５％のチモサイトで発現され、
１〜５％の骨髄細胞において発現されるが、それは未だ
循環リンパ球には実際上存在しない。Bollum,J.Biol.Ch
em.,235:2399(1960)、Coleman,et al,Proc.Natl.Acad.Sc
i.,U.S.A.,７１：４４０４（１９７４）。このようにＴ
ｄＴはある種の未熟リンパ球に対する生化学的なマーカ
ーとみなされる。
ヌクレオチドモノホスフェートをテンプレートの不存在
下にＤＮＡに付加させるＤＮＡポリメラーゼである。Td
Tは造血系の未熟なリンパ球の副集団の通常の構成成分
である。TdTは通常約６５％のチモサイトで発現され、
１〜５％の骨髄細胞において発現されるが、それは未だ
循環リンパ球には実際上存在しない。Bollum,J.Biol.Ch
em.,235:2399(1960)、Coleman,et al,Proc.Natl.Acad.Sc
i.,U.S.A.,７１：４４０４（１９７４）。このようにＴ
ｄＴはある種の未熟リンパ球に対する生化学的なマーカ
ーとみなされる。
上昇したＴｄＴ水準はひどい栄養不良の子供の循環器系
に存在することが報告された。Chandra,etal,Acta.Pedi
atr.Scand.,６８：８４１（１９７９）。これらの個々
のＴｄＴの上昇は未熟な（効力のない）リンパ球の水準
の増大と相関関係があり、ひどい栄養の欠陥が正常のリ
ンパ球の成熟を遅らせていることを示唆している。
に存在することが報告された。Chandra,etal,Acta.Pedi
atr.Scand.,６８：８４１（１９７９）。これらの個々
のＴｄＴの上昇は未熟な（効力のない）リンパ球の水準
の増大と相関関係があり、ひどい栄養の欠陥が正常のリ
ンパ球の成熟を遅らせていることを示唆している。
上昇したＴｄＴ水準はまた、急性リンパ母細胞白血病を
もつ多数の患者の血液細胞および骨髄細胞に存在するこ
とも述べられている。McCaffrey,et al.Proc.Natl.Aca
d.Sci.,U.S.A.,70:521(1973);Coleman,et al.,Cancer R
esearch,36:120、(1976)。この疾患においては、未熟細
胞は未熟リンパ球の形態学的、組織化学的、および表面
膜の諸特性の多くをもっている。Brandt et al,Cancer,
42:817(1978):Cressells,et all,Lancet,2:1307、(197
7):Diekel,et al.,J.Clin.Invest.,６７：７２５（１９
８１）。これとは対照的に、急性骨髄白血病をもつ患者
からの未熟細胞はある検知しうる水準のＴｄＴを含むこ
とが散発的に報告されたにすぎなかった。Blood,52:107
9、(1978);Srivastaya,et al.,Cancer Research,36:3847
(1976)。 ＴｄＴ酵素活性の通常の測定技術は末端デオキシヌクレ
オチジル転移酵素ＤＮＡ重合分析と呼ぶ放射標識下での
重合に依存している。このようなＴｄＴ−重合分析はＴ
ｄＴの酵素活性すなわち放射性標識ヌクレオチドトリホ
スフェートをＤＮＡテンプレートに付加させるＴｄＴの
能力を測定するものであり、このような分析法は単にリ
ンパ球に抽出物中のTdT酵素活性の測定に限定される。
もつ多数の患者の血液細胞および骨髄細胞に存在するこ
とも述べられている。McCaffrey,et al.Proc.Natl.Aca
d.Sci.,U.S.A.,70:521(1973);Coleman,et al.,Cancer R
esearch,36:120、(1976)。この疾患においては、未熟細
胞は未熟リンパ球の形態学的、組織化学的、および表面
膜の諸特性の多くをもっている。Brandt et al,Cancer,
42:817(1978):Cressells,et all,Lancet,2:1307、(197
7):Diekel,et al.,J.Clin.Invest.,６７：７２５（１９
８１）。これとは対照的に、急性骨髄白血病をもつ患者
からの未熟細胞はある検知しうる水準のＴｄＴを含むこ
とが散発的に報告されたにすぎなかった。Blood,52:107
9、(1978);Srivastaya,et al.,Cancer Research,36:3847
(1976)。 ＴｄＴ酵素活性の通常の測定技術は末端デオキシヌクレ
オチジル転移酵素ＤＮＡ重合分析と呼ぶ放射標識下での
重合に依存している。このようなＴｄＴ−重合分析はＴ
ｄＴの酵素活性すなわち放射性標識ヌクレオチドトリホ
スフェートをＤＮＡテンプレートに付加させるＴｄＴの
能力を測定するものであり、このような分析法は単にリ
ンパ球に抽出物中のTdT酵素活性の測定に限定される。
また、ＴｄＴ酵素活性は適切な抽出法を使用しないと実
質的に減少することが報告された。Coleman,Archives o
f Biochemistry and Biophysics,182、525-532(1977)に
は高い塩濃度が完全な酵素抽出のために絶対的に必須で
あることが報告されており、更にColemanらはTris（pH
7.7）、ＥＤＴＡ、１−メルカプトエタノールおよび0.5
％TritonＸ−１００はＴｄＴ酵素活性を保持するには不
満足な抽出物であることを指摘している。
質的に減少することが報告された。Coleman,Archives o
f Biochemistry and Biophysics,182、525-532(1977)に
は高い塩濃度が完全な酵素抽出のために絶対的に必須で
あることが報告されており、更にColemanらはTris（pH
7.7）、ＥＤＴＡ、１−メルカプトエタノールおよび0.5
％TritonＸ−１００はＴｄＴ酵素活性を保持するには不
満足な抽出物であることを指摘している。
本発明の目的はＴｄＴの定量的測定法を提供することに
ある。また本発明の目的はヒトの血液試料ならびに骨髄
抽出物およびリンパ球抽出物からえられた試料の中のＴ
