JPH06141883A

JPH06141883A - 上皮化生に対するモノクローナル抗体およびそれを生産するハイブリドーマ

Info

Publication number: JPH06141883A
Application number: JP4319241A
Authority: JP
Inventors: Akihiko Kimura; 章彦木村
Original assignee: Mercian Corp
Current assignee: Mercian Corp
Priority date: 1992-11-05
Filing date: 1992-11-05
Publication date: 1994-05-24

Abstract

(57)【要約】【目的】上皮化生を選択的に認識するモノクローナル
抗体およびそれを生産するハイブリドーマを提供する。【構成】ヒトの胃粘膜ムチンの血液型活性画分を用い
て免疫した動物の抗体産生細胞（例えば脾細胞等）とミ
エローマ細胞を融合させ、上皮化生に選択的に結合する
モノクローナル抗体を生産するハイブリドーマ（例え
ば、2D11(FERM P-13205)）を選択する。こうして得たハ
イブリドーマを細胞培養するか、または動物に接種して
得た腹水からモノクローナル抗体を取得することができ
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は正常組織に反応せず、上
皮化生にのみ反応するモノクローナル抗体および該モノ
クローナル抗体を産生するハイブリドーマに関する。

【０００２】

【従来の技術】化生とは完全に分化した正常成熟組織が
関連のある成熟組織に転換することである。上皮組織に
おけるその古典的な例としては、正常円柱上皮が偏平上
皮に移行する変化が知られている。化生を起こす原因
は、組織への機械的刺激、化学的刺激などさまざまであ
り、発現部位と種によっては前腫瘍性変化となることが
知られている。

【０００３】現在、上皮化生は組織学的に診断がなされ
ており、細胞の形態変化としてのみ認識され、その生化
学的本質についてはほとんど知られていない状況であ
る。正常組織に反応せず、上皮化生にのみ反応するモノ
クローナル抗体が得られれば、ある種の前癌病変の診断
等に極めて有用であることが期待される。また、上皮化
生と癌の関係の研究、あるいは上皮化生の生化学的な研
究に利用できるものと期待される。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】従って、本発明は正常
組織に反応せず、上皮化生にのみ反応するモノクローナ
ル抗体を提供することを目的とするものである。さら
に、本発明は該モノクローナル抗体を生産するハイブリ
ドーマを提供することをも目的とするものである。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者は、上皮化生に
選択的に反応するモノクローナル抗体を得るため鋭意研
究を行ったところ、抗原としてヒトの胃粘膜ムチンの血
液型活性画分を用いて免疫した動物の脾細胞等の抗体産
生細胞とミエローマ細胞を融合させて得たハイブリドー
マが意外にも上皮化生に選択的に反応するモノクローナ
ル抗体を産生することを見出し、本発明を完成した。

【０００６】すなわち本発明は、ヒトの胃粘膜ムチンの
血液型活性画分で免疫した動物の抗体産生細胞とミエロ
ーマ細胞との細胞融合により得られたハイブリドーマに
よって生産される、正常組織に反応せず、上皮化生にの
み選択的に反応するモノクローナル抗体および該モノク
ローナル抗体を生産するハイブリドーマを提供するもの
である。

【０００７】以下に本発明を詳細に説明する。本発明の
モノクローナル抗体の製造に使用するヒト胃粘膜ムチン
の血液型活性画分は、Yyrewicz E.C.らが子宮頸管粘膜
ムチンの精製に用いた方法(J.Biol.Chem.,256巻,11895-
11904頁,1981年)に従い精製したものを用いることがで
きる。

【０００８】即ち、子宮頸管ムチン(5g)を、6Mグアニデ
ィンクロライド、10mMジチオスレイトール(DTT)、5mM E
DTAを含む0.3Mトリス緩衝液(pH 8.5)で可溶化し、ヨー
ドアセトアミドと反応させてチオール基をカルボキシメ
チル化した後、0.15M食塩を含む50mMトリス緩衝液(pH
8.0)に対して一夜4℃で透析する。ムチン溶液に1％SD
S、10mM DTT（最終濃度）となるように両試薬を加え、6
0℃、15分間インキュベートし、0.1％ SDSを含む50mMト
リス緩衝液(pH 8.0)で平衡化したBio-Gel A-50mカラム
(2.5φ×90cm)にチャージし、同緩衝液で溶出してムチ
ン画分を得るという方法である。

