JPH0614788A - 修飾サ−モリシン様酵素及びこの酵素を用いるα−Ｌ−アスパラチル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステル前駆体の製造方法 - Google Patents
修飾サ−モリシン様酵素及びこの酵素を用いるα−Ｌ−アスパラチル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステル前駆体の製造方法Info
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- JPH0614788A JPH0614788A JP3328378A JP32837891A JPH0614788A JP H0614788 A JPH0614788 A JP H0614788A JP 3328378 A JP3328378 A JP 3328378A JP 32837891 A JP32837891 A JP 32837891A JP H0614788 A JPH0614788 A JP H0614788A
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- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
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- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【構成】バチルス属金属酵素にテトラニトロメタンを作
用させてチロシン残基をニトロ化した修飾サ−モラシン
様酵素及びこの修飾サ−モリシン様酵素を使用すること
を特徴とするα−Ｌ−アスパラチル−Ｌ−フェニルアラ
ニンメチルエステル前駆体としてのＮ−ベンジルオキシ
カルボニル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステルを製
造する方法。 【効果】本発明のニトロ化されたサ−モリシン様酵素
は、カゼインなどによる加水分解及び自己分解に対する
耐久性が向上し、α−ＡＰＭの前駆体であるＺ−ＡＰＭ
の合成活性も向上する。又、その効果は酵素の修飾方
法、例えばニトロ化のｐＨ等により容易に調節すること
が可能である。
用させてチロシン残基をニトロ化した修飾サ−モラシン
様酵素及びこの修飾サ−モリシン様酵素を使用すること
を特徴とするα−Ｌ−アスパラチル−Ｌ−フェニルアラ
ニンメチルエステル前駆体としてのＮ−ベンジルオキシ
カルボニル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステルを製
造する方法。 【効果】本発明のニトロ化されたサ−モリシン様酵素
は、カゼインなどによる加水分解及び自己分解に対する
耐久性が向上し、α−ＡＰＭの前駆体であるＺ−ＡＰＭ
の合成活性も向上する。又、その効果は酵素の修飾方
法、例えばニトロ化のｐＨ等により容易に調節すること
が可能である。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は修飾サ−モリシン様酵素
に関するものであり、この修飾サ−モリシン様酵素を使
用して、人工甘味料の一種であるα−Ｌ−アスパラチル
−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステル（以下、α−Ａ
ＰＭと略する。）前駆体であるＮ−ベンジルオキシカル
ボニル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステル（以下、
Ｚ−ＡＰＭと略する。）とＬ−フェニルアラニンメチル
エステル（以下、ＰＭと略する。）との複塩を製造する
方法に関する。
に関するものであり、この修飾サ−モリシン様酵素を使
用して、人工甘味料の一種であるα−Ｌ−アスパラチル
−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステル（以下、α−Ａ
ＰＭと略する。）前駆体であるＮ−ベンジルオキシカル
ボニル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステル（以下、
