JPH0616715B2 - 融合蛋白質の精製方法 - Google Patents
融合蛋白質の精製方法Info
- Publication number
- JPH0616715B2 JPH0616715B2 JP60172096A JP17209685A JPH0616715B2 JP H0616715 B2 JPH0616715 B2 JP H0616715B2 JP 60172096 A JP60172096 A JP 60172096A JP 17209685 A JP17209685 A JP 17209685A JP H0616715 B2 JPH0616715 B2 JP H0616715B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- protein
- fusion protein
- fatty acid
- acid ester
- sucrose fatty
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、蔗糖脂肪酸エステルを含有する蛋白質可溶化
剤を使用して融合蛋白質を精製する方法に関するもので
ある。
剤を使用して融合蛋白質を精製する方法に関するもので
ある。
近年、所謂、遺伝子工学的手法によつて大腸菌等の微生
物に有用な外来遺伝子を人為的に組込み、該外来遺伝子
由来の蛋白質を生産させることが盛んに行われている。
物に有用な外来遺伝子を人為的に組込み、該外来遺伝子
由来の蛋白質を生産させることが盛んに行われている。
その場合、微生物に目的とする蛋白質を発現させ、それ
を安定に生産させるために、その蛋白質をコードする遺
伝子のみではなく、その微生物の転写と翻訳の仕組に合
つた遺伝情報の発現シグナル、例えば、プロモーターや
リボソーム付着信号等を予め目的蛋白質をコードする遺
伝子と接続して組換え分子に組込んでおく方法がしばし
ばとられる。従つて、組換え微生物により産生される蛋
白質は、プロモーター由来の蛋白質等と目的蛋白質との
融合蛋白質（fusedprotein）として得られる。
を安定に生産させるために、その蛋白質をコードする遺
伝子のみではなく、その微生物の転写と翻訳の仕組に合
つた遺伝情報の発現シグナル、例えば、プロモーターや
リボソーム付着信号等を予め目的蛋白質をコードする遺
伝子と接続して組換え分子に組込んでおく方法がしばし
ばとられる。従つて、組換え微生物により産生される蛋
白質は、プロモーター由来の蛋白質等と目的蛋白質との
融合蛋白質（fusedprotein）として得られる。
ところで、かかる融合蛋白質はほとんどの場合不溶性で
あり、穏やかな条件で可溶化することは困難である。そ
こで、この融合蛋白質以外の夾雑蛋白質をできるだけ可
溶化して分離除去し、融合蛋白質を精製することが考え
られる。
あり、穏やかな条件で可溶化することは困難である。そ
こで、この融合蛋白質以外の夾雑蛋白質をできるだけ可
溶化して分離除去し、融合蛋白質を精製することが考え
られる。
しかしながら、従来、蛋白質の可溶化剤として広く使用
されているTriton X−１００の様な可溶化剤を使用して
も必ずしも分離が十分とはいえない。
されているTriton X−１００の様な可溶化剤を使用して
も必ずしも分離が十分とはいえない。
その原因の１つとして、融合蛋白質は一般にアグリゲー
トしていて、従来の可溶化剤で処理した後もアグリゲー
トのままで存在するため、次のゲルろ過、イオン交換樹
脂クロマト、分別沈殿等の通常の分離操作でうまく分離
できないということが考えられる。
トしていて、従来の可溶化剤で処理した後もアグリゲー
トのままで存在するため、次のゲルろ過、イオン交換樹
脂クロマト、分別沈殿等の通常の分離操作でうまく分離
できないということが考えられる。
本発明者らは、かかる可溶化剤として、蔗糖脂肪酸エス
テルを使用したところ、夾雑蛋白質を良好に可溶化して
融合蛋白質との分離を容易にすると共に、通常の分離操
作での分離も良好に行われることを知得し、本発明を完
成するに至つた。
テルを使用したところ、夾雑蛋白質を良好に可溶化して
融合蛋白質との分離を容易にすると共に、通常の分離操
作での分離も良好に行われることを知得し、本発明を完
成するに至つた。
すなわち、本発明の要旨は、少くとも、外来遺伝子を導
入された微生物の産生する該外来遺伝子由来の蛋白質部
分を有する融合蛋白質を含む粗蛋白質を、蔗糖脂肪酸エ
