JPH06148189A - レーザ磁気免疫測定用磁性微粒子およびその作製法 - Google Patents
レーザ磁気免疫測定用磁性微粒子およびその作製法Info
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- JPH06148189A JPH06148189A JP29620592A JP29620592A JPH06148189A JP H06148189 A JPH06148189 A JP H06148189A JP 29620592 A JP29620592 A JP 29620592A JP 29620592 A JP29620592 A JP 29620592A JP H06148189 A JPH06148189 A JP H06148189A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 磁気特性が大きく分散性に優れたレーザ磁気
免疫測定用磁性微粒子およびその作製法の提供を目的と
するものである。 【構成】 磁性微粒子で標識した抗体で抗原を捕捉後、
これを磁界で水面上に凝集させ水面の隆起量をレーザ干
渉光強度で測定するレーザ磁気免疫測定方法における前
記磁性微粒子は、アミノ化デキストラン被覆磁性微粒子
の複数個が結合してなるものであることを特徴とするレ
ーザ磁気免疫測定用磁性微粒子。 【効果】 レーザ磁気免疫測定方法における高感度化を
図り、そのデータの信頼性の高めることができる。
免疫測定用磁性微粒子およびその作製法の提供を目的と
するものである。 【構成】 磁性微粒子で標識した抗体で抗原を捕捉後、
これを磁界で水面上に凝集させ水面の隆起量をレーザ干
渉光強度で測定するレーザ磁気免疫測定方法における前
記磁性微粒子は、アミノ化デキストラン被覆磁性微粒子
の複数個が結合してなるものであることを特徴とするレ
ーザ磁気免疫測定用磁性微粒子。 【効果】 レーザ磁気免疫測定方法における高感度化を
図り、そのデータの信頼性の高めることができる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、抗原抗体反応を利用し
た免疫測定法のひとつであるレーザ磁気免疫測定法に使
用するレーザ磁気免疫測定用磁性微粒子およびその作製
法に関するものである。
た免疫測定法のひとつであるレーザ磁気免疫測定法に使
用するレーザ磁気免疫測定用磁性微粒子およびその作製
法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】従来から知られている抗原抗体反応を利
用した検出法としては、ラジオイムノアッセイ（ＲＩ
Ａ）、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）、蛍光イムノアッ
セイ（ＦＩＡ）、レーザイムノアッセイ（ＬＩＡ）等が
既に実用化されている。これらの方法は、それぞれアイ
ソトープ、酵素、蛍光物質を標識として付加した抗原の
有無を検出する方法である。
用した検出法としては、ラジオイムノアッセイ（ＲＩ
Ａ）、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）、蛍光イムノアッ
セイ（ＦＩＡ）、レーザイムノアッセイ（ＬＩＡ）等が
既に実用化されている。これらの方法は、それぞれアイ
ソトープ、酵素、蛍光物質を標識として付加した抗原の
有無を検出する方法である。
【０００３】しかしながら、上記ＥＩＡ法、ＦＩＡ法、
ＬＩＡ法の感度は、１０-6ｇからせいぜい１０-10ｇで
あり、ウイルスの感染初期診断や微量なホルモン検査な
どの抗原そのものを検出する免疫測定においては、感度
不足であり、実用上の問題があった。また、ＲＩＡ法に
ついては、その感度は１０-12ｇと、超微量分析や抗原
検査をするには充分可能であるが、放射性物質を利用す
るため特殊設備を必要とし、安全性、汎用性、価格等の
点で問題があった。
ＬＩＡ法の感度は、１０-6ｇからせいぜい１０-10ｇで
あり、ウイルスの感染初期診断や微量なホルモン検査な
どの抗原そのものを検出する免疫測定においては、感度
不足であり、実用上の問題があった。また、ＲＩＡ法に
ついては、その感度は１０-12ｇと、超微量分析や抗原
検査をするには充分可能であるが、放射性物質を利用す
るため特殊設備を必要とし、安全性、汎用性、価格等の
点で問題があった。
【０００４】そこで本願発明者らは抗原検査が可能な１
０-12ｇ以上の感度を有し、かつ汎用性の高い測定法と
してレーザ磁気免疫測定方法を提案してきた。（特開昭
６３−７９０７０、特開昭６３−１０６５５９、特開昭
６３−１０８２６５、特開昭６３−１８８７６６、特開
昭６３−３１５９５１、特開平１−２９７６８など。）
これらの新しい測定方法は、抗原抗体反応後、ポリマビ
ーズに結合した抗原を磁性微粒子で標識し、この磁性微
粒子で標識されたポリマビーズを磁界で水面上に凝集さ