Ｚ−ＡＰＭと略する。）とＬ−フェニルアラニンメチル
エステル（以下、ＰＭと略する。）との複塩を製造する
方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】α−ＡＰＭはショ糖の２００倍近い甘味
性を有する既知のジペプチドであり、ダイエット甘味剤
としてその需要が大きく伸長しているものである。α−
ＡＰＭの製造方法には化学的合成方法と酵素的合成方法
が、共に数多く知られている。例えば化学的な製法とし
ては、アミノ基の保護したＬ−アスパラギン酸無水物と
ＰＭを適当な媒体中で縮合させたのちハロゲン化水素酸
との共存下に保護基を脱離させ、水、アルコ−ル及びハ
ロゲン化水素酸と処理することによりエステル化を行い
得る方法が代表的製法である。しかしながら化学的方法
は、β−ＡＰＭを副生し脱保護基のため鉱酸水溶液を使
用するのでα−ＡＰＭのメチルエステルの加水分解が進
行し易い点に問題がある。一方、酵素による合成方法と
しては、Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−アスパラ
ギン酸（以下Ｚ−Ａｓｐと略称する。）とＰＭとを金属
酵素の存在下に、縮合させてＺ−ＡＰＭを製造した後、
接触還元によりベンジルオキシカルボニル基を除去して
製造する方法を上げることが出来き、化学合成法に比べ
ると高選択的製法である。
性を有する既知のジペプチドであり、ダイエット甘味剤
としてその需要が大きく伸長しているものである。α−
ＡＰＭの製造方法には化学的合成方法と酵素的合成方法
が、共に数多く知られている。例えば化学的な製法とし
ては、アミノ基の保護したＬ−アスパラギン酸無水物と
ＰＭを適当な媒体中で縮合させたのちハロゲン化水素酸
との共存下に保護基を脱離させ、水、アルコ−ル及びハ
ロゲン化水素酸と処理することによりエステル化を行い
得る方法が代表的製法である。しかしながら化学的方法
は、β−ＡＰＭを副生し脱保護基のため鉱酸水溶液を使
用するのでα−ＡＰＭのメチルエステルの加水分解が進
行し易い点に問題がある。一方、酵素による合成方法と
しては、Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−アスパラ
ギン酸（以下Ｚ−Ａｓｐと略称する。）とＰＭとを金属
酵素の存在下に、縮合させてＺ−ＡＰＭを製造した後、
接触還元によりベンジルオキシカルボニル基を除去して
製造する方法を上げることが出来き、化学合成法に比べ
ると高選択的製法である。
【０００３】
【本発明が解決しようとする課題】酵素の利用に於ける
最大の課題は、目的物質を効率良く生産するために存在
の知られている全ての酵素を自由に活用出来る状況を作
り上げることであり、その上で酵素反応を旨く調節する
ことである。
最大の課題は、目的物質を効率良く生産するために存在
の知られている全ての酵素を自由に活用出来る状況を作
り上げることであり、その上で酵素反応を旨く調節する
ことである。
【０００４】該酵素は尚その安定性、活性能等の面で改
善される余地を有するものである。
善される余地を有するものである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、該酵素の
蛋白分子の化学修飾を着想し、鋭意研究を重ねた結果、
該酵素を特定の方法によりニトロ化することで、殊に自
己分解に対する安定性が顕著に向上されることを見出だ
し、ここに本発明を完成するに至った。以下、本発明を
詳細に説明する。
蛋白分子の化学修飾を着想し、鋭意研究を重ねた結果、
該酵素を特定の方法によりニトロ化することで、殊に自
己分解に対する安定性が顕著に向上されることを見出だ
し、ここに本発明を完成するに至った。以下、本発明を
詳細に説明する。
【０００６】即ち、本発明はサ−モリシン様酵素にテト
ラニトロメタンを作用させてニトロ化することを特徴と
する修飾サ−モリシン様酵素の製造方法に係わる。本発
明に於いてニトロ化すべき原料であるサ−モリシン様酵
素としては、従来公知のバチルス属金属酵素を利用す
る。こらは市販のサ−モリシンに限定されず、別途にバ
チルス属細菌より調製された培養液、これらをイオン交
換カラムクロマトグラフ法やゲルクロマトグラフ法によ
り精製した精製品、他の同様な酵素的性質を有するバチ
