JPH0616564A

JPH0616564A - 神経成長因子産生促進用ペプチド

Info

Publication number: JPH0616564A
Application number: JP5105965A
Authority: JP
Inventors: Osanori Numao; 長徳沼尾; Heiritsu Ri; 炳律李; Daiei Tsunemoto; 大英常本; Tomoko Tsuji; 智子辻; Koji Yamaguchi; 宏二山口; Akenori Sasano; 朱里笹野
Original assignee: Sagami Chemical Research Institute
Current assignee: Sagami Chemical Research Institute
Priority date: 1992-05-01
Filing date: 1993-04-09
Publication date: 1994-01-25

Abstract

(57)【要約】【目的】安価かつ大量生産が可能な神経成長因子産生
促進剤を提供する。【構成】配列番号１〜３で表されるペプチド（各配列
番号で表されるペプチドのＮ末端のアミノ基は、アセチ
ル基、t-ブトキシカルボニル基又はベンジルオキシカル
ボニル基で修飾されてもよく、Ｃ末端のカルボキシル基
はアミド基であってもよい）を有効成分とする神経成長
因子産生促進剤。配列番号１のペプチドの配列は、Thr
Val Asp Arg Asp Thr Val Ala Gly Ala Arg Lys Asn Gl
n Tyr Arg His Tyr Trp Ser Glu Asn Leu Phe Gln Gly
である。【効果】上記ペプチドは化学合成により容易に得るこ
とができ、また、ＮＧＦの大量生産が可能である。した
がって、痴呆症等の脳神経系疾患、および末梢神経損傷
による末梢神経性機能疾患の治療薬としての使用が期待
される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は神経成長因子（以下、Ｎ
ＧＦと称する）産生促進剤に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】ＮＧＦは試験管内で神経細胞を分化さ
せ、神経突起の伸長を促すと共に神経細胞の生存を維持
する。動物実験において、ＮＧＦを脳内に投与すること
により、記憶や学習能力が亢進し、また脳虚血によるニ
ューロンの死滅を防ぐ効果がある[J. Neurosci., 6, 21
55 (1986), Brain Res., 293, 305 (1985), Science, 2
35, 214 (1986), Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 83, 9
231 (1986), Annals of Neurology, 120, 275 (198
6)]。

【０００３】ＮＧＦがこの神経細胞の生存や分化に必須
であると報告されている[ ファルマシア, 147 (1986),
老年精神医学, 3, 751 (1986) ]ことから、ＮＧＦは記
憶や思考を司る殆どの神経細胞（マイネルト核のコリン
作動性ニューロン）の死滅、消失が認められるアルツハ
イマー型老年性痴呆症の治療薬としての可能性が示唆さ
れている。実際、ランス-オルソンらの報告（1991年ア
ルツハイマー病治療シンポジウム）では、アルツハイマ
ー病による痴呆症状を示す患者の脳に、ネズミから取っ
たＮＧＦを３ヶ月間、計6.6mgを投与することで症状の
改善が認められた。

【０００４】ハンチントン舞踏症患者の脳の線条体で
は、ＧＡＢＡ作動性神経細胞の脱落とともにコリン作動
性神経細胞の脱落が著しく、ＮＧＦが線条体の内因性コ
リン作動性神経細胞にも作用することが知られている
［Science, 234, 1341 (1986)］ことから、ＮＧＦは脳
神経疾患治療薬として注目されている。

【０００５】末梢神経においては、神経の損傷にともな
いシュワン細胞と繊維芽様細胞のＮＧＦ分泌が亢進する
ことから［Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 84, 8735 (1
987), J. Cell. Biol., 104, 1623 (1987), Nature, 3
30,658 (1987)］、末梢神経修復、再生とＮＧＦの関係
が詳細に研究され、脊髄損傷、末梢神経損傷等の末梢神
経機能障害の治療薬としても期待されている。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】このＮＧＦを臨床にお
いて用いるには大量のＮＧＦが必要とされるが、現在、
その大量生産技術手段が確立されてないことから、ＮＧ
Ｆ産生細胞を活性化し、ＮＧＦの分泌を促す物質が望ま
れている。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは上記の課題
を解決するために鋭意検討した結果、配列番号１、配列
番号２、または配列番号３で表されるペプチド（各配列
番号で表されるペプチドのＮ末端のアミノ基はアセチル
基、t-ブトキシカルボニル基又はベンジルオキシカルボ
ニル基で修飾されてもよく、Ｃ末端のカルボキシル基は
アミド基であってもよい）がＮＧＦ産生促進活性を有す
ることを見い出し、本発明を完成するに至った。

