JPH06157335A - アレルギー性、ウイルス性、寄生虫性および細菌性疾患ならびにかび感染症の治療、予防および診断のためのｉｌ−４受容体の使用 - Google Patents

アレルギー性、ウイルス性、寄生虫性および細菌性疾患ならびにかび感染症の治療、予防および診断のためのｉｌ−４受容体の使用

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JPH06157335A
JPH06157335A JP5213859A JP21385993A JPH06157335A JP H06157335 A JPH06157335 A JP H06157335A JP 5213859 A JP5213859 A JP 5213859A JP 21385993 A JP21385993 A JP 21385993A JP H06157335 A JPH06157335 A JP H06157335A
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Abstract

(57)【要約】 【構成】 インターロイキン−４受容体、その誘導体す
なわちその部分、突然変異体もしくは変異体、またはイ
ンターロイキン−４受容体もしくはその誘導体を含有す
る複合蛋白質の医薬的使用。 【効果】 アレルギー性、ウイルス性、寄生虫性および
細菌性疾患ならびにかび感染症の治療、予防および診断
を可能にする。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】多くのアレルギー性、ウイルス性、寄生虫
性および細菌性疾患の治療および予防には重大な問題が
残されている。本発明は、このような疾患の治療、予防
および診断のためのＩＬ−４受容体またはその誘導体の
使用に関する。
【０００２】ある種の寄生虫性、ウイルス性および細菌
性疾患の経過において、リンパ球および単球細胞の亜集
団に変化があることは知られている。これは例えば、い
わゆる２型のＴ−ヘルパー細胞（以下、ＴＨ２細胞とい
う）の増大と関連する。Ｔ細胞は一般に、表面マーカー
およびそれらの機能に基づいて亜集団に分割することが
できる。すなわち、たとえばＴ−ヘルパーリンパ細胞は
ＣＤ４表面分子をもち、それらが活性化されるとサイト
カインが分泌される。
【０００３】健康なマウスまたは同種細胞で刺激された
マウスからのクローン化Ｔ−ヘルパー細胞のサイトカイ
ンパターンの分析により、これらの細胞はインターロイ
キン−２、インターロイキン−４、γ−インターフェロ
ン、インターロイキン−５、インターロイキン−６、イ
ンターロイキン−１０およびリンホトキシンを産生する
ことが明らかにされた（いわゆるＴＨＯ型のＴ−ヘルパ
ー細胞）。
【０００４】マウスを、たとえば細菌性抗原、ウシ流産
菌（Brucella abortus）または結核菌（Mycobacterium
tuberculosis）で刺激したのち、とくにＴ−ヘルパー細
胞のクローニング後に見出されるクローンは、リンホト
キシン、γ−インターフェロンおよびインターロイキン
−２を分泌するが、インターロイキン−４、インターロ
イキン−５、インターロイキン−６およびインターロイ
キン−１０はほとんどまたは全く分泌されない（いわゆ
るＴＨ１型のＴ−ヘルパー細胞）。
【０００５】たとえば、感受性マウスの、リーシュマニ
アメージャー（Leishmania major）のような寄生性病原
体による感染後に、とくにＴ−ヘルパー細胞のクローニ
ングに際して生じるクローンにおいては、インターロイ
キン−４、インターロイキン−５およびインターロイキ
ン−１０の産生が増大するが、インターロイキン−２お
よびγ−インターフェロンの産生は低下するか、検出不
可能な量になる（ＴＨ２型のＴ−ヘルパー細胞）（Mosm
annら、Immunological Reviews, 1991, No.123, 209−2
29；S．Romagnani, Immunology Today, 256-257、Vol,
12, No. 8, 1991)。
【０００６】このＴＨ２リンパ球の存在の増加は既に、
動物およびヒトの一部の感染性疾患で検出され（Else
＆ Grencis, Parasitology Today, Vol. 7, No. 11, 1
991,pp.313−316；Parasitology Today, Vol. 7, No. 1
0, 1991, p.261）、これは二次パラメーターにも反映し
ている。すなわち、リーシュマニアメージャーに感染し
たマウスは一般に、γ−インターフェロンの産生低下、
血清ＩｇＥの著しい上昇および好酸球増多症を示した。
【０００７】たとえば、癩腫癩、リーシュマニア症およ
び住血吸虫症ならびに結核菌感染症の患者では、一般
に、血清中のＩｇＥ濃度が、正常対象の血清の場合に比
べて、著しく高いことが見出されている。寄生虫感染症
では、その疾患の経過中、好酸球増多症を認めることが