ルス属金属酵素であればよい。
ラニトロメタンを作用させてニトロ化することを特徴と
する修飾サ−モリシン様酵素の製造方法に係わる。本発
明に於いてニトロ化すべき原料であるサ−モリシン様酵
素としては、従来公知のバチルス属金属酵素を利用す
る。こらは市販のサ−モリシンに限定されず、別途にバ
チルス属細菌より調製された培養液、これらをイオン交
換カラムクロマトグラフ法やゲルクロマトグラフ法によ
り精製した精製品、他の同様な酵素的性質を有するバチ
ルス属金属酵素であればよい。
【０００７】上記原料酵素にテトラニトロメタンを作用
させて該酵素をニトロ化する。このニトロ化反応は、原
料酵素の水溶液中にニトロ化剤のアルコ−ル溶液を添加
することにより実施される。ここで原料酵素の水溶液
は、適当なｐＨ範囲の水溶液であってもよく、またはト
リス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−塩酸緩衝液な
どの通常の緩衝剤を用いて調製される水溶液であっても
良い、該液には更に塩化カルシウム等の金属イオンの適
当量（通常１〜１０ミリモル）を添加存在させることも
可能である。また上記水溶液は、例えば水酸化ナトリウ
ム等により、そのｐＨを一般に７．０〜１０．０程度に
調節されるのが望ましい。更に上記ニトロ化反応に用い
られるニトロ剤の使用量は特に限定されるものではない
が、通常酵素量の４０〜２００倍モル範囲が好ましく、
添加方法も複数回に別けて加えるのが適当である。該ニ
トロ化反応は通常室温下で良好に進行するが、温和な加
温或いは冷却条件を採用出来得る。通常ニトロチロシン
含量を分光学的手法により追跡、反応は約１時間程で終
了する。反応終了後、得られる反応液は、適当な手段、
例えばトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−塩酸
緩衝液（ｐＨ ７．５）に対する透析やゲル濾過などを
行って実用することが出来る。更には、常法に従って乾
燥粉末や固定化することも可能である。
させて該酵素をニトロ化する。このニトロ化反応は、原
料酵素の水溶液中にニトロ化剤のアルコ−ル溶液を添加
することにより実施される。ここで原料酵素の水溶液
は、適当なｐＨ範囲の水溶液であってもよく、またはト
リス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−塩酸緩衝液な
どの通常の緩衝剤を用いて調製される水溶液であっても
良い、該液には更に塩化カルシウム等の金属イオンの適
当量（通常１〜１０ミリモル）を添加存在させることも
可能である。また上記水溶液は、例えば水酸化ナトリウ
ム等により、そのｐＨを一般に７．０〜１０．０程度に
調節されるのが望ましい。更に上記ニトロ化反応に用い
られるニトロ剤の使用量は特に限定されるものではない
が、通常酵素量の４０〜２００倍モル範囲が好ましく、
添加方法も複数回に別けて加えるのが適当である。該ニ
トロ化反応は通常室温下で良好に進行するが、温和な加
温或いは冷却条件を採用出来得る。通常ニトロチロシン
含量を分光学的手法により追跡、反応は約１時間程で終
了する。反応終了後、得られる反応液は、適当な手段、
例えばトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−塩酸
緩衝液（ｐＨ ７．５）に対する透析やゲル濾過などを
行って実用することが出来る。更には、常法に従って乾
燥粉末や固定化することも可能である。
【０００８】
【実施例】以下に本発明を更に詳細に説明するために実
施例を記載するが、これらの実施例は本発明を説明する
ための一例であり、本発明を限定するものではない。
施例を記載するが、これらの実施例は本発明を説明する
ための一例であり、本発明を限定するものではない。
【０００９】実施例１ （ニトロ化）配列表１のアミノ酸配列を有するサ−モリ
シン様酵素（２〜４ｍｇ／ミリリットル）を０．１Ｍト
リス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−塩酸緩衝液、
pH７．０〜９．５に溶かす。９５％エタノ−ルを用いて
テトラニトロメタンの０．１５Ｍ溶液を調製し、蛋白質
溶液１ミリリットル当たり２０マイクロリットルを加え
る。室温、６０分間、５０マイクロリットルの１Ｍメル