せ、凝集による水面の隆起量をレーザ干渉光の強度で測
定する方法である。よって、上記レーザ磁気免疫測定方
法は磁界による凝集効果とレーザ光の干渉による高感度
変位測定のため、感度はＲＩＡ法と同等もしくはそれ以
上の超微量検出が可能である。
０-12ｇ以上の感度を有し、かつ汎用性の高い測定法と
してレーザ磁気免疫測定方法を提案してきた。（特開昭
６３−７９０７０、特開昭６３−１０６５５９、特開昭
６３−１０８２６５、特開昭６３−１８８７６６、特開
昭６３−３１５９５１、特開平１−２９７６８など。）
これらの新しい測定方法は、抗原抗体反応後、ポリマビ
ーズに結合した抗原を磁性微粒子で標識し、この磁性微
粒子で標識されたポリマビーズを磁界で水面上に凝集さ
せ、凝集による水面の隆起量をレーザ干渉光の強度で測
定する方法である。よって、上記レーザ磁気免疫測定方
法は磁界による凝集効果とレーザ光の干渉による高感度
変位測定のため、感度はＲＩＡ法と同等もしくはそれ以
上の超微量検出が可能である。
【０００５】ここで、レーザ磁気免疫測定法において、
その感度を左右する重要な要素の一つは、その測定原理
から明らかなように標識材料として用いられている磁性
微粒子である。レーザ磁気免疫測定方法に適用される磁
性微粒子に関しては、Moldayらが米国特許第４４５２７
７３号において開示したデキストランで被覆した磁性微
粒子がある。この発明は磁性微粒子の周りがデキストラ
ンで被覆され、デキストランを酸化処理することによっ
て抗体、あるいはその他のタンパク質を結合し、レーザ
磁気免疫測定方法に使用できることを示している。
その感度を左右する重要な要素の一つは、その測定原理
から明らかなように標識材料として用いられている磁性
微粒子である。レーザ磁気免疫測定方法に適用される磁
性微粒子に関しては、Moldayらが米国特許第４４５２７
７３号において開示したデキストランで被覆した磁性微
粒子がある。この発明は磁性微粒子の周りがデキストラ
ンで被覆され、デキストランを酸化処理することによっ
て抗体、あるいはその他のタンパク質を結合し、レーザ
磁気免疫測定方法に使用できることを示している。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】そこで、本願発明者ら
は、この特許を改良し、レーザ磁気免疫測定方法に適用
される磁性微粒子について鋭意検討を重ねてきた。その
結果、磁化率の高い磁性微粒子が得られ、特開平３−１
４１１１９に「磁性微粒子の製造方法」、特開平３−２
４２３２７に「磁性微粒子の製造方法」として特許出願
している。
は、この特許を改良し、レーザ磁気免疫測定方法に適用
される磁性微粒子について鋭意検討を重ねてきた。その
結果、磁化率の高い磁性微粒子が得られ、特開平３−１
４１１１９に「磁性微粒子の製造方法」、特開平３−２
４２３２７に「磁性微粒子の製造方法」として特許出願
している。
【０００７】これまでの方法で得られた磁性微粒子は電
顕観測の結果、直径１０ｎｍ以下のマグネタイト複数個
が、直径１００ｎｍ程度あるいはそれ以下のデキストラ
ンに含有されていることがわかった。しかし、抗原濃度
が低い領域では１個のポリマビーズに結合する抗原量が
少ないため、標識される磁性微粒子量もそれに従い少な
くなり、ポリマビーズ１個に対する磁界による吸引力が
小さくなる。このため、さらに高感度化を図るためには
磁性微粒子の「磁界に対する凝集性」（以下「磁気特
性」と表現する）の向上が望まれていた。
顕観測の結果、直径１０ｎｍ以下のマグネタイト複数個
が、直径１００ｎｍ程度あるいはそれ以下のデキストラ
ンに含有されていることがわかった。しかし、抗原濃度
が低い領域では１個のポリマビーズに結合する抗原量が
少ないため、標識される磁性微粒子量もそれに従い少な
くなり、ポリマビーズ１個に対する磁界による吸引力が
小さくなる。このため、さらに高感度化を図るためには
磁性微粒子の「磁界に対する凝集性」（以下「磁気特
性」と表現する）の向上が望まれていた。
【０００８】磁気特性を向上させる方法としては、
（１）マグネタイトそのものの磁化率を向上させる。
（２）マグネタイトを埋包するデキストランを大きくす
るなどの方法があった。しかし、上記（１）に記載の方
法については、現在の磁化率がほぼ理論限界に近い値が
得られており、材料を変更しない限り、その向上は期待
できない。上記（２）に記載の方法については、これま
でも検討を重ねてきたが、分散性が良く磁性微粒子その
ものの粒径を大きくすることは現在の作製法では困難で
あることが明らかになってきた。よって、本発明は、上
記事情に鑑みてなされたもので、磁気特性が大きく分散
性に優れたレーザ磁気免疫測定用磁性微粒子およびその
作製法の提供を目的とするものである。
（１）マグネタイトそのものの磁化率を向上させる。
（２）マグネタイトを埋包するデキストランを大きくす
るなどの方法があった。しかし、上記（１）に記載の方
法については、現在の磁化率がほぼ理論限界に近い値が