多い。
【０００８】即時型のＩｇＥ仲介アレルギー反応ならび
にアトピー性皮膚炎および喘息も、この種類の調節障害
によって特徴づけられる。たとえば、アトピー性皮膚炎
患者の皮膚バイオプシーから得られる抗原特異的Ｔ−細
胞クローンはとくにＴＨ２型である（Kapsenbergら、Im
munology Today, Vol. 12, No.11, 1991, 392−39
5）。
【０００９】今回、ＴＨ２型のＴ−ヘルパー細胞の産生
増大によって特徴づけられる疾患は、ＩＬ−４Ｒまたは
その誘導体を使って診断ならびに治療的および／または
予防的処置が可能であることが見出された。
【００１０】したがって、本発明は、ＴＨ２型Ｔ−ヘル
パー細胞の産生増大を生じる疾患の治療および／または
予防のための医薬の製造またはその疾患の確認のための
診断剤の製造のためのＩＬ−４受容体またはその誘導体
の使用に関する。
【００１１】ＩＬ−４Ｒの「誘導体」とは、本発明の目
的においては、ＩＬ−４Ｒの機能的に均等な部分、突然
変異体または変異体を意味し、とくにＩＬ−４Ｒの細胞
外部分、またとくに、ヒトＩＬ−４受容体の成熟蛋白質
のアミノ酸１〜約２０９ならびにそのグリコシル化変異
体である。また、本発明による受容体の使用に際して
は、ＩＬ−４Ｒまたはその誘導体および他の蛋白質また
は蛋白質の部分を含有する融合蛋白質、好ましくは抗体
のＦｃ部分を含有する融合蛋白質（ＩＬ−４Ｒ／Ｆｃ融
合蛋白質）の採用も可能である。さらに、ＩＬ−４Ｒ、
その誘導体または融合蛋白質を、上記疾患の治療および
／または予防処置用の配合製品中に、好ましくはγ−イ
ンターフェロンと配合して使用することもできる。
【００１２】精製アレルゲンまたはその部分との配合に
よる治療、特に、たとえばアレルギー性鼻炎患者の特異
的免疫療法（脱感作）における精製アレルゲンとの配合
による脱感作も有利である。
【００１３】γ−インターフェロン、および／または細
胞表面分子ＣＤ４０とそのリガンドとの相互作用を遮断
する物質、細胞表面分子ＣＤ４０リガンド、好ましくは
ＣＤ４０表面分子自体の可溶性変異体、たとえば以下に
述べるようなＣＤ４０／Ｉｇ融合蛋白質もしくはその誘
導体との配合による治療も有利である。
【００１４】ＣＤ４０表面分子の可溶性変異体の「誘導
体」とは、本発明の目的においては、細胞性ＣＤ４０の
細胞表面分子ＣＤ４０リガンドとの相互作用を遮断す
る、それらの機能的に均等な部分または変異体を意味す
る。
【００１５】疾患としては、アレルギーおよび感染症、
とくにウイルス性、細菌性および寄生虫性感染症、なら
びにかび感染症が包含される。とくにヒト免疫不全ウイ
ルス（ＨＩＶ）、マイコバクテリアとくに癩菌（Mycoba
cterium leprae）、リステリア（listeria）、とくにリ
ーシュマニア属（Leishmania）およびプラスモジウム属
（Plasmodium）の原生動物（protozoa）、とくに住血吸
虫属（Schistosoma）、寄生性鉤虫属（Nippostrongylu
s）、ヘリグモソモイデス属（Heligmosomoides）の蠕
虫、鞭虫（Trichurida）、旋毛虫（Trichinella）、嚢
尾虫（Taenia）（キスチケルクス、Cysticercus）、カ
ンジダ（Candida）、ならびにアスペルギルス（Aspergi
llus）による感染症を挙げることができる。しかしなが
ら、即時型のアレルギー反応、とくにＩｇＥ仲介反応の
診断、処置または予防的処置も可能である。これらに
は、とくにアトピー性皮膚炎および喘息が包含される。
【００１６】投与形態は一般に、疾患によって異なる。
すなわち、一部の疾患では、たとえば局所投与が有利で
ある。有益な例としては、喘息に対しては吸入による投
与、結膜炎に対しては点眼剤での投与、アトピー性皮膚
炎には経皮または皮内投与がある。病原性ＴＨ２細胞は
とくに局所的に検出されるからである。
【００１７】ヒトＩＬ−４受容体は、合計８２５個のア
ミノ酸から構成されることが報告されている（Idzerda,
R. J. ら、1990, J. Exp. Med. 171, 861−873)。Idze
rdaらによれば、２５Ｎ−末端アミノ酸はシグナルペプ
チドとして機能し、成熟ヒトＩＬ−４受容体は８００個
のアミノ酸からなり、1) 細胞外ドメイン（２０７アミ
ノ酸）、2) 膜通過領域（約２４アミノ酸）、3) 細胞質
内ドメイン（５６９アミノ酸）の３つのドメイン構造を
有する。遺伝子工学によるＩＬ−４受容体の製造は、治
療に必要な大量の物質の直接製造を可能にするので、殊
に有利である。
【００１８】ＩＬ−４Ｒは、たとえば、国際特許出願Ｗ
Ｏ90／05183号に記載されているようにして製造でき
る。この方法によれば、ｃＤＮＡ遺伝子バンクをたとえ
ばＴ細胞系Ｔ22から作成し、ＩＬ−４Ｒ特異的ＤＮＡに
対するプローブでスクリーニングした。プローブとし
て、ＷＯ90／05183号に記載されたマウス細胞系のハイ