【０００８】本発明のペプチドは、一般的なペプチド合
成法を適用して容易に得ることができる。ペプチド合成
法としては活性化エステル法、混合酸無水物法、アジド
法などのＣ末端活性化法、カルボジイミド等のカップリ
ング法、Ｎ-カルボキシ無水物（NCA）法、酸化還元法、
酵素法あるいはMerrifieldが開発した固相法［Angew. C
hem. Int. Ed. Engl., 24, 799 (1985)］などがある。

【０００９】本発明に用いられるペプチドは、生理学的
に許容される塩の形で用いても良い。その生理学的に許
容される塩としては、アルカリ金属塩またはアルカリ土
類金属塩、アミンとの塩および有機酸、例えば塩酸、硫
酸、燐酸、蟻酸、酢酸、メタンスルホン酸、クエン酸、
酒石酸、乳酸、オレイン酸、フマール酸、リンゴ酸、ケ
イ皮酸、マロン酸、グルタミン酸、アスパラギン酸、粘
液酸、安息香酸、グルコン酸、シュウ酸、アスコルビン
酸、アセチルグリシンとの塩などをあげることができ
る。

【００１０】本発明におけるこれらのペプチドは治療の
ために経口的あるいは非経口的に投与することができ
る。経口投与剤としては散剤、顆粒剤、カプセル剤、錠
剤などの固形製剤あるいはシロップ剤、エリキシル剤な
どの液状製剤とすることができる。また、非経口投与剤
として注射剤、直腸投与剤、皮膚外用剤、吸入剤とする
ことができる。これらの製剤は活性成分に薬学的に認容
である製造助剤を加えることにより常法に従って製造さ
れる。更に公知の技術により持続性製剤とすることも可
能である。

【００１１】経口投与用の固形製剤を製造するには活性
成分と賦形剤例えば乳糖やマンニトールなどの糖、デン
プン、結晶セルロース、乳酸カルシウム、クエン酸カル
シウム、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム、無水ケイ
酸などとを混合して散剤とするか、更に必要に応じて白
糖、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリ
ドンなどの結合剤、カルボキシメチルセルロース、カル
ボキシメチルセルロースカルシウムなどの崩壊剤などを
加えて湿式又は乾式造粒して顆粒剤とする。錠剤を製造
するにはこれらの散剤及び顆粒剤をそのままあるいはス
テアリン酸マグネシウム、タルクなどの滑沢剤を加えて
打錠すればよい。これらの顆粒または錠剤はヒドロキシ
プロピルメチルセルロースフタレート、メタアクリル
酸、メタアクリル酸メチルコポリマーなどの腸溶性基剤
で被覆して腸溶性製剤、あるいはエチルセルロース、カ
ルナウバロウ、硬化油などで被覆して持続性製剤とする
こともできる。また、カプセル剤を製造するには散剤又
は顆粒剤をなどの硬カプセルに充填するか、活性成分を
グリセリン、ポリエチレングリコール、ゴマ油、オリー
ブ油などに溶解したのちゼラチン膜で被覆し軟カプセル
とすることができる。

【００１２】経口投与用の液状製剤を製造するには活性
成分と白糖、ソルビトール、グリセリンなどの甘味剤
とを水に溶解して透明なシロップ剤、更に精油、エタノ
ールなどを加えてエリキシル剤とするか、アラビアゴ
ム、トラガント、ポリソルベート８０、カルボキシメチ
ルセルロースナトリウムなどを加えて乳剤又は懸濁剤と
してもよい。これらの液状製剤には所望により矯味剤、
着色剤、保存剤などを加えてもよい。

【００１３】注射剤を製造するには活性成分を必要に応
じ塩酸、水酸化ナトリウム、乳剤、乳酸ナトリウム、リ
ン酸一水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウムなどの
ｐＨ調製剤、塩化ナトリウム、ブドウ糖などの等張化剤
とともに注射用蒸留水に溶解し、無菌ろ過してアンプル
に充填するか、更にマンニトール、デキストリン、シク
ロデキストリン、ゼラチンなどを加えて真空下凍結乾燥
し、用時溶解型の注射剤としてもよいし、活性成分にレ
シチン、ポリソルベート８０、ポリオキシエチレン硬化
ヒマシ油などを加えて水中で乳化せしめ注射用乳剤とす
ることもできる。

