JPH06153998A - 核酸ハイブリッド体の検出方法及びそれに用いるプローブ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 Ｂ／Ｆ分離の必要がなく、より簡易化された
工程からなり、良好な測定感度を得ることができるハイ
ブリダイゼーションを利用した核酸ハイブリッドの検出
方法を提供すること。 【構成】 標的一本鎖核酸・プローブ・ハイブリットに
おける２重らせん構造を検出できる試薬物質を用いて試
料の分析を行い、試料中の標的核酸の有無を検出する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ウイルス、微生物、動
植物、ヒトなどの核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）の所望の
塩基配列を検出、同定、もしくは各種塩基配列における
変異の有無を検出する方法及びそれに用いるプローブに
関する。

【０００２】

【従来の技術】核酸の分析技術の発達により種々の変異
遺伝子が数多く見つけ出され、遺伝子の変異に基づく各
種遺伝病の解明も進みつつある。そのなかには、遺伝子
中の塩基が部分的に欠失したものや塩基が点突然変異を
起こしたものがあり、それによって蛋白質に変異が生
じ、さまざまな症状を引き起こすものがあることが明ら
かにされてきている。現在のところ、これらの遺伝病
は、症状が現れてから、酵素によるアッセイや、抗体を
用いた免疫的な方法により発見されることが主流である
が、早期治療という観点から、重篤な症状が現れる前に
遺伝子上で変異の有無を早期に発見することの重要性が
指摘されている。

【０００３】その有力な方法の一つとして、ＲＦＬＰ
（restriction fragment length polymorphism：制限酵
素断片長多型）が挙げられる。この方法は、例えばヒト
の全遺伝子を制限酵素によって切断して得られるＤＮＡ
断片をアガロ−スゲル電気泳動で展開し、サザンブロッ
ト法を用いてフィルタ−上に固定した後、放射性同位元
素等により標識したＤＮＡ（またはＲＮＡ）からなるプ
ロ−ブとハイブリッドさせ、正常なＤＮＡと検体ＤＮＡ
の切断パタ−ンの相違から、これらの疾患と関連する遺
伝子の有無を検出するものである。

【０００４】また、ＤＮＡ診断は、必ずしもヒトの遺伝
子に用いられるだけでなく、感染した細菌の同定にもお
いても利用しうる。

【０００５】従来は、分離した細菌の形態学的性状およ
び生化学的性状から、類似性に基づいて菌種を同定する
方法が取られていた。この方法では、培養に時間がかか
る上に、検査法の違いによって性状の判定が異なった
り、どの性状に重点を置くかによって同定の結果が異な
る等の問題があった。

【０００６】そこで、近年、特に、細菌感染症における
原因細菌の検出や同定の分野において、ＤＮＡ−ＤＮＡ
ハイブリダイゼ−ション法、あるいはＤＮＡ−ＲＮＡハ
イブリダイゼ−ション法を用いる試みがなされてきてい
る。この方法は、細菌から核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）
を抽出し、細菌由来の核酸のうち特定部分に着目して、
その部分の塩基配列とホモロジ−の高い塩基配列が、対
象とする被検核酸サンプル中に存在するか否かをハイブ
リダイゼ−ション法によって調べ、サンプル中に問題と
なる細菌が存在するか否かを判定する方法である。

【０００７】これらの基礎技術であるハイブリダイゼ−
ションという方法は、一般的には、次のような工程から
構成される。 （１）ＤＮＡを切断し、それをゲル電気泳動で展開する
工程。 （２）展開した各ＤＮＡ断片をニトロセルロ−スフィル
タ−に吸着させる工程（サザンブロット）。 （３）（２）で得たニトロセルロ−スフィルタ−をプロ
−ブと反応させ、ハイブリッド体を形成させる工程。 （４）ハイブリッド体を形成したＤＮＡ断片を検出する
工程。

【０００８】例えばＤＮＡどうしのハイブリダイゼ−シ
ョン反応では、標識を施したプロ−ブＤＮＡと標的ＤＮ
Ａとがお互いの相補的な配列の部分で水素結合によりハ
イブリッド体を形成する。

【０００９】これらのハイブリダイゼ−ション反応に供
せられるプロ−ブも時代とともに変化してきている。最
も初期の頃は、長いＤＮＡ断片をニックトランスレ−シ
ョン反応により放射性同位元素で標識することが行なわ
れてきた。ＤＮＡ合成機の発達にともない、長いＤＮＡ
の代わりに合成オリゴヌクレオチドが用いられるように
なり、標識物質も、危険な放射性物質からより安全なビ
オチン−アビジン系、そして、さらに、種々の化学発光
系へと推移している。

【００１０】ハイブリダイゼ−ション反応においては、
相補的な配列間で正確にハイブリッド体を形成させるた
めには、反応の温度、イオン強度を最適に選ぶ必要があ
る。つまり、温度が高すぎると、プロ−ブと相補的配列
をもつ核酸とが結合できず、逆に低すぎると、プロ−ブ
が非特異的に核酸に結合してしまう。さらに、より正確
さを期するために、溶液の塩濃度を下げて、或はまた、
溶液の温度を上げて、不安定な水素結合を除き、非特異
的に結合したプロ−ブやミスマッチしているプロ−ブを
洗い流すことが重要となる。従って、適当な反応条件、
洗浄条件の設定には、かなりの試行錯誤が必要になる。

【００１１】遺伝子診断では、ハイブリッド体形成反
応、及び、洗いの条件設定に、一塩基対レベルのミスマ
ッチをも除去する精度が更に要求される。

【００１２】ハイブリダイゼーション反応において、標
的核酸をニトロセルロ−スのような担体に固定させて用
いる場合は、反応後、プロ−ブの非特異的結合等を除去
するための洗浄が行ないやすいという利点はあるもの
の、操作が煩雑で検査の自動化を困難にしている。しか
も、時間がかかるという欠点を持つため、検体大量処理
には向かない。

【００１３】そこで、核酸の固定化なしに溶液中でハイ
ブリッド体を検出する方法によれば、自動化の可能性が
開けることが期待されており、種々の試みがなされてい
る。核酸の固定化を行わない方法における最大の課題
は、標的核酸に結合しているプロ−ブと、結合していな
い過剰なプロ−ブをどのようにして区別するか（Ｂ／Ｆ
分離）というところにある。さらに、この場合にも、上
述の固定化核酸を用いたハイブリダイゼ−ション反応と
同様に、プロ−ブの非特異的吸着やミスマッチを除くた
めの適当な反応条件、洗浄条件設定が重要な課題とな
る。

【００１４】Ｂ／Ｆ分離を行わずに標的核酸とプローブ
とのハイブリッド体を検出するための方法としては、蛍
光偏光解消法を用いた検出方法がいくつか提案されてい
る（特開平２−２９５４９６号公報、特開平２−７５９
５８号公報等参照）。これらの方法は、蛍光標識された
一本鎖ＤＮＡプロ−ブを、分析検体中のＤＮＡと接触さ
せて二本鎖ＤＮＡを形成させ、二本鎖形成前の蛍光偏光
と二本鎖形成後の蛍光偏光との変異を測定して検体中の
ＤＮＡに、プロ−ブの塩基配列に対応する塩基配列が存
在するかどうかを検出する方法である。この方法は、一
本鎖のプロ−ブに結合させた蛍光物質が、二本鎖になっ
たことによって動きにくくなり、蛍光異方性が増大する
ことがその検出の原理となっている。

