JPH0614799A - ビリルビン干渉除去用試薬組成物及びそれを用いた生体成分の測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】本発明は生体成分を酸化酵素−パーオキシダー
ゼ−発色剤系で測定するに際し、共存するビリルビンの
反応干渉を回避することを特徴とする生体成分の測定法
及びそれに用いる試薬組成物に関する。 【構成】ヒドロキシルアミン、２−カルボキシ−５−ヒ
ドロキシ−γ−ピロンあるいは２−クロロメチル−５−
ヒドロキシ−γ−ピロンがビリルビンオキシダーゼの発
色剤に対する作用は強く阻害するものの、ビリルビンに
対する作用はほとんど阻害しない事を見い出し、これら
の物質をビリルビンオキシダーゼと共に使用する事によ
り、ビリルビンを消去してビリルビンによる干渉作用を
回避する事が出来る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は生体成分を酸化酵素−パ
ーオキシダーゼ−発色剤系で測定するに際し、共存する
ビリルビンの反応干渉を回避することを特徴とする生体
成分の測定法及びそれに用いる試薬組成物に関する。近
年、臨床化学分析において、酸化酵素−パーオキシダー
ゼ−発色試薬系を用いた酵素的分析法の進歩はめざまし
い。しかし、この測定系を用いた場合、生体試料中に存
在する種々の還元物質、投与薬剤、生体色素などにより
干渉を受け易い。特に生体色素の一つ、ビリルビンによ
る干渉作用は特に大きな問題で、未だに基本的解決がな
されていないのが現状である。

【０００２】

【従来の技術】従来技術としては、例えば、グルコース
オキシダーゼ−パーオキシダーゼ−発色試薬系によりグ
ルコースを定量する方法において、フェロシアン化物を
用いる方法〔特公昭55-25840号公報、クリニカルケミス
トリー（Clinical Chemistry），26巻，227〜231頁（19
81年）〕、ウリカーゼ−パーオキシダーゼ−発色試薬系
により尿酸を定量する方法において、フェロシアン化イ
オンを用いる方法（特開昭55-138656号公報）、ピクリ
ン酸との反応で尿酸を定量する方法において、アスコル
ビン酸によりビリルビンの酸化を阻止する方法（特開昭
55-29718号公報）、多波長光度計を用いてビリルビンに
よる干渉を補正する方法において、ＥＤＴＡ−鉄錯体を
添加する方法（特開昭57-71398号公報）、ビリルビン特
異性菌性酵素又はビリルビンオキシダーゼを反応系に添
加して、ビリルビンを消去する方法（特公昭55-25840号
公報、特開昭55-138656号公報、特開昭55-29718号公
報、特開昭57-71398号公報、特開昭59-18000号公報）等
がある。しかし、いずれも満足できる方法とはいえなか
った。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】特に前記したビリルビ
ンオキシダーゼを用いてビリルビンを消去する方法は以
下の理由で有用な方法と考えられている。つまり、ビリ
ルビンオキシダーゼはビリルビンを酸化し、ビリベルジ
ンを生成し、生成したビリベルジンは更にビリルビンオ
キシダーゼにより、更に無色の物質に変換され、還元性
は消失する反応を触媒する酵素である。この反応には、
過酸化水素の生成は認められない為、当該技術に有用な
方法である。

【０００４】しかし、ビリルビンオキシダーゼは発色剤
である４−アミノアンチピリン、フェノール、Ｎ，Ｎ−
ジエチルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ
−３−スルフォプロピル）−ｍ−トルイジン（以下、Ｔ
ＯＯＳという）等と若干の反応性がある為、ブランク値
を上昇させるという欠点がある。

【０００５】本発明はこの様な欠点を改良し、ビリルビ
ンオキシダーゼによるビリルビンの干渉を回避又は軽減
し、測定精度を向上することを可能にする技術を提供す
るものである。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者らは上記のよう
な問題点を解決して、目的を達成する為に鋭意研究を重
ねた結果、ヒドロキシルアミン、２−カルボキシ−５−
ヒドロキシ−γ−ピロンあるいは２−クロロメチル−５
−ヒドロキシ−γ−ピロンがビリルビンオキシダーゼの
発色剤に対する作用は強く阻害するものの、ビリルビン
に対する作用はほとんど阻害しない事を見い出した。そ
して、これらの物質をビリルビンオキシダーゼと共に酸
化酵素−パーオキシダーゼ−発色剤系に使用する事によ
り、ビリルビンオキシダーゼによってビリルビンを消去
してビリルビンによる干渉作用を回避する事が出来、同
時にビリルビンオキシダーゼによる測定系への影響を回
避する事が出来る事を見い出し、本発明を完成した。