ｄＴを定量的に測定する方法を提供することにある。更
に本発明の目的はＴｄＴの抗原活性を保持する血液試料
からTdTを抽出する方法を提供することにある。
ある。また本発明の目的はヒトの血液試料ならびに骨髄
抽出物およびリンパ球抽出物からえられた試料の中のＴ
ｄＴを定量的に測定する方法を提供することにある。更
に本発明の目的はＴｄＴの抗原活性を保持する血液試料
からTdTを抽出する方法を提供することにある。
本発明は試料中のTdT抗原を定量的に測定するための固
相“サンドイッチ”免疫分析に関する。TdT抗原に特異
的な抗体を被覆した固体支持体をTdT抗原を含むと想定
される試料と共に培養して固体支持体上に抗体−抗原錯
体を生成させる。結合しない物質を除いて固体支持体上
の錯体を抗TdTで処理して固体支持体上に抗体・抗原・
抗TdT錯体を生成させる。抗体・抗原錯体に結合した抗T
dTの量を試料中に存在するTdT抗原の量を示すものとし
て測定する。
相“サンドイッチ”免疫分析に関する。TdT抗原に特異
的な抗体を被覆した固体支持体をTdT抗原を含むと想定
される試料と共に培養して固体支持体上に抗体−抗原錯
体を生成させる。結合しない物質を除いて固体支持体上
の錯体を抗TdTで処理して固体支持体上に抗体・抗原・
抗TdT錯体を生成させる。抗体・抗原錯体に結合した抗T
dTの量を試料中に存在するTdT抗原の量を示すものとし
て測定する。
加えて、分析すべき試料が血液試料であるときは、緩衝
媒質中のノニオン表面活性剤、抗凝固剤、および還元剤
から成る組成物でこの血液試料を処理することによって
TdT抗原を血液試料から抽出する。
媒質中のノニオン表面活性剤、抗凝固剤、および還元剤
から成る組成物でこの血液試料を処理することによって
TdT抗原を血液試料から抽出する。
本発明はTdT蛋白、特にはTdT抗原の濃度を測定するため
の免疫分析技術に関する。本発明の好ましい具体例によ
れば、TdTを含むと想定される血液試料を緩衝媒質中の
ノニオン表面活性剤、抗凝固剤および還元剤から成る抽
出剤組成物の有効量で処理する。このように、ＴｄＴを
含むと考えられる試料を、緩衝媒質中のノニオン表面活
性剤、抗凝固剤および還元剤の三者からなる抽出剤組成
物で処理するとそれぞれ単独で処理する場合よりも優れ
た利点が得られる。ノニオン表面活性剤あるいは抗凝固
剤あるいは還元剤をそれぞれ別個に使用した場合には、
ＴｄＴ自体を測定に有効に利用しうるようになすに問題
がある。
の免疫分析技術に関する。本発明の好ましい具体例によ
れば、TdTを含むと想定される血液試料を緩衝媒質中の
ノニオン表面活性剤、抗凝固剤および還元剤から成る抽
出剤組成物の有効量で処理する。このように、ＴｄＴを
含むと考えられる試料を、緩衝媒質中のノニオン表面活
性剤、抗凝固剤および還元剤の三者からなる抽出剤組成
物で処理するとそれぞれ単独で処理する場合よりも優れ
た利点が得られる。ノニオン表面活性剤あるいは抗凝固
剤あるいは還元剤をそれぞれ別個に使用した場合には、
ＴｄＴ自体を測定に有効に利用しうるようになすに問題
がある。
上記本発明に従った抽出物組成物を用いることによって
はじめて、ＴｄＴを測定可能に抽出できかつそのＴｄＴ
抽出物は貯蔵安定性においても優れている。
はじめて、ＴｄＴを測定可能に抽出できかつそのＴｄＴ
抽出物は貯蔵安定性においても優れている。
またその抽出物組成物を用いて試料を処理することによ
り、免疫学的にＴｄＴを測定することが有効になし得
る。さらに、本発明に従って、ノニオン表面活性剤、抗
凝固剤および還元剤を組み合わせて含む抽出剤組成物で
試料を処理することによりＴｄＴの測定は免疫学的な手
法においても非常に信頼性における結果をもたらす。そ
してＴｄＴを定量的に測定することも可能にしている。
この定量的にＴｄＴを測定するということは、ＴｄＴの
レベルが各種の細胞あるいは、疾患の症状などとも関連
を有することから非常に重要なことである。
り、免疫学的にＴｄＴを測定することが有効になし得
る。さらに、本発明に従って、ノニオン表面活性剤、抗
凝固剤および還元剤を組み合わせて含む抽出剤組成物で
試料を処理することによりＴｄＴの測定は免疫学的な手
法においても非常に信頼性における結果をもたらす。そ
してＴｄＴを定量的に測定することも可能にしている。
この定量的にＴｄＴを測定するということは、ＴｄＴの
レベルが各種の細胞あるいは、疾患の症状などとも関連
を有することから非常に重要なことである。
従来、このような作用効果は記載がない。えられた抽出
混合物を撹拌し、十分な時間遠心分離して試料のTdT抗
原の実質的にすべてを上澄液中に抽出させる。TdT抗原
の回収を増大させるために、試料を凍結してから抽出剤
組成物による試料の処理前に一度解凍するのが好まし
い。この抽出操作後に、ＴｄＴ抗原を含む抽出試料を固
体支持体上に被覆されてありそして試料中のTdTに特異
的なTdT抗体と接触させる。えられた混合物を十分な時
間培養して固体支持体上に抗体−抗原錯体を生成させ
る。固体支持上の抗体・抗原錯体を水洗して結合してい
ない試料を除き、次いで抗TdTで処理する。えられた混
合物を次いで十分な時間培養して固体支持体上に抗体・
抗原・抗TdT錯体を生成させる。固体支持体上の錯体を
水洗して、抗体・抗原錯体に結合した抗TdTの量を試料
中に存在するTdT蛋白質の濃度の尺度として測定する。
混合物を撹拌し、十分な時間遠心分離して試料のTdT抗
原の実質的にすべてを上澄液中に抽出させる。TdT抗原
の回収を増大させるために、試料を凍結してから抽出剤
組成物による試料の処理前に一度解凍するのが好まし
い。この抽出操作後に、ＴｄＴ抗原を含む抽出試料を固
体支持体上に被覆されてありそして試料中のTdTに特異
的なTdT抗体と接触させる。えられた混合物を十分な時
間培養して固体支持体上に抗体−抗原錯体を生成させ
る。固体支持上の抗体・抗原錯体を水洗して結合してい
ない試料を除き、次いで抗TdTで処理する。えられた混