カプトエタノ−ルを加えて反応を停止し直ちに１％ＮＨ
４ＨＣＯ３に対して、４℃で徹底的に透析した。透析し
た酵素は、凍結乾燥して以下の実験に使用した。 （残存活性を指標とする酵素耐久性試験）上記ニトロ化
により得られた酵素を適当な濃度に希釈し、荻原らのカ
ゼイン−フォ−リン法により酵素活性を測定した。以下
に、このカゼイン−フォ−リン法を説明する。
シン様酵素（２〜４ｍｇ／ミリリットル）を０．１Ｍト
リス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−塩酸緩衝液、
pH７．０〜９．５に溶かす。９５％エタノ−ルを用いて
テトラニトロメタンの０．１５Ｍ溶液を調製し、蛋白質
溶液１ミリリットル当たり２０マイクロリットルを加え
る。室温、６０分間、５０マイクロリットルの１Ｍメル
カプトエタノ−ルを加えて反応を停止し直ちに１％ＮＨ
４ＨＣＯ３に対して、４℃で徹底的に透析した。透析し
た酵素は、凍結乾燥して以下の実験に使用した。 （残存活性を指標とする酵素耐久性試験）上記ニトロ化
により得られた酵素を適当な濃度に希釈し、荻原らのカ
ゼイン−フォ−リン法により酵素活性を測定した。以下
に、このカゼイン−フォ−リン法を説明する。
【００１０】酵素希釈用緩衝液（１０ミリモル ホウ酸
バッファ−（ｐＨ＝８．０）−２ミリモル 硫酸カルシ
ウム）で１〜２μｇ／ミリリットルに濃度調整した酵素
溶液各１ミリリットルと基質溶液（１％カゼイン（Ｈａ
ｍｍａｒｓｔｅｎ）含有リン酸緩衝液（ｐＨ＝７．
２））を３５℃で５分間前処理する。この各酵素溶液に
基質溶液１ミリリットルを加え、３５℃で１０分間イン
キュベ−ションする。反応停止液（０．１モル トリク
ロロ酢酸、０．２モル 酢酸ナトリウム、０．３モル
酢酸）２ミリリットルを加え、さらに３０分間３５℃に
保持し、酸不溶性の蛋白質を完全に析出させる。不溶物
を濾過し、濾液を新しい試験管に１ミリリットルずつ分
注する。それぞれにアルカリ溶液５ミリリットルとフォ
リン試薬（蛋白質測定用フェノ−ル試薬（Ｆｏｌｉｎ−
Ｃｉｏｃａｌｔｅｎ´ｓ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｓｏｌｎ）
を蒸留水で５倍希釈液）１ミリリットルを加え、３５℃
で２０分間インキュベ−ションする。６６０ｎｍの吸光
度を測定し、以下の式に示される活性の計算式に当ては
めた。バックグラウンドを測定する際には、反応停止液
と基質溶液を加える順序を逆にした。
バッファ−（ｐＨ＝８．０）−２ミリモル 硫酸カルシ
ウム）で１〜２μｇ／ミリリットルに濃度調整した酵素
溶液各１ミリリットルと基質溶液（１％カゼイン（Ｈａ
ｍｍａｒｓｔｅｎ）含有リン酸緩衝液（ｐＨ＝７．
２））を３５℃で５分間前処理する。この各酵素溶液に
基質溶液１ミリリットルを加え、３５℃で１０分間イン
キュベ−ションする。反応停止液（０．１モル トリク
ロロ酢酸、０．２モル 酢酸ナトリウム、０．３モル
酢酸）２ミリリットルを加え、さらに３０分間３５℃に
保持し、酸不溶性の蛋白質を完全に析出させる。不溶物
を濾過し、濾液を新しい試験管に１ミリリットルずつ分
注する。それぞれにアルカリ溶液５ミリリットルとフォ
リン試薬（蛋白質測定用フェノ−ル試薬（Ｆｏｌｉｎ−
Ｃｉｏｃａｌｔｅｎ´ｓ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｓｏｌｎ）
を蒸留水で５倍希釈液）１ミリリットルを加え、３５℃
で２０分間インキュベ−ションする。６６０ｎｍの吸光
度を測定し、以下の式に示される活性の計算式に当ては
めた。バックグラウンドを測定する際には、反応停止液
と基質溶液を加える順序を逆にした。
【００１１】 得られた結果を表１に示した。
【００１２】
【表１】 表中のカゼイン分解値は、原料酵素を１００％とした時
の相対活性値で示されている。
の相対活性値で示されている。
【００１３】表１から明らかな様に、ニトロ化反応のｐ
Ｈがアルカリ側になるにつれて、カゼインによる加水分
解に対する耐久性が向上し、ｐＨ９に於けるニトロ化反
応で得られた酵素では、加水分解率が原料酵素よりも５
０％も減少している。 （ＡＰＭの前駆体（ＺＡＰＭ）の合成）Ｌ−フェニルア
ラニンメチルエステル塩酸塩とＮ−ベンジルオキシカル