ステル含有蛋白質可溶化剤で処理し、該可溶化剤で可溶
化される蛋白質を分離して該融合蛋白質を得ることを特
徴とする融合蛋白質の精製方法に存する。
入された微生物の産生する該外来遺伝子由来の蛋白質部
分を有する融合蛋白質を含む粗蛋白質を、蔗糖脂肪酸エ
ステル含有蛋白質可溶化剤で処理し、該可溶化剤で可溶
化される蛋白質を分離して該融合蛋白質を得ることを特
徴とする融合蛋白質の精製方法に存する。
本発明で使用する蔗糖脂肪酸エステルとしては、通常、
ＨＬＢが１２〜２０、好ましくは、１５〜１８であり、
且つ、炭素数が８〜１４程度の脂肪酸、例えば、カプリ
ル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸等と蔗糖
とのエステルが挙げられる。特に、モノエステルが７５
〜１００％で、ジエステルが２５％以下で、トリエステ
ル乃至オクタエステルが１％以下程度のものが好適に使
用できる。
ＨＬＢが１２〜２０、好ましくは、１５〜１８であり、
且つ、炭素数が８〜１４程度の脂肪酸、例えば、カプリ
ル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸等と蔗糖
とのエステルが挙げられる。特に、モノエステルが７５
〜１００％で、ジエステルが２５％以下で、トリエステ
ル乃至オクタエステルが１％以下程度のものが好適に使
用できる。
蔗糖脂肪酸エステルの濃度は、対象とする外来遺伝子を
導入された微生物の細菌膜の種類等により異なるが、通
常、0.０１〜２０％、好ましくは、0.０５〜５％の範囲
の濃度で使用される。その際、蔗糖脂肪酸エステルは、
一般に生化学分野で常用される緩衝液溶液、例えば、ト
リス−塩酸緩衝液等の溶液として使用され、ｐＨは通常
中性付近が選ばれる。
導入された微生物の細菌膜の種類等により異なるが、通
常、0.０１〜２０％、好ましくは、0.０５〜５％の範囲
の濃度で使用される。その際、蔗糖脂肪酸エステルは、
一般に生化学分野で常用される緩衝液溶液、例えば、ト
リス−塩酸緩衝液等の溶液として使用され、ｐＨは通常
中性付近が選ばれる。
外来遺伝子を導入された微生物の産生する融合蛋白質の
例としては、例えば、特開昭５６−166200に記載されて
いるようなヒトプロインシユリンの融合蛋白質、特開昭
５６−145221に記載されているようなソマトスタチン又
はヒト成長ホルモンの融合蛋白質、或いは、特開昭５９
−154989に記載されているようなβ−エンドルフインの
融合蛋白質等が挙げられる。
例としては、例えば、特開昭５６−166200に記載されて
いるようなヒトプロインシユリンの融合蛋白質、特開昭
５６−145221に記載されているようなソマトスタチン又
はヒト成長ホルモンの融合蛋白質、或いは、特開昭５９
−154989に記載されているようなβ−エンドルフインの
融合蛋白質等が挙げられる。
これら融合蛋白質を含む粗蛋白質を、常法に従つて菌体
から分離し、これを上記濃度範囲の蔗糖脂肪酸エステル
を含む可溶化剤に０℃〜室温で懸濁させ、この可溶化剤
で可溶化し得る蛋白質を十分可溶化させる。次いで、遠
心分離して目的の融合蛋白質を含む画分を沈殿として得
る。
から分離し、これを上記濃度範囲の蔗糖脂肪酸エステル
を含む可溶化剤に０℃〜室温で懸濁させ、この可溶化剤
で可溶化し得る蛋白質を十分可溶化させる。次いで、遠
心分離して目的の融合蛋白質を含む画分を沈殿として得
る。
更に必要に応じて、常法に従い、ゲルろ過、イオン交換
樹脂クロマト、分別沈殿等を適宜組合せることにより、
精製された融合蛋白質を得ることができる。
樹脂クロマト、分別沈殿等を適宜組合せることにより、
精製された融合蛋白質を得ることができる。
実施例１ プラスミドpBR322 trpE-β-EPを調製し（特開昭59-1549
89実施例２に記載された方法に従う）、これにより形質
転換されたＷ3110をクローニングした。
89実施例２に記載された方法に従う）、これにより形質
転換されたＷ3110をクローニングした。
このクローニングした大腸菌Ｗ3110を下記第１表に示す
Ｍ９培地５mlの入つたＬ字管に接種し、３７℃で約２０
時間振とう培養した。次いで、その培養液１mlをＭ９培
地1,000mlの入つた三角フラスコに植えつぎ、引続き３
７℃でklett値が約２００になるまで約１８時間培養し
た。
Ｍ９培地５mlの入つたＬ字管に接種し、３７℃で約２０
時間振とう培養した。次いで、その培養液１mlをＭ９培
地1,000mlの入つた三角フラスコに植えつぎ、引続き３