得られており、材料を変更しない限り、その向上は期待
できない。上記（２）に記載の方法については、これま
でも検討を重ねてきたが、分散性が良く磁性微粒子その
ものの粒径を大きくすることは現在の作製法では困難で
あることが明らかになってきた。よって、本発明は、上
記事情に鑑みてなされたもので、磁気特性が大きく分散
性に優れたレーザ磁気免疫測定用磁性微粒子およびその
作製法の提供を目的とするものである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】請求項１に記載のレーザ
磁気免疫測定用磁性磁性微粒子は、上記課題を解決する
ために、磁性微粒子で標識した抗体で抗原を捕捉後、こ
れを磁界で水面上に凝集させ水面の隆起量をレーザ干渉
光強度で測定するレーザ磁気免疫測定方法における前記
磁性体微粒子は、アミノ化デキストラン被覆磁性微粒子
の複数個が結合してなるものであることを特徴とするも
のである。
磁気免疫測定用磁性磁性微粒子は、上記課題を解決する
ために、磁性微粒子で標識した抗体で抗原を捕捉後、こ
れを磁界で水面上に凝集させ水面の隆起量をレーザ干渉
光強度で測定するレーザ磁気免疫測定方法における前記
磁性体微粒子は、アミノ化デキストラン被覆磁性微粒子
の複数個が結合してなるものであることを特徴とするも
のである。
【００１０】請求項２に記載のレーザ磁気免疫測定用磁
性微粒子の作製法は、上記課題を解決するために、請求
項１に記載のレーザ磁気免疫測定用磁性微粒子をアミノ
化デキストラン被覆磁性微粒子と２官能性架橋剤を油中
で混合攪拌し液滴を生成後、当該液滴内でアミノ化デキ
ストランのアミノ基間で架橋反応を起こし、アミノ化デ
キストラン被覆磁性微粒子を複数個結合させることによ
り作製することを特徴とするものである。
性微粒子の作製法は、上記課題を解決するために、請求
項１に記載のレーザ磁気免疫測定用磁性微粒子をアミノ
化デキストラン被覆磁性微粒子と２官能性架橋剤を油中
で混合攪拌し液滴を生成後、当該液滴内でアミノ化デキ
ストランのアミノ基間で架橋反応を起こし、アミノ化デ
キストラン被覆磁性微粒子を複数個結合させることによ
り作製することを特徴とするものである。
【００１１】請求項３に記載のレーザ磁気免疫測定用磁
性微粒子の作製法は、上記課題を解決するために、請求
項２に記載のレーザ磁気免疫測定用磁性微粒子の作製法
における液滴を生成する際に、アミノ化デキストラン被
覆磁性微粒子と２官能性架橋剤に、さらに界面活性剤を
添加し油中で混合攪拌して、液滴を生成させることを特
徴とするものである。
性微粒子の作製法は、上記課題を解決するために、請求
項２に記載のレーザ磁気免疫測定用磁性微粒子の作製法
における液滴を生成する際に、アミノ化デキストラン被
覆磁性微粒子と２官能性架橋剤に、さらに界面活性剤を
添加し油中で混合攪拌して、液滴を生成させることを特
徴とするものである。
【００１２】
【作用】本発明におけるレーザ磁気免疫測定用磁性微粒
子は、アミノ化デキストラン被覆磁性微粒子の複数個が
結合してなるものであり、こうして前記磁性微粒子を複
数個結合させることにより、１個あたりの磁性体量を増
大させ、磁気特性の向上を図ったものである。また、上
記のように磁性微粒子が複数個の結合されてなる本発明
の磁性微粒子は、その大粒化により、磁界による吸引力
がブラウン運動によって阻害されることを回避し、前記
磁気特性の著しい向上を可能としたものである。
子は、アミノ化デキストラン被覆磁性微粒子の複数個が
結合してなるものであり、こうして前記磁性微粒子を複
数個結合させることにより、１個あたりの磁性体量を増
大させ、磁気特性の向上を図ったものである。また、上
記のように磁性微粒子が複数個の結合されてなる本発明
の磁性微粒子は、その大粒化により、磁界による吸引力
がブラウン運動によって阻害されることを回避し、前記
磁気特性の著しい向上を可能としたものである。
【００１３】また、上記の本発明のレーザ磁気免疫測定
用磁性微粒子の作製法は、アミノ化デキストラン被覆磁
性微粒子と２官能性架橋剤を油中で混合攪拌し液滴を生
成後、当該液滴内でアミノ化デキストランのアミノ基間
で架橋反応を起こすことにより、アミノ化デキストラン
被覆磁性微粒子を複数個結合させてなる、大粒径の本発
明の磁性微粒子の生成を可能としたものであり、上記の
アミノ化デキストラン被覆磁性微粒子と２官能性架橋剤
を油中で混合攪拌し液滴を生成する際に、さらに界面活
性剤を添加することにより、より分散性の良い大粒径の
磁性微粒子を効率良く作製することが可能である。
用磁性微粒子の作製法は、アミノ化デキストラン被覆磁
性微粒子と２官能性架橋剤を油中で混合攪拌し液滴を生
成後、当該液滴内でアミノ化デキストランのアミノ基間
で架橋反応を起こすことにより、アミノ化デキストラン
被覆磁性微粒子を複数個結合させてなる、大粒径の本発
明の磁性微粒子の生成を可能としたものであり、上記の
アミノ化デキストラン被覆磁性微粒子と２官能性架橋剤