ボニル−Ｌ−アスパラギン酸とをそれぞれ０．２Ｍの濃
度で含む水溶液（ｐＨ＝７．０）１．０ミリリットルに
実施例１で得た各酵素１５μＭを加え４０℃で反応させ
た。反応収率は高速液体クロマトグラフィ−（カラム：
ＯＤＳ−８０Ｔｍ，ＴＯＳＯＨ，流速１ミリリットル／
ｍｉｎ，溶離液トリエチルアミン−燐酸緩衝液 pH 3.0
，４０％アセトニトリル）を用いて実施した。得られ
た結果を表２に示した。
Ｈがアルカリ側になるにつれて、カゼインによる加水分
解に対する耐久性が向上し、ｐＨ９に於けるニトロ化反
応で得られた酵素では、加水分解率が原料酵素よりも５
０％も減少している。 （ＡＰＭの前駆体（ＺＡＰＭ）の合成）Ｌ−フェニルア
ラニンメチルエステル塩酸塩とＮ−ベンジルオキシカル
ボニル−Ｌ−アスパラギン酸とをそれぞれ０．２Ｍの濃
度で含む水溶液（ｐＨ＝７．０）１．０ミリリットルに
実施例１で得た各酵素１５μＭを加え４０℃で反応させ
た。反応収率は高速液体クロマトグラフィ−（カラム：
ＯＤＳ−８０Ｔｍ，ＴＯＳＯＨ，流速１ミリリットル／
ｍｉｎ，溶離液トリエチルアミン−燐酸緩衝液 pH 3.0
，４０％アセトニトリル）を用いて実施した。得られ
た結果を表２に示した。
【００１４】
【表２】 表中のＺ−ＡＰＭの合成活性値は、原料酵素を１００％
とした時の相対活性値で示されている。
とした時の相対活性値で示されている。
【００１５】表２から明らかな様に、Ｚ−ＡＰＭ合成活
性が増加し、ｐＨ９で調製した修飾酵素では、原料酵素
よりも、活性が２０％上昇した。 （自己分解耐久性試験）上記ニトロ化で得られた各酵素
溶液（１．２５マイクログラム／ミリリットル）を３７
℃でインキュベ−ションし、経時的に残存する酵素活性
を２％カゼインを用いて測定した。結果を表３に示し
た。
性が増加し、ｐＨ９で調製した修飾酵素では、原料酵素
よりも、活性が２０％上昇した。 （自己分解耐久性試験）上記ニトロ化で得られた各酵素
溶液（１．２５マイクログラム／ミリリットル）を３７
℃でインキュベ−ションし、経時的に残存する酵素活性
を２％カゼインを用いて測定した。結果を表３に示し
た。
【００１６】
【表３】 表中の残存活性値は、時間０に於ける各々の酵素活性を
１００％とした時の相対活性値で示されている。
１００％とした時の相対活性値で示されている。
【００１７】表３から明らかな様に、これらの酵素の自
己分解耐性試験では、インキュベ−ション開始から２時
間後でｐＨ８及び９でニトロ化した修飾酵素が未反応の
酵素に比べてカゼイン分解残存活性１０％以上高く、原
料酵素よりも安定な酵素である。
己分解耐性試験では、インキュベ−ション開始から２時
間後でｐＨ８及び９でニトロ化した修飾酵素が未反応の
酵素に比べてカゼイン分解残存活性１０％以上高く、原
料酵素よりも安定な酵素である。
【００１８】配列表２及び３の酵素に関しても、上記実
施例の操作を施したところ同様な結果を得た。
施例の操作を施したところ同様な結果を得た。
【００１９】
【発明の効果】本発明のニトロ化されたサ−モリシン様
酵素は、カゼインなどによる加水分解及び自己分解に対
する耐久性が向上し、α−ＡＰＭの前駆体であるＺ−Ａ
ＰＭの合成活性も向上する。又、その効果は酵素の修飾
方法、例えばニトロ化のｐＨ等により容易に調節するこ
とが可能である。
酵素は、カゼインなどによる加水分解及び自己分解に対
する耐久性が向上し、α−ＡＰＭの前駆体であるＺ−Ａ
ＰＭの合成活性も向上する。又、その効果は酵素の修飾
方法、例えばニトロ化のｐＨ等により容易に調節するこ
とが可能である。
【００２０】尚、本発明における配列表１〜３は以下の
様に表現される。
様に表現される。
【００２１】［配列表１］ 配列の長さ：３１６ トポロジ−：直鎖状 配列の種類：蛋白質 起源：バチルス属 Ile Thr Gly Thr Ser Thr Val Gly Val Gly Arg Gly Val Leu Gly 1 5 10 15 Asp Gln Lys Asn Ile Asn Thr Thr Tyr Ser Thr Tyr Tyr Tyr Leu 20 25 30 Gln Asp Asn Thr Arg Gly Asp Gly Ile Phe Thr Tyr Asp Ala Lys 35 40 45 Tyr Arg Thr Thr Leu Pro Gly Ser