７℃でklett値が約２００になるまで約１８時間培養し
た。
培養液、４℃で8,000rpm、１０分間遠心して集菌した。
その約４１ｇ（湿重量）をＴＥＮ緩衝液（50mM Tris-HC
l(pH8.0)、１mM EDTA、0.3M NaCl)４００mlに懸濁し、0.
2M PMSF（フエニルメチルスルフオニルフロライド）0.4
mlおよびリゾチーム１００mgを添加し、氷中で３０分撹
拌後、超音波処理して菌体を破壊した。
その約４１ｇ（湿重量）をＴＥＮ緩衝液（50mM Tris-HC
l(pH8.0)、１mM EDTA、0.3M NaCl)４００mlに懸濁し、0.
2M PMSF（フエニルメチルスルフオニルフロライド）0.4
mlおよびリゾチーム１００mgを添加し、氷中で３０分撹
拌後、超音波処理して菌体を破壊した。
この処理液に1.5倍量のＮＭ緩衝液（1.5M NaCl、１２mM
MgCl2）とD Nase I１０mgを添加し、撹拌後４℃で一夜
静置した。次いで、これを４℃で8,０００rpm、３０分
間遠心してその沈殿画分を得た。
MgCl2）とD Nase I１０mgを添加し、撹拌後４℃で一夜
静置した。次いで、これを４℃で8,０００rpm、３０分
間遠心してその沈殿画分を得た。
この沈殿画分に５００mlのＴＥＮ緩衝液を加えて室温で
２時間撹拌し、上記と同様に遠心してその沈殿画分を得
た。このＴＥＮ緩衝液洗浄沈殿画分に２％蔗糖脂肪酸エ
ステル“リヨートー”シユガーエステルＬ−1695（商品
名、三菱化成食品株式会社）を含むＴＥＮ緩衝液500ml
を加え、よく懸濁さて４℃で一夜撹拌した。次いで、上
記と同様に遠心してその沈殿画分を得、それに上記の２
％蔗糖脂肪酸エステルを含むＴＥＮ緩衝液５００mlを加
え、２時間撹拌した後、遠心して蔗糖脂肪酸エステル処
理沈殿画分を得た。
２時間撹拌し、上記と同様に遠心してその沈殿画分を得
た。このＴＥＮ緩衝液洗浄沈殿画分に２％蔗糖脂肪酸エ
ステル“リヨートー”シユガーエステルＬ−1695（商品
名、三菱化成食品株式会社）を含むＴＥＮ緩衝液500ml
を加え、よく懸濁さて４℃で一夜撹拌した。次いで、上
記と同様に遠心してその沈殿画分を得、それに上記の２
％蔗糖脂肪酸エステルを含むＴＥＮ緩衝液５００mlを加
え、２時間撹拌した後、遠心して蔗糖脂肪酸エステル処
理沈殿画分を得た。
上記ＴＥＮ緩衝液洗浄沈殿画分の全蛋白質量（A280によ
る測定）は約７９０mg／培養液で、そのうち目的のβ
−エンドルフインの融合蛋白質（trpE-β-EP）量は約２
６３mg／培溶液であり、また、蔗糖脂肪酸エステル処
理沈殿画分の全蛋白質量は約２９７mg／培養液で、そ
のうち目的のtrpE-β-EP量は約２６３mg／培養液であ
つた。
る測定）は約７９０mg／培養液で、そのうち目的のβ
−エンドルフインの融合蛋白質（trpE-β-EP）量は約２
６３mg／培溶液であり、また、蔗糖脂肪酸エステル処
理沈殿画分の全蛋白質量は約２９７mg／培養液で、そ
のうち目的のtrpE-β-EP量は約２６３mg／培養液であ
つた。
従つて、蔗糖脂肪酸エステル処理により、約６2.４％の
夾雑蛋白質が除去され、目的のtrpE-β-EPは何らロスす
ることなく、約８8.６％に精製されたことが判つた。
夾雑蛋白質が除去され、目的のtrpE-β-EPは何らロスす
ることなく、約８8.６％に精製されたことが判つた。
この蔗糖脂肪酸エステル処理沈殿画分を尿素溶液に溶解
し、これを４℃、１２０分間酵素（クロストリパイン）
処理した。次いで、常法に従い、ＣＭ−セフアデツクス
Ｃ−２５およびセフアデツクスＧ−２５カラムクロマ
ト、更に、液体クロマトグラフイーにより精製β−エン
ドルフインを得た。この分離精製工程でのβ−エンドル
フインの回収率は約８7.２％であつた。
し、これを４℃、１２０分間酵素（クロストリパイン）
処理した。次いで、常法に従い、ＣＭ−セフアデツクス
Ｃ−２５およびセフアデツクスＧ−２５カラムクロマ
ト、更に、液体クロマトグラフイーにより精製β−エン
ドルフインを得た。この分離精製工程でのβ−エンドル
フインの回収率は約８7.２％であつた。
実施例２ 実施例１において、蔗糖脂肪酸エステルとして“リヨー
トー”シユガーエステルC10momo（商品名、三菱化成食
品株式会社）を使用したほかは同様にして処理した。そ
の結果、蔗糖脂肪酸エステル処理沈殿画分の全蛋白質量
は約２９９mg／培養液で、そのうち目的のtrpE-β-EP