を油中で混合攪拌し液滴を生成する際に、さらに界面活
性剤を添加することにより、より分散性の良い大粒径の
磁性微粒子を効率良く作製することが可能である。
【００１４】従って、上記のように大粒径の分散性の良
好な磁性微粒子をレーザ磁気免疫測定方法に適用するこ
とにより、レーザ磁気免疫測定方法の高感度化を図り、
そのデータの信頼性の高めることができる。
好な磁性微粒子をレーザ磁気免疫測定方法に適用するこ
とにより、レーザ磁気免疫測定方法の高感度化を図り、
そのデータの信頼性の高めることができる。
【００１５】
【実施例】以下に、図面を参照しつつ本発明を具体的に
詳細するが、以下に開示する実施例は本発明の単なる一
例にすぎず、本発明の範囲を何等限定するものではな
い。 （実施例１）以下に、本発明における実施例１のレーザ
磁気免疫測定用磁性微粒子の作製法について詳細する。
まず、アミノ化デキストランを以下の方法により合成し
た。平均分子量が４万のファルマシア製デキストラン２
０ｇを０．０５Ｍのアセテート緩衝液（ｐＨ６．５）１
００ｍｌに溶解し、これを２．１４ｇの過ヨウ素酸ナト
リウムで室温にて１．５時間かけて酸化した。酸化した
デキストランは純水で１８０ｍｌに希釈し、氷酢酸で予
めｐＨ９以上に調整した６Ｍのジアミノエタン２０ｍｌ
を２３℃で１時間反応させた。反応後、ＮａＢＨ4で還
元しクエンチングし、さらに、その溶液をニトロセルロ
ース透析膜を用いて４リットルの純水によって１昼夜透
析し、未反応物を除去した。
詳細するが、以下に開示する実施例は本発明の単なる一
例にすぎず、本発明の範囲を何等限定するものではな
い。 （実施例１）以下に、本発明における実施例１のレーザ
磁気免疫測定用磁性微粒子の作製法について詳細する。
まず、アミノ化デキストランを以下の方法により合成し
た。平均分子量が４万のファルマシア製デキストラン２
０ｇを０．０５Ｍのアセテート緩衝液（ｐＨ６．５）１
００ｍｌに溶解し、これを２．１４ｇの過ヨウ素酸ナト
リウムで室温にて１．５時間かけて酸化した。酸化した
デキストランは純水で１８０ｍｌに希釈し、氷酢酸で予
めｐＨ９以上に調整した６Ｍのジアミノエタン２０ｍｌ
を２３℃で１時間反応させた。反応後、ＮａＢＨ4で還
元しクエンチングし、さらに、その溶液をニトロセルロ
ース透析膜を用いて４リットルの純水によって１昼夜透
析し、未反応物を除去した。
【００１６】そして、上記のように得られたアミノ化デ
キストランを５ｍｌ秤量し、このアミノ化デキストラン
に、塩化第二鉄六水和物０．７５ｇと塩化第一鉄四水和
物０．３２ｇとを混合し、さらにこれに７．５％アンモ
ニア水溶液を室温にて激しく攪拌しながら注意深く１ｍ
ｌ添加する。添加後ｐＨが高まると磁性微粒子が生じ黒
膜を形成する。そして、黒膜生成後、この温度を１時間
で７０℃まで徐々に上げ、全量２０ｍｌの７．５％アン
モニア水溶液を激しく攪拌しながら添加し、アミノ化デ
キストラン被覆磁性微粒子を作製した。
キストランを５ｍｌ秤量し、このアミノ化デキストラン
に、塩化第二鉄六水和物０．７５ｇと塩化第一鉄四水和
物０．３２ｇとを混合し、さらにこれに７．５％アンモ
ニア水溶液を室温にて激しく攪拌しながら注意深く１ｍ
ｌ添加する。添加後ｐＨが高まると磁性微粒子が生じ黒
膜を形成する。そして、黒膜生成後、この温度を１時間
で７０℃まで徐々に上げ、全量２０ｍｌの７．５％アン
モニア水溶液を激しく攪拌しながら添加し、アミノ化デ
キストラン被覆磁性微粒子を作製した。
【００１７】そこで、以上の方法によって得られたアミ
ノ化磁性微粒子を用いて、本発明の架橋剤による液滴中
での大粒径の磁性微粒子の作製法を以下に詳細する。ま
ず、上記のように作製したアミノ化デキストラン磁性微
粒子（鉄濃度１０-6ｇ／ｍｌ）をリン酸バッファー溶液
（ＰＢＳ）により１０倍に希釈し、この希釈物１ｃｃ
に、Pierce社製Bis(sulfosuccinimidyl)suberate（以
下、ＢＳ3と略記する。）を０．５ｍｇ溶解する。上記
ＢＳ3をより溶解し易くするには、前記ＢＳ3をあらかじ
めジメチルホルムアミド３０μｌに溶解したものを混合
すると良い。
ノ化磁性微粒子を用いて、本発明の架橋剤による液滴中
での大粒径の磁性微粒子の作製法を以下に詳細する。ま
ず、上記のように作製したアミノ化デキストラン磁性微
粒子（鉄濃度１０-6ｇ／ｍｌ）をリン酸バッファー溶液
（ＰＢＳ）により１０倍に希釈し、この希釈物１ｃｃ
に、Pierce社製Bis(sulfosuccinimidyl)suberate（以
下、ＢＳ3と略記する。）を０．５ｍｇ溶解する。上記
ＢＳ3をより溶解し易くするには、前記ＢＳ3をあらかじ
めジメチルホルムアミド３０μｌに溶解したものを混合
すると良い。
【００１８】そして、上記混合物に市販サラダオイル５
０ｃｃと市販界面活性剤 TWEEN 20(0.1%) ５００μｌを
添加し、ホモジナイザで激しく攪拌して、磁性微粒子を
含む逆ミセル状液滴の懸濁液を作製する。そしてさら