Leu Trp Ala Asp Ala Asp Asn 50 55 60 Gln Phe Phe Ala Ser Tyr Asp Ala Pro Ala Val Asp Ala His Tyr 65 70 75 Tyr Ala Gly Val Thr Tyr Asp Tyr Tyr Lys Asn Val His Asn Arg 80 85 90 Leu Ser Tyr Asp Gly Asn Asn Ala Ala Ile Arg Ser Ser Val His 95 100 105 Tyr Ser Gln Gly Tyr Asn Asn Ala Phe Trp Asn Gly Ser Glu Met 110 115 120 Val Tyr Gly Asp Gly Asp Gly Gln Thr Phe Ile Pro Leu Ser Gly 125 130 135 Gly Ile Asp Val Val Ala His Glu Leu Thr His Ala Val Thr Asp 140 145 150 Tyr Thr Ala Gly Leu Ile Tyr Gln Asn Glu Ser Gly Ala Ile Asn 155 160 165 Glu Ala Ile Ser Asp Ile Phe Gly Thr Leu Val Glu Phe Tyr Ala 170 175 180 Asn Lys Asn Pro Asp Trp Glu Ile Gly Glu Asp Val Tyr Thr Pro 185 190 195 Gly Ile Ser Gly Asp Ser Leu Arg Ser Met Ser Asp Pro Ala Lys 200 205 210 Tyr Gly Asp Pro Asp His Tyr Ser Lys Arg Tyr Thr Gly Thr Gln 215 220 225 Asp Asn Gly Gly Val His Ile Asn Ser Gly Ile Ile Asn Lys Ala 230 235 240 Ala Tyr Leu Ile Ser Gln Gly Gly Thr His Tyr Gly Val Ser Val 245 250 255 Val Gly Ile Gly Arg Asp Lys Leu Gly Lys Ile Phe Tyr Arg Ala 260 265 270 Leu Thr Gln Tyr Leu Thr Pro Thr Ser Asn Phe Ser Gln Leu Arg 275 280 285 Ala Ala Ala Val Gln Ser Ala Thr Asp Leu Tyr Gly Ser Thr Ser 290 295 300 Gln Glu Val Ala Ser Val Lys Gln Ala Phe Asp Ala Val Gly Val 305 310 315 Lys
【００２２】［配列表２］ 配列の長さ：３１６ トポロジ−：直鎖状 配列の種類：蛋白質 起源：バチルス属 Ile Thr Gly Thr Ser Thr Val Gly Val Gly Arg Gly Val Leu Gly 1 5 10 15 Asp Gln Lys Asn Ile Asn Thr Thr Tyr Ser Thr Tyr Tyr Tyr Leu 20 25 30 Gln Asp Asn Thr Arg Gly Asn Gly Ile Phe Thr Tyr Asp Ala Lys 35 40 45 Tyr Arg Thr Thr Leu Pro Gly Ser Leu Trp Ala Asp Ala Asp Asn 50 55 60 Gln Phe Phe Ala Ser Tyr Asp Ala Pro Ala Val Asp Ala His Tyr 65 70 75 Tyr Ala Gly Val Thr Tyr Asp Tyr Tyr Lys Asn Val His Asn Arg 80 85 90 Leu Ser Tyr Asp Gly Asn Asn Ala Ala Ile Arg Ser Ser Val His 95 100 105 Tyr Ser Gln Gly Tyr Asn Asn Ala Phe Trp Asn Gly Ser Gln Met 110 115 120 Val Tyr Gly Asp Gly Asp