ブリッド減数ｃＤＮＡを用いることが可能である。しか
しながら、ｃＤＮＡバンクのスクリーニングには、ＩＬ
−４Ｒ特異的ハイブリダイゼーションプローブ、たとえ
ば約２０ヌクレオチド長の１個または２個以上の、たと
えば位置１９３〜２１０のプローブも使用できる。陽性
クローンを、たとえば配列決定により、ＩＬ−４Ｒ特異
的ｃＤＮＡについて照合したのち、見出されたＩＬ−４
Ｒ ＤＮＡを適当な発現ベクターたとえばｐＣＡＶ／Ｎ
ＯＴ（ＷＯ90／05183号）にクローン化し、適当な宿主
細胞たとえばＣＯＳ−７、ＢＨＫ−２１またはＣＨＯ細
胞中で完全にまたは部分的に発現させることができる。
ＩＬ−４受容体の細胞外領域をコードするｃＤＮＡ部分
のみが発現に使用される場合には、インターロイキン−
４受容体の細胞外領域は、一般に、トランスフェクトさ
れた細胞により培養培地中に分泌される。この目的で
は、本技術分野の技術水準に相当する遺伝子工学方法に
より、受容体の細胞外領域のコード配列またはその所望
の部分の後に停止コドンを導入するような方法でｃＤＮ
Ａを変換し、こうして変換されたｃＤＮＡを適当な発現
ベクター中にクローン化する（Maliszewskiら、1990,
J. Immunol.,144, 3028−3033；Dowerら、1989, J. Imm
unol.，142, 4314）。多くの場合、たとえばマウスＩＬ
−４受容体の場合は、単離されたｃＤＮＡは天然に生じ
る分泌型の受容体をコードする（Mosleyら、1989, Cell
59, 335）。これらのｃＤＮＡはついで、発現ベクター
の製造に直接使用できる。分泌された蛋白質はたとえば
リガンドアフィニティークロマトグラフィーまたは、特
異的モノクローナル抗体（Maliszewskiら、1990, J. Im
munol., 144, 3028−3033）を用いるイムノアフィニテ
ィークロマトグラフィーによって培養培地から精製でき
る。さらに欧州特許出願EP−A1−0 464 533号に記載の
ように遺伝子工学的手段により、ＩＬ−４Ｒまたはその
誘導体と、他の蛋白質たとえば免疫グロブリン部分たと
えば抗体分子のＦｃ部分との融合蛋白質（以下、ＩＬ−
４Ｒ／Ｆｃという）を製造し、それを発現させることが
できる。このような融合蛋白質の利点は、半減期が延長
され、プロテインＡ−セファロースアフィニティークロ
マトグラフィーによる濃縮および精製が単純化されるこ
とである。
【００１９】アフィニティークロマトグラフィーによる
問題のない精製およびファーマコキネティックスの性質
の改良可能性が、ＩＬ−４受容体溶解型の免疫グロブリ
ンとの融合蛋白質としての合成が特に有利であることを
意味する。
【００２０】ＣＤ４０はI型膜蛋白質であり、すなわ
ち、（アミノ末端）細胞外領域、膜通過領域および（カ
ルボキシ末端）細胞質内領域から構成される。ＣＤ４０
をコードするｃＤＮＡは、たとえば、ラージ細胞のｃＤ
ＮＡバンクからパニング法を用いて（Stamenkovic. I.
ら、1989, EMBO J., Vol. 8, pp．1403−1410）単離で
きる。通常は膜に会合している蛋白質を溶解型として発
現させるためには、熟練した研究者によく知られている
様々なオプションがある。たとえば、突然変異原付与プ
ライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応において、細胞
外領域をコードするｃＤＮＡ配列の末端に停止コドンを
導入することが可能である。この方法によって変換させ
たｃＤＮＡは膜アンカーを欠くので、他の分泌蛋白質と
同様に細胞によって分泌されるＣＤ４０蛋白質をコード
することになる（Fanslow、W. C.ら、1992. J. Immuno
l., pp．655−660）。可溶性組換え免疫グロブリン融合
蛋白質を使用するのも有利である。その製造はたとえば
EP−A−0 464 533号に記載されている。とくに、ＣＤ４
０／Ｉｇ融合蛋白質はまた文献に開示されている（Fans
lowら、1992, J. Immunol., Vol. 149, pp．655−660お
よびNoelleら、1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vo
l. 89, pp.6550-6554)。両報告とも、ヒト免疫グロブリ
ンＧ１分子のＨ鎖の蝶番部、ＣＨ２およびＣＨ３ドメイ
ンに融合したＣＤ４０の細胞外領域からなるＣＤ４０／
Ｉｇ融合蛋白質を記載している。相当するＤＮＡ構築体
の製造には、ＣＤ４０ｃＤＮＡに適当な制限切断部位
を、突然変異原付与プライマーを使用するポリメラーゼ
連鎖反応によって導入するか（Fanslowら、1992, J. Im
munol., Vol. 149, pp．655−660)、あるいはＣＤ４０
ｃＤＮＡ中に天然に存在する制限切断部位を利用した
（Noelleら、1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.