【００１４】直腸投与剤を製造するには活性成分及びカ
カオ脂、脂肪酸のトリ、ジ及びモノグリセリド、ポリエ
チレングリコールなどの坐剤用基剤とを加湿して溶融し
型に流しこんで冷却するか、活性成分をポリエチレング
リコール、大豆油などに溶解したのちゼラチン膜で被覆
すればよい。

【００１５】皮膚外用剤を製造するには活性成分を白色
ワセリン、ミツロウ、流動パラフィン、ポリエチレング
リコールなどにくわえて必要ならば加湿して練合し軟膏
剤とするか、ロジン、アクリル酸アルキルエステル重合
体などの粘着剤と練合ししたのちポリエチレンなどの不
織布に展延してテープ剤とする。

【００１６】吸入剤を製造するには活性成分をフロンガ
スなどの噴射剤に溶解又は分散して耐圧容器に充填しエ
アゾール剤とする。

【００１７】本発明のペプチドの投与量は患者の年齢、
体重および病態によって異なるが、通常１日約１mg〜５
００mgであり、１乃至数回に分けて投与することが望ま
しい。

【００１８】このペプチドの生物学的評価は、ペプチド
のＬＭ細胞に対するＮＧＦ産生促進活性を測定すること
により行った（実施例参照）。

【００１９】以下、本発明を実施例により、更に、具体
的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものでは
ない。

【００２０】

【実施例】

【００２１】実施例１配列番号１で表されるペプチド合成ペプチドの合成は、固相法を採用し、ペプチド自動合成
機（Applied Biosystems社製の430Aまたは431A型）を使
用し、同社のプログラムにより実施した。合成機に使用
した試薬は430Aの場合、1.ジイソプロピルエチルアミン
2.トリフルオロ酢酸 3.ニュ-トライザ-（エタノ-ル
アミン） 4.メタノ-ル 5.ヒドロキシベンゾトリアゾ-
ル 6.ジシクロヘキシルカルボジイミド 7.ジクロロメ
タン 8.ジメチルホルムアミドである。431Aの場合はジ
メチルホルムアミドの代りに、Ｎ-メチルピロリドンを
用いた。合成にあたって用いたアミノ酸は、Boc-Ala、
Boc-Arg(Mts)、 Boc-Asn、 Boc-Asp(OBzl)、Boc-Glu(OB
zl)、Boc-Gln、Boc-Gly、Boc-His(Dnp)、Boc-Leu、Boc-
Lys(Cl-Z)、 Boc-Phe、 Boc-Ser(Bzl)、Boc-Thr(Bzl)、
Boc-Trp(CHO)、 Boc-Tyr(Br-Z)、 Boc-Val である。C末
端カルボン型のペプチド合成にはPAMレジンを用い、C末
端アミド型のペプチド合成にはP-メチルBHAレジンを用
いた。保護基の脱離、樹脂からの切り出しはApplied Bi
osystems 社のマニュアルに従った。Boc-Trp(CHO)を使
用して合成したペプチド樹脂の切り出しに使用した試
薬 ( ペプチド樹脂 1g スケール ) は次ぎの通りであ
る。1.低温条件、m-クレゾール 1ml、ジメチルスルフィ
ド 3ml、トリフルオロ酢酸 5ml、トリフルオロメタン
スルホン酸 1 mlであり、次いで、2.高温条件、チオア
ニソール : 1, 2- エタンジチオール ( 2 : 1 ) 1.5 m
l、トリフルオロ酢酸 10ml、トリフルオロメタンスル
ホン酸 1 ml である。

【００２２】本実施例のペプチドの合成に当っては、Bo
c法を採用し、0.5mmol Boc-Gly-PAMレジンを使用し
た。合成を終了し、2.7 gのペプチド樹脂を得た。ジメ
チルホルムアミド(65ml)に上記のペプチド樹脂を懸濁、
チオフェノール(2.7ml)を添加した後、1 時間、室温で
かくはんし, まず、ヒスチジンの保護基Dnpを除去し
た。ペプチド樹脂をろ別し、ジクロロメタンで洗浄し
た。ペプチド樹脂から、以下、Applied Biosystems 社
のマニュアルに従い、切り出しを行った。即ち、m-クレ
ゾール (2.1ml)、ジメチルスルフィド (8.1 ml)を加
え、かくはんした混合物に、氷浴中で冷却しながらトリ
フルオロ酢酸 (13.5ml)、次いでトリフルオロメタンス
ルホン酸 (2.7ml)を加えた。その温度で3時間かくはん
した。エーテル (150ml)を加え、反応混合物をろ過し、
エーテルで3 回洗浄した。得られた混合物にチオアニソ
ール : 1,2-エタンジチオール (2:1) ( 3.0ml)を加え、
10分間かくはんした。次に、氷浴中で冷却しながらトリ
フルオロ酢酸 (30ml)を加えた。トリフルオロメタンス
ルホン酸 (2.0ml)をゆっくり加えて、室温で30分間かく
はんした。冷却したエーテルを加えて、反応混合物をろ
過し、エーテルで3 回洗浄した。