【０００９】動物の抗体産生細胞を得るためには、上記
の画分を抗原として使用して、マウス、ラット、ウサ
ギ、ヒツジ、ウマ、ウシ等に接種してこれらの動物を免
疫し、それらから脾細胞等の抗体産生細胞を採取すれば
よい。また免疫に際して、アジュバントとしてフロイン
ト完全アジュバントを使用してもよい。フロイント完全
アジュバントを使用する際には、該血液型活性画分と該
アジュバントを1:1〜1:10、好ましくは約1:1の容量比で
使用し、該血液型活性画分が0.1〜1mg/ml、好ましくは1
mg/mlとなるように、例えば約0.25〜0.5M食塩水に懸濁
して抗原懸濁液を調製すればよい。

【００１０】上記の抗原懸濁液を被免疫動物に接種する
ことにより、ヒトの胃粘膜ムチンの血液型活性画分を抗
原として免疫された動物が得られる。例えばマウスを免
疫する場合には上記の抗原懸濁液を1〜3回、好ましくは
2〜3回、1〜2週間隔で、例えば腹腔内投与することによ
り効率よくマウスを免疫することができる。

【００１１】このようにして得られた免疫動物から、脾
細胞等の抗体産生細胞を分離することにより、抗体産生
細胞を得ることができる。例えば、脾細胞を抗体産生細
胞として使用する場合には、脾臓を摘出した後に、例え
ば15％ウシ胎児血清含有RPMI1640(GIBCO製、以降NS-1培
地と略称)で洗浄し、同培地中で脾臓を切断し、ステン
レスメッシュを通した後、さらに同培地で遠心洗浄して
抗体産生細胞を得ることができる。

【００１２】細胞融合に使用するミエローマ細胞として
は、マウス、ラット、ウサギ、ヒト等の種々の動物の細
胞株を使用することができるが、好適にはヒポキサンチ
ン・グアニン・ホスホリボシルトランスフェラーゼ(HGP
RT)を欠損するミエローマ細胞を挙げることができる。
このようなミエローマ細胞は、未融合の状態ではHGPRT
を欠くためにヒポキサン・アミノプテリン・チミジン(H
AT)培地で核酸の合成ができずに死滅する。一方、リン
パ球と融合しHGPRT活性を獲得したハイブリドーマは、
アミノプテリンで核酸の生合成を阻害されてもヒポキサ
ンチンを利用して生育することができる。融合処理後に
ハイブリドーマのみが生育するので、ハイブリドーマの
選択には好適である。なお本発明に使用するミエローマ
細胞は、非分泌型の細胞株であることが好ましい。

【００１３】この様なミエローマ細胞としては、例え
ば、マウスミエローマP3/X63-Ag8U1(P3U1)(Current top
ics in Microbiology & Immunology 81巻,1-7頁,1978
年)、P3/NS1-1-Ag4-1(NS-1)(European J.Immun. 6巻,51
1-519頁,1976年)、P3/X63-Ag8-6・5・3(X63・6・5・3)(J.Imm
un. 123巻,1548-1550頁,1979年)、SP2/0-Ag14(SP2)(Nat
ure276巻,269-270頁,1978年)、ラットミエローマ210・RC
Y3・Ag1・2・3(Y3・Ag1・2・3)(Nature 277巻,131-133頁,1979
年)、ヒトミエローマSKOー007、GM1500TG-A12等を挙げ
ることができる。

【００１４】動物の抗体産生細胞とミエローマ細胞との
細胞融合は常法に従って行うことができる。例えば、RP
MI1640等の動物細胞培養培地中で10⁷〜10⁸個のミエロー
マ細胞に4〜10倍の数の上記抗体産生細胞を混合すれば
よい。その際、細胞融合促進物質として、平均分子量10
00〜6000のポリエチレングリコール(PEG)やポリビニル
アルコール、センダイウイルス等が使用できるが、PEG
を用いることが好ましい。融合処理は通常37℃で5〜20
分間、好ましくは、37℃で6分間行えばよい。