89, pp．6550−6554)。
【００２１】溶解型ＣＤ４０は、組換え蛋白質として既
知の原核生物または真核生物系中で発現させることがで
きるが、哺乳動物培養細胞中で発現させることが好まし
く、培養液上清または細胞溶解物から慣用方法によって
精製できる。可溶性ＣＤ４０分子の直接的な遺伝子療法
への使用の可能性は別として、可溶性ＣＤ４０分子はさ
らに、膜会合ＣＤ４０およびＣＤ４０リガンドの相互作
用を遮断する、したがって、同様に治療的可能性を有す
る他の物質の確認にも使用できる。これはたとえば、可
溶性ＣＤ４０分子が固相上に存在し可溶性ＣＤ４０リガ
ンドの結合は適当な標識または抗体を用いて追跡する、
細胞を含まない受容体結合アッセイ（EP−A−O 488 170
号）によって実施できる。この種のアッセイは、その自
動化が可能であることから、ＣＤ４０／ＣＤ４０リガン
ドとの相互作用についての大量の物質の検討方法（受容
体スクリーニング）を提供する。
【００２２】以下に詳述する実施例においては、Idzerd
aら（1990, J. Exp. Med., 171, 861−873）およびMali
szewskiら（1990, J. Immunol., 144, 3028−3033)によ
って定義された細胞外領域および天然に生じる溶解型の
ヒトおよびマウスＩＬ−４受容体（以下、それぞれｈｕ
ＩＬ−４ＲおよびｍｕＩＬー４Ｒと称す）を、メトトレ
キセートおよびＧ418（EP−A 0330 977号）による二重
選択後、それを安定に発現するＢＨＫ細胞によって可溶
性蛋白質として培養培地中に分泌させて、イムノアフィ
ニティークロマトグラフィーによって精製された。ま
た、ヒトもしくはマウスＩＬ−４受容体の細胞外領域、
およびヒトＩｇＧ１またはマウスＩｇＧ２ｂ分子の蝶番
部、ＣＨ２およびＣＨ３ドメイン（Zettlmeisslら、199
0, DNA Cell Biol. 9, 347−353）から構成される（以
下、それぞれ、ｈｕＩＬ−４Ｒ／ＦｃおよびｍｕＩＬ−
４Ｒ／Ｆｃと称す）受容体／免疫グロブリン融合蛋白質
（EP−A1−0 464 533号）も使用され、ＢＨＫ細胞中で
同様に発現後、プロテインＡ−セファロースアフィニテ
ィークロマトグラフィーによって精製された。
【００２３】ＩＬ−４ＲおよびＩＬ−４Ｒ／Ｆｃは、各
場合とも同種のインターロイキン−４のバイオアッセイ
における中和に等しく有効である（実施例１）。さら
に、ｈｕＩＬ−４Ｒ／ＦｃによるＴＨ２型のヒトＴ−細
胞クローンの阻害の検出はインビトロでも可能であっ
た。これらのクローンによってインビトロで形成された
ＩＬ−４はｈｕＩＬ−４Ｒ／Ｆｃによって中和された。
これは増殖の低下を生じた。ＴＨ１型の対照クローンの
成長はｈｕＩＬ−４Ｒ／Ｆｃによって影響されなかった
（実施例４）。
【００２４】さらに、ｈｕＩＬ−４Ｒ／Ｆｃは、ＩＬ−
４によって誘導される合成をインビトロで抑制すること
ができて（実施例２）、また驚くべきことに、ヒト末梢
血単核細胞によるＩｇＥの抗原特異的合成を抑制できる
（実施例３）ことが見出された。驚くべきことに、たと
えば、マウスリステリア症の動物モデル、嚢尾虫（Cyst
icercus crassiceps）感染症の動物モデル（マウス）、
全身エリテマトーデスの動物モデル（ＭＲＬ／１マウ
ス）、慢性移植片対宿主反応の動物モデル（マウス）お
よびアレルゲン誘発喘息の動物モデル（マウス）におけ
るマウス可溶性インターロイキン−４受容体に対する例
証で明らかにできたように（実施例５）、感染症および
免疫系の異常に対して治療または予防的効果を示す。
【００２５】実施例 １ ＩＬ−４ＲおよびＩＬ−４Ｒ／Ｆｃのヒトおよびマウス
変異体の生物活性 生物活性はバイオアッセイで測定した。ＩＬ−４は、Ｉ
Ｌ−４受容体に厳密に種特異的に結合する。この理由の
ため、マウス起源であり、マウスＩＬ−４受容体が膜に
会合している細胞系を使用した。この細胞系を、ヒトイ
ンターロイキン−４受容体の完全遺伝子でトランスフェ
クトした。マウスおよびヒト膜会合受容体はこの細胞系
によって同時に機能的に発現され、細胞系の増殖はマウ
スおよびヒト両ＩＬ−４に依存する（Mosleyら、Cell,
Vol. 59, 335−348, 1989年10月20日)。
【００２６】ｍｕＩＬ−４ＲおよびｍｕＩＬ−４Ｒ／Ｆ
ｃの検出にはマウスＩＬ−４を使用した（表１）。細胞
系の増殖はマウスＩＬ−４に依存する（表１）。インタ
ーロイキン−４の常時使用およびｍｕＩＬ−４Ｒまたは
ｍｕＩＬ−４Ｒ／Ｆｃの同時添加により、インターロイ
キン−４の濃度依存性中和を生じた。細胞系が利用可能
なインターロイキン−４が減少するので増殖は低下す
る。同じＦｃ部分を有する対照蛋白質はこの効果を示さ
ない。表１の濃度依存性阻害におけるｍｕＩＬ−４Ｒと
ｍｕＩＬ−４Ｒ／Ｆｃの間の差は分子量の差によるもの
である。