合物を次いで十分な時間培養して固体支持体上に抗体・
抗原・抗TdT錯体を生成させる。固体支持体上の錯体を
水洗して、抗体・抗原錯体に結合した抗TdTの量を試料
中に存在するTdT蛋白質の濃度の尺度として測定する。
“固体支持体”とはTdT抗体に対して吸着性のある不溶
性重合体物質をいう。この種の物質にはポリスチレン、
ポリエチレン・ポリプロピレン・ポリブチレン、ブチル
ゴムおよびその他の合成ゴムなどの炭化水素ポリマーが
包含される。その他の好適な有機ポリマーには弾性ゴ
ム、ポリエステル、ポリアミド、セルローズおよびセル
ローズ誘導体、アクリレート、メタアクリレート、なら
びに塩化ビニルおよびポリ塩化ビニルが包含される。ポ
リスチレンのグラフトコポリマーのようなコポリマーも
有用である。上記の物質の他に、固体支持体の表面はシ
リカゲル、シリカウエフアー、ガラス不溶性蛋白金属を
含むことができ、そして固体支持体はビーズ、チュー
ブ、ストリップ、ディスクなどの形体でありうる。
性重合体物質をいう。この種の物質にはポリスチレン、
ポリエチレン・ポリプロピレン・ポリブチレン、ブチル
ゴムおよびその他の合成ゴムなどの炭化水素ポリマーが
包含される。その他の好適な有機ポリマーには弾性ゴ
ム、ポリエステル、ポリアミド、セルローズおよびセル
ローズ誘導体、アクリレート、メタアクリレート、なら
びに塩化ビニルおよびポリ塩化ビニルが包含される。ポ
リスチレンのグラフトコポリマーのようなコポリマーも
有用である。上記の物質の他に、固体支持体の表面はシ
リカゲル、シリカウエフアー、ガラス不溶性蛋白金属を
含むことができ、そして固体支持体はビーズ、チュー
ブ、ストリップ、ディスクなどの形体でありうる。
ここで使用する“抗TdT”なる用語はTdT抗原に向けられ
たまたはこれに特異的な抗体をいい、ヒト以外の動物種
たとえばウサギ、ヤギ、馬、羊、ギニア豚などに見出さ
れるものである。上述のように、抗体・抗原錯体を抗Td
Tと反応させて固体支持体上に抗体・抗原・抗TdT錯体を
形成させ、この錯体を試料中のTdT抗原の濃度の層度と
して測定する。酵素のような標識または螢光染料のよう
な螢光標識で抗TdTを直接に標識して結合量を測定する
ことができ、または更なる反応たとえば抗TdTに特異的
であって通常の方法により酵素などで標識した抗体との
更なる反応によって抗TdTを間接的に標識してもよい。
たまたはこれに特異的な抗体をいい、ヒト以外の動物種
たとえばウサギ、ヤギ、馬、羊、ギニア豚などに見出さ
れるものである。上述のように、抗体・抗原錯体を抗Td
Tと反応させて固体支持体上に抗体・抗原・抗TdT錯体を
形成させ、この錯体を試料中のTdT抗原の濃度の層度と
して測定する。酵素のような標識または螢光染料のよう
な螢光標識で抗TdTを直接に標識して結合量を測定する
ことができ、または更なる反応たとえば抗TdTに特異的
であって通常の方法により酵素などで標識した抗体との
更なる反応によって抗TdTを間接的に標識してもよい。
抗TdTの直接酵素標識を使用するのが好ましい。酵素の
例としてカタラーゼ、パーオキシダーゼ、ウレアーゼ、
グルコースオキシダーゼ、フスフアターゼなどがあげら
れる。抗TdTの直接標識を使用するときは、抗体・抗原
・抗TdT＊錯体（抗TdT＊は標識した抗TdTを表わす）の
形成後に、反応混合物のリガンドおよび／または固相に
酵素基質を加え、比色測定法のような通常の技術を使用
して酵素的測定を行ない、結合した標識抗TdTを測定す
る。間接標識の場合すなわち抗TdTが標識されていない
場合には、抗体・抗原・抗TdT錯体を洗浄して結合して
いない抗TdTを除去し、次いで抗TdTに対する標識抗体と
反応させ、抗TdTに結合した抗体を次いで測定する。
例としてカタラーゼ、パーオキシダーゼ、ウレアーゼ、
グルコースオキシダーゼ、フスフアターゼなどがあげら
れる。抗TdTの直接標識を使用するときは、抗体・抗原
・抗TdT＊錯体（抗TdT＊は標識した抗TdTを表わす）の
形成後に、反応混合物のリガンドおよび／または固相に
酵素基質を加え、比色測定法のような通常の技術を使用
して酵素的測定を行ない、結合した標識抗TdTを測定す
る。間接標識の場合すなわち抗TdTが標識されていない
場合には、抗体・抗原・抗TdT錯体を洗浄して結合して
いない抗TdTを除去し、次いで抗TdTに対する標識抗体と
反応させ、抗TdTに結合した抗体を次いで測定する。
本発明において使用する抽出剤組成物は緩衝媒質中のノ
ニオン表面活性剤、抗凝固剤および還元剤から成る。本
発明の組成物中において有用なノニオン表面活性剤は当
業技術において周知のものであり、たとえばトウイーン
−２０、トリトンＸ−１００などである。ノニオン表面
活性剤を抽出剤組成物中に0.005〜１％、更に好ましく
は0.05〜0.1％の濃度で使用するのが好ましい。ノニオ
ン表面活性剤を抽出剤組成物中に約0.05％の濃度で使用
するのが最も好ましい。抽出剤組成物中に使用する抗凝
固剤は当業者によって容易に求めうるものであって、凝
固を除くに十分な量で使用される。抽出剤組成物中に約
2.5mMの最少濃度の抗凝固剤を使用するのが好ましい。
また、TdT抗原の安定性を増大させるために、キレート
性抗凝固剤たとえばクエン酸塩、シウ酸塩、エチレンジ
アミン四酢酸およびその塩（“ＥＤＴＡ”）などを使用
して、還元剤の酸化を防止することによって還元剤を安
定化するのが好ましい。抗凝固剤としてＥＤＴＡを使用
するのが好ましい。ここでいう“還元剤”なる用語はTd
Tの分子間ジサルファイド結合形成を除きTdTの酸化を防
止することによってTdTを安定化する組成物をいう。こ
のような還元剤は当業者によって容易に求めうるものが
あって、グルタチオンなどのようなチオール類が包含さ
れる。本発明の抽出剤組成物中の還元剤としてグルタチ
オンを使用するのが好ましい。本発明の抽出緩衝剤中に
使用する個々の緩衝媒質は臨界的なものではなく、当業