【００１５】ところが、これらの方法では、検体中に蛋
白質等の夾雑物が含まれていて、それがプロ−ブＤＮＡ
に非特異的に吸着すると、ハイブリッド体検出のバック
グランドを上昇させる原因となるため、あらかじめこれ
らの夾雑物を完全に除去するという煩雑な作業が必要と
なる。また、プローブＤＮＡの非特異的吸着、及び、塩
基のミスマッチによる擬ハイブリッド体は他の溶液系の
場合と同様、それをあらかじめ除去する操作が必要であ
る。さらに、確かにＢ／Ｆ分離は必要ないもののプロー
ブ濃度が標的ＤＮＡ濃度と同程度であることが蛍光の変
異を測定する上で必要となる。

【００１６】

【発明が解決しようとする課題】上記のように、ハイブ
リダイゼ−ション反応を用いた標的核酸の検出法でＢ／
Ｆ分離を必要とする場合は、標的核酸を固定した場合
も、固定しない溶液系の場合も、Ｂ／Ｆ分離（過剰なプ
ローブの除去）、非特異吸着やミスマッチの除去などの
操作を数多く含み、かなり煩雑である。しかも、これら
の操作の最適条件はプロ−ブの長さ、或は、それぞれの
塩基配列によって異なるため、それぞれの場合で条件を
検討し、設定していく必要がある。特に、ミスマッチし
ている塩基のプロ−ブ上の位置もハイブリッド体の安定
性に影響を与える重要な因子となり、その位置によって
はミスマッチしているハイブリッド体を除去できない場
合も生じるため、ミスマッチの可能性を考慮して、ハイ
ブリダイゼ−ション反応の条件を個々のケースに応じて
設定するという更に煩雑な作業が必要となる。

【００１７】また、上述のＢ／Ｆ分離を必要としない蛍
光の変異を測定する方法でも、非特異吸着やミスマッチ
の発生を防止する、あるいは発生した非特異吸着やミス
マッチを除去するための煩雑な処理が必要である。しか
も、夾雑物の存在によって測定感度が影響を受けたり、
プロ−ブ濃度が標的核酸濃度と同程度であることが必須
であるので、十分な量の試料を確保する必要があり、少
量しか採れない試料の分析に適用できない場合があると
いった問題がある。

【００１８】本発明は、以上のような従来技術における
問題に鑑みなされたものであり、Ｂ／Ｆ分離の必要がな
く、より簡易化された工程からなり、良好な測定感度を
得ることができるハイブリダイゼーションを利用した標
的核酸の検出方法及びそれに用いるプローブを提供する
ことにある。

【００１９】本発明の他の目的は、ミスマッチしている
ハイブリッド体が存在する場合でも所望のハイブリッド
体のみを正確に検出できる標的核酸の検出方法及びそれ
に用いるプローブを提供することにある。

【００２０】

【課題を解決するための手段】本発明の核酸ハイブリッ
ド体の検出方法は、試料溶液中にプローブを加えてこれ
らを反応させ、該試料溶液中に標的核酸が存在する場合
に得られるプローブと標的核酸とのハイブリッド体の２
重らせん構造を検出するものである。

【００２１】本発明の検出方法は、従来の方法とはまっ
たく異なる原理に基づいてハイブリッド体を検出するも
のである。すなわち、本発明の方法は、ハイブリッド体
形成にともなう二重らせん構造の形成を検出するもので
あり、Ｂ／Ｆ分離が不要である。さらに、本発明におい
ては、正確な２重らせん構造のみ検出できる条件を設定
することで、非特異吸着やミスマッチが生じていてもそ
のまま所望の核酸ハイブリッド体の形成を検出可能とな
り、測定精度を向上させることが可能である。なお、本
発明は、ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーション、ＤＮ
Ａ−ＲＮＡハイブリダイゼーションなど核酸が規則的な
２重らせん構造を形成する場合に適用される。

【００２２】以下、本発明について詳細に説明する。

【００２３】ハイブリダイゼ−ションという現象は、こ
れまで単に、互いに相補的な核酸塩基間の水素結合とい
う視点でとらえられていたにすぎない。それは、核酸
（ＤＮＡやＲＮＡ）を固定化させてからハイブリダイゼ
−ション反応を行なうことが一般的であったからであ
る。しかし、溶液中でのハイブリダイゼ−ション反応の
場合には、核酸がある長さで二本鎖を形成すれば、二重
らせん構造をとることが期待される。本発明者らは、核
酸が一本鎖の場合と二本鎖（ハイブリッド体）の場合
に、その高次構造や化学的性質が異なることに着目し、
その検出システムを確立し、本発明を完成した。

【００２４】２重らせん構造では、核酸塩基部分が水素
結合により塩基対を形成し、リン酸部分及び糖の部分は
外側に向いた形でらせんを巻く。核酸塩基はお互いに積
み重なりスタッキングにより安定化してらせん軸の中心
に位置する。二重らせん構造としては、Ａ、Ｂ、Ｃ及び
Ｚ型、そして、これらの変形が知られている。それぞれ
の構造は、塩基配列だけでなく、アニーリングの際に用
いるイオン種や塩濃度によって、ピッチ長、らせんの対
称性、溝の幅、溝の深さなどが異なり、同じ配列を用い
た場合でも条件によって２重らせん構造が変化するとい
われている。一般的には、ＤＮＡはＢ型構造をとるとい
われ、その場合、ピッチ長は３３．８オングストロ−
ム、１ピッチ当たりの核酸塩基対数は１０塩基といわれ
ている。

【００２５】本発明は、ハイブリッド体の有する２重ら
せん構造を利用して検出可能な変化を起し得る試薬物質
を用い、該試薬物質の化学的変化を測定することで２重
らせん構造の形成を検出する方法である。

【００２６】この試薬物質としては、（ａ）２重らせん
構造自体と反応（相互作用）して変化を起こすもの、
（ｂ）２重らせん構造を介して相互作用する２種以上の
試薬物質であって、該相互作用に基づく変化を検出する
ものなどが利用できる。

【００２７】（ａ）の試薬物質を用いる場合は、試料溶
液とプローブとを反応させ、試料中に標的核酸が含まれ
ている場合に形成するプローブと標的核酸とのハイブリ
ッド体の有する２重らせん構造を、試薬物質あるいは核
酸の構成成分の変化によって検出する。この場合、試薬
物質は、試料溶液とプローブの反応系に共存させてもよ
いし、これらの反応を終了させてから、添加してもよ
い。この試薬物質の２重らせん構造との反応による変化
の検出は、試薬物質の変化自体が測定可能である場合に
は、この変化を測定することで行い、また試薬物質の変
化が検出可能な別の変化を誘導するものであれば、この
別の変化を測定することで行う。

【００２８】この方法において、試薬物質を反応に共存
させる場合には、試薬物質をプローブに結合させておく
ことで、また試薬物質として核酸塩基に対するインター
カレーターを用いることで、試薬物質と２重らせん構造
との反応をより容易なものとすることができるので好ま
しい。

【００２９】２重らせん構造と相互作用する試薬物質と
しては、例えば、２重らせん構造を構成している核酸等
の物質と反応して、それ自身が、あるいは２重らせん構
造側が検出可能な化学変化や構造的変異を起こすもの
や、反応系に加えた第３の物質と２重らせん構造の存在
下で反応して検出可能な変化を起こすものが利用でき
る。

【００３０】この相互作用としては、例えば、２重らせ
ん構造と試薬物質との間の電荷移動に基づく相互作用な
どが利用できる。相互作用として、電荷移動を利用する
場合には、試薬物質としては、２重らせん構造に対して
電子供与体または電子受容体となり得る物質が利用され
る。この相互作用は、例えばハイブリッド体形成前後に
おける試薬物質、２重らせん構造、または、これらの物
質と相互作用しうる第三の物質の化学構造の変化、電子
状態の変化、或はまた、変化した物質に由来する信号の
変化として検出される。