【００２７】表２は、ヒトインターロイキン−４の生物
活性および、表１に相当するｈｕＩＬ−４Ｒおよびｈｕ
ＩＬ−４Ｒ／Ｆｃの特異的中和作用を示す。濃度依存性
阻害におけるｈｕＩＬ−４ＲとｈｕＩＬ−４Ｒ／Ｆｃの
間の差は分子量の差によるものである。
【００２８】実施例 ２ ｈｕＩＬ−４Ｒ／ＦｃによるＩＬ−４Ｒ誘発ＩｇＥ合成
の抑制 ヒト末梢血単核細胞を単離し、５％ＦＣＳ含有Iscove培
養培地中、２４ウエルプレートにおいて、培養ウエルあ
たり細胞数１×１０6細胞、培養容量１ｍｌで、４８時
間培養した。培地に、３００ｎｇ／ｍｌのヒトインター
ロイキン−４を添加した。既に存在した膜結合ＩｇＥが
この前刺激時に培養培地中に放出された。４８時間後、
細胞を洗浄して放出されたＩｇＥを除去した。細胞をつ
いで、５％ＦＣＳ含有Iscove培養培地中、９６ウエル平
底培養プレートにおいて、細胞濃度１×１０5細胞、培
養容量２００μｌで培養した。培地に、０ｎｇ／ｍｌ、
３ｎｇ／ｍｌおよび３０ｎｇ／ｍｌのインターロイキン
−４を添加した。このバッチを、さらに添加物を加えな
いで、または各回３μｇ／ｍｌのｈｕＩＬ−４Ｒ／Ｆｃ
もしくはｈｕＣＤ４／Ｆｃを加えて実施した。ｈｕＣＤ
４／ＦｃはＩＬ−４Ｒ／ＦｃのＦｃ部分の対照として使
用されたもので、EP−A2−0 325 262号の記載に従って
調製された。ｈｕＣＤ４／ＦｃとｈｕＩＬ−４Ｒ／Ｆｃ
のＦｃ部分は同一である（ＩｇＧ１）。１０日の培養期
間後に培養培地を分離し、ヒトＩｇＥをＥＬＩＳＡでア
ッセイした。表３はこの試験の結果を示す。ＩＬ−４誘
導ＩｇＥ合成はｈｕＩＬ−４Ｒ／Ｆｃの添加によって特
異的に抑制された。
【００２９】実施例 ３ ヒト末梢血単核細胞を単離した。９６−ウエル培養プレ
ートにおいて、ウエルあたり５０００個の細胞を、１０
％ＦＣＳ含有Iscove培養培地２００μｌ中で１４日間培
養した。培養開始時にはほかに何も添加しないか、また
は１００ＳＱ単位（製造業者による）の精製ダニ抗原
（Derm. Pt., 注文番号 Sq 503, Scherax,Hamburgより
入手）単独またはダニ抗原と３μｇ／ｍｌのｈｕＩＬ−
４Ｒ／Ｆｃを添加した。ダニ抗原と３μｇ／ｍｌのＴＷ
１の混合物はＦｃ対照として使用した。ＴＷ１は狂犬病
抗原に対して特異性を有し、ｈｕＩＬ-４Ｒ／Ｆｃと同
じアイソタイプをもつヒトモノクローナル抗体である。
ＴＷ１はEP−0 445 625 A1の記載に従って製造された。
ついで、上清を分離し、ヒトＩｇＥをＥＬＩＳＡでアッ
セイした。抗原誘導ＩｇＥの産生は、ｈｕＩＬ−４Ｒ／
Ｆｃにより特異的に抑制されることが明らかにされた
（表４）。
【００３０】実施例 ４ ＴＨ２サブタイプＴ細胞クローンの抗原誘発増殖の阻害 Ｔ細胞クローンをアトピー性皮膚炎患者の皮膚から単離
した。大部分のクローンはインビトロでの刺激後にＴＨ
２型のサイトカインを分泌し、小部分のクローンのみに
ＴＨ１型が見出された。増殖アッセイは、１×１０4の
クローン化Ｔ細胞およびスティミュレーター細胞として
１×１０5の放射線照射同種ＰＢＬを用い、４％ヒトＡ
Ｂ血清含有Iscove培養培地中、９６−ウエルマイクロタ
イタープレートにおいて実施した。培養は、０.５μＣ
ｉ／培養ウエルの3Ｈ-チミジンの存在下ＣＯ2を通じな
がら、インキュベーター中３７℃で１８時間実施した。
１８時間後に、チミジンの取り込みによって細胞の増殖
を測定した。上清中のサイトカインの産生については、
１×１０6／ｍｌのクローン化Ｔ細胞を２４−ウエル培
養プレート中Iscove、１０％ＦＣＳおよび１０μｇ／ｍ
ｌのコンカナバリンＡで刺激した。ＣＯ2を通じなが
ら、インキュベーター（３７℃）中で２４時間培養した
のち、上清を分離した。培養上清について、ヒトインタ
ーロイキン−２およびヒトインターロイキン−４の含量
をバイオアッセイで検定した。バイオアッセイは、その
増殖がそれぞれヒトインターロイキン−２およびヒトイ
ンターロイキン−４に依存する細胞系に基づくものであ
る（Mosleyら、 Cell, Vol. 59,335−348, 1989年10月2
0日）。一つのＴＨ２クローンの上清中にはＩＬ−２は
検出できなかったが大量のＩＬ−４が検出された。４９
ｎｇ／ｍｌのＩＬ−４に対して、３μｇのｈｕＩＬ−４
Ｒ／Ｆｃを添加した場合には、わずかに１０ｎｇ／ｍｌ
のＩＬ−４しか検出できなかった。ＴＨ１クローンの上
清は，比較的大量のＩＬ−２を含んだが、ＩＬ−４はわ
ずかであった。ＴＨ１クローンの上清中のインターロイ
キン−２の濃度は、培養時のｈｕＩＬ−４Ｒ／Ｆｃの添
加では有意な影響を受けなかった。増殖実験から、３μ
ｇ／ｍｌのｈｕＩＬ−４Ｒ／Ｆｃの添加により、ＴＨ２
クローンの増殖は抑制されるがＴＨ１クローンの増殖は
抑制されないことを明らかにすることができた（表
５）。さらに、ダニ特異的ＴＨ２クローンの抗原特異的
増殖はｈｕＩＬ−４Ｒ／Ｆｃの添加により抑制される