【００１５】細胞融合処理後の細胞からハイブリドーマ
を選別するには選択培地における選択的増殖を行えばよ
い。例えば、細胞をNS-1培地等の培地で5×10⁶個/mlと
なるように希釈した後に、マイクロタイタープレート上
の画ウェルに10⁵〜10⁶細胞個／ウェルとなるように細胞
を入れ、その後HAT培地等の選択培地を加えて、以後適
当な間隔、例えば、3日間隔で選択培地を交換して培養
すればよい。例えばミエローマ細胞としてP3/X63-Ag8U1
(P3U1)を使用した場合にはHAT培地で10〜14日間程度培
養することにより、ハイブリドーマのみを選別すること
ができる。

【００１６】得られたハイブリドーマから上皮化生に反
応するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを
選択するには、予め胃粘膜ムチンの血液型活性画分に結
合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを
選択し、さらにその中から上皮化生に結合するモノクロ
ーナル抗体を産生するハイブリドーマを免疫組織染色に
より選択することができる。

【００１７】胃粘膜ムチンの血液型活性画分に結合する
モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを選択す
るには、例えば酵素免疫測定法(ELISA)を用い、以下の
ようにして行えばよい。予め胃粘膜ムチンの血液型活性
画分を含む検体をリン酸緩衝生理食塩液(PBS)、炭酸水
素ナトリウム緩衝液(pH8.0)等の緩衝液に溶解し、ポリ
スチレン、ポリビニール、ポリカーボネート、ポリアク
リルアミド、シリコン、デキストラン、セルロース等の
ソフトプレートやガラスプレート、ビーズ、シート、ウ
ェル、チューブ等の固相を添加して、例えば4℃で一晩
放置して抗原を吸着させる。

【００１８】次に抗原溶液を捨て、PBSで洗浄した後に1
％ウシ血清アルブミン(BSA)含有PBSを加え、例えば4℃
で一晩放置して抗原の結合していない部位をBSAでブロ
ックする。その後に、ハイブリドーマの上清を50μlず
つ加えて、例えば室温で1時間放置した後、PBSで3回洗
浄する。次にビオチン化した抗マウスイムノグロブリン
抗血清（第2抗体）を加えて、室温で1時間放置する。PB
Sで3回洗浄した後に、アビジンを結合した酵素を加え
て、室温で15分間静置する。PBSで4回洗浄した後に、酵
素基質を加えて発色させ、吸光光度計、蛍光光度計等で
測定すれば、胃粘膜ムチンの血液型活性画分に結合する
抗体を産生しているハイブリドーマを選択することがで
きる。

【００１９】上記のようにして得られたハイブリドーマ
について、さらに上皮化生に結合するモノクローナル抗
体を産生するハイブリドーマを選択するには、以下のよ
うに免疫組織染色によるスクリーニングを行えばよい。
まずホルマリン固定パラフィン包埋病理組織切片を脱パ
ラフィン、親水処理、過酸化水素水−メタノールによる
処理を行い、内因性ペルオキシダーゼを消去し、正常血
清によるブロッキングを行った標本と培養上清を反応さ
せる。次いでビオチン化抗マウスIgG抗体、アビジン・
ビオチンペルオキシダーゼコンプレックスと反応させ、
3-アミノ-9-エチルカルバゾール(3-amino-9-ethylcarba
zole, AEC)を基質として発色させる。対比染色としてヘ
マトキシリン染色を用い、上皮化生に反応する抗体を生
産するハイブリドーマを選別することができる。