者によって容易に求めうるものである。任意の低張性緩
衝剤を使用することができ、これらはたとえばホスフェ
ート緩衝食塩水、Trisなどがある。5.0〜8.0のpHをもつ
緩衝剤を使用するのが好ましく、7.0より低いpHをもつ
緩衝剤を使用するのが更に好ましく、そして還元剤の自
動酸化を最少にするために5.5〜6.5のpHをもつ緩衝剤を
使用するのが最も好ましい。上記の成分の他に、本発明
の抽出剤組成物はバクテリアの生育を阻止するためにチ
メロサルのような保存剤を含んでいてもよい。
ニオン表面活性剤、抗凝固剤および還元剤から成る。本
発明の組成物中において有用なノニオン表面活性剤は当
業技術において周知のものであり、たとえばトウイーン
−２０、トリトンＸ−１００などである。ノニオン表面
活性剤を抽出剤組成物中に0.005〜１％、更に好ましく
は0.05〜0.1％の濃度で使用するのが好ましい。ノニオ
ン表面活性剤を抽出剤組成物中に約0.05％の濃度で使用
するのが最も好ましい。抽出剤組成物中に使用する抗凝
固剤は当業者によって容易に求めうるものであって、凝
固を除くに十分な量で使用される。抽出剤組成物中に約
2.5mMの最少濃度の抗凝固剤を使用するのが好ましい。
また、TdT抗原の安定性を増大させるために、キレート
性抗凝固剤たとえばクエン酸塩、シウ酸塩、エチレンジ
アミン四酢酸およびその塩（“ＥＤＴＡ”）などを使用
して、還元剤の酸化を防止することによって還元剤を安
定化するのが好ましい。抗凝固剤としてＥＤＴＡを使用
するのが好ましい。ここでいう“還元剤”なる用語はTd
Tの分子間ジサルファイド結合形成を除きTdTの酸化を防
止することによってTdTを安定化する組成物をいう。こ
のような還元剤は当業者によって容易に求めうるものが
あって、グルタチオンなどのようなチオール類が包含さ
れる。本発明の抽出剤組成物中の還元剤としてグルタチ
オンを使用するのが好ましい。本発明の抽出緩衝剤中に
使用する個々の緩衝媒質は臨界的なものではなく、当業
者によって容易に求めうるものである。任意の低張性緩
衝剤を使用することができ、これらはたとえばホスフェ
ート緩衝食塩水、Trisなどがある。5.0〜8.0のpHをもつ
緩衝剤を使用するのが好ましく、7.0より低いpHをもつ
緩衝剤を使用するのが更に好ましく、そして還元剤の自
動酸化を最少にするために5.5〜6.5のpHをもつ緩衝剤を
使用するのが最も好ましい。上記の成分の他に、本発明
の抽出剤組成物はバクテリアの生育を阻止するためにチ
メロサルのような保存剤を含んでいてもよい。
ここに使用する“抽出剤組成物の有効量”なる用語は分
析すべき試料中のTdT抗原の実質的にすべてを緩衝液上
澄液中に抽出するに十分な抽出剤組成物の量をいう。抽
出すべき試料の量に等しい量の抽出剤組成物を使用する
のが好ましい。
析すべき試料中のTdT抗原の実質的にすべてを緩衝液上
澄液中に抽出するに十分な抽出剤組成物の量をいう。抽
出すべき試料の量に等しい量の抽出剤組成物を使用する
のが好ましい。
次の実施例は本発明を具体的に説明すためのものであっ
て、本発明の範囲を限定するものと解釈すべきではな
い。
て、本発明の範囲を限定するものと解釈すべきではな
い。
実施例１ 血液抽出物からのTdT抗原の抽出 血液試料を静脈穿刺によって集め、エチレンジアミン四
酢酸を含む血液収集管に入れた。収集した血液試料を−
20℃に凍結し、次いで室温で解凍した。リン酸緩衝食塩
水（pH6.0）中に、0.05％Tween-20、10mMＥＤＴＡ、20mM
グルタチオン、0.01％チメロサルを含む抽出用緩衝液に
上記の解凍血液の５００μｌ分別量を加えた。えられた
抽出混合物を撹拌し、次いで２〜８℃の温度で１０分間
２００〜８００Xgで遠心分離した。TdT抗原を含む上澄
液をデカンテーションにより透明試験管に移した。
酢酸を含む血液収集管に入れた。収集した血液試料を−
20℃に凍結し、次いで室温で解凍した。リン酸緩衝食塩
水（pH6.0）中に、0.05％Tween-20、10mMＥＤＴＡ、20mM
グルタチオン、0.01％チメロサルを含む抽出用緩衝液に
上記の解凍血液の５００μｌ分別量を加えた。えられた
抽出混合物を撹拌し、次いで２〜８℃の温度で１０分間
２００〜８００Xgで遠心分離した。TdT抗原を含む上澄
液をデカンテーションにより透明試験管に移した。
実施例２ 市販のヤギ抗−子牛血清をpH7.5のTris 0.01Mで１：７
５００に希釈した。希釈溶液を使用して６mMポリスチチ
レンビーズを室温で一夜被覆して、それぞれのセットの
ビーズを洗浄し、次いで0.01Ｍ−Tris(pH7.5)および0.0
1M／mlのジエンタマイシンを含む溶液に、使用時まで、
保存した。
５００に希釈した。希釈溶液を使用して６mMポリスチチ
レンビーズを室温で一夜被覆して、それぞれのセットの
ビーズを洗浄し、次いで0.01Ｍ−Tris(pH7.5)および0.0
1M／mlのジエンタマイシンを含む溶液に、使用時まで、
保存した。
TdT抗原の測定 1.実施例１からえられたTdT抗原を含む抽出試料の２０
０μｌ分別量および対照標準試料を反応皿の適当な区域
に加えた。
０μｌ分別量および対照標準試料を反応皿の適当な区域
に加えた。
2.TdT抗体を被覆したポリスチレンビーズを試験試料ま
たは対照標準試料を含むそれぞれの区域に加え、反応皿
を覆って水浴中３０℃で９０分間培養した。
たは対照標準試料を含むそれぞれの区域に加え、反応皿
を覆って水浴中３０℃で９０分間培養した。
3.培養期間の後に、結合していない試験試料または対照
標準試料をそれぞれの区域から除き、ビーズを水で３回
洗浄した。
標準試料をそれぞれの区域から除き、ビーズを水で３回
洗浄した。
4.0.1-Trisおよび0.15Ｍ塩化ナトリウム中の１０％牛血
清にホルセラディッシュパーオキシダーゼに共有結合し
たウサギ抗TdTを0.05〜３μｇ／ml含む溶液の２００μ
ｌを、上記の洗浄したビーズを含む区域に加えた。