【００３１】この電荷移動に基づく相互作用としては、
後述の（ｂ）の試薬物質の場合と同様に、いわゆるｔｈ
ｒｏｕｇｈ ｓｐａｃｅの場合と、ｔｈｒｏｕｇｈ ｂ
ｏｎｄの場合とが考えられ、例えば、核酸塩基対のスタ
ッキングを介した電荷移動や、二重らせん構造への変化
に伴う電子供与体と電子受容体の近接効果に基づく電荷
移動が利用できる。

【００３２】なお、２重らせん構造と試薬物質間での電
荷移動が起こりにくい場合には、これらの間に電荷移動
を仲介するようなメディエーター、或は、センシタイザ
ーと称される物質を介在させてもよい。

【００３３】本発明においては試薬物質が２重らせん構
造と反応できる位置に配置されて、これらの相互作用が
生じる必要がある。試薬物質が二重らせん構造と反応可
能な位置に配置される方式としては、インターカレータ
ーのように核酸塩基対の間に入り込む場合、二重らせん
構造の溝に埋め込まれる場合、更に、二重らせん構造に
寄り添う形で配置される場合等が利用できる。いずれの
場合も、一本鎖であるプロ−ブと標的核酸とによって形
成されたハイブリッド体の２重らせん構造に特異的に配
置されることが本発明にとって本質的に必要なことであ
る。

【００３４】これらの中では、後述の（ｂ）の場合と同
様に、インターカレーターは、スタッキングを介する電
荷移動を利用する場合に最も有利である。

【００３５】二重らせん構造と試薬物質の相互作用の変
化を電子受容体の変化としてとらえる方法は、その検出
手段に応じていくつかの種類に分類できる。

【００３６】例えば、スピンラベル化剤を用いると、ス
ピン解消法等により、移動してきた電荷をＥＳＲ等でス
ペクトル変化としてとらえることができる。また、電荷
移動吸収帯のように、新しい吸収スペクトルの出現、或
は、変化としてとらえることもできる。電荷移動の結
果、溶液が着色、変色するような系は、直接その変化を
目でとらえることができ、簡便な系として、さらに有効
である。蛍光やリン光のような発光系も利用できる。こ
の場合、蛍光やリン光が新たに生じる反応や、発光して
いたものが相互作用の結果消失する反応を利用できる。
また、電子受容体が電荷移動の結果、別の物質に化学変
化し、それを検出するという方法も利用できる。この
時、変化した物質に、後から第三の物質を加え、両者の
化学反応により化学発光を起こし検出することも可能で
ある。第三の物質として酵素や抗体のような蛋白質を利
用する場合には生物発光による検出方法が利用できる。

【００３７】検出方法として、電子受容体の変化の他
に、電子供与体の変化で相互作用を検出しても良い。そ
して、それは基本的には、電子受容体の場合に用いられ
る方法のほとんどがそのまま適応できる。蛍光物質を電
子供与体として用いる場合には、電荷移動に伴って蛍光
の量子収率が減少するものを用いて、蛍光消光のような
直接の変化を検出することもできるし、生じた変化をさ
らにいくつかの反応と組み合わせて可視化する方法も利
用できる。

【００３８】試薬物質が２重らせん構造に対する電子供
与体である場合は、これが光によって活性化されて電子
を放出し電荷移動が開始される場合のほか、第三の物質
として、電子供与体である試薬物質を刺激して電子を発
生させるような物質が存在してもよい。

【００３９】さらに、試薬物質が２重らせん構造に対す
る電子受容体である場合は、これを活性化して、それに
誘起されて電子が電子受容体から引き抜かれてもよい。
そして、その開始剤としては、電子供与体の時と同様、
光の他、何らかの開始剤であってもよい。

【００４０】また、先に述べたように、第三の物質とし
て、電荷移動を仲介するようなメディエ−タ−、或は、
センシタイザ−と称される物質が介在しても良い。そし
て、これらの物質が二重らせんと相互作用し、直接二重
らせんとは結合していない電子供与体、電子受容体に電
荷移動を促しても良い。

【００４１】（ａ）の試薬物質としては、例えば、リボ
フラビンなどのように２重らせん構造の核酸とのみ結合
し、相手から電子を引き抜く作用のある試薬物質が利用
できる。リボフラビンの他、Ｎ，Ｎ’−ジメチル−２，
７−ジアザピレニウムイオンのような酸化剤が利用でき
る。

【００４２】この（ａ）の試薬物質は、２重らせん構造
に特異的な反応による検出可能な変化を起こすものであ
れば、非結合状態で、あるいはプローブに結合させて用
いることができる。

【００４３】先に挙げた（ｂ）の試薬物質を用いる方法
は、一本鎖から二本鎖、つまり、二重らせんへの構造変
化にともない、二種以上の試薬物質の相互作用により起
る変化を測定することでハイブリッド体を検出するもの
である。ここでいう相互作用としては、電荷移動等を挙
げることができる。相互作用として、電荷移動を利用す
る場合には、二種以上の試薬物質には、少なくとも電子
供与体と電子受容体のセットが含まれる。そして、両者
の相互作用は、例えばハイブリッド体形成前後における
電子受容体、電子供与体、または、これらの物質と相互
作用しうる第三の物質の化学構造の変化、電子状態の変
化、或はまた、変化した物質に由来する信号の変化とし
て検出される。

【００４４】電子受容体と電子供与体の関係は、両者の
エネルギ−状態の関係で決まるものである。従って、本
発明においては、電子供与体または電子受容体として一
般に定義された物質が、その定義のとおりに用いられる
のではなく、２種以上の試薬物質の個々の組合せにおい
て、電子供与体及び電子受容体となり得る物質を適宜選
択して用いる。例えば、アントラセンは典型的な電子供
与体として、その酸化還元電位が測られている一方で、
電子受容体としてもその特性が調べられていることはよ
く知られたことである。

【００４５】電子供与体と電子受容体の相互作用とし
て、いわゆるｔｈｒｏｕｇｈ ｓｐａｃｅの場合と、ｔ
ｈｒｏｕｇｈ ｂｏｎｄの場合とが考えられる。前者に
は、例えば、核酸塩基対のスタッキングを介して電子供
与体と電子受容体が相互作用するような場合と、二重ら
せん構造への変化に伴う電子供与体と電子受容体の近接
効果に基づくような場合とが含まれる。後者（ｔｈｒｏ
ｕｇｈ ｂｏｎｄ）では、核酸を構成する塩基、リン酸
部分、或は、糖の部分をも含めた電荷の移動が考えられ
る。いずれの場合もそれらの相互作用が、二重らせんを
形成したことに由来するものであればその形態はなんら
限定されない。

【００４６】核酸塩基間のスタッキングを介する場合と
は、２重らせん構造と反応できる位置に置かれた電子供
与体と電子受容体の距離が本来相互作用できないほど離
れている時、電子供与体から放出された電子が、核酸塩
基対上に広がる電子雲を介して、電子を次々隣接する核
酸塩基対に受け渡され、最終的に電子受容体にまで電子
を到達させるというものである。また、逆に、電子受容
体が核酸塩基対から電子を引き抜き、それが連鎖的に行
われて最終的に電子供与体から電子が奪い取られるとい
う機構も成り立つ。つまり、電荷移動におけるメディエ
−タ−が、核酸塩基対ということになる。