に、この懸濁液を３７℃の恒温槽中に静置し３０分間架
橋反応させる。その後、エタノールを５０ｃｃ加えて、
よく振とうさせ、分離ロートで下層（油層）を除き、さ
らにエタノールを５０ｃｃ加えて、５０００ｒｐｍで１
０分間遠心分離機にかけ上清を捨てる。この操作を２回
繰り返して、最終的に前記エタノールを０．０５％ウシ
血清アルブミン（ＢＳＡ−ＨＥＰＥＳ）５ｃｃを含んだ
バッファー溶液に置き換える。
０ｃｃと市販界面活性剤 TWEEN 20(0.1%) ５００μｌを
添加し、ホモジナイザで激しく攪拌して、磁性微粒子を
含む逆ミセル状液滴の懸濁液を作製する。そしてさら
に、この懸濁液を３７℃の恒温槽中に静置し３０分間架
橋反応させる。その後、エタノールを５０ｃｃ加えて、
よく振とうさせ、分離ロートで下層（油層）を除き、さ
らにエタノールを５０ｃｃ加えて、５０００ｒｐｍで１
０分間遠心分離機にかけ上清を捨てる。この操作を２回
繰り返して、最終的に前記エタノールを０．０５％ウシ
血清アルブミン（ＢＳＡ−ＨＥＰＥＳ）５ｃｃを含んだ
バッファー溶液に置き換える。
【００１９】なお、２液を攪拌機で懸濁した時の液滴の
平均粒径は R.Arshady の「Microspheres and Microcaps
ules:A Survey of Manufacturing Techniques.」 (POLYM
ER ENGINEERING AND SCIENCE, VOL. 29. NO. 24, pp174
6-1758) で詳細に検討されて、次式で表わされることが
分かっている。 ＜ｄ＞ ∝ ｋ（Ｄｖ・Ｒ・ｖｄ・Ｓ）／（Ｄｓ・Ｐ・
ｖｍ・Ｃ） ここで、＜ｄ＞：平均粒径、ｋ：装置定数、Ｄｖ：容器
の直径、Ｄｓ：攪拌子の直径、Ｒ：懸濁液に対する液滴
の体積比、Ｐ：攪拌の回転数（またはパワー）、ｖｄ：
液滴の粘土、ｖｍ：懸濁液の粘土、Ｓ：懸濁液と液滴間
の表面張力、Ｃ：安定剤の濃度である。
平均粒径は R.Arshady の「Microspheres and Microcaps
ules:A Survey of Manufacturing Techniques.」 (POLYM
ER ENGINEERING AND SCIENCE, VOL. 29. NO. 24, pp174
6-1758) で詳細に検討されて、次式で表わされることが
分かっている。 ＜ｄ＞ ∝ ｋ（Ｄｖ・Ｒ・ｖｄ・Ｓ）／（Ｄｓ・Ｐ・
ｖｍ・Ｃ） ここで、＜ｄ＞：平均粒径、ｋ：装置定数、Ｄｖ：容器
の直径、Ｄｓ：攪拌子の直径、Ｒ：懸濁液に対する液滴
の体積比、Ｐ：攪拌の回転数（またはパワー）、ｖｄ：
液滴の粘土、ｖｍ：懸濁液の粘土、Ｓ：懸濁液と液滴間
の表面張力、Ｃ：安定剤の濃度である。
【００２０】上式から液滴の粒径を決定する材料的因子
は、液滴の粘土、懸濁液の粘土、液滴と懸濁液間の表面
張力である。それ故、本発明においてはアミノ化デキス
トラン被覆磁性微粒子の濃度、使用する油の種類、界面
活性剤の種類、濃度等について幅広い範囲で検討した。
上記の実施例で例示したものはこれらの代表的な種類、
数値であって、これに規定されるものではない。例え
ば、懸濁液となる油は市販サラダオイル以外に胡麻油、
綿実油あるいはトルエン／クロロホルム、シクロヘキサ
ン／クロロホルムなどが使用できる。また、架橋剤はア
ミノ基同士を架橋するものであれば良く、上記ＢＳ3以
外にもジサクシニミジル スベレートやジチオビス ス
クシニミジルピオネートなどやグルタルアルデヒドを用
いることができる。
は、液滴の粘土、懸濁液の粘土、液滴と懸濁液間の表面
張力である。それ故、本発明においてはアミノ化デキス
トラン被覆磁性微粒子の濃度、使用する油の種類、界面
活性剤の種類、濃度等について幅広い範囲で検討した。
上記の実施例で例示したものはこれらの代表的な種類、
数値であって、これに規定されるものではない。例え
ば、懸濁液となる油は市販サラダオイル以外に胡麻油、
綿実油あるいはトルエン／クロロホルム、シクロヘキサ
ン／クロロホルムなどが使用できる。また、架橋剤はア
ミノ基同士を架橋するものであれば良く、上記ＢＳ3以
外にもジサクシニミジル スベレートやジチオビス ス
クシニミジルピオネートなどやグルタルアルデヒドを用
いることができる。
【００２１】そこで、上記のようにして得られた大粒化
磁性微粒子の平均粒径を静的光錯乱法から求めた。表１
は磁性微粒子の平均粒径であって、本発明方法で得られ
た磁性微粒子は従来法の約４倍の粒径を持つことが分か
る。これから本発明方法で作成した磁性微粒子は重合す
る前の磁性微粒子を４の３乗倍程度結合し、大粒化した
ものと考えられる。
磁性微粒子の平均粒径を静的光錯乱法から求めた。表１
は磁性微粒子の平均粒径であって、本発明方法で得られ
た磁性微粒子は従来法の約４倍の粒径を持つことが分か
る。これから本発明方法で作成した磁性微粒子は重合す
る前の磁性微粒子を４の３乗倍程度結合し、大粒化した
ものと考えられる。
【００２２】
【表１】
【００２３】また、磁気特性はレーザ磁気免疫測定方法