清にホルセラディッシュパーオキシダーゼに共有結合し
たウサギ抗TdTを0.05〜３μｇ／ml含む溶液の２００μ
ｌを、上記の洗浄したビーズを含む区域に加えた。
5.反応皿を覆い、３０℃で９０分間培養した。
6.培養後、結合していないウサギ抗TdT−ホルセラディ
ッシュパーオキシダーゼ共役体を除き、ビーズを水で３
回洗浄した。
ッシュパーオキシダーゼ共役体を除き、ビーズを水で３
回洗浄した。
7.始めに試験試料および対照標準試料を含んでいたそれ
ぞれの区域からのビーズを分析管に移し、次いでこれに
新しく調製した基質溶液（pH5.5で0.02％過酸化水素含
有のクエン酸塩・リン酸塩緩衝剤５ml中にｏ−フェニレ
ンジアミン・２ＨＣｌの約２７mgを含む溶液）の３００
μｌを加えた。次いで分析管を室温で３０分間培養し
た。
ぞれの区域からのビーズを分析管に移し、次いでこれに
新しく調製した基質溶液（pH5.5で0.02％過酸化水素含
有のクエン酸塩・リン酸塩緩衝剤５ml中にｏ−フェニレ
ンジアミン・２ＨＣｌの約２７mgを含む溶液）の３００
μｌを加えた。次いで分析管を室温で３０分間培養し
た。
8.培養後に、１Ｎ硫酸１mlをそれぞれの分析管に加え、
えられた試験試料溶液および対照標準溶液の吸光度を分
光光度計で４９２nmにおいて読んだ。
えられた試験試料溶液および対照標準溶液の吸光度を分
光光度計で４９２nmにおいて読んだ。
9.試験試料からえられた吸光度を既知量のTdTを使用し
て上記方法を行なって作成した基準曲線と比較すること
によって、試験試料中のTdT抗原の量を測定した。
て上記方法を行なって作成した基準曲線と比較すること
によって、試験試料中のTdT抗原の量を測定した。
基準曲線は吸光度（ｙ軸）を基準の対応する濃度（ｘ
軸）に対してプロットすることによって作成した。基準
と同時に行なった対照標準試料中のTdT濃度は基準曲線
から測定することができる。
軸）に対してプロットすることによって作成した。基準
と同時に行なった対照標準試料中のTdT濃度は基準曲線
から測定することができる。
始めの分析において、試料が最高基準のTdTよりも多量
のTdTを含んでいることがわかったならば、その試料を
希釈用緩衝剤で希釈してから上記の分析法に従って分析
することができる。１００μｌの試料＋0.9mlの希釈用
緩衝液を使用する１：１０希釈が推奨される。
のTdTを含んでいることがわかったならば、その試料を
希釈用緩衝剤で希釈してから上記の分析法に従って分析
することができる。１００μｌの試料＋0.9mlの希釈用
緩衝液を使用する１：１０希釈が推奨される。
実施例３ 2.5ng／ml〜２５ng／mlの範囲の既知量の純TdTを正常の
ヒト血液および血漿に加え、実施例２の方法に従って分
析した。TdTの回収は９５±１０％の範囲内であった。
ヒト血液および血漿に加え、実施例２の方法に従って分
析した。TdTの回収は９５±１０％の範囲内であった。
実施例４ ４種のリンパ球抽出試料を３個のレプリカで５回、実施
例２に記載のパーオキシダーゼにより５日間にわたって
分析した。試料中のTdT濃度は2.5ng／ml〜２５ng／mlの
範囲であった。変動の内部分析（分析内）係数は2.5〜
5.0％であり、内部分析（分析間）の変動は3.5〜6.5％
であった。
例２に記載のパーオキシダーゼにより５日間にわたって
分析した。試料中のTdT濃度は2.5ng／ml〜２５ng／mlの
範囲であった。変動の内部分析（分析内）係数は2.5〜
5.0％であり、内部分析（分析間）の変動は3.5〜6.5％
であった。
上記の実施例中に使用したTdT基準はTris緩衝液(pH6.0)
中に0.0025％Tween、20mMグルタチオンおよびＥＤＴＡを
含む組成物中にTdTを含むものであった。貯蔵安定性の
ためTdT基準物は凍結乾燥することができる。
中に0.0025％Tween、20mMグルタチオンおよびＥＤＴＡを
含む組成物中にTdTを含むものであった。貯蔵安定性の
ためTdT基準物は凍結乾燥することができる。
本発明の方法の感度は約0.4ngTdT／mlである。この感度
はゼロ基準から区別しうる濃度として、すなわちゼロ基
準より上の２つの標準偏差として計算された。
はゼロ基準から区別しうる濃度として、すなわちゼロ基
準より上の２つの標準偏差として計算された。
血液全体について使用したのと同様の方法を使用して骨
髄細胞試料および白血球細胞試料を抽出し分析すること
ができる。骨髄試料および白血球試料からの抽出TdTへ
の抽出剤組成物の使用は抽出TdT抗原の安定性を増大さ
せた。
髄細胞試料および白血球細胞試料を抽出し分析すること
ができる。骨髄試料および白血球試料からの抽出TdTへ
の抽出剤組成物の使用は抽出TdT抗原の安定性を増大さ
せた。
本発明に従って試料を、ノニオン表面活性剤、抗凝固剤
および還元剤の三つの成分を同時に含む抽出剤組成物で
処理することにより、 1.抽出されたＴｄＴが安定化され、貯蔵性に優れ、Ｔｄ
Ｔ抽出物を、簡易に測定に利用できる、 2.ＴｄＴを安定して抽出できるため、試料中のＴｄＴ含
量に応じた抽出量を与える、 3.免疫学的測定系に利用できる抽出物を与える、 4.従来抽出することが不可能であり、また抗原性を失う
ために免疫学的に測定することが不可能であったＴｄＴ
を、はじめて測定可能に抽出することができる、 5.ＴｄＴが、抗原性を保持できるので、免疫学的測定系
でＴｄＴを定量分析すことを可能にする、 6.臨床的に重要な測定データを提供できる、 7.測定用試料として、広い範囲のものを対象にすること
ができる、 というような作用効果が期待しうるし、更にそれらの作
用効果を確認しうることが明らかである。
および還元剤の三つの成分を同時に含む抽出剤組成物で
処理することにより、 1.抽出されたＴｄＴが安定化され、貯蔵性に優れ、Ｔｄ
Ｔ抽出物を、簡易に測定に利用できる、 2.ＴｄＴを安定して抽出できるため、試料中のＴｄＴ含
量に応じた抽出量を与える、 3.免疫学的測定系に利用できる抽出物を与える、 4.従来抽出することが不可能であり、また抗原性を失う