【００４７】これに対し、電子供与体と電子受容体の近
接効果に基づく場合とは、２重らせん構造に形成によっ
て電子供与体と電子受容体の距離がこれらの相互作用な
可能な程度に近くなる場合である。例えば、電子供与体
と電子受容体の両方をプローブに結合させ、これらの距
離をプローブが一本鎖の状態のときにはこれらが相互作
用を起さず、標的核酸とハイブリダイズして２重らせん
構造を形成して近接した場合にこれらの相互作用が生じ
るように設定すれば、２重らせん構造の形成をこれらの
相互作用が生じたかどうかによって検出できる。

【００４８】なお、２重らせん構造を介した電子供与体
と電子受容体の間での電荷移動が起こりにくい場合に
は、これらの間に電荷移動を仲介するようなメディエー
ター、或は、センシタイザーと称される物質を介在させ
てもよい。

【００４９】上記のように、本発明においては電子供与
体と電子受容体が２重らせん構造と反応できる位置に配
置されて、これらの相互作用が生じる必要がある。試薬
物質が二重らせん構造と反応可能な位置に配置される方
式としては、インターカレーターのように核酸塩基対の
間に入り込む場合、二重らせん構造の溝に埋め込まれる
場合、更に、二重らせん構造に寄り添う形で配置される
場合等が利用できる。いずれの場合も、一本鎖であるプ
ロ−ブと標的核酸とによって形成されたハイブリッド体
の２重らせん構造に特異的に配置されることが本発明に
とって本質的に必要なことである。

【００５０】これらの中では、インターカレーターは、
スタッキングを介する電荷移動を利用する場合に最も有
利である。つまり、インターカレーターは、一般には、
電子の広がりを持つ平面状の化合物で、核酸塩基対の積
み重なりの延長線上に、核酸塩基対間の距離と同じよう
な距離で、核酸塩基対と平行な位置に配向する。例え
ば、電子供与体としてインターカレーターを用い、２重
らせん構造の反対側に電子受容体を配置すれば、電子供
与体から放出された電子が、隣接する核酸塩基対に電子
が送られ、それがそれぞれの核酸塩基対の電子雲を経由
して、一直線に電子受容体に向かって流れ得る。或は、
この逆に、電子受容体としてインターカレーターを用
い、２重らせん構造を挟んだ反対側に電子受容体を配置
すれば、電子受容体上の電子孔により隣接する核酸塩基
対から電子を引き抜き、この電子の引き抜きが他の核酸
塩基対間に次々と生じて最終的に電子供与体から電子を
引き抜き、電荷移動が行われる場合もある。これらの点
を考慮すると、スタッキングを介する電荷移動の場合に
は、電子供与体、電子受容体のうち、少なくともひとつ
がインターカレーターであることが好ましく、両者が共
にインターカレーターである場合には、さらに電荷移動
効率を上げることが可能であるのでより好ましい。イン
ターカレーターは二重らせん構造を安定化させ、その融
解温度を上昇させることが知られており、電子供与体や
電子受容体がインターカレーターであることは、プロ−
ブと標的核酸間のハイブリッド体を安定化させるという
点でも有利である。

【００５１】二重らせん形成に伴う二種以上の試薬物質
の相互作用の変化を電子受容体の変化としてとらえる方
法は、その検出手段に応じていくつかの種類に分類でき
る。

【００５２】例えば、スピンラベル化剤を用いると、ス
ピン解消法等により、移動してきた電荷をＥＳＲ等でス
ペクトル変化としてとらえることができる。また、電荷
移動吸収帯のように、新しい吸収スペクトルの出現、或
は、変化としてとらえることもできる。電荷移動の結
果、溶液が着色、変色するような系は、直接その変化を
目でとらえることができ、簡便な系として、さらに有効
である。蛍光やリン光のような発光系も利用できる。こ
の場合、蛍光やリン光が新たに生じる反応や、発光して
いたものが相互作用の結果消失する反応を利用できる。
また、電子受容体が電荷移動の結果、別の物質に化学変
化し、それを検出するという方法も利用できる。この
時、変化した物質に、後から第三の物質を加え、両者の
化学反応により化学発光を起こし検出することも可能で
ある。第三の物質として酵素や抗体のような蛋白質を利
用する場合には生物発光による検出方法が利用できる。

【００５３】検出方法として、電子受容体の変化の他
に、電子供与体の変化で相互作用を検出しても良い。そ
して、それは基本的には、電子受容体の場合に用いられ
る方法のほとんどがそのまま適応できる。蛍光物質を電
子供与体として用いる場合には、電荷移動に伴って蛍光
の量子収率が減少するものを用いて、蛍光消光のような
直接の変化を検出することもできるし、生じた変化をさ
らにいくつかの反応と組み合わせて可視化する方法も利
用できる。

【００５４】本発明では、電子供与体が光によって活性
化されて電子を放出し電荷移動が開始される場合のほ
か、第三の物質として、電子供与体を刺激して電子を発
生させるような物質が存在してもよい。

【００５５】さらに、電子受容体の方を活性化して、そ
れに誘起されて電子が電子受容体から引き抜かれてもよ
い。そして、その開始剤としては、電子供与体の時と同
様、光の他、何らかの開始剤であってもよい。

【００５６】また、先に述べたように、電子供与体、電
子受容体の他に、第三の物質として、電荷移動を仲介す
るようなメディエ−タ−、或は、センシタイザ−と称さ
れる物質が介在しても良い。そして、これらの物質が二
重らせんと相互作用し、直接二重らせんとは結合してい
ない電子供与体、電子受容体に電荷移動を促しても良
い。

【００５７】電子供与体と電子受容体を用いる形態とし
ては、例えば以下のものを挙げることができる。 ａ）これらの両方を、プローブと標的核酸とのハイブリ
ダイゼーションによる２重らせん構造の形成時に反応系
に存在させる。 ｂ）これらの両方を、プローブと標的核酸とのハイブリ
ダイゼーションによる２重らせん構造の形成後に反応系
に添加する。 ｃ）これらの一方を、プローブと標的核酸とのハイブリ
ダイゼーションによる２重らせん構造の形成時に反応系
に存在させておき、その後に他方を添加する。

【００５８】電子供与体と電子受容体は、非結合状態で
これらを反応系に添加した場合にこれらの相互作用が２
重らせん構造に特異的に生じるものであれば、非結合状
態でそのまま利用可能である。

【００５９】しかしながら、電子供与体及び電子受容体
が、これらの一方または両方が反応系にフリ−に共存し
ている場合に、標的核酸の存在の有無に関係なく、両者
間での相互作用が起こってしまい、バックグランドが上
昇してＳ／Ｎ比が悪くなるものである場合には、これら
の一方または両方をプローブに結合させて用いるのが好
ましい。なお、反応系中での濃度を選択することで、こ
のようなバックグランドの上昇が生じないものであれ
ば、これらの濃度を選択すれば、非結合状態で用いるこ
とも可能である。電子供与体や電子受容体のプローブへ
の結合は、必要に応じて例えば（ＣＨ₂ ）_n のようなリ
ンカーを介して行い、その際これらの相互作用が最も効
率よくなされるようにこれらの位置関係等を配慮する。

【００６０】最も望ましい形態としては、両方がプロ−
ブに結合している場合であり、その場合には、相互作用
する試薬物質間の位置関係が明確となるため、その相互
作用の制御を、プローブでのこれらの位置関係によって
行うことができるので有利である。この場合、電子供与
体と電子受容体のプローブ上での距離は、用いる電子供
与体と電子受容体の種類に応じて適宜選択されるが、例
えば、近接効果を利用する場合には、電子供与体と電子
受容体の距離は、２０〜１２０オングストロームである
ことが好ましく、５０〜８０オングストロームであるこ
とがより好ましい。また、２重らせん構造を介した電荷
移動を行う場合には、これらの距離は、２０〜１２０オ
ングストロームであることが好ましく、５０〜８０オン
グストロームであることがより好ましい。これらをプロ
ーブに結合させる場合の位置は、プローブの長さにもよ
るが、プローブの両端に分けて結合させるのが、結合の
容易性の点から有利である。