【０００７】即ち、本発明は血清、尿などの検体中に含
まれる生体成分を酸化酵素−パーオキシダーゼ−発色剤
系で測定するに際し、検体を予め少なくともビリルビン
オキシダーゼ及びヒドロキシルアミン、２−カルボキシ
−５−ヒドロキシ−γ−ピロンあるいは２−クロロメチ
ル−５−ヒドロキシ−γ−ピロンより選ばれる１種以上
並びに発色剤を含有した試薬組成物の存在下で処理し、
その後測定する方法及び該方法に使用する試薬組成物で
ある。

【０００８】本発明における酸化酵素−ペルオキシダー
ゼ−発色剤系の測定とは定量しようとする成分から過酸
化水素を生成させ、その後、パーオキシダーゼ、発色剤
で比色定量する方法であり、各種の酸化酵素を用いた生
体成分の測定が挙げられる。例えば、酸化酵素としてグ
ルコースオキシダーゼを用いたグルコースの測定、コレ
ステロールオキシダーゼを用いたコレステロールの測
定、ガラクトースオキシダーゼを用いたガラクトースの
測定、ウリカーゼを用いた尿酸の測定等が挙げられる。

【０００９】本発明に使用されるパーオキシダーゼとし
ては、植物起源、動物起源、微生物起源の何れも使用で
きる。

【００１０】発色剤としては、４−アミノアンチピリン
とフェノールの組み合わせが主に利用される。そのほか
に感度を上げるために３−メチル−２−ベンゾチアゾリ
ノンヒドラゾンとＮ，Ｎ−ジメチルアニリンの組み合わ
せ、４−アミノアンチピリンとｐ−クロルフェノールの
組み合わせ、４−アミノアンチピリンとＴＯＯＳの組み
合わせ、４−アミノアンチピリンと３−メチル−Ｎ−
（β−ヒドロキシエチル）−アニリンの組み合わせ、４
−アミノアンチピリンとＮ−エチル−Ｎ−（３−メチル
フェニル）−Ｎ’−アセチルエチレンジアミンの組み合
わせ等多くの発色剤が利用されるようになった。またこ
れらは適宜組み合わせを変えても利用される。

【００１１】更に、本発明に使用されるビリルビンオキ
シダーゼとしては、例えばミロセシウム（Myrotheciu
m）属、トラキデルマ（Trachyderma）属又はコプリナス
（Coprinus）属に属する菌株より生産される酵素が挙げ
られる。

【００１２】被検体中のビリルビンを消去するために用
いる試薬組成物としては、例えば以下のような組成物が
使用できる。

【００１３】ビリルビンオキシダーゼを0.1〜1.0u/ml、
ヒドロキシルアミンを0.1〜2.4mM及び／又は２−カルボ
キシ−５−ヒドロキシ−γ−ピロンを2〜40μg/ml及び
／又は２−クロロメチル−５−ヒドロキシ−γ−ピロン
を8〜200μg/ml、発色剤として４−アミノアンチピリン
を0.3〜3mM含有する。

【００１４】反応条件としてはビリルビンの含有量、ビ
リルビンオキシダーゼの酵素量等によって変動するが、
上記のような試薬組成物を被検体に添加し、好ましくは
30〜40℃、１〜10分、pH6.0〜8.0で反応させ、その後、
通常の方法で各種酸化酵素を用いて生体成分を測定する
ことができる。

【００１５】酸化酵素で反応する際に、アジ化ナトリウ
ムを添加して、残存するビリルビンオキシダーゼの活性
を完全に阻害することによって、更に精度良く各種の生
体成分を測定する事も可能である。以下、実験例、実施
例で本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定
されるものではない。

【００１６】

【実施例】実施例１ 石英セルに以下に示す試薬Ａを1.2ml採り、その後、５
％トリトンＸ−100を0.02ml、20mg/dlのアルブミン結合
ビリルビン0.1ml及び各種濃度のコレステロール0.06ml
を添加し、37℃、５分間インキュベーションした。その
後、試薬Ｂを2.0ml添加し、37℃で反応し、555nmの吸光
度を測定した。同様にアルブミン結合ビリルビンを含ま
ない試薬系でも測定した。

【００１７】試薬Ａ コール酸ナトリウム 20 mg/ml ビリルビンオキシダーゼ 0.25 u/ml ヒドロキシルアミン 0.48 mM ４−アミノアンチピリン 0.9 mM

【００１８】試薬Ｂ ＴＯＯＳ 1.5 mM パーオキシダーゼ 10 u/ml コレステロールオキシダーゼ 1.5 u/ml トリトンＸ−１００ 0.1 % アジ化ナトリウム 50 mM いずれも0.1Mリン酸緩衝液（pH7.0）にて溶解した。