ために免疫学的に測定することが不可能であったＴｄＴ
を、はじめて測定可能に抽出することができる、 5.ＴｄＴが、抗原性を保持できるので、免疫学的測定系
でＴｄＴを定量分析すことを可能にする、 6.臨床的に重要な測定データを提供できる、 7.測定用試料として、広い範囲のものを対象にすること
ができる、 というような作用効果が期待しうるし、更にそれらの作
用効果を確認しうることが明らかである。
本発明を特定の具体例に関して説明したけれども、その
詳細は本発明を限定するものと解釈すべきではない。種
々の均等の態様、変化および変形が本発明の精神および
範囲から逸脱することなしに行ないうることが明らかで
あり、そしてこのような均等な実施態様も本発明に含ま
れるべきものであることが理解されるからである。
詳細は本発明を限定するものと解釈すべきではない。種
々の均等の態様、変化および変形が本発明の精神および
範囲から逸脱することなしに行ないうることが明らかで
あり、そしてこのような均等な実施態様も本発明に含ま
れるべきものであることが理解されるからである。
フロントページの続き (72)発明者 アドレイシヨン・フエリシアノ・サ−レズ アメリカ合衆国イリノイ州シカゴ・ノ− ス・フランシスコ6528 (56)参考文献 特開 昭57−74087（ＪＰ，Ａ) 特開 昭55−144898（ＪＰ，Ａ)
Claims (10)
- 【請求項１】試料中の末端デオキシヌクレオチジル転移
酵素（ＴｄＴ）抗原を定量的に測定する方法であって、 a)緩衝媒質中にノニオン表面活性剤、抗凝固剤および還
元剤の少なくとも三成分から成る抽出剤組成物で試料を
処理することによって試料からＴｄＴ抗原を抽出し、 b)抽出したＴｄＴ抗原を抗ＴｄＴを被覆した固体支持体
と接触させて固体支持体上に抗原−抗ＴｄＴ錯体を生成
させ、 c)固体支持体上の抗原−抗体錯体をＴｄＴ抗原に特異の
抗体で処理して固体支持体上に抗体−抗原−抗ＴｄＴ錯
体を生成させ、そして d)生成させた抗体−抗原・抗ＴｄＴ錯体の量を試料中に
存在するＴｄＴ抗原の尺度として測定する、 ことから成ることを特徴とする測定方法。 - 【請求項２】抗凝固剤がキレート性抗凝固剤である特許
請求の範囲第１項記載の方法。 - 【請求項３】キレート性抗凝固剤がエチレンジアミン四
酢酸またはその塩である特許請求の範囲第２項記載の方
法。 - 【請求項４】還元剤がグルタチオンである特許請求の範
囲第１項記載の方法。 - 【請求項５】ノニオン表面活性剤がＴＷＥＥＮ−２０で
ある特許請求の範囲第１項記載の方法。 - 【請求項６】抽出剤組成物が７より低いpHにおいて緩衝
化されている特許請求の範囲第１項記載の方法。 - 【請求項７】抽出剤組成物が5.5〜6.5の範囲内のpHにお
いて緩衝化されている特許請求の範囲第６項記載の方
法。 - 【請求項８】抽出剤組成物がリン酸塩緩衝食塩水媒質中
のＴＷＥＥＮ−２０、エチレンジアミン四酢酸およびグ
ルタチオンから成る特許請求の範囲第７項記載の方法。 - 【請求項９】抗ＴｄＴが酵素で標識されている特許請求
の範囲第１項〜第８項のいずれかに記載の方法。 - 【請求項１０】試料が血液試料である特許請求の範囲第
１項〜第８項のいずれかに記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US06/440,129 US4515890A (en) | 1982-11-08 | 1982-11-08 | Immunoassay of terminal deoxynucleotidyl transferase |
| US440129 | 2003-01-15 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS59104555A JPS59104555A (ja) | 1984-06-16 |
| JPH0614045B2 true JPH0614045B2 (ja) | 1994-02-23 |
Family
ID=23747564
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58208437A Expired - Lifetime JPH0614045B2 (ja) | 1982-11-08 | 1983-11-08 | 末端デオキシヌクレオチジル転移酵素の測定法 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4515890A (ja) |
| EP (1) | EP0108402B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0614045B2 (ja) |
| CA (1) | CA1210691A (ja) |
| DE (1) | DE3371815D1 (ja) |
| ES (1) | ES8407100A1 (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4707439A (en) * | 1984-10-26 | 1987-11-17 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Screening test for reverse-transcriptase containing virus such as non-A, non-B hepatitis, NANBH |
| US5770459A (en) * | 1986-04-30 | 1998-06-23 | Igen International, Inc. | Methods and apparatus for improved luminescence assays using particle concentration, electrochemical generation of chemiluminescence detection |