量は約２６３mg／培養液であつた。従つて、蔗糖脂肪
酸エステル処理により約６2.２％の夾雑蛋白質が除去さ
れ、目的のtrpE-β-EPは約８8.０％に精製されたことが
判つた。
トー”シユガーエステルC10momo（商品名、三菱化成食
品株式会社）を使用したほかは同様にして処理した。そ
の結果、蔗糖脂肪酸エステル処理沈殿画分の全蛋白質量
は約２９９mg／培養液で、そのうち目的のtrpE-β-EP
量は約２６３mg／培養液であつた。従つて、蔗糖脂肪
酸エステル処理により約６2.２％の夾雑蛋白質が除去さ
れ、目的のtrpE-β-EPは約８8.０％に精製されたことが
判つた。
比較例１ 実施例１において、蔗糖脂肪酸エステルの代りにTriton
X−１００を使用したほかは同様にして処理した。その
結果、Triton X−１００処理沈殿画分の全蛋白質量は約
３８０mg／培養液で、そのうち目的のtrpE-β-EP量は
約２５１mg／培養液であつた。従つて、Triton X−１
００処理によつて約５1.９％の夾雑蛋白質が除去され、
目的のtrpE-β-EPは約６6.１％に精製されたことが伴つ
た。また、この処理によつて約５％の目的物がロスして
いることが判つた。
X−１００を使用したほかは同様にして処理した。その
結果、Triton X−１００処理沈殿画分の全蛋白質量は約
３８０mg／培養液で、そのうち目的のtrpE-β-EP量は
約２５１mg／培養液であつた。従つて、Triton X−１
００処理によつて約５1.９％の夾雑蛋白質が除去され、
目的のtrpE-β-EPは約６6.１％に精製されたことが伴つ
た。また、この処理によつて約５％の目的物がロスして
いることが判つた。
このTriton X−１００処理沈殿画分を実施例１と同様に
して分離精製したところ、この分離精製工程でのβ−エ
ンドルフインの回収率は約５８％であつた。
して分離精製したところ、この分離精製工程でのβ−エ
ンドルフインの回収率は約５８％であつた。
本願発明によれば粗蛋白質中の夾雑蛋白質の可溶化、分
離除去が良好に行われ目的とする融合蛋白質を容易に精
製することができる。しかも得られる融合蛋白質の純度
は従来法よりはるかに高く、処理過程におけるロスもな
いので、工業的に極めて有利な方法である。
離除去が良好に行われ目的とする融合蛋白質を容易に精
製することができる。しかも得られる融合蛋白質の純度
は従来法よりはるかに高く、処理過程におけるロスもな
いので、工業的に極めて有利な方法である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:19）
Claims (1)
- 【請求項１】少くとも、外来遺伝子を導入された微生物
の産生する該外来遺伝子由来の蛋白質部分を有する融合
蛋白質を含む粗蛋白質を、蔗糖脂肪酸エステル含有蛋白
質可溶化剤で処理し、該可溶化剤で可溶化される蛋白質
を分離して該融合蛋白質を得ることを特徴とする融合蛋
白質の精製方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60172096A JPH0616715B2 (ja) | 1985-08-05 | 1985-08-05 | 融合蛋白質の精製方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60172096A JPH0616715B2 (ja) | 1985-08-05 | 1985-08-05 | 融合蛋白質の精製方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6232897A JPS6232897A (ja) | 1987-02-12 |
| JPH0616715B2 true JPH0616715B2 (ja) | 1994-03-09 |
Family
ID=15935464
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60172096A Expired - Fee Related JPH0616715B2 (ja) | 1985-08-05 | 1985-08-05 | 融合蛋白質の精製方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0616715B2 (ja) |
-
1985