【００１９】図１に示す様にビリルビンの有無にかかわ
らず、吸光度値は同じ値を示し、ビリルビンによる干渉
が回避されたことがわかる。

【００２０】一方、試薬Ａにビルオキシダーゼとヒドロ
キシルアミンを含まず、且つ試薬Ｂにアジ化ナトリウム
を含まない系でも同様に測定した。図２に示す様にこの
系では、ビリルビンによる干渉を強く受けていることが
わかる。

【００２１】実施例２ 実施例１ においてヒドロキシルアミンに代えて、10μg/
mlの２−カルボキシ−ヒドロキシ−γ−ピロンを使用し
て同様に行った。その結果を図３に示す。その結果は実
施例１と同様に、ビリルビンの干渉が回避されている事
がわかる。

【００２２】実施例３ 実施例１ においてヒドロキシルアミンに代えて、50μg/
mlの２−クロロメチル−５−ヒドロキシ−γ−ピロンを
使用して同様に行った。その結果を図４に示す。その結
果は実施例１と同様で、ビリルビンの干渉が回避されて
いる事がわかる。

【００２３】実施例４ 実施例１ において、ミロセシウム属起源のビリルビンオ
キシダーゼに代えて、トラキデルマ属起源のビリルビン
オキシダーゼを使用して同様に行った。その結果は実施
例１と同様であった。

【００２４】実施例５ 石英セルに以下に示す・のサンプル0.1mlを採り、
その後、下記の試薬Ａ1.2mlを添加し、37℃、５分間イ
ンキュベーションした。その後、試薬Ｂを2.0ml添加
し、37℃、５分間反応させ、555nmの吸光度を測定し
た。一方、同様にビリルビンオキシダーゼ、ヒドロキシ
ルアミン、アジ化ナトリウムを含まない試薬系でも測定
した。

【００２５】 サンプル アルブミン結合ビリルビン（20mg/dl） を含むグルコース溶液 15 mg/dl グルコース溶液 15 mg/dl

【００２６】試薬Ａ ４−アミノアンチピリン 0.9 mM コール酸ナトリウム 20 mg/ml ヒドロキシルアミン 0.48 mM ビリルビンオキシダーゼ 0.25 u/ml （ミロセシウム起源） パーオキシダーゼ 10 u/ml

【００２７】試薬Ｂ ＴＯＯＳ 1.5 mM アジ化ナトリウム 50 mM グルコースオキシダーゼ 30 u/ml ムタロターゼ １ u/ml いずれも0.1Mリン酸緩衝液（pH7.0）にて溶解した。そ
の結果を表１に示す。

【００２８】

【表１】

【００２９】ビリルビンオキシダーゼ、ヒドロキシルア
ミン、アジ化ナトリウムを含む試薬系で、ビリルビンの
干渉が回避された事がわかる。

【００３０】実験例１ 実施例１ に記載の試薬Ａを37℃で１、６、24及び30時間
放置した後、実施例１と同様にして測定した。尚、試料
のコレステロール濃度は100mg/dlとした。

【００３１】ヒドロキシルアミンに代えて、２−カルボ
キシ−５−ヒドロキシ−γ−ピロンあるいは２−クロロ
メチル−５−ヒドロキシ−γ−ピロンを用いても同様に
して測定した。又、対照としてこれらの阻害剤を含有し
ない試薬Ａも同様に処理した後に測定した。その結果を
表２に示す。

【００３２】

【表２】

【００３３】表２からも明らかなように、ヒドロキシル
アミン等の阻害剤を添加していない試薬Ａを37℃で放置
したのちに、試薬Ｂを用いてコレステロールを定量する
と正確な測定値が得られないことが分かる。即ち、試薬
調製時の測定値を100％とした場合、30時間放置した試
薬を用いると70％の測定値となり、試薬が不安定であ
る。また、明らかに試薬Ａは褐変している。

【００３４】それに比較してヒドロキシルアミン、２−
カルボキシ−５−ヒドロキシ−γ−ピロンあるいは２−
クロロメチル−５−ヒドロキシ−γ−ピロンを含有させ
ることによって試薬Ａの保存安定性が図られ、且つ正確
な測定を行うことができる。

【００３５】実験例２ ヒドロキシルアミンのビリルビンオキシダーゼ阻害作用
を以下の様に検討した。 ビリルビンを基質にした場合 石英セルに0.0075u/mlのビリルビンオキシダーゼ0.1ml
及び各種濃度のヒドロキシルアミン0.1mlを添加し、37
℃、10分間インキュベーションした。その後、20μg/ml
のビリルビン2.5mlを添加し、37℃で反応し、440nmの吸
光度を測定した。同様にヒドロキシルアミンの代わりに
水を用いて測定した。