| US4818686A (en) * | 1986-09-15 | 1989-04-04 | Coulter Corporation | Chemical blocking agent against non-specific binding or staining of an antibody specific for terminal deoxynucleotidyl transferase in biological specimens during immunoassay |
| US5173407A (en) * | 1986-12-16 | 1992-12-22 | Konica Corporation | Method for measuring glycosyltransferase |
| US5935779A (en) * | 1988-11-03 | 1999-08-10 | Igen International Inc. | Methods for improved particle electrochemiluminescence assay |
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| US5746974A (en) * | 1988-11-03 | 1998-05-05 | Igen International, Inc. | Apparatus for improved luminescence assays using particle concentration, electrochemical generation of chemiluminescence and chemiluminescence detection |
| US5779976A (en) * | 1988-11-03 | 1998-07-14 | Igen International, Inc. | Apparatus for improved luminescence assays |
| US5705402A (en) * | 1988-11-03 | 1998-01-06 | Igen International, Inc. | Method and apparatus for magnetic microparticulate based luminescence assay including plurality of magnets |
| US5962218A (en) * | 1988-11-03 | 1999-10-05 | Igen International Inc. | Methods and apparatus for improved luminescence assays |
| US5334499A (en) * | 1989-04-17 | 1994-08-02 | Eastman Kodak Company | Methods of extracting, amplifying and detecting a nucleic acid from whole blood or PBMC fraction |
| ZA92803B (en) | 1991-02-06 | 1992-11-25 | Igen Inc | Method and apparatus for magnetic microparticulate based luminescene asay including plurality of magnets |
| CA2445204C (en) * | 2002-10-16 | 2014-08-12 | Streck Laboratories, Inc. | Method and device for collecting and preserving cells for analysis |
| JP5590796B2 (ja) | 2005-06-03 | 2014-09-17 | ボード・オブ・リージェンツ・オブ・ザ・ユニバーシティ・オブ・テキサス・システム | 電気化学および単一ファラデー電極による電気化学発光 |
| US11634747B2 (en) * | 2009-01-21 | 2023-04-25 | Streck Llc | Preservation of fetal nucleic acids in maternal plasma |
| NO2398912T3 (ja) | 2009-02-18 | 2018-02-10 | ||
| US20110111410A1 (en) * | 2009-11-09 | 2011-05-12 | Streck, Inc. | Stabilization of rna in intact cells within a blood sample |
| US9956281B2 (en) | 2011-05-04 | 2018-05-01 | Streck, Inc. | Inactivated virus compositions and methods of preparing such compositions |
| US10091984B2 (en) | 2013-07-24 | 2018-10-09 | Streck, Inc. | Compositions and methods for stabilizing circulating tumor cells |
| US11168351B2 (en) | 2015-03-05 | 2021-11-09 | Streck, Inc. | Stabilization of nucleic acids in urine |
| US20170145475A1 (en) | 2015-11-20 | 2017-05-25 | Streck, Inc. | Single spin process for blood plasma separation and plasma composition including preservative |