【００６１】なお、プローブの長さは、標的核酸との良
好なハイブリダイゼーションが可能で、安定した２重ら
せん構造が得られる長さが個々のケースにおいて適宜選
択される。電子供与体と電子受容体の両方をプローブに
結合させる場合でこれらが近接していると２重らせん構
造の存在しない場合でも相互作用を起こし得るものであ
る場合には、両者の距離を考慮してプローブ長は決定さ
れるが、その長さは、例えば、８塩基長以上、好ましく
は１２塩基長以上とされる。

【００６２】しかしながら、２重らせん構造の安定化に
は、プローブ長の他に、塩基配列自体、反応系の塩濃度
やイオン強度も大きく影響する。Ｇ−Ｃ塩基対は、Ａ−
Ｔ塩基対よりも水素結合数が多いため、ＧＣが多い配列
ではより安定な２重らせん構造が形成される。また、Ｋ
Ｃｌのモル濃度を０．０１Ｍから１Ｍに上昇させるとＤ
ＮＡの融点温度は３０℃上昇するといわれている。ま
た、インターカレーターの存在も安定に大きく寄与す
る。従って、これらの安定化因子を適宜利用することに
よって、８塩基長未満のプローブを用いることも可能で
ある。

【００６３】電子供与体の電子受容体は相互作用に基づ
く変化は、不可逆的なものであることが望ましい。すな
わち、検出に供せられる電子供与体、或いは、電子受容
体が不可逆的に変化するものであれば、変化を蓄積して
検出することも可能であり、その場合感度の点で有利で
ある。

【００６４】

【実施例】以下実施例により本発明を更に詳細に説明す
る。 実施例１ ［１］スピンラベル化剤であるＴＥＭＰＯ（４−ヒドロ
キシ−２、２、６、６−テトラメチルピペリジン）を結
合させた２０量体オリゴヌクレオチドプロ−ブの作製 （１）４−アミノヘキシルアミノ−２，２，６，６，−
テトラメチルピペリジン−Ｎ−オキシル（４−アミノヘ
キシルアミノ−ＴＥＭＰＯ）の合成 ４−オキソ−ＴＥＭＰＯの０．５ｍｍｏｌｅとヘキサメ
チレンジアミンニ塩酸塩５ｍｍｏｌｅをメタノール３０
ｍｌに溶解し、これにシアノ化ホウ素ナトリウム０．４
ｍｍｏｌｅ、モレキュラーシーブ３Ａを加えて室温下２
４時間攪拌してこれらを反応させた。次に、反応溶液を
グラスフィルターで濾過しモレキュラーシーブを除去
し、続いて濾液から溶媒を減圧下で除去した。次に得ら
れた残留物に１Ｎ塩酸３０ｍｌを加えて溶解した後、ク
ロロホルムで抽出した。クロロホルム相を水で洗浄後減
圧下でクロロホルムを減圧下で留去した。得られた残留
物に水を加え不溶物を濾過して得た濾液を再度減圧下で
溶媒を留去し赤色の油状物を得た。

【００６５】（２）オリゴヌクレオチドの合成 標的ＤＮＡとしてのＭ１３ｍｐ１８ＤＮＡ（一本鎖）と
部分的に相補的な塩基配列を有する２０量体オリゴヌク
レオチドをＡＢＩ社製３８１Ａ ＤＮＡ自動合成基を用
いて合成した。５’末端ジメトキシトリチル基は自動合
成機上で除去した。その塩基配列は以下のとおりであ
る。

【００６６】５’−ＧＴＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣ
ＣＡＧＴ−３’ （３）スピンラベルオリゴヌクレオチドプローブの合成 上記（２）の工程で、合成したオリゴヌクレオチド（１
μｍｏｌｅ）をＣＰＧサポートに結合させたままガスタ
イトシリンジに移した。以下の反応はシリンジ内で行な
った。ＣＰＧサポートにカルボニル−Ｎ，Ｎ’−ジイミ
ダゾール（ＣＤＩ）５０ｍｇを溶解したジオキサン１ｍ
ｌを加え室温下１時間放置した。ジオキサンで洗浄後減
圧乾燥し、続いて４−アミノヘキシルアミノ−ＴＥＭＰ
ＯのＤＭＳＯ溶液（０．２Ｍ ０．４ｍｌ）を加え５５
℃で２４時間放置した。ＤＭＳＯ、ジオキサン、メタノ
ールの順で洗浄し減圧乾燥した。

【００６７】常法に従って濃アンモニア水によるスピン
ラベルオリゴヌクレオチドの切り出しと脱保護を行ない
ＲＰＬＣによって精製した。

【００６８】［２］ＴＥＭＰＯプロ−ブとＭ１３ｍｐ１
８ＤＮＡとのハイブリッド体の形成反応 上記［１］で作製されたＴＥＭＰＯが導入されたオリゴ
ヌクレオチドプロ−ブの０．２μＭと、Ｍ１３ｍｐ１８
ＤＮＡ（宝酒造社製）の０．２μＭを１ｍＭリン酸緩衝
溶液（ｐＨ７．０）／１４５ｍＭ ＮａＣｌ／５ｍＭ
ＫＣｌ中で８０℃に加熱し、その後、徐々に冷却して室
温まで下げて、プロ−ブ・標的ＤＮＡ・ハイブリッド体
を作製した。次に、この反応液にフルオレセイン（コダ
ック社製）を最終濃度１０μＭになるように加え、以下
に示すＥＳＲスペクトルの測定に供した。また、Ｍ１３
ｍｐ１８ＤＮＡを用いずに上記と同様の操作を行い、Ｅ
ＳＲスペクトルの測定用のサンプル（プローブ単独）を
得た。

【００６９】［３］ＥＳＲスペクトルの測定 ＥＳＲ測定は一つのサンプルにつき２０分間隔でsweep
し、それを１００分間にわたって続けた。そして、強度
比、および、線幅の時間変化を追った。ＥＳＲは日本電
子社製、測定には、人工石英の扁平セルを用いた。

【００７０】ＥＳＲおよび光照射装置は以下の設定で行
なった。

【００７１】

【表１】 光照射装置 モノクロメ−タ− 490nm Power supply 88.5V-89V / 22A 図１にＥＳＲシグナル強度比の経時変化、線幅の経時変
化を示す。図１からわかるように、プロ−ブ単独の場合
には、光照射しても強度比及び線幅に変化は見られなか
った。また、フルオレセイン／プロ−ブ／Ｍ１３ｍｐ１
８の場合にも、光照射しなかった場合には、強度比、線
幅に変化は見られなかった。

【００７２】これに対し、フルオレセイン／プロ−ブ／
Ｍ１３ｍｐ１８ＤＮＡに光（４９０ｎｍ）を照射した場
合、時間と共にＥＳＲの強度比は減少した。また、線幅
に変化が観測されなかったことから、ＥＳＲでの強度変
化が化学変化によるものではないといえる。従って、プ
ロ−ブとＭ１３ｍｐ１８ＤＮＡによって形成された２重
らせん構造を介してフルオレセインからプローブに結合
させたＴＥＭＰＯへ電荷が移動した結果、ＴＥＭＰＯの
スピンが解消されたことが確認された。つまり、Ｂ／Ｆ
分離なしに、プロ−ブ・標的ＤＮＡ・ハイブリッド体が
検出できたことになる。 実施例２ プロ−ブの塩基配列として下記の配列を用いる以外は、
実施例１と同様の実験を行った。