で評価した。レーザ磁気免疫測定方法では、一定の磁界
中で磁性微粒子を水面上の１点に凝集させ、その凝集力
を盛り上がり量に対応したレーザ干渉強度から求める方
法である。このため、一定磁界に対する磁性微粒子の磁
気特性は、磁性微粒子中のマグネタイト量と干渉光強度
の関係で評価できる。
で評価した。レーザ磁気免疫測定方法では、一定の磁界
中で磁性微粒子を水面上の１点に凝集させ、その凝集力
を盛り上がり量に対応したレーザ干渉強度から求める方
法である。このため、一定磁界に対する磁性微粒子の磁
気特性は、磁性微粒子中のマグネタイト量と干渉光強度
の関係で評価できる。
【００２４】測定結果を図１に示す。（ａ）は本発明で
得られた大粒径磁性微粒子、（ｂ）は従来の重合方法で
得られた磁性微粒子の測定結果を示している。図１の縦
軸は、干渉光強度、即ち磁気特性の大きさに比例する量
であり、横軸は測定した磁性体の鉄濃度を示している。
図１から明らかなように、本実施例１で得られた大粒径
磁性体は、従来の重合方法で合成された磁性微粒子に比
較して、同一の干渉光強度を得るための磁性体量はほぼ
１００分の１である。
得られた大粒径磁性微粒子、（ｂ）は従来の重合方法で
得られた磁性微粒子の測定結果を示している。図１の縦
軸は、干渉光強度、即ち磁気特性の大きさに比例する量
であり、横軸は測定した磁性体の鉄濃度を示している。
図１から明らかなように、本実施例１で得られた大粒径
磁性体は、従来の重合方法で合成された磁性微粒子に比
較して、同一の干渉光強度を得るための磁性体量はほぼ
１００分の１である。
【００２５】以上の結果から、磁性微粒子を大粒化する
ことによって、レーザ磁気免疫測定方法における感度は
飛躍的に増大する効果があることが分かった。これは、
磁性微粒子１個当たりの磁気特性は含有される磁性体量
に比例するためである他に、これまでの重合方法では、
得られる磁性微粒子が１００ｎｍ以下の粒径であるため
に、磁界による吸引力がブラウン運動によって大きく阻
害されていたことに影響されていたためと考えられる。
ことによって、レーザ磁気免疫測定方法における感度は
飛躍的に増大する効果があることが分かった。これは、
磁性微粒子１個当たりの磁気特性は含有される磁性体量
に比例するためである他に、これまでの重合方法では、
得られる磁性微粒子が１００ｎｍ以下の粒径であるため
に、磁界による吸引力がブラウン運動によって大きく阻
害されていたことに影響されていたためと考えられる。
【００２６】（実施例２）本実施例２においては、腫瘍
マーカの一種であるα−フェトプロティンを用いて、本
発明で得られたレーザ磁気免疫測定用磁性微粒子の免疫
測定における検出感度を測定した。検体調製は、以下の
方法により行なった。まず、抗体を結合したポリマビー
ズ（ビーズ濃度０．２ｗｔ％）浮遊液２０μｌ、抗原と
してα−フェトプロテインの希釈液（蛋白濃度１０-15
〜１０-8ｇ／ｍｌの範囲で１０倍希釈、８段階）の各段
階２０μｌを３７℃、２時間反応させた。次に、各反応
液にビオチンを結合した抗α−フェトプロテイン抗体
（抗体濃度０．３ｍｇ／ｍｌ）を２０μｌ添加し、３７
℃で１時間反応させ、未反応ビオチン化抗体をＢ／Ｆ分
離した。
マーカの一種であるα−フェトプロティンを用いて、本
発明で得られたレーザ磁気免疫測定用磁性微粒子の免疫
測定における検出感度を測定した。検体調製は、以下の
方法により行なった。まず、抗体を結合したポリマビー
ズ（ビーズ濃度０．２ｗｔ％）浮遊液２０μｌ、抗原と
してα−フェトプロテインの希釈液（蛋白濃度１０-15
〜１０-8ｇ／ｍｌの範囲で１０倍希釈、８段階）の各段
階２０μｌを３７℃、２時間反応させた。次に、各反応
液にビオチンを結合した抗α−フェトプロテイン抗体
（抗体濃度０．３ｍｇ／ｍｌ）を２０μｌ添加し、３７
℃で１時間反応させ、未反応ビオチン化抗体をＢ／Ｆ分
離した。
【００２７】さらに、Ｂ／Ｆ分離した各反応液に、本発
明で得られた磁性微粒子に予めPierce 社製ＢＳ3を用い
てアジピンを結合させたアジピン化磁性微粒子（マグネ
タイト濃度 ０．１ｍｇ／ｍｌ）を２０μｌ添加し、３
７℃で１時間反応させた。そして、反応後に未反応の磁
性微粒子をＢ／Ｆ分離し、３０μｌの緩衝液で反応物を
回収し測定検体とした。
明で得られた磁性微粒子に予めPierce 社製ＢＳ3を用い
てアジピンを結合させたアジピン化磁性微粒子（マグネ
タイト濃度 ０．１ｍｇ／ｍｌ）を２０μｌ添加し、３
７℃で１時間反応させた。そして、反応後に未反応の磁
性微粒子をＢ／Ｆ分離し、３０μｌの緩衝液で反応物を
回収し測定検体とした。
【００２８】以上のように得られた各測定検体をレーザ
磁気免疫測定装置で測定し、その干渉光強度を得た。そ
の結果を図２（ａ）にて示す。一方、従来法で得られた
磁性微粒子を用いて、上記と全く同様の検体を調製し、
レーザ磁気免疫測定装置で測定した干渉光強度を図２
（ｂ）に示す。図２から明らかなように、本発明で得ら
れた大粒径磁性微粒子を用いた検体は、従来の磁性微粒