【００２０】胃粘膜ムチンの血液型活性画分に反応する
抗体を産生しているハイブリドーマの中、そのほとんど
が、Baraらが既に報告した胃粘膜ムチンに対する抗体
（Br.J.Cancer,41巻,209-221頁,1980年、Cancer Res.,4
6巻,3983-3989頁,1986年、Int.J.Cancer,47巻,304-310
頁,1991年）と類似の特性を示す抗体を産生するもので
あるが、数％のハイブリドーマは、その生産する抗体が
免疫組織染色において正常組織を染色せず、上皮化生の
みを染色するという、既に報告されている何れの抗胃粘
膜ムチン抗体とも異なる特性を有していた。

【００２１】このようにして上皮化生に特異的に反応す
る抗体を産生する細胞を選別した後、限界希釈法等によ
りクローニングを行うことにより、単一のハイブリドー
マを起源とする抗体産生細胞を得ることができる。上記
のようにして得られるハイブリドーマの一例として、ハ
イブリドーマ2D11を挙げることができる。ハイブリドー
マ2D11より得られるモノクローナル抗体は、胃粘膜の腸
上皮化生および子宮頸部、胆嚢、肺の偏平上皮化生等の
上皮化生とは反応するが、十二指腸粘膜あるいは正常重
層偏平上皮等の正常組織とは全く反応しない。

【００２２】上記ハイブリドーマ2D11は、平成4年10月2
0日付けで工業技術院微生物工業技術研究所に微工研菌
寄第13205号(FERM P-13205)として寄託している。上記
のモノクローナル抗体産生ハイブリドーマによる抗体産
生は、培養フラスコや培養瓶を用いて、10〜20％ウシ胎
児血清含有RPMI1640培地または無血清培地等の動物細胞
培養用培地で培養し、その培養上清液を分離することに
より行うことができる。培養方法および条件は通常の動
物細胞培養方法に準じて、当業者が容易に選択し得るも
のである。

【００２３】さらに大量の抗体を産生する方法として
は、例えばハイブリドーマの親ミエローマ細胞の由来動
物と同系動物にプリスタン(2,6,10,14-テトラメチルペ
ンタデカン)等の鉱物油を腹腔内に投与した後、ハイブ
リドーマを腹腔内に投与して大量に増殖させる方法を採
用することができる。該方法によれば、ハイブリドーマ
は10〜18日程で腹水腫瘍を形成し、血清および腹水中に
高濃度(約1〜20mg/ml)の抗体が産生される。

【００２４】さらに精製が必要な場合には、該腹水を硫
安分画した後に、DEAEセルロースイオン交換クロマトグ
ラフィー、プロテインAあるいは胃粘膜ムチンの血液型
活性画分を結合させたセファロース4B等を用いたアフィ
ニティーカラムクロマトグラフィー、分子ふるいカラム
クロマトグラフィー等によって精製することが可能であ
る。

【００２５】

【発明の効果】このモノクローナル抗体は、上皮化生部
位とその他の変化を起こしている部位の鑑別、ある種の
前癌病変の診断に有用である。また、上皮化生と癌の関
係の研究、あるいは上皮化生の生化学的な解析をする上
で有用な手段となるものである。

【００２６】

【実施例】以下に本発明を実施例によりさらに具体的に
説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されること
はない。

【００２７】実施例１抗原の調製ヒト胃（Ｏ型、非分泌型）の粘膜をスライドグラスで掻
きとり、PBSの浮遊液として、10分間煮沸後、ホモジナ
イズ、遠心分離してムチンを含む上清20mlを得た。上清
を一夜蒸留水に対して透析後、凍結乾燥して粗胃ムチン
40mgを調製した。粗胃ムチンを1％SDSを含む20mMリン酸
緩衝液(pH7.4)で平衡化したSepharose 4Bカラム(25φ×
400mm)でゲル濾過してボイドボリューム溶出する糖含有
画分(抗原)11mgを得た。