【００７３】５’−ＧＴＴＧＴＡＡＡＡＧＧＡＣＧＧＣ
ＣＡＧＴ−３’ なお、このプローブの配列は、実施例１で用いたプロー
ブの配列の５’末端から第１０番目の塩基をＣからＧに
変換したもので、実施例１のものと１塩基異なり、Ｍ１
３ｍｐ１８ＤＮＡとはミスマッチするようになってい
る。

【００７４】このミスマッチ配列を有するプロ−ブ０．
２μＭにＭ１３ｍｐ１８ＤＮＡ０．２μＭを加え、実施
例１と同様な操作でアニ−ルさせ、さらに、フルオレセ
インを加えて、ＥＳＲシグナルの強度比及び線幅の経時
変化を調べた。

【００７５】その結果、実施例１で見られた強度変化は
観測されず、プロ−ブ単独の場合と同じ強度を保ったま
まであった。このことは、ミスマッチしたオリゴヌクレ
オチドプロ−ブとＤＮＡのハイブリッド体の場合には、
正確な二本鎖が形成されず、電荷が移動しなかったとい
える。

【００７６】実施例３ 両末端ラベル（５’−ＴＥＭＰＯ，３’- ＦＩＴＣ）オ
リゴヌクレオチドプローブの合成 （１）３’アミノ基結合オリゴヌクレオチドの合成 グレンリサーチ社製の３’−アミノモディファイアーＣ
ＰＧ（１μｍｏｌ）を担体として実施例１で用いた標的
ＤＮＡのモデルとしてのＭ１３ｍｐ１８ＤＮＡの一本鎖
ＤＮＡと部分的に相補的な塩基配列を有する２０量体オ
リゴヌクレオチドをＡＢＩ社製３８１Ａ ＤＮＡ自動合
成基で合成した。５’末端ジメトキシトリチル基は自動
合成機上で除去した。 （２）スピンラベルオリゴヌクレオチドプローブの合成 上記（１）で合成したオリゴヌクレオチド（１μｍｏ
ｌ）をＣＰＧサポートに結合したままガスタイトシリン
ジに移した。以下の反応はシリンジ内で行なった。ＣＰ
Ｇサポートにカルボニル−Ｎ，Ｎ’−ジイミダゾール
（ＣＤＩ）５０ｍｇを溶解したジオキサン１ｍｌを加え
室温下１時間放置した。ジオキサンで洗浄後減圧乾燥
し、続いて実施例１で示した４−アミノヘキシルアミノ
−ＴＥＭＰＯのＤＭＳＯ溶液（０．２Ｍ ０．４ｍｌ）
を加え５５℃で２４時間放置した。ＤＭＳＯ、ジオキサ
ン、メタノールの順で洗浄し減圧乾燥した。

【００７７】次に、常法に従って濃アンモニア水による
スピンラベルオリゴヌクレオチドの切り出しと脱保護を
行ないＲＰＬＣによって精製し、５’末端にＴＥＭＰＯ
をラベルしたスピンラベルオリゴヌクレオチドを得た。 （３）両末端ラベルオリゴヌクレオチドプローブの合成 上記（２）で合成したスピンラベルオリゴヌクレオチド
の３’末端には３−アミノ−２−ヒドロキシ基が結合し
ているので、このアミノ基とＦＩＴＣ（フルオレセイン
イソチオシアネート、Sigma社製）を以下の操作によっ
て結合させた。

【００７８】上記（２）で合成したスピンラベルオリゴ
ヌクレオチド０．２μｍｏｌ（７００μｌ水溶液）と１
Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９）１００μｌを混合
し、得られた溶液にＦＩＴＣの２ｍｇのＤＭＦ溶液を加
え３５℃で２４時間反応させた。ファルマシア社製ゲル
濾過カラムＮＡＰ−２５で処理し大過剰のＦＩＴＣを除
去した後ＲＰＬＣによって精製し、５’末端にＴＥＭＰ
Ｏが結合され、３’末端にＦＩＴＣが結合されたプロー
ブを得た。

【００７９】（４）ＥＳＲスペクトルの測定 上記（３）で得たプロ−ブとＭ１３ｍｐ１８ＤＮＡ（そ
れぞれ０．２μＭ）を定法に従ってアニ−ルさせ、ＥＳ
Ｒシグナルの強度比及び線幅の変化を実施例１の場合と
同様な方法で調べた。プロ−ブ単独、光非照射時のプロ
−ブ・標的ＤＮＡ・ハイブリッド体では、強度の変化が
見られなかったのに対し、プロ−ブ・標的ＤＮＡ・ハイ
ブリッド体にフルオレセインの励起波長である４９０ｎ
ｍの光をあてた場合にのみシグナルは時間と共に減少
し、電荷移動が確認できた（図２）。さらに、スピン解
消の度合いはフルオレセインがプロ−ブに結合されてい
ない場合（実施例１）よりも大きく、両末端に電子供与
体、電子受容体を結合させた方が効果的に電子移動が起
こることが確認された。

【００８０】実施例４ プロ−ブの真ん中にＭ１３ｍｐ１８ＤＮＡとは１塩基異
なる塩基配列を持つオリゴヌクレオチド（実施例２と同
じ配列）を合成し、実施例３と同様な方法で、その両末
端にＴＥＭＰＯとフルオレセインとを結合させた。

【００８１】このプロ−ブとＭ１３ｍｐ１８ＤＮＡ（そ
れぞれ０．２μＭ）を定法に従ってアニ−ルさせ、ＥＳ
Ｒシグナルの強度比及び線幅の変化を実施例１の場合と
同様な方法で調べた。プロ−ブ・標的ＤＮＡ・ハイブリ
ッド体にフルオレセインの励起波長である４９０ｎｍの
光をあてた場合にも、プロ−ブ単独、光非照射時のプロ
−ブ・標的ＤＮＡ・ハイブリッド体の場合と同様、ＥＳ
Ｒシグナルの強度比及び線幅の変化は観測されなかっ
た。

【００８２】実施例５ 実施例１と同様な塩基配列を持つ２０量体オリゴヌクレ
オチドをＤＮＡ自動合成機により合成した。このオリゴ
ヌクレオチドをプロ−ブとして用い、Ｍ１３ｍｐ１８Ｄ
ＮＡとのハイブリッド体を形成させた。溶液は１０ｍＭ
リン酸緩衝液、プロ−ブは最終濃度３μＭ、６μＭ、１
０μＭ、２０μＭ、Ｍ１３ｍｐ１８ＤＮＡの濃度は最終
濃度１０μＭとなるように調製した。さらに、このプロ
−ブ・標的ＤＮＡ・ハイブリッド体にリボフラビンを最
終濃度１００μＭになるように加えた。プロ−ブ／Ｍ１
３ｍｐ１８ＤＮＡ／リボフラビン混合液１ｍｌにリボフ
ラビンの励起波長である４７０ｎｍの光を５分間照射し
た。

【００８３】そのうちの２００μｌをヌクレア−ゼＰ₁
で処理し、続いてＥ．ｃｏｌｉ アルカリフォスファタ
−ゼで消化してプロ−ブ、及び、ＤＮＡをヌクレオシド
に分解した。この分解物をＫａｓａｉらの方法（Ｇａｎ
ｎ，７５，ｐ８４１−８４４，（１９８４））に従って
ＨＰＬＣで分離して８−ヒドロキシグアノシン（８−Ｏ
Ｈ−Ｇ）の量を定量した。対照実験として、プロ−ブ／
リボフラビン溶液及びＭ１３ｍｐ１８ＤＮＡ／リボフラ
ビン溶液のそれぞれについても同様な実験を行なった。