子を用いた検体に比べ、抗原の低濃度領域での感度が１
桁以上向上していることが分かる。
磁気免疫測定装置で測定し、その干渉光強度を得た。そ
の結果を図２（ａ）にて示す。一方、従来法で得られた
磁性微粒子を用いて、上記と全く同様の検体を調製し、
レーザ磁気免疫測定装置で測定した干渉光強度を図２
（ｂ）に示す。図２から明らかなように、本発明で得ら
れた大粒径磁性微粒子を用いた検体は、従来の磁性微粒
子を用いた検体に比べ、抗原の低濃度領域での感度が１
桁以上向上していることが分かる。
【００２９】以上のように、本発明によるレーザ磁気免
疫測定用磁性体は、粒径が大きくかつ分散性が良いた
め、これをレーザ磁気免疫測定方法に適用した場合に
は、その感度を著しく向上させることができる。
疫測定用磁性体は、粒径が大きくかつ分散性が良いた
め、これをレーザ磁気免疫測定方法に適用した場合に
は、その感度を著しく向上させることができる。
【００３０】
【発明の効果】本発明におけるレーザ磁気免疫測定用磁
性微粒子は、アミノ化デキストラン被覆磁性微粒子の複
数個が結合してなるものであり、こうして前記磁性微粒
子を複数個結合させることにより、１個あたりの磁性体
量を増大させ、磁気特性の向上を図ったものである。ま
た、上記のように磁性微粒子が複数個の結合されてなる
本発明の磁性微粒子は、その大粒化により、磁界による
吸引力がブラウン運動によって阻害されることを回避
し、前記磁気特性の著しい向上を可能としたものであ
る。
性微粒子は、アミノ化デキストラン被覆磁性微粒子の複
数個が結合してなるものであり、こうして前記磁性微粒
子を複数個結合させることにより、１個あたりの磁性体
量を増大させ、磁気特性の向上を図ったものである。ま
た、上記のように磁性微粒子が複数個の結合されてなる
本発明の磁性微粒子は、その大粒化により、磁界による
吸引力がブラウン運動によって阻害されることを回避
し、前記磁気特性の著しい向上を可能としたものであ
る。
【００３１】また、上記の本発明のレーザ磁気免疫測定
用磁性微粒子の作製法は、アミノ化デキストラン被覆磁
性微粒子と２官能性架橋剤を油中で混合攪拌し液滴を生
成後、当該液滴内でアミノ化デキストランのアミノ基間
で架橋反応を起こすことにより、アミノ化デキストラン
被覆磁性微粒子を複数個結合させてなる、大粒径の本発
明の磁性微粒子の生成を可能としたものであり、上記の
アミノ化デキストラン被覆磁性微粒子と２官能性架橋剤
を油中で混合攪拌し液滴を生成する際に、さらに界面活
性剤を添加することにより、より分散性の良い大粒径の
磁性微粒子を効率良く作製することが可能である。
用磁性微粒子の作製法は、アミノ化デキストラン被覆磁
性微粒子と２官能性架橋剤を油中で混合攪拌し液滴を生
成後、当該液滴内でアミノ化デキストランのアミノ基間
で架橋反応を起こすことにより、アミノ化デキストラン
被覆磁性微粒子を複数個結合させてなる、大粒径の本発
明の磁性微粒子の生成を可能としたものであり、上記の
アミノ化デキストラン被覆磁性微粒子と２官能性架橋剤
を油中で混合攪拌し液滴を生成する際に、さらに界面活
性剤を添加することにより、より分散性の良い大粒径の
磁性微粒子を効率良く作製することが可能である。
【００３２】従って、上記のように大粒径の分散性の良
好な磁性微粒子をレーザ磁気免疫測定方法に適用するこ
とにより、レーザ磁気免疫測定方法の高感度化を図り、
そのデータの信頼性の高めることができる。
好な磁性微粒子をレーザ磁気免疫測定方法に適用するこ
とにより、レーザ磁気免疫測定方法の高感度化を図り、
そのデータの信頼性の高めることができる。
【図１】図１は、本発明における実施例１に基づく磁性
微粒子のマグネタイト量と干渉光強度の関係を示したも
のであって、図中曲線（ａ）は本発明の作製法で得られ
た大粒径磁性微粒子、（ｂ）は従来法で得られた磁性微
粒子を用いた測定結果である。
微粒子のマグネタイト量と干渉光強度の関係を示したも
のであって、図中曲線（ａ）は本発明の作製法で得られ
た大粒径磁性微粒子、（ｂ）は従来法で得られた磁性微
粒子を用いた測定結果である。
【図２】図２は、本発明における実施例２に基づくα−
フェトプロテイン抗原検出の実験結果であって、図中
（ａ）は本発明の作製法で得られた大粒磁性微粒子、
（ｂ）は従来法で得られた磁性微粒子を用いた結果を示
している。
フェトプロテイン抗原検出の実験結果であって、図中
（ａ）は本発明の作製法で得られた大粒磁性微粒子、
（ｂ）は従来法で得られた磁性微粒子を用いた結果を示
している。
Claims (3)
- 【請求項１】 磁性微粒子で標識した抗体で抗原を捕捉
後、これを磁界で水面上に凝集させ水面の隆起量をレー
ザ干渉光強度で測定するレーザ磁気免疫測定方法におけ
る前記磁性微粒子は、アミノ化デキストラン被覆磁性微
粒子の複数個が結合してなるものであることを特徴とす
るレーザ磁気免疫測定用磁性微粒子。 - 【請求項２】 アミノ化デキストラン被覆磁性微粒子と