Gly Gln Thr Phe Ile Pro Leu Ser Gly 125 130 135 Gly Ile Asp Val Val Ala His Glu Leu Thr His Ala Val Thr Asp 140 145 150 Tyr Thr Ala Gly Leu Ile Tyr Gln Asn Glu Ser Gly Ala Ile Asn 155 160 165 Glu Ala Ile Ser Asp Ile Phe Gly Thr Leu Val Glu Phe Tyr Ala 170 175 180 Asn Lys Asn Pro Asp Trp Glu Ile Gly Glu Asp Val Tyr Thr Pro 185 190 195 Gly Ile Ser Gly Asp Ser Leu Arg Ser Met Ser Asp Pro Ala Lys 200 205 210 Tyr Gly Asp Pro Asp His Tyr Ser Lys Arg Tyr Thr Gly Thr Gln 215 220 225 Asp Asn Gly Gly Val His Ile Asn Ser Gly Ile Ile Asn Lys Ala 230 235 240 Ala Tyr Leu Ile Ser Gln Gly Gly Thr His Tyr Gly Val Ser Val 245 250 255 Val Gly Ile Gly Arg Asp Lys Leu Gly Lys Ile Phe Tyr Arg Ala 260 265 270 Leu Thr Gln Tyr Leu Thr Pro Thr Ser Asn Phe Ser Gln Leu Arg 275 280 285 Ala Ala Ala Val Gln Ser Ala Thr Asp Leu Tyr Gly Ser Thr Ser 290 295 300 Gln Glu Val Ala Ser Val Lys Gln Ala Phe Asp Ala Val Gly Val 305 310 315 Lys
【００２３】［配列表３］ 配列の長さ：３１７ トポロジ−：直鎖状 配列の種類：蛋白質 起源：バチルス属 Val Thr Gly Thr Asn Lys Val Gly Thr Gly Lys Gly Val Leu Gly 1 5 10 15 Asp Thr Lys Ser Leu Asn Thr Thr Leu Ser Gly Ser Ser Tyr Tyr 20 25 30 Leu Gln Asp Asn Thr Arg Gly Ala Thr Ile Phe Thr Tyr Asp Ala 35 40 45 Lys Asn Arg Ser Thr Leu Pro Gly Thr Leu Arg Gly Ala Thr Ile 50 55 60 Asn Val Phe Asn Ala Ala Tyr Asp Ala Ala Ala Val Asp Ala His 65 70 75 Tyr Tyr Ala Gly Lys Thr Tyr Asp Tyr Tyr Lys Ala Thr Phe Asn 80 85 90 Arg Asn Ser Ile Asn Asp Ala Gly Ala Pro Leu Lys Ser Thr Val 95 100 105 His Tyr Gly Ser Asn Tyr Asn Asn Ala Phe Trp Asn Gly Ser Glu 110 115 120 Met Val Tyr Gly Asp Gly Asp Gly Gln Thr Phe Thr Ser Leu Ser 125 130 135 Gly Gly Ile Asp Val Ile Gly His Glu Leu Thr His Ala Val Thr 140 145 150 Gln Asn Ser Ser Asn Leu Ile Tyr Gln Asn Glu Ser Gly Ala Leu 155 160 165 Asn Glu Ala Ile Ser Asp Ile Phe Gly Thr Leu Val Glu Phe Tyr 170 175 180 Asp Asn Arg Asn Pro Asp Trp Glu Ile Gly Glu Asp Ile Tyr Thr 185 190 195 Pro Gly