【００８４】その結果、図３に示すように、プロ−ブの
濃度に依存して８−ＯＨ−Ｇが精製し、その最大値は、
プロ−ブと標的ＤＮＡの比が１：１の時であることが明
らかになった。プロ−ブ／リボフラビン溶液、Ｍ１３ｍ
ｐ１８ＤＮＡ／リボフラビン溶液では８−ＯＨ−Ｇは検
出されなかった。つまり、プロ−ブとＤＮＡとがハイブ
リッド体を形成した時にのみ８−ＯＨ−Ｇが生成したこ
とになる。

【００８５】実施例６ 実施例１と同様な塩基配列を持つ２０量体オリゴヌクレ
オチドをＤＮＡ自動合成機により合成した。このオリゴ
ヌクレオチドをプロ−ブとして用い、Ｍ１３ｍｐ１８Ｄ
ＮＡとハイブリッド体を形成させた。溶液は１０ｍＭリ
ン酸緩衝液、プロ−ブは最終濃度３μＭ、６μＭ、１０
μＭ、２０μＭ、Ｍ１３ｍｐ１８ＤＮＡの濃度は最終濃
度１０μＭとなるように調製した。さらに、このプロ−
ブ・標的ＤＮＡ・ハイブリッド体にリボフラビンを最終
濃度１００μＭになるように加えた。プロ−ブ／Ｍ１３
ｍｐ１８ＤＮＡ／リボフラビン混合液１ｍｌにリボフラ
ビンの励起波長である４７０ｎｍの光を５分間照射し
た。

【００８６】対照実験として、プロ−ブ／リボフラビン
溶液及びＭ１３ｍｐ１８ＤＮＡ／リボフラビン溶液のそ
れぞれについても同様な実験を行なった。

【００８７】光照射後の各サンプル１００μｌにＳａｌ
ｍｏｎ Ｔｅｓｔｅｓ ＤＮＡ５０μｇを加えてマイク
ロプレ−トに固定し、ＥｌＩＳＡ法により８−ＯＨ−Ｇ
の抗体と反応させた。二次抗体としてアルカリフォスフ
ァタ−ゼの発色で定量した結果を図４に示す。Ｓａｌｍ
ｏｎ Ｔｅｓｔｅｓ ＤＮＡ５０μｇをもとに評価する
と、プロ−ブ／リボフラビン溶液、Ｍ１３ｍｐ１８ＤＮ
Ａ／リボフラビン溶液ではＳａｌｍｏｎ Ｔｅｓｔｅｓ
ＤＮＡと同程度のわずかな発色が認められたのにすぎ
ないのに対して、プロ−ブ／ＤＮＡ複合体ではそのプロ
−ブ濃度に応じた発色が観測された。そして、プロ−ブ
とＤＮＡとが等モルの時、最大となった。

【００８８】実施例７ 実施例１と同様な塩基配列を持つ２０量体オリゴヌクレ
オチドをＤＮＡ自動合成機により合成した。このオリゴ
ヌクレオチドをプロ−ブとして用い、Ｍ１３ｍｐ１８Ｄ
ＮＡとハイブリッド体を形成させた。溶液は１０ｍＭリ
ン酸緩衝液、プロ−ブは最終濃度３μＭ、６μＭ、１０
μＭ、２０μＭ、Ｍ１３ｍｐ１８ＤＮＡの濃度は最終濃
度１０μＭとなるように調製した。さらに、このプロ−
ブ／ＤＮＡハイブリッド体にリボフラビンを最終濃度１
００μＭになるように加えた。プロ−ブ／Ｍ１３ｍｐ１
８ＤＮＡ／リボフラビン混合液１ｍｌにリボフラビンの
励起波長である４７０ｎｍの光を５分間照射した。

【００８９】対照実験として、プロ−ブ／リボフラビン
溶液及びＭ１３ｍｐ１８ＤＮＡ／リボフラビン溶液のそ
れぞれについても同様な実験を行なった。

【００９０】各サンプルについてリボフラビンの吸収強
度（４５０ｎｍ）を測定した（図５）。リボフラビンの
み、プロ−ブ／リボフラビン、Ｍ１３ｍｐ１８ＤＮＡ／
リボフラビン溶液では、吸収強度は変化せず、１．５Ｏ
Ｄであるのに対し、プロ−ブ／Ｍ１３ｍｐ１８ＤＮＡ／
リボフラビン溶液では吸収強度が減少してリボフラビン
が電荷移動の結果他の物質に変化していることが確認で
きた。

【００９１】

【発明の効果】本発明の標的核酸の検出方法は、Ｂ／Ｆ
分離が必要ないという利点を持つ。その結果、従来法で
不可欠であった過剰なプロ−ブの除去、非特異吸着を除
くための繁雑な処理、その条件検討等、数多くの操作が
不要になった。

【００９２】さらに、正確なハイブリッド体でのみ信号
変化が観測されるように試薬物質選択することで、反応
系中にミスマッチが発生している場合でも、正確な２重
らせん構造を形成しているハイブリッド体のみを検出す
ることが可能となる。

【図面の簡単な説明】

【図１】（Ａ）は、実施例１において得られたＥＳＲシ
グナル強度比の経時変化を示すグラフである。（Ｂ）
は、実施例１において得られたＥＳＲシグナル線幅の経
時変化を示すグラフである。なお、□は反応系にプロー
ブ、標的ＤＮＡ及びフルオレセインを含み、光照射を行
った場合を、■は反応系にプローブ、標的ＤＮＡ及びフ
ルオレセインを含み、光照射を行わなかった場合を、◆
は反応系にプローブ及びフルオレセインを含み、光照射
を行った場合をそれぞれ表わす。

【図２】実施例３において得られたＥＳＲシグナル強度
比の経時変化を示すグラフである。□、■及び◆は図１
と同様である。

【図３】実施例５において得られた８−ヒドロキシグア
ノシンの生成量（Ｇに対する割合）と用いたプローブの
量の関係を示すグラフである。

【図４】実施例６において得られた８−ヒドロキシグア
ノシンの生成量（ＥＬＩＳＡ法による呈色反応）と用い
たプローブの量の関係を示すグラフである。

【図５】実施例７において得られたリボフラビンとプロ
ーブ・標的ＤＮＡ・ハイブリッド体の相互作用を示すグ
ラフである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ａ６１Ｂ 10/00 (72)発明者 富田 佳紀 東京都大田区下丸子３丁目30番２号 キヤ ノン株式会社内 (72)発明者 牧野 圭祐 京都府京都市左京区上高野西明寺山33−24 (72)発明者 村上 章 京都府京都市左京区岩倉中町363−１