【００２３】得られた粗ペプチドをトリフルオロ酢酸
(15ml ) で溶解し、冷却、かくはんしてあるエーテル中
に滴下した。析出物をろ過し、エーテルで3 回洗浄し
た。10％酢酸水溶液で溶解し、ろ過した。この粗ペプチ
ドを酢酸水溶液に溶解しオープンカラム[Bio-Gel P-2]
を用い、10％酢酸水溶液で展開した。目的物を含む溶
出液を凍結乾燥し、白色粉末 0.9 g を得た。HPLC [ O
DS-80TMカラム（東ソー、21.5mmID ｘ30cm)、アセトニ
トリル直線勾配／0.1% トリフルオロ酢酸 ]で分取し、
凍結乾燥し白色粉末(104 mg)を得た。分析用カラム [
ODS-80TMカラム（東ソー、4.6mmID ｘ15cm)アセトニト
リル直線勾配／0.1% トリフルオロ酢酸 ]を使用し、HPL
Cを行い、精製物が単一なことを確認した。一部を、App
lied Biosystems社製の477Ａプロテインシーケンサー、
120A PTH アナライザーを使用し、アミノ酸配列分析を
行った。また、6N 塩酸で110℃、20 時間加水分解した
後、医理化工業のA-8700型アミノ酸分析装置を使用し、
分析した結果、配列番号１の配列を有していることを確
認した。

【００２４】実施例２配列番号２で表されるペプチドの合成ペプチドの合成は、固相法を採用し、ペプチド自動合成
機 (Applied Biosystems社製の430A または 431A型) を
使用し、同社のプログラムにより実施した。合成機に使
用した試薬は430A の場合、1. ジイプロピルエチルア
ミン 2. トリフルオロ酢酸 3. ニュートライザー
(エタノールアミン) 4. メタノール 5. ヒドロキシ
ベンゾトリアゾール 6. ジシクロヘキシルカルボジイ
ミド 7.ジクロロメタン 8. ジメチルホルムアミドで
ある。431A の場合はジメチルホルムアミドの代りに、N
-メチルピロリドンを用いた。合成にあたって用いたア
ミノ酸は、Boc-Ala、 Boc-Arg(Mts)、 Boc-Asn、 Boc-A
sp(OBzl)、Boc-Cys(4-CH3OBzl)、Boc-Glu(OBzl)、Boc-G
ln、Boc-Gly、Boc-His(Dnp)、Boc-Leu、Boc-Lys(Cl-
Z)、Boc-Phe、Boc-Ser(Bzl)、Boc-Thr(Bzl)、Boc-Trp(C
HO)、Boc-Tyr(Br-Z)、Boc-Val である。Ｃ末端カルボキ
シル基型のペプチド合成にはPAMレジンを用い、Ｃ末端
アミド基型のペプチド合成にはP-メチルBHAレジンを用
いた。保護基の脱離、樹脂からの切り出しはApplied Bi
osystems 社のマニュアルに従った。

【００２５】本実施例のペプチドの合成に当っては、Bo
c法を採用し、0.5mmol Boc-Gly-PAMResinを使用した。
合成を終了し、2.6 gのペプチド樹脂を得た。ジメチル
ホルムアミド(50 ml)に上記のペプチド樹脂を懸濁、チ
オフェノール(2.6 ml)を添加した後、1 時間、室温で攪
拌し, まず、ヒスチジンの保護基Dnpを除去した。ペプ
チド樹脂をろ別し、ジクロロメタンで洗浄した。ペプ
チド樹脂から、以下、Applied Biosystems 社のマニュ
アルに従い、特別法で切り出しを行った。即ち、m-クレ
ゾール (2.1 ml)、ジメチルスルフィド (7.8 ml)を加
え、攪拌した混合物に、氷浴中で冷却しながらトリフル
オロ酢酸 (13.0 ml)、次いでトリフルオロメタンスルホ
ン酸 (2.6 ml)を加えた。その温度で3時間攪拌した。エ
ーテル (150ml)を加え、反応混合物をろ過し、エーテル
で3 回洗浄した。得られた混合物にチオアニソール :
1,2-エタンジチオール (2:1) ( 3.9 ml)を加え、10分
間攪拌した。次に、氷浴中で冷却しながらトリフルオロ
酢酸 (26 ml)を加えた。トリフルオロメタンスルホン酸
(2.6 ml)をゆっくり加えて、室温で30分間攪拌した。
冷却したエーテルを加えて、反応混合物をろ過し、エー
テルで3 回洗浄した。