【００２８】実施例２免疫実施例１で得られた抗原50μgをフロイント完全アジュ
バントのエマルジョンとして、BALB/cマウス（雌、6週
令）の腹腔内に投与して感作を行った。2週間後に同様
の操作を行い、さらに2週間後に50μgの抗原を生理食塩
液の溶液として腹腔内に投与して最終感作を行った。最
終の抗原感作の3日後にマウスの頸椎を脱臼させて殺
し、脾臓を無菌的に取り出した。NS-1培地を含むシャー
レに脾臓を入れてハサミで細片に切断し、ピぺッティン
グにより組織をほぐした後、ステンレスメッシュを通し
て脾細胞懸濁液を得た。次にこの懸濁液を500g、7分間
遠心分離して集めた脾細胞を新鮮なNS-1培地30mlに懸濁
した。この洗浄操作を3回繰り返し、最後に脾細胞をト
リパンブルーで染色して生細胞数を計数した。

【００２９】実施例３細胞融合マウスミエローマ細胞P3U1 5×10⁷個をNS-1培地30mlで
洗浄し、P3U1と実施例２で得られた脾細胞 1.5×10⁸個
を混合し、遠心分離を行い、上清を除去して細胞ペレッ
トを得た。このペレットにPEG1500 1ml、次いでRPMI164
0溶液2mlを徐々に加え、RPMI1640で最終的に10mlとした
後、再び遠心して得たペレットを15％ウシ胎児血清含有
HAT培地に脾細胞として5×10⁸個/mlとなるように懸濁さ
せ、96ウェルマイクロプレートに0.1mlずつ分注した。
培養は、5％CO₂−インキュベーター内で 37℃の条件で
行い、培養4日目、6日目に50μlずつHAT培地を添加し
た。

【００３０】実施例４抗体産生ハイブリドーマの選択
（１）細胞融合後、9日目からハイブリドーマの増殖を観察す
ると共に、培養上清中の抗体産生を以下の方法で測定し
た。実施例３で得られたハイブリドーマについて、培養
上清中の抗体産生の有無を酵素免疫測定法により調べ
た。ハイブリドーマが育成してきたウェルの上清50μl
ずつをそれぞれ予め前記抗原でコートした96ウェルソフ
トプレートに添加した。室温で１時間放置した後、PBS
で3回洗浄し、ペルオキシダーゼ標識抗マウスIgG抗血清
（第2抗体、CALTAG社製）50μlを加えて、室温で1時間
放置した。PBSで3回洗浄した後に、0.01％過酸化水素、
3.5mM O-フェニレンジアミンを含むクエン酸−リン酸緩
衝液(pH5.0) 50μlを加えて30分間発色させ、2N-H₂SO₄
50μlで反応を停止した後、波長490nmにおける吸光度を
測定し、胃粘膜ムチンの血液型活性画分に反応する抗体
を産生するハイブリドーマを20株得た。

【００３１】実施例５抗体産生ハイブリドーマの選択
（２）実施例４で得られた20株について、免疫組織染色による
スクリーニングを行った。ホルマリン固定パラフィン包
埋病理組織切片を脱パラフィン用キシレンに15分ずつ2
回浸漬した。次に99％、90％、80％及び70％のエタノー
ル系列を通し、0.3％過酸化水素加メタノール（30％過
酸化水素水原液：メタノール＝1：100）に20分浸して内
因性ペルオキシダーゼ活性を除去した後PBSで流水洗し
た。5％正常ウマ血清−PBSを切片に滴下して20分反応さ
せ非特異的結合をブロックした後、PBSで軽く洗い流し
た。この様な処理をした標本に培養上清を200〜500μl
載せ、30分間反応させた後、PBSで3分間ずつ5回洗浄し
た。次に。ビオチン化抗マウスIgG抗体（ウマ、Vector
社製）200〜500μlを載せ、30分間反応させた後、PBSで
3分間ずつ5回洗浄した。

【００３２】アビジンビオチンペルオキシダーゼコンプ
レックスの調製は、Vectastain ABCkit（Vector社製）
を用い、アビジンDH：ビオチン化ペルオキシダーゼ＝1:
3のモル比で混合し、室温で30分間反応させコンプレッ
クスを形成させた。このコンプレックスを含む溶液を組
織切片に滴下し30分間反応させた。その後、PBSで3分間
ずつ5回洗浄した。次に、AEC Substrate Kit（Vector社
製）を用いて調製した基質溶液を組織切片に滴下し、20
分間反応させた。水道水で5分間洗浄した。