が、ＴＨ１の場合は抑制されないことを示すことができ
た。さらに別の実験的アプローチで、ＴＨ２クローンと
同じドナーからの自己Ｂリンパ球の混合物中においてダ
ニ抗原によって誘導されたＩｇＥ合成はｈｕＩＬ−４Ｒ
／Ｆｃの添加で抑制できることの例証が可能であった。
【００３１】実施例 ５ マウスの肺アレルギー化後のｍｕＩＬ−４Ｒ処理による
皮膚試験反応および他のパラメーターの阻害 ＰＢＳ中オバルブミン溶液（５００μｇ／７ｍｌ）のエ
アゾルの吸入によって、Ｂａｌｂ／ｃマウスをオバルブ
ミンで感作した。操作はRenzら、1992, J. Allergy Cli
n. Immunol. 89：112に記載されている。エアゾルは、
超音波アトマイザー（PulmoSonic 25型，The De Vilbis
s Co., Somerest, PA）中で製造した。生成した粒子の
９０％以上はサイズ１〜５μｍであった。動物を、日
１、７、１４および２１のそれぞれに２０分間オバルブ
ミン含有エアゾルに暴露した。このモデルにおける可溶
性ｍｕＩＬ−４Ｒの効果を調べるため、１５０μｇ／注
射のｍｕＩＬ−４Ｒ（i.p.)、ＰＢＳおよび１１Ｂ１１
（マウスＩＬー４に対するラットモノクローナル抗体、
Ohara, J. & W. E. Paul, 1985, Nature 315：333）
を、日−２、−１、１、２、７、８、１４、１５、２１
および２２のそれぞれに投与した。
【００３２】実験日２３に、オバルブミン（ＯＶＡ）に
よる皮膚試験を各群について実施した。操作はSaloga
ら、1993, J. Clin. Invest., 91：133−140に記載され
ている。結果は表６にまとめる。陽性皮膚試験反応を呈
する動物の数は８３.３％から２２.２％に明瞭に低下し
た。
【００３３】ＯＶＡ−特異的ＩｇＥおよびこれらの動物
の単離気管の気管収縮に対するｍｕＩＬ−４Ｒの効果
を、同じ実験系で検討した。その検討方法は、Renz, H.
ら、1992, J. Allergy Clin. Immunology, 89：112およ
びLarsenら, 1992, J. Clin. Invest., 89：747に記載
されている。実験は、本例において上述したのと同じオ
バルブミンおよびｍｕＩＬ−４Ｒ投与計画ならびに同じ
投与量で実施した。結果は表７にまとめる。気管収縮
は、電場における刺激により生体外から実施した（ES50
単位でのデータ）。ＩｇＥ濃度は血清からＥＬＩＳＡで
測定した（抗ＯＶＡ高力価のマウス対照血清を基準とし
た比較単位でのデータ）。血清は実験日２３に採取し
た。結果は、２.４７から３.４ＥＳ５０への気管機能の
明らかな正常化、およびＩｇＥ力価の低下を示す。ＯＶ
Ａ−特異的ＩｇＧ１を平行して測定したが同様に低下す
る（詳細は示していない）。同時にＩｇＧ２ａの増加が
観察される。
【００３４】オバルブミンによる肺感作後（投与計画、
投与量および方法は同例に上述した通りである）の皮膚
試験反応およびｍｕＩＬ−４Ｒによる肺処置を、上述と
同じ実験系で平行して試験した。この実験では、オバル
ブミン法と同様に、７ｍｌのＰＢＳ中、５００μｇのｍ
ｕＩＬ−４Ｒを、日−２、−１、１、２、７、８、１
４、１５、２１および２２のそれぞれに、超音波アトマ
イザーでエアゾルに微粒子化した。動物は密閉容器中で
エアゾルに２０分間暴露した（噴霧１回あたり動物４
匹）。超音波で微粒化してもｍｕＩＬ−４Ｒ蛋白質の生
物活性が保持されることは、予備試験で保証された。ま
た、動物が総量５００μｇのｍｕＩＬ−４Ｒの約０.５
〜５％を吸入することも確立された。皮膚試験は上述の
ように、実験日２３に実施した。結果は表８に示す。局
所投与による皮膚試験での効果は、動物あたりのｍｕＩ
Ｌ−４Ｒ投与量は少量であるにもかかわらず（最終吸入
量：ｍｕＩＬ−４Ｒ １２５μｇ／動物の０.５〜５
％）、腹腔内処置（１５０μｇ／動物）の場合とほぼ同
じであることが認められる。
【００３５】実施例 ６ 誘発慢性移植片対宿主病（cGvHD）に対するインターロ
イキン−４の効果 体重１５〜１８ｇの雌性Ｂ６Ｄ２Ｆ１ハイブリッド動物
（親株Ｃ５７Ｂ１／ｇおよびＤＢＡ／２）に、４週連続
して、１回あたりＤＢＡ／２マウスからの脾臓細胞１×
１０8個を４回静注し、ｃＧｖＨＤを誘発した。発症し
た蛋白尿をN−Combur試験（Boehringer Mannheim GmbH,
Mannheim, Germany）でモニタリングした。各群１０匹
の動物を使用した。一群には日２７、２８、２９、３０
および３１のそれぞれに、２ｍｇ／ｋｇのマウスインタ
ーロイキン−４受容体（ｍｕＩＬ−４Ｒ／Ｆｃ）を投与
し、他の群は対照蛋白質としてのヒトインターロイキン
−４受容体（ｈｕＩＬ−４Ｒ／Ｆｃ）の同投与量および
同投与計画で処置し、そして一対照群はＰＢＳで処置し
た。表９には、群内の動物の分数として生存動物を示