【００２６】得られた粗ペプチドをトリフルオロ酢酸
(15 ml ) で溶解し、冷却、攪拌してあるエーテル中に
滴下した。析出物をろ過し、エーテルで3 回洗浄した。
10％酢酸水溶液で溶解し、ろ過した。この粗ペプチドを
酢酸水溶液に溶解しオープンカラム[Bio-Gel P-2]を用
い、10％酢酸水溶液で展開した。目的物を含む溶出液
を凍結乾燥し、白色粉末 1.68 g を得た。HPLC ［ODS-
80TMカラム（東ソー、21.5mmID ｘ30cm)、アセトニトリ
ル直線勾配／0.1% トリフルオロ酢酸］で分取し、凍結
乾燥し白色粉末(500 mg)を得た。分析用カラム［ODS-80
TMカラム（東ソー、4.6mmID ｘ15cm)アセトニトリル直
線勾配／0.1% トリフルオロ酢酸］を使用し、HPLCを行
い、精製物が単一なことを確認した。一部を、Applied
Biosystems社製の477Ａプロテインシーケンサー、120A
PTH アナライザーを使用し、アミノ酸配列分析を行っ
た。また、6N 塩酸で110℃、20 時間加水分解した後、
医理化工業のA-8700型アミノ酸分析装置を使用して分析
した。分析結果よりペプチドが配列Gln Phe Leu Asn Gl
u Ser Trp Tyr His Arg Tyr Gln Asn Lys Arg Ala Gly
AlaVal Thr Asp Arg Asp Val Thr Gly を有しているこ
とを確認した。

【００２７】実施例３実施例２と同様の反応操作を行い、配列番号３で表され
るペプチドを得た。

【００２８】実施例３ＬＭ細胞に対する本発明ペプチドのＮＧＦ産生促進活性２×１０⁴ 細胞／ｍｌ（0.5％ペプトン加199培地）のＬ
Ｍ細胞を９６ウエルマルチプレ-トに１ウエル当り、0.2
mlづつ3日間培養後、0.5％BSA加199培地により希釈した
各ペプチド溶液と培地交換し、更に24時間培養した。培
養終了後、培養液に含まれるＮＧＦを抗マウスＮＧＦポ
リクロ-ナル抗体を用いるＥＩＡ法によって測定した。
その結果、図１および図２（各々、縦軸はＮＧＦ産生
量、横軸はペプチド濃度を表す）に示したようにペプチ
ドは用量依存的にＮＧＦ産生を促進した。

【００２９】

【配列表】

【００３０】配列番号：１配列の長さ：２６配列の型：アミノ酸トポロジ-：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Thr Val Asp Arg Asp Thr Val Ala Gly Ala Arg Lys Asn Gln Tyr 5 10 15 Arg His Tyr Trp Ser Glu Asn Leu Phe Gln Gly 20 25

【００３１】配列番号：２配列の長さ：２６配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Gln Phe Leu Asn Glu Ser Trp Tyr His Arg Tyr Gln Asn Lys Arg 1 5 10 15 Ala Gly Ala Val Thr Asp Arg Asp Val Thr Gly 20 25

【００３２】配列番号：３配列の長さ：１２配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列

【図面の簡単な説明】

【図１】ＬＭ細胞における配列番号１のペプチドのＮＧ
Ｆ産生促進活性を示すグラフである。

【図２】ＬＭ細胞における配列番号２および３のペプチ
ドのＮＧＦ産生促進活性を示すグラフである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者笹野朱里神奈川県相模原市相模大野５−４−７

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】（１）配列番号１（２）配列番号２または（３）配列番号３で表されるペプチド（各配列番号で表されるペプチドの
Ｎ末端のアミノ基はアセチル基、t-ブトキシカルボニル
基又はベンジルオキシカルボニル基で修飾されてもよ
く、Ｃ末端のカルボキシル基はアミド基であってもよ
い）を有効成分とする神経成長因子産生促進剤。