| WO2018022991A1 (en) | 2016-07-29 | 2018-02-01 | Streck, Inc. | Suspension composition for hematology analysis control |
| CN115119829B (zh) | 2017-10-19 | 2024-07-12 | 斯特雷克股份有限公司 | 用于胞外囊泡的溶血和凝血调节以及稳定化的组合物 |
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|---|---|---|---|---|
| NL154599B (nl) * | 1970-12-28 | 1977-09-15 | Organon Nv | Werkwijze voor het aantonen en bepalen van specifiek bindende eiwitten en hun corresponderende bindbare stoffen, alsmede testverpakking. |
| US3932141A (en) * | 1974-07-10 | 1976-01-13 | Abbott Laboratories | Apparatus for determining immunoassays of antigens and their antibodies |
| US4020151A (en) * | 1976-02-17 | 1977-04-26 | International Diagnostic Technology, Inc. | Method for quantitation of antigens or antibodies on a solid surface |
| JPS5536759A (en) * | 1978-09-07 | 1980-03-14 | Ajinomoto Co Inc | Measuring method of kallikrein in human urine |
| IL57108A (en) * | 1979-04-22 | 1981-12-31 | Yeda Res & Dev | Assay for the quantitative determination of interferon and a kit therefor |
| JPS5653465A (en) * | 1979-10-05 | 1981-05-13 | Toyo Jozo Co Ltd | Improved method in measurement of enzyme immunity |
| JPS56118671A (en) * | 1980-02-22 | 1981-09-17 | Amano Pharmaceut Co Ltd | Measuring method of specific enzyme immunity of hybrid type protein |
| US4307189A (en) * | 1980-03-21 | 1981-12-22 | Malon Kit | Method for the quantitative determination of terminal deoxynucleotidyl transferase in biological samples |
| US4363634A (en) * | 1980-07-18 | 1982-12-14 | Akzona Incorporated | Glass support coated with synthetic polymer for bioprocess |
| JPS5774087A (en) * | 1980-10-27 | 1982-05-10 | Green Cross Corp:The | Separation and purification of placental enzyme transformating angiotensin (a tase) |
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-
1982
- 1982-11-08 US US06/440,129 patent/US4515890A/en not_active Expired - Fee Related
-
1983
- 1983-11-02 CA CA000440217A patent/CA1210691A/en not_active Expired
- 1983-11-04 EP EP83111009A patent/EP0108402B1/en not_active Expired
- 1983-11-04 DE DE8383111009T patent/DE3371815D1/de not_active Expired
- 1983-11-07 ES ES527086A patent/ES8407100A1/es not_active Expired
- 1983-11-08 JP JP58208437A patent/JPH0614045B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
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| CA1210691A (en) | 1986-09-02 |
| EP0108402A2 (en) | 1984-05-16 |
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| EP0108402B1 (en) | 1987-05-27 |
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