【００３３】対比染色としてヘマトキシリン染色を用い
た。マイヤーヘマトキシリン溶液中で組織切片を3分間
染色し、水道水で20分間洗浄した。20株中、1株のハイ
ブリドーマが産生する抗体のみが、免疫組織染色におい
て胃幽門部の腸上皮化生のみを染色した。このハイブリ
ドーマを限界希釈法によりクローニングし、ハイブリド
ーマ2D11を得た。

【００３４】実施例６モノクローナル抗体の産生
（１）実施例５で得られたハイブリドーマ2D11をNS-1培地で、
96ウェルプレート、25dlフラスコ、75dlフラスコとスケ
ールアップしながらそれぞれ37℃、5％炭酸ガス培養装
置にて培養して培養上清を集めた。

【００３５】実施例７モノクローナル抗体の産生
（２） 6週令のBALB/cマウスの腹腔に0.5mlのプリスタン（アル
ドリッチ社製）を注射し、3週間後にハイブリドーマ2D1
1をマウスあたり1×10⁷個の割合で腹腔内に注射した。
ハイブリドーマ移植の1〜2週間後に、腹部の膨満を確認
した後、開腹して腹水を回収した。1匹のマウスから約5
mlの腹水が採取でき、腹水1ml中にモノクローナル抗体
タンパクが約10mg含まれていた。

【００３６】実施例８モノクローナル抗体の特性
（１）ハイブリドーマ2D11の生産するモノクローナル抗体の各
組織との反応性を実施例５のスクリーニングと同様の方
法で調べた。その結果を表１に示した。

【００３７】

【表１】

【００３８】その結果、ハイブリドーマ2D11の生産する
モノクローナル抗体は、胃粘膜の腸上皮化生および子宮
頸部、胆嚢、肺の偏平上皮化生と選択的に反応すること
が示された。

【００３９】実施例９．モノクローナル抗体の特性
（２）ハイブリドーマ2D11の産生するモノクローナル抗体の抗
原認識部位を以下の方法で調べた。ハイブリドーマ2D11
の生産するモノクローナル抗体を結合したゲルを用いて
胃ムチンのアフィニチークロマトグラフィーを行うと高
分子量（分子量：数百万）のムチンのみが結合した。

【００４０】なお、モノクローナル抗体を結合したゲル
は、以下のように調製した。精製した2D11 5mg(1.2ml
0.2Mリン酸緩衝液 pH7.5)とホルミルセロファイン（生
化学工業）0.8gとを4℃で2時間振とう後、6mgのNaCNBH₃
を加え、4℃で8時間振とうした。ゲルを蒸留水で洗浄
後、1Mエタノールアミンを含むリン酸緩衝液1.5mlと6mg
のNaCNBH₃を加えて2時間室温で振とうし、ゲルを蒸留水
で洗浄後、PBSに懸濁させて調製した。また本抗体と胃
ムチンおよび上皮化生組織との反応は、胃ムチンおよび
組織の過ヨウ素酸処理で消失した。従って、本抗体はム
チンの糖鎖を認識する抗体と考えられる。

【００４１】実施例１０モノクローナル抗体の特性
（３）ハイブリドーマ2D11の生産するモノクローナル抗体のサ
ブクラスをバインディングサイト社サブクラスキットを
用いてELISA法およびイムノブッロット法により決定し
た。その結果、本抗体はIgG2bのサブクラスの抗体であ
ることが判明した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｇ０１Ｎ 33/574 Ｚ 9015−2Ｊ 33/577 Ｂ 9015−2Ｊ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】上皮化生に反応するモノクローナル抗体
【請求項２】ヒト胃粘膜ムチンの血液型活性画分で免
疫した動物の抗体産生細胞と動物のミエローマ細胞との
ハイブリドーマによって生産され、かつ、上皮化生に反
応するモノクローナル抗体
【請求項３】上皮化生に反応するモノクローナル抗体
を産生するハイブリドーマ