Lys Ala Gly Asp Ala Leu Arg Ser Met Ser Asp Pro Thr 200 205 210 Lys Tyr Gly Asp Pro Asp His Tyr Ser Lys Arg Tyr Thr Gly Ser 215 220 225 Ser Asp Asn Gly Gly Val His Thr Asn Ser Gly Ile Ile Asn Lys 230 235 240 Gln Ala Tyr Leu Leu Ala Asn Gly Gly Thr His Tyr Gly Val Thr 245 250 255 Val Thr Gly Ile Gly Lys Asp Lys Leu Gly Ala Ile Tyr Tyr Arg 260 265 270 Ala Asn Thr Gln Tyr Phe Thr Gln Ser Thr Thr Phe Ser Gln Ala 275 280 285 Arg Ala Gly Ala Val Gln Ala Ala Ala Asp Leu Tyr Gly Ala Asn 290 295 300 Ser Ala Glu Val Ala Ala Val Lys Gln Ser Phe Ser Ala Val Gly 305 310 315 Val Asn
フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 9/54 Ｃ１２Ｒ 1:07）
Claims (3)
- 【請求項１】バチルス属金属酵素にテトラニトロメタン
を作用させてチロシン残基をニトロ化した修飾サ−モラ
シン様酵素。 - 【請求項２】前記金属酵素のアミノ酸配列が、配列表
１、２又は３で表せられることを特徴とする請求項１記
載の酵素。 - 【請求項３】請求項１又は２に記載の修飾サ−モリシン
様酵素を使用することを特徴とするα−Ｌ−アスパラチ
ル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステル前駆体として
のＮ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−フェニルアラニ
ンメチルエステルを製造する方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3328378A JPH0614788A (ja) | 1991-11-18 | 1991-11-18 | 修飾サ−モリシン様酵素及びこの酵素を用いるα−Ｌ−アスパラチル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステル前駆体の製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3328378A JPH0614788A (ja) | 1991-11-18 | 1991-11-18 | 修飾サ−モリシン様酵素及びこの酵素を用いるα−Ｌ−アスパラチル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステル前駆体の製造方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0614788A true JPH0614788A (ja) | 1994-01-25 |
Family
ID=18209584
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3328378A Pending JPH0614788A (ja) | 1991-11-18 | 1991-11-18 | 修飾サ−モリシン様酵素及びこの酵素を用いるα−Ｌ−アスパラチル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステル前駆体の製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0614788A (ja) |
-
1991
- 1991-11-18 JP JP3328378A patent/JPH0614788A/ja active Pending
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