【００３６】 ４−アミノアンチピリン−フェノール
を基質にした場合 石英セルに３u/mlのビリルビンオキシダーゼ0.1ml、各
種濃度のヒドロキシルアミン0.1mlを添加し、37℃、10
分間インキュベーションした。その後、2.5mMの４−ア
ミノアンチピリン、0.15％のフェノールを含む試薬2.5m
lを添加し、37℃で反応し、505nmの吸光度を測定した。
同様にヒドロキシルアミンの代わりに水を用いて測定し
た。

【００３７】 ４−アミノアンチピリン−ＴＯＯＳを
基質にした場合 石英セルに0.75u/mlのビリルビンオキシダーゼ0.1ml、
各種濃度のヒドロキシルアミン0.1mlを添加し、37℃、1
0分間インキュベーションした。その後、0.3mMの４−ア
ミノアンチピリン、1.0mMのＴＯＯＳを含む試薬2.5mlを
添加し、37℃反応し、555nmの吸光度を測定した。同様
にヒドロキシルアミンの代わりに水を用いて測定した。
〜の試薬は全て0.1Ｍリン酸緩衝液（pH7.0）を使用
して溶解した。その結果を表３に示す。

【００３８】

【表３】

【００３９】実験例３ ２−カルボキシ−５−ヒドロキシ−γ−ピロンについて
実験例２と同様に行った。その結果を表４に示す。

【００４０】

【表４】

【００４１】実験例４ ２−クロロメチル−５−ヒドロキシ−γ−ピロンについ
て実験例２と同様に行った。その結果を表５に示す。

【００４２】

【表５】

【００４３】実験例２〜４より、ヒドロキシルアミン、
２−カルボキシ−５−ヒドロキシ−γ−ピロン、２−ク
ロロメチル−５−ヒドロキシ−γ−ピロン共に、ビリル
ビンを基質にした場合と比較し、４−アミノアンチピリ
ン／フェノール、４−アミノアンチピリン／ＴＯＯＳを
基質にした場合のほうがビリルビンオキシダーゼによる
活性を阻害する効果が大きかった。特にヒドロキシルア
ミンを用いた場合、阻害効果が顕著であった。

【００４４】

【発明の効果】本発明により、ヒドロキシルアミン、２
−カルボキシ−５−ヒドロキシ−γ−ピロンあるいは２
−クロロメチル−５−ヒドロキシ−γ−ピロンがビリル
ビンオキシダーゼの４−アミノアンチピリン、フェノー
ル、Ｎ，Ｎ−ジエチルアニリン又はＴＯＯＳ等への反応
は阻害するが、ビリルビンへの作用はほとんど阻害しな
いことを利用して、この物質を酸化酵素−ペルオキシダ
ーゼ−色原体系の測定にビリルビンオキシダーゼと共存
させることによって、ビリルビンオキシダーゼによって
ビリルビンを消去して干渉作用を回避する事ができ、同
時にビリルビンオキシダーゼによる測定系への影響を回
避することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例１の結果を示すグラフであり、図中で丸
はアルブミン結合ビリルビンを含まないときの結果を示
し、三角はアルブミン結合ビリルビンを含むときの結果
を示す。

【図２】実施例１でビリルビンオキシダーゼ、ヒドロキ
シルアミン及びアジ化ナトリウムを含まない時の測定結
果を示すグラフであり、図中で丸はアルブミン結合ビリ
ルビンを含まないときの結果を示し、三角はアルブミン
結合ビリルビンを含むときの結果を示す。

【図３】実施例２の結果を示すグラフであり、図中で丸
はアルブミン結合ビリルビンを含まないときの結果を示
し、三角はアルブミン結合ビリルビンを含むときの結果
を示す。

【図４】実施例３の結果を示すグラフであり、図中で丸
はアルブミン結合ビリルビンを含まないときの結果を示
し、三角はアルブミン結合ビリルビンを含むときの結果
を示す。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】酸化酵素、パーオキシダーゼ及び発色剤を
   用いる生体成分の測定用試薬組成物であって、少なくと
   もビリルビンオキシダーゼ及びヒドロキシルアミン、２
   −カルボキシ−５−ヒドロキシ−γ−ピロンあるいは２
   −クロロメチル−５−ヒドロキシ−γ−ピロンの１種以
   上並びに発色剤を含有してなるビリルビンの干渉除去用
   試薬組成物。
2. 【請求項２】酸化酵素、パーオキシダーゼ及び発色剤を
   用いる生体成分の測定において、予め、少なくともビリ
   ルビンオキシダーゼ及びヒドロキシルアミン、２−カル
   ボキシ−５−ヒドロキシ−γ−ピロンあるいは２−クロ
   ロメチル−５−ヒドロキシ−γ−ピロンの１種以上並び
   に発色剤を含有してなる試薬組成物で処理し、ビリルビ
   ンの干渉を除去する方法。