し、表１０は各群内動物の尿中平均蛋白レベルの変動を
示す。生存数および蛋白尿の両者で、ｍｕＩＬ−４Ｒの
有意な効果が認められる。別の実験を上述のｃＧｖＨＤ
の誘発とともに実施した。群分けは同じにしたが、処置
は糸球体腎炎の出現後、日６３、６４、６５、６６およ
び６７に、すなわち治療的に（これらの各実験日に２ｍ
ｇ／ｋｇのｈｕＩＬ−４Ｒ／ＦｃまたはｍｕＩＬ−４Ｒ
／Ｆｃを静注）実施した。生存動物の分数および動物の
尿中の蛋白レベルはそれぞれ表１１および１２に示す。
同じｃＧｖＨＤの誘導および同じ群分けでのさらに別の
実験では、モノマーｍｕＩＬ−４Ｒまたはモノマーｈｕ
ＩＬ−４Ｒを、実験日２４に開始して３日毎に５回、各
注射あたり２ｍｇ／ｋｇを静脈内投与した。この場合も
本例の前の実験と同様に、ｍｕＩＬ−４Ｒ処置群で、ｃ
ＧｖＨＤのパラメーターの有意な抑制および動物の生存
率の増加が観察された。この実験では、実験時に動物か
ら血液を採取した。これらの血清中のマウス免疫グロブ
リンＥ（ＩｇＥ）はＥＬＩＳＡで測定した。このＩｇＥ
濃度は疾患時に増加し、記載された実験の日５９におけ
る測定後に再び低下する。ｍｕＩＬ−４Ｒ処置を行う
と、この低下は早期に、日４５における測定後に始ま
る。ｍｕＩＬ−４Ｒ処置群および対照群（ＰＢＳ処置）
から無作為に選んだ３匹の動物の平均ＩｇＥ濃度の変化
を表１３に示す。
【００３６】実施例 ７ ヒト全身エリテマトーデスに類似するＭＲＬ／１マウス
の自然発症自己免疫疾患の処置 約１２週齢のＭＲＬ／Ｍｐ−Ｌｐｒ−Ｌｐｒ（ＭＲＬ／
１）マウスに対して、各５連続日に、緩衝液対照（ＰＢ
Ｓ）、マウスインターロイキン−４受容体−Ｆｃ融合蛋
白質（ｍｕＩＬ−４Ｒ／Ｆｃ）または対照蛋白質として
のヒトインターロイキン−４受容体−Ｆｃ融合蛋白質
（ｈｕＩＬ−４Ｒ／Ｆｃ）を静脈内投与（i.v.）した。
動物を週２５に屠殺した。脾臓、リンパ節および血液を
採取した。脾臓およびリンパ節の重量を測定し、血液ま
たは血清からの各種パラメーターを測定した。二重鎖Ｄ
ＮＡ（ｄｓＤＮＡ）に対する抗体ならびにリウマチ因子
（ＲＦ）を、Schorlemmerら（Int. J. Immunotherapy,
7：169, 1991）の記載に従いＥＬＩＳＡで測定した。生
存率の変化を表１４に、また週２５における他のパラメ
ーターを表１５に示す。この疾患に対するｍｕＩＬ−４
Ｒ／Ｆｃの明らかな効果が、生存動物数の変化および週
２５における他のパラメーターの両者から証明される。
【００３７】実施例 ８ マウスにおける嚢尾虫（Cysticercus (Taenia) crassic
eps）感染症のマウスインターロイキン−４受容体によ
る処置 この実験では、日０に、体重１５〜２５ｇのＮＭＲIマ
ウスに、各マウスあたり嚢尾虫（Cysticercus (Taenia)
crassiceps）ＭＲ−１株のメタケストーデス５匹を１
ｍｌのＰＢＳに取って腹腔内注射で感染させた。各実験
群あたり１０匹の動物を使用した。一つの対照群は感染
させなかった（メタケストーデスを含まないＰＢＳの注
射）。一群は感染させたが，処置を行わなかった。一群
は感染させ、日−１、０、１、７、１４、２０、３０、
３５、４０、４５、５０、５５および６３のそれぞれ
に、１００μｇのｍｕＩＬ−４Ｒを腹腔内注射で処置し
た。他の群は感染させ、ｍｕＩＬ−４Ｒ処置の場合と同
様にして、対照蛋白質としてのｈｕＩＬ−４Ｒで処置し
た。日７６に、動物の体重を測定し、解剖した。腹腔内
にメタケストーデスが認められる動物を決定した。陽性
動物については、各動物に見出されたメタケストーデス
の湿重量を測定した。マウスインターロイキン−４受容
体による処置群では、メタケストーデスの総重量に明ら
かな低下が認められた（表１６）。
【００３８】実施例 ９ マウスカンジダアルビカンス感染に対するｍｕＩＬ−４
Ｒの効果 雌性ハイブリッドマウス（ＢＡＬＢ／ｃＣｒ×ＤＢＡ／
２Ｃｒ）Ｆ１（ＣＤ２Ｆ１）を病原性の高いカンジダア
ルビカンスＣＡ−６株（５×１０4細胞、静脈内）で感
染させた（試験日０）。感染の24時間前に開始し、動物
に、２５０μｌのＰＢＳ中１００μｇのｍｕＩＬ−４Ｒ
を、日−１に１回、日０および１にそれぞれ２回、日２
および３にそれぞれ１回、腹腔内投与した。それに代え
て対照動物には、同じ投与計画を用いて、精製マウス血
清アルブミン（ＭＳＡ）、ｈｕＩＬ−４ＲまたはＰＢＳ
を投与した。マウス血清アルブミン（１６匹）、ｈｕＩ
Ｌ−４Ｒ（１６匹）およびＰＢＳ（２４匹）処置動物は
すべて、進行性のカンジダ感染症を発症し、平均生存時
間は感染後１４〜１７日であった。ｍｕＩＬ−４Ｒ処置
動物（２４匹）の９１.６％は生存した。これらの生存
動物は、感染８週後に、カンジダアルビカンス（１０6
細胞）で再感染させた。すべての動物がこの再感染後も
生存した。通常の非処置動物では、この感染は致死感染
を招き、生存時間は感染後２〜３日である。