Claims (46)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 試料溶液中にプローブを加えてこれらを
   反応させる過程と、該試料溶液中に標的核酸が存在する
   場合に得られるプローブと標的核酸とのハイブリッド体
   の２重らせん構造を検出する過程とを有する核酸ハイブ
   リッド体の検出方法において、２重らせん構造を介した
   相互作用により検出可能な変化を起こす２種以上の試薬
   物質を前記試料溶液中に存在させて、標的核酸が存在す
   る場合に形成されるプローブと標的核酸とのハイブリッ
   ド体の２重らせん構造を介して起こる前記２種以上の試
   薬物質間の相互作用に基づく変化を測定して、２重らせ
   ん構造を検出することを特徴とする核酸ハイブリッド体
   の検出方法。
2. 【請求項２】 ２種以上の試薬物質間の相互作用がこれ
   ら試薬物質間の電荷移動に基づくものである請求項１に
   記載の方法。
3. 【請求項３】 ２種以上の試薬物質が、少なくとも電子
   供与体と電子受容体を含む請求項２に記載の方法。
4. 【請求項４】 電荷移動が、２重らせん構造を構成する
   塩基対のスタッキングを介して行われる請求項３に記載
   の方法。
5. 【請求項５】 電荷移動が２重らせん構造の形成にとも
   なう電子供与体と電子受容体の近接効果による請求項３
   に記載の方法。
6. 【請求項６】 電子受容体が、電子の受容によってＥＰ
   Ｒ（電子スピン共鳴）スペクトルに変化を起こす物質で
   ある請求項３に記載の方法。
7. 【請求項７】 試薬物質間の相互作用に基づく変化が光
   学的に検出可能である請求項３に記載の方法。
8. 【請求項８】 試薬物質間の相互作用に基づく変化が化
   学的に検出可能である請求項３に記載の方法。
9. 【請求項９】 試薬物質が、２重らせん構造を構成する
   核酸塩基に対するインターカレーターである請求項３に
   記載の方法。
10. 【請求項１０】 試薬物質間の相互作用が、光照射によ
    り開始される請求項３に記載の方法。
11. 【請求項１１】 試薬物質の少なくとも１種がプローブ
    に結合されている請求項２または３に記載の方法。
12. 【請求項１２】 試薬物質間の相互作用に基づく変化が
    不可逆的である請求項２または３に記載の方法。
13. 【請求項１３】 試料溶液中にプローブを加えてこれら
    を反応させる過程と、該試料溶液中に標的核酸が存在す
    る場合に得られるプローブと標的核酸とのハイブリッド
    体の２重らせん構造を検出する過程とを有する核酸ハイ
    ブリッド体の検出方法において、２重らせん構造との相
    互作用により検出可能な変化を起こす試薬物質を前記試
    料溶液中に存在させ、標的核酸が存在する場合に形成さ
    れたプローブと標的核酸とのハイブリッド体の２重らせ
    ん構造と該試薬物質との相互作用によって起こる変化を
    測定することで２重らせん構造を検出することを特徴と
    する核酸ハイブリッド体の検出方法。
14. 【請求項１４】 相互作用が電荷移動に基づくものであ
    る請求項１に記載の方法。
15. 【請求項１５】 試薬物質が、２重らせん構造に対する
    電子供与体または電子受容体である請求項１４に記載の
    方法。
16. 【請求項１６】 電荷移動が、２重らせん構造を構成す
    る塩基対のスタッキングを介して行われる請求項１５に
    記載の方法。
17. 【請求項１７】 電荷移動が２重らせん構造の形成にと
    もなう電子供与体と電子受容体の近接効果による請求項
    １５に記載の方法。
18. 【請求項１８】 電子受容体が、電子の受容によってＥ
    ＰＲ（電子スピン共鳴）スペクトルに変化を起こす物質
    である請求項１５に記載の方法。
19. 【請求項１９】 相互作用に基づく変化が光学的に検出
    可能である請求項１５に記載の方法。
20. 【請求項２０】 相互作用に基づく変化が化学的に検出
    可能である請求項１５に記載の方法。
21. 【請求項２１】 試薬物質が、２重らせん構造を構成す
    る核酸塩基に対するインターカレーターである請求項１
    ５に記載の方法。
22. 【請求項２２】 相互作用が、光照射により開始される
    請求項１５に記載の方法。
23. 【請求項２３】 試薬物質がプローブに結合されている
    請求項１４または１５に記載の方法。
24. 【請求項２４】 相互作用に基づく変化が不可逆的であ
    る請求項１４または１５に記載の方法。
25. 【請求項２５】 標的核酸とのハイブリダイズのための
    配列を有する標的核酸検出用プローブであって、該プロ
    ーブに、前記標的核酸のハイブリダイゼーションにより
    形成される２重らせん構造を介した相互作用により検出
    可能な変化を起こす２種以上の試薬物質の少なくとも１
    種が結合されてなることを特徴とする標的核酸検出用プ
    ローブ。
26. 【請求項２６】 ２種以上の試薬物質間の相互作用がこ
    れら試薬物質間の電荷移動に基づくものである請求項２
    ５に記載の標的核酸検出用プローブ。
27. 【請求項２７】 ２種以上の試薬物質が、少なくとも電
    子供与体と電子受容体を含む請求項２６に記載の標的核
    酸検出用プローブ。
28. 【請求項２８】 電荷移動が、２重らせん構造を構成す
    る塩基対のスタッキングを介して行われる請求項２６に
    記載の標的核酸検出用プローブ。
29. 【請求項２９】 電荷移動が２重らせん構造を介した電
    子供与体と電子受容体の近接効果による請求項２６に記
    載の標的核酸検出用プローブ。
30. 【請求項３０】 電子受容体が、電子の受容によってＥ
    ＰＲ（電子スピン共鳴）スペクトルに変化を起こす物質
    である請求項２６に記載の標的核酸検出用プローブ。
31. 【請求項３１】 試薬物質間の相互作用に基づく変化が
    光学的に検出可能である請求項２６に記載の標的核酸検
    出用プローブ。
32. 【請求項３２】 試薬物質間の相互作用に基づく変化が
    化学的に検出可能である請求項２６に記載の標的核酸検
    出用プローブ。
33. 【請求項３３】 試薬物質が、２重らせん構造を構成す
    る核酸塩基に対するインターカレーターである請求項２
    ６に記載の核酸ハイブリッド体検出用プローブ。
34. 【請求項３４】 試薬物質間の相互作用が、光照射によ
    り開始される請求項２６に記載の標的核酸検出用プロー
    ブ。
35. 【請求項３５】 試薬物質間の相互作用に基づく変化が
    不可逆的である請求項２６に記載の標的核酸検出用プロ
    ーブ。
36. 【請求項３６】 標的核酸とのハイブリダイズのための
    配列を有する標的核酸検出用プローブであって、該プロ
    ーブに、前記標的核酸とのハイブリダイゼーションにと
    もなって形成される２重らせん構造との相互作用により
    検出可能な変化を生じる試薬物質が結合されてなること
    を特徴とする核酸ハイブリッド体検出用プローブ。
37. 【請求項３７】 相互作用が電荷移動に基づくものであ
    る請求項３６に記載のプローブ。
38. 【請求項３８】 試薬物質が、２重らせん構造に対する
    電子供与体または電子受容体である請求項３７に記載の
    プローブ。
39. 【請求項３９】 電荷移動が、２重らせん構造を構成す
    る塩基対のスタッキングを介して行われる請求項３８に
    記載のプローブ。
40. 【請求項４０】 電荷移動が２重らせん構造の形成にと
    もなう電子供与体と電子受容体の近接効果による請求項
    ３８に記載のプローブ。
41. 【請求項４１】 電子受容体が、電子の受容によってＥ
    ＰＲ（電子スピン共鳴）スペクトルに変化を起こす物質
    である請求項３８に記載のプローブ。
42. 【請求項４２】 相互作用に基づく変化が光学的に検出
    可能である請求項３８に記載のプローブ。
43. 【請求項４３】 相互作用に基づく変化が化学的に検出
    可能である請求項３８に記載のプローブ。
44. 【請求項４４】 試薬物質が、２重らせん構造を構成す
    る核酸塩基に対するインターカレーターである請求項３
    ８に記載のプローブ。
45. 【請求項４５】 相互作用が、光照射により開始される
    請求項３８に記載のプローブ。
46. 【請求項４６】 相互作用に基づく変化が不可逆的であ
    る請求項３７または３８に記載のプローブ。