２官能性架橋剤を油中で混合攪拌し液滴を生成後、当該
液滴内でアミノ化デキストランのアミノ基間で架橋反応
を起こし、アミノ化デキストラン被覆磁性微粒子を複数
個結合させることを特徴とする請求項１に記載のレーザ
磁気免疫測定用磁性微粒子の作製法。 - 【請求項３】 液滴を生成する際に、アミノ化デキスト
ラン被覆磁性微粒子と２官能性架橋剤に、さらに界面活
性剤を添加し油中で混合攪拌して、液滴を生成させるこ
とを特徴とする請求項２に記載のレーザ磁気免疫測定用
磁性微粒子の作製法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP29620592A JPH06148189A (ja) | 1992-11-05 | 1992-11-05 | レーザ磁気免疫測定用磁性微粒子およびその作製法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP29620592A JPH06148189A (ja) | 1992-11-05 | 1992-11-05 | レーザ磁気免疫測定用磁性微粒子およびその作製法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06148189A true JPH06148189A (ja) | 1994-05-27 |
Family
ID=17830537
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP29620592A Pending JPH06148189A (ja) | 1992-11-05 | 1992-11-05 | レーザ磁気免疫測定用磁性微粒子およびその作製法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH06148189A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2007538380A (ja) * | 2003-07-10 | 2007-12-27 | ミクロモート パルティケルテヒノロギー ゲーエムベーハー | 改善された磁気性質を有する磁性ナノ粒子 |
| US7632688B2 (en) | 2003-04-16 | 2009-12-15 | Sekisui Chemical Co., Ltd. | Particle having magnetic material incorporated therein, process for producing the same, particle for immunoassay and method of immunoassay |
| US11237162B2 (en) | 2016-05-24 | 2022-02-01 | Jsr Corporation | Composite particles, coated particles, method for producing composite particles, ligand-containing solid phase carrier and method for detecting or separating target substance in sample |
-
1992
- 1992-11-05 JP JP29620592A patent/JPH06148189A/ja active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7632688B2 (en) | 2003-04-16 | 2009-12-15 | Sekisui Chemical Co., Ltd. | Particle having magnetic material incorporated therein, process for producing the same, particle for immunoassay and method of immunoassay |
| JP2007538380A (ja) * | 2003-07-10 | 2007-12-27 | ミクロモート パルティケルテヒノロギー ゲーエムベーハー | 改善された磁気性質を有する磁性ナノ粒子 |
| US11237162B2 (en) | 2016-05-24 | 2022-02-01 | Jsr Corporation | Composite particles, coated particles, method for producing composite particles, ligand-containing solid phase carrier and method for detecting or separating target substance in sample |
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