【００３９】
【表１】
【００４０】
【表２】
【００４１】
【表３】
【００４２】
【表４】
【００４３】
【表５】
【００４４】
【表６】
【００４５】
【表７】
【００４６】
【表８】
【００４７】
【表９】
【００４８】
【表１０】
【００４９】
【表１１】
【００５０】
【表１２】
【００５１】
【表１３】
【００５２】
【表１４】
【００５３】
【表１５】
【００５４】
【表１６】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ローラント・クルレ ドイツ連邦共和国35096ニーダーヴアイマ ル．キーフエルンヴエーク12 (72)発明者 レアンダー・ラウフアー ドイツ連邦共和国35075グラーデンバハ. シユロスアレー25 (72)発明者 フリードリヒ−ローベルト・ザイラー ドイツ連邦共和国35041マルブルク．オー ベラーアイヒヴエーク10

Claims (19)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ＴＨ２型Ｔ−ヘルパー細胞の産生増大を
    生じる疾患の治療および予防のための医薬の製造におけ
    るＩＬ−４受容体（ＩＬ−４Ｒ）またはその誘導体の使
    用。
  2. 【請求項２】 ＴＨ２型Ｔ−ヘルパー細胞の産生増大を
    生じる疾患の診断のためのＩＬ−４Ｒまたはその誘導体
    の使用。
  3. 【請求項３】 誘導体がＩＬ−４Ｒの部分、突然変異体
    または変異体である請求項１に記載のＩＬ−４Ｒまたは
    その誘導体の使用。
  4. 【請求項４】 誘導体がＩＬ−４Ｒの細胞外領域である
    請求項３に記載のＩＬ−４Ｒまたはその誘導体の使用。
  5. 【請求項５】 ＩＬ−４受容体またはその誘導体が融合
    蛋白質の構成成分である請求項１に記載のＩＬ−４Ｒま
    たはその誘導体の使用。
  6. 【請求項６】 融合蛋白質がＩＬ−４受容体またはその
    誘導体および抗体のＦｃ部分を含有する請求項５に記載
    のＩＬ−４Ｒまたはその誘導体の使用。
  7. 【請求項７】 疾患が感染症である請求項１〜６のいず
    れかに記載のＩＬ−４Ｒまたはその誘導体の使用。
  8. 【請求項８】 感染症がウイルス性、細菌性、寄生虫性
    またはかび感染症である請求項７に記載のＩＬ−４Ｒま
    たはその誘導体の使用。
  9. 【請求項９】 感染症がレトロウイルス、プレクトマイ
    セテス、酵母様かび、マイコバクテリウム、リステリ
    ア、原生動物、条虫または蠕虫による感染症である請求
    項８に記載のＩＬ−４Ｒまたはその誘導体の使用。
  10. 【請求項１０】 感染症がヒト免疫不全ウイルス（ＨＩ
    Ｖ）、癩菌、リーシュマニア、プラスモジウム、住血吸
    虫、寄生性鉤虫、鞭虫、旋毛虫、嚢尾虫（キスチケルク
    ス）、カンジダ、アスペルギルス、シクロフィリダまた
    はヘリグモソモイデスによる感染症である請求項８に記
    載のＩＬ−４Ｒまたはその誘導体の使用。
  11. 【請求項１１】 疾患がアレルギー反応の形態をとる請
    求項１に記載のＩＬ−４Ｒまたはその誘導体の使用。
  12. 【請求項１２】 アレルギー反応がアトピー性皮膚炎ま
    たは喘息である請求項１１に記載のＩＬ−４Ｒまたはそ
    の誘導体の使用。
  13. 【請求項１３】 ＩＬ−４Ｒまたはその誘導体が配合製
    品中に使用される請求項１〜６のいずれかに記載のＩＬ
    −４Ｒまたはその誘導体の使用。
  14. 【請求項１４】 配合製品がγ−インターフェロンを含
    有する請求項１３に記載のＩＬ−４Ｒまたはその誘導体
    の使用。
  15. 【請求項１５】 配合製品がアレルゲンまたはアレルゲ
    ンの部分を含有する請求項１３に記載のＩＬ−４Ｒまた
    はその誘導体の使用。
  16. 【請求項１６】 配合製品が細胞表面蛋白質ＣＤ４０の
    リガンドと細胞表面蛋白質ＣＤ４０との相互作用を阻害
    する１種または２種以上の物質を含有する請求項１３に
    記載のＩＬ−４Ｒまたはその誘導体の使用。
  17. 【請求項１７】 少なくとも１種の物質が可溶性のＣＤ
    ４０表面分子またはその誘導体の決定基である請求項１
    ６に記載のＩＬ−４Ｒまたはその誘導体の使用。
  18. 【請求項１８】 局所投与用の請求項１〜６のいずれか
    に記載の医薬の製造のためのＩＬ−４Ｒまたはその誘導
    体の使用。
  19. 【請求項１９】 皮内、皮下、経皮、経鼻または経肺投
    与用の請求項１８に記載の医薬の製造のためのＩＬ−４
    Ｒまたはその誘導体の使用。
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