- 1985-08-05 JP JP60172096A patent/JPH0616715B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS6232897A (ja) | 1987-02-12 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP0052861B1 (en) | Extraction of interferon from bacteria | |
| Tam et al. | The F plasmid ccd autorepressor is a complex of CcdA and CcdB proteins | |
| US5525472A (en) | Method for production and purification or recombinant Apolipoprotein E from bacteria | |
| EP0080848B1 (en) | Stabilizing & selecting cells | |
| EP0778893B1 (en) | Bacterial production of Interferon-beta polypeptide | |
| EP0091527A2 (en) | DNA sequences, recombinant DNA molecules and processes for producing human serum albumin-like polypeptides | |
| EP0145174B1 (en) | Novel, physiologically active polypeptides and production method thereof | |
| AU643712B2 (en) | Method for recovering recombinant proteins | |
| JP2001525672A (ja) | 組換えタンパク質の収率を増大させるための方法 | |
| JP2561674B2 (ja) | 蛋白質の産生方法 | |
| EP1390522B1 (en) | Acetate-free purification of plasmid dna on hydroxyapatite | |
| JPS6232897A (ja) | 融合蛋白質の精製方法 | |
| CA1255220A (en) | Highly solubilized protein and production thereof | |
| JPH1198980A (ja) | ヌクレオシド誘導体の製造方法 | |
| EP0239075A2 (en) | Process for producing fish growth hormone polypeptide | |
| HU200939B (en) | Process for stabilizing htnf obtained by recombinant dna technique | |
| JP2788070B2 (ja) | ２―ハロ酸デハロゲナーゼ生産性遺伝子 | |
| EP0226639B1 (en) | Process for preparing heterogenic protein | |
| EP0227833B1 (en) | Process for preparing hetero-protein | |
| RU2099348C1 (ru) | Способ выделения рекомбинантного полипептида с последовательностью соматотропина | |
| JPS62209097A (ja) | 組換えヒトインタリユーキン−１αの精製法 | |
| US20040058402A1 (en) | Method for purifying the helicobacter adhesin-like protein a (alpa) | |
| JP3491695B2 (ja) | Ｎ−アシルノイラミン酸アルドラーゼの製造法 | |
| US3060102A (en) | Method of purifying streptokinase | |
| WO2000034312A1 (en) | Method of separating basic peptide or basic protein |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |