JPS6232897A - 融合蛋白質の精製方法 - Google Patents
融合蛋白質の精製方法Info
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- JPS6232897A JPS6232897A JP60172096A JP17209685A JPS6232897A JP S6232897 A JPS6232897 A JP S6232897A JP 60172096 A JP60172096 A JP 60172096A JP 17209685 A JP17209685 A JP 17209685A JP S6232897 A JPS6232897 A JP S6232897A
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- fatty acid
- acid ester
- sucrose fatty
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は、蔗糖脂肪酸エステルを含有する蛋白５［可溶
化剤を使用して帛合蛋白質を精製する方法に関するもの
である。
化剤を使用して帛合蛋白質を精製する方法に関するもの
である。
近年、所謂、遺伝子工学的手法によって大隣菌等の微生
物に有用な外来遺伝子を人為的に組込み、該外来遺伝子
由来の蛋白質を生産させることが盛んに行われている。
物に有用な外来遺伝子を人為的に組込み、該外来遺伝子
由来の蛋白質を生産させることが盛んに行われている。
その場合、微生物に目的とする蛋白質を発現させ、それ
を安定に生成させるために、その蛋白質をコードする遺
伝子のみではなく、その微生物の転写と翻訳の仕組に合
った遺伝情報の発現シグナル、例えば、プロモーターや
リポソーム付着信号等を予め目的蛋白質をコードする遺
伝子と接続して組換え分子に組込んでおく方法がしばし
ばとられる。従って、組換え微生物により産生される蛋
白質は、プロモーター由来の蛋白質等と目的蛋白質との
融合蛋白質（ｆｕｓｅｄｐｒｏｔｅｉｎ ）として得ら
れる。
を安定に生成させるために、その蛋白質をコードする遺
伝子のみではなく、その微生物の転写と翻訳の仕組に合
った遺伝情報の発現シグナル、例えば、プロモーターや
リポソーム付着信号等を予め目的蛋白質をコードする遺
伝子と接続して組換え分子に組込んでおく方法がしばし
ばとられる。従って、組換え微生物により産生される蛋
白質は、プロモーター由来の蛋白質等と目的蛋白質との
融合蛋白質（ｆｕｓｅｄｐｒｏｔｅｉｎ ）として得ら
れる。
ところで、かかる融合蛋白質はほとんどの場合不溶性で
あり、穏やかな粂件で可溶化することは困難である。そ
こで、この融合蛋白質以外の夾雑蛋白質をできるだけ可
溶化して分離除去し、融合蛋白質を精製することが考え
られる。
あり、穏やかな粂件で可溶化することは困難である。そ
こで、この融合蛋白質以外の夾雑蛋白質をできるだけ可
溶化して分離除去し、融合蛋白質を精製することが考え
られる。
しかしながら、従来、蛋白質の可溶化剤として広く使用
されているＴｒｉｔＯｎ Ｘ、 −／θθの様な可溶化
剤を使用しても必ずしも分離が十分とはいえない。
されているＴｒｉｔＯｎ Ｘ、 −／θθの様な可溶化
剤を使用しても必ずしも分離が十分とはいえない。
その原因の７つとして、融合蛋白質は一般にアグリゲー
トしていて、従来の可溶化剤で処理した後もアグリゲー
トのｉｔで存在するため、次のゲルろ過、イオン交換樹
脂クロマト、分別沈殿等の通常の分離操作でうまく分離
できないということが考えられる。
トしていて、従来の可溶化剤で処理した後もアグリゲー
トのｉｔで存在するため、次のゲルろ過、イオン交換樹
脂クロマト、分別沈殿等の通常の分離操作でうまく分離
できないということが考えられる。
本発明者らは、かかる可溶化剤として、療糖脂肪酸エス
テルを使用したところ、夾雑蛋白質を良好に可溶化して
融合蛋白質との分離を容易にすると共に、通常の分離操
作での分離も良好に行われることを知得し、本発明を完
成するに至 Ａつた。
テルを使用したところ、夾雑蛋白質を良好に可溶化して
融合蛋白質との分離を容易にすると共に、通常の分離操
作での分離も良好に行われることを知得し、本発明を完
成するに至 Ａつた。
すなわち、本発明の要旨は、少くとも、外来遺伝子を導
入された微生物の産生ずる該外来遺伝子由来の蛋白質部
分を有する融合蛋白質を含む粗蛋白質を、戸糖脂肪酸エ
ステル含有蛋白質可溶化剤で処理し、該可溶化剤で可溶
化される蛋白質を分離して該融合蛋白質を得ることを特
徴とする融合蛋白質の精製方法に存する。
入された微生物の産生ずる該外来遺伝子由来の蛋白質部
分を有する融合蛋白質を含む粗蛋白質を、戸糖脂肪酸エ
ステル含有蛋白質可溶化剤で処理し、該可溶化剤で可溶
化される蛋白質を分離して該融合蛋白質を得ることを特
徴とする融合蛋白質の精製方法に存する。
本発明で使用する竺糖脂肪酸エステルとしては、通常、
Ｉ（ＬＢが７２〜２θ、好ましくは、／ｊ〜／？であり
、且つ、炭素数がｒ〜７９程度の脂肪酸、例えば、カプ
リル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸等と蔗
糖とのエステルが挙げられる。特に１モノエステルが７
５〜７００％で、ジエステルが２ｊ％以下で、トリエス
テル乃至オクタエステルが／チ以下程度のものが好適に
使用できる。
Ｉ（ＬＢが７２〜２θ、好ましくは、／ｊ〜／？であり
、且つ、炭素数がｒ〜７９程度の脂肪酸、例えば、カプ
リル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸等と蔗
糖とのエステルが挙げられる。特に１モノエステルが７
５〜７００％で、ジエステルが２ｊ％以下で、トリエス
テル乃至オクタエステルが／チ以下程度のものが好適に
使用できる。
蔗糖脂肪酸エステルの濃度は、対象とする外来遺伝子を
導入された微生物の細菌膜の種類等により異なるが、通
常、０．０７〜２０％、好ましくは、θ、θｊ−Ｓ％の
範囲の濃度で使用される。その際、蔗糖脂肪酸エステル
は、一般に生化学分野で常用される緩衝液溶液、例えば
、トリス−塩酸緩衝液等の溶液として使用され、ｐＨは
通常中性付近が選ばれる。
導入された微生物の細菌膜の種類等により異なるが、通
常、０．０７〜２０％、好ましくは、θ、θｊ−Ｓ％の
範囲の濃度で使用される。その際、蔗糖脂肪酸エステル
は、一般に生化学分野で常用される緩衝液溶液、例えば
、トリス−塩酸緩衝液等の溶液として使用され、ｐＨは
通常中性付近が選ばれる。
外来遺伝子を導入された微生物の産生ずる融合蛋白質の
例としては、例えば、特開昭ｊ乙−／ｇ≦２００に記載
されているようなヒトプロインシュリンの融合蛋白質、
特開昭ｊ乙−／ｐｔｊ、Ｚ２／に記載されているような
ソマトスタチン又はヒト成長ホルモンの融合蛋白質、或
いは、特開昭ｊター／ｊ％？Ｊ’９に記載されているよ
りなβ−エンドルフィンの融合蛋白質等が挙げられる。
例としては、例えば、特開昭ｊ乙−／ｇ≦２００に記載
されているようなヒトプロインシュリンの融合蛋白質、
特開昭ｊ乙−／ｐｔｊ、Ｚ２／に記載されているような
ソマトスタチン又はヒト成長ホルモンの融合蛋白質、或
いは、特開昭ｊター／ｊ％？Ｊ’９に記載されているよ
りなβ−エンドルフィンの融合蛋白質等が挙げられる。
これら融合蛋白質を含む粗蛋白質を、常法に従って菌体
から分離し、これを上記濃度範囲の蔗糖脂肪酸エステル
を含む可溶化剤にＱ℃〜室温で懸濁させ、この可溶化剤
で可溶化し得る蛋白質を十分可溶化させる。次いで、遠
心分離して目的の融合蛋白質を含む画分を沈殿として得
る。
から分離し、これを上記濃度範囲の蔗糖脂肪酸エステル
を含む可溶化剤にＱ℃〜室温で懸濁させ、この可溶化剤
で可溶化し得る蛋白質を十分可溶化させる。次いで、遠
心分離して目的の融合蛋白質を含む画分を沈殿として得
る。
更に必要に応じて、常法に従い、ゲルろ過、イオン交換
樹脂クロマト、分別沈殿等を適宜組合せることにより、
精製された融合蛋白質を得ることができる。
樹脂クロマト、分別沈殿等を適宜組合せることにより、
精製された融合蛋白質を得ることができる。
実施例／
プラスミドｐＢＲ１２２ｔｒｐＥ−β−ＥＰ を調製
しく特開昭６？−／ｊダタ♂り実施例コに記載された方
法に従う）、これにより形質転換されたＷ３／１０をク
ローニングした。
しく特開昭６？−／ｊダタ♂り実施例コに記載された方
法に従う）、これにより形質転換されたＷ３／１０をク
ローニングした。
このクローニングした大腸菌ＶＩＥ／１０を下記第７表
に示すＭ９培地ｊ ａｔの入ったＬ字管に接種し、３７
℃で約２０時間振とり培養した。次いで、その培養液／
ｒｔｔｌをＭワ培地／、０００ｒｒｔｌ（０人った三角
フラスコに植えつぎ、引続き３７℃でｋｌｅｔｔ値が約
コ００になるまで約／／時間培養し次。
に示すＭ９培地ｊ ａｔの入ったＬ字管に接種し、３７
℃で約２０時間振とり培養した。次いで、その培養液／
ｒｔｔｌをＭワ培地／、０００ｒｒｔｌ（０人った三角
フラスコに植えつぎ、引続き３７℃でｋｌｅｔｔ値が約
コ００になるまで約／／時間培養し次。
第１表
２０％グルコース λ０ｗ１２０％カザア
ミノ酸 コ０．ｉθ、０ ／ Ｍ ０ａＯ
ｔ２ ／ ＯａｔＯ１／ Ｍ Ｍ２
ＳＯ４／ ０尻ｌ 塩混合物＊／ １００ｒｘｌテトラ
サイクリン ０．０２２アンピシリン
０，０ダ？水
♂９ｔＯ＠／！／、θ００．１ ＊／ニア％Ｎａ２ＨＰＯ４＋ ３％ＫＨ２ＰＯ４＋ ０
．５％ＮａＣｔ＋／％ＮＨ４Ｃｌ 培養後、％’Ｃでｅ！’、０００ ｒｐｍ、１０分間遠
心して集菌した。その約′ｌｔ／？（湿重偶・）をＴＥ
Ｎ緩衝液（ｊ ＯｍＭ Ｔｒｉｓ −ＨＣＩ （ｐＨｔ
！、０ ）、／ｍＭＥＤＴＡ１０，３ＭＮａＣ１）＜ｔ
θＯ献にＰ濁し、０．２ＭＰＭＳＦ （フェニルメチル
スルフォニルフロライド）θ、’Ａｍ／！およびリゾチ
ーム１００７１１９を添加し、水中で３０分攪拌後、超
音波処理して菌体を破壊した。
ミノ酸 コ０．ｉθ、０ ／ Ｍ ０ａＯ
ｔ２ ／ ＯａｔＯ１／ Ｍ Ｍ２
ＳＯ４／ ０尻ｌ 塩混合物＊／ １００ｒｘｌテトラ
サイクリン ０．０２２アンピシリン
０，０ダ？水
♂９ｔＯ＠／！／、θ００．１ ＊／ニア％Ｎａ２ＨＰＯ４＋ ３％ＫＨ２ＰＯ４＋ ０
．５％ＮａＣｔ＋／％ＮＨ４Ｃｌ 培養後、％’Ｃでｅ！’、０００ ｒｐｍ、１０分間遠
心して集菌した。その約′ｌｔ／？（湿重偶・）をＴＥ
Ｎ緩衝液（ｊ ＯｍＭ Ｔｒｉｓ −ＨＣＩ （ｐＨｔ
！、０ ）、／ｍＭＥＤＴＡ１０，３ＭＮａＣ１）＜ｔ
θＯ献にＰ濁し、０．２ＭＰＭＳＦ （フェニルメチル
スルフォニルフロライド）θ、’Ａｍ／！およびリゾチ
ーム１００７１１９を添加し、水中で３０分攪拌後、超
音波処理して菌体を破壊した。
この処理液に／、５倍量のＮＭ緩衝液（／、ｓＭＮａＣ
ｔ、 ／ ２ ｍＭ １．イｙｃ１２ ）とＤＮａｓｅ
ｌ／θ■を添加し、攪拌後ダ℃で一夜静置した。次いで
、これを弘℃で♂、０００ｒｐｍ、３０分間遠心してそ
の沈殿画分を得た。
ｔ、 ／ ２ ｍＭ １．イｙｃ１２ ）とＤＮａｓｅ
ｌ／θ■を添加し、攪拌後ダ℃で一夜静置した。次いで
、これを弘℃で♂、０００ｒｐｍ、３０分間遠心してそ
の沈殿画分を得た。
この沈殿画分にｊ ００ ｍｌのＴＥＮ緩衝液を加えて
室温で一時間擾拌し、上記と同様に遠心してその沈殿画
分を得た。このＴＢＮ緩衝液洗浄沈殿画分に２％蔗糖脂
肪酸エステル、“リョートー”シュガーエステルＬ−／
１９！（商品名、三菱化成食品株式会社）を含むＴＥＮ
緩衝液樹液００１を加え、よく懸濁させてダ℃で一夜撹
拌した。
室温で一時間擾拌し、上記と同様に遠心してその沈殿画
分を得た。このＴＢＮ緩衝液洗浄沈殿画分に２％蔗糖脂
肪酸エステル、“リョートー”シュガーエステルＬ−／
１９！（商品名、三菱化成食品株式会社）を含むＴＥＮ
緩衝液樹液００１を加え、よく懸濁させてダ℃で一夜撹
拌した。
次いで、上記と同様に遠心してその沈殿画分を得、それ
江上記の、２％蔗糖脂肪酸エステルを含むＴＥＮ緩衝液
５ＯＯ−を加え、２時間攪拌した後、遠心して蔗糖脂肪
酸エステル処理沈殿画分を得た。
江上記の、２％蔗糖脂肪酸エステルを含むＴＥＮ緩衝液
５ＯＯ−を加え、２時間攪拌した後、遠心して蔗糖脂肪
酸エステル処理沈殿画分を得た。
上記ＴＥＮ緩衝液洗浄沈殿画分の全蛋白質量（Ａ２８゜
による測定）は約７９０■／を培養液で、そのうち目的
のβ−エンドルフィンの融合蛋白質（ｔｒｐＥ−β−Ｅ
Ｐ）ｉは約２１３ ｍｑ／を培養液であり、！た、蔗糖
脂肪酸エステル処理沈殿画分の全蛋白質量は約コタ７〜
／を培養液で、そのうち目的のｔｒｐ Ｅ−β−ＥＦ−
１ｉｉは約２ｔ３ｒｍ／を培養液であった。
による測定）は約７９０■／を培養液で、そのうち目的
のβ−エンドルフィンの融合蛋白質（ｔｒｐＥ−β−Ｅ
Ｐ）ｉは約２１３ ｍｑ／を培養液であり、！た、蔗糖
脂肪酸エステル処理沈殿画分の全蛋白質量は約コタ７〜
／を培養液で、そのうち目的のｔｒｐ Ｅ−β−ＥＦ−
１ｉｉは約２ｔ３ｒｍ／を培養液であった。
従って、蔗糖脂肪酸エステル処理により、約４ Ｊ４ｔ
％の夾雑蛋白質が除去され、目的のｔｒｐＥ−β−ＥＦ
は何らロスすることなく、約ｔｒｔｒ、ｔチにｆｉｌ製
され念ことが判った。
％の夾雑蛋白質が除去され、目的のｔｒｐＥ−β−ＥＦ
は何らロスすることなく、約ｔｒｔｒ、ｔチにｆｉｌ製
され念ことが判った。
この蔗糖脂肪酸エステル処理沈殿画分を尿素溶液に溶解
し、これを％℃、７２０分間酵素（クロス） ＩＪパイ
ン）処理した。次いで、常法に従い、ＣＭ−セファデッ
クスＯ−，２ｊおよびセファデックスＧ−，２６カラム
クロマト、更に、液体クロマトグラフィーにより精製β
−エンドルフィンを得次。この分離精製工程でのβ−エ
ンドルフィンの回収率は約！７．２％であった。
し、これを％℃、７２０分間酵素（クロス） ＩＪパイ
ン）処理した。次いで、常法に従い、ＣＭ−セファデッ
クスＯ−，２ｊおよびセファデックスＧ−，２６カラム
クロマト、更に、液体クロマトグラフィーにより精製β
−エンドルフィンを得次。この分離精製工程でのβ−エ
ンドルフィンの回収率は約！７．２％であった。
実施例コ
実施例／において、蔗糖脂肪酸エステルとして”リョー
トー″シュカーエステル０１０ ｍｏｎ。
トー″シュカーエステル０１０ ｍｏｎ。
（商品名、三菱化成食品株式会社）を使用したほかは同
様にして処理した。その結果、蔗糖脂肪酸エステル処理
沈殿画分の全蛋白質量は約、２９９■／を培養液で、そ
のうち目的のｔｒｐ Ｆｉ−β−ＥＰ−ｉは約、２≦３
■／を培養液であった。
様にして処理した。その結果、蔗糖脂肪酸エステル処理
沈殿画分の全蛋白質量は約、２９９■／を培養液で、そ
のうち目的のｔｒｐ Ｆｉ−β−ＥＰ−ｉは約、２≦３
■／を培養液であった。
従って、Ｒ糖脂肪酸エステル処理により約ｇ、２．コチ
の夾雑蛋白質が除去され、目的のｔｒｐＥ−β−］ｌｌ
ｌ！Ｐは約？？、Ｑ％に精製されたことが判つ之。
の夾雑蛋白質が除去され、目的のｔｒｐＥ−β−］ｌｌ
ｌ！Ｐは約？？、Ｑ％に精製されたことが判つ之。
比較例／
実施例／において、筆穂脂肪酸エステルの代りにＴｒｉ
ｔｏｎ Ｘ −／ ００を使用し次ほかは同様にして処
理した。その結果、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ −／θ０処理沈
殿画分の全蛋白質量は約３ｒＯｍｔｉ／を培養液で、そ
のうち目的のｔｒｐ Ｆｉ−β−ＥＰ量は約コｊ／■／
を培養液であった。従って、Ｔｒｉｔｏｎ！−１００処
理によって約６１．ターの夾雑蛋白質が除去され、目的
のｔｒｐ Ｅ−β−Ｆ２Ｆは約に乙、／チに精製された
ことが判った。また、この処理によって約！チの目的物
がロスしていることが判った。
ｔｏｎ Ｘ −／ ００を使用し次ほかは同様にして処
理した。その結果、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ −／θ０処理沈
殿画分の全蛋白質量は約３ｒＯｍｔｉ／を培養液で、そ
のうち目的のｔｒｐ Ｆｉ−β−ＥＰ量は約コｊ／■／
を培養液であった。従って、Ｔｒｉｔｏｎ！−１００処
理によって約６１．ターの夾雑蛋白質が除去され、目的
のｔｒｐ Ｅ−β−Ｆ２Ｆは約に乙、／チに精製された
ことが判った。また、この処理によって約！チの目的物
がロスしていることが判った。
このＴｒｉｔｏｎ Ｘ −／θ０処理沈殿画分を実施例
／と同様にして分離精製したところ、この分離精製工程
でのβ−エンドルフィンの回収率は約！！チであった。
／と同様にして分離精製したところ、この分離精製工程
でのβ−エンドルフィンの回収率は約！！チであった。
本願発明によれば粗蛋白質中の夾雑蛋白質の可溶化、分
離除去が良好に行われ目的とする融合蛋白質を容易に精
製することができる。しかも得られる融合蛋白質の紳度
は従来法よりはるかに高く、処理過程におけるロスもな
いので、工業的に極めて有利な方法である。
離除去が良好に行われ目的とする融合蛋白質を容易に精
製することができる。しかも得られる融合蛋白質の紳度
は従来法よりはるかに高く、処理過程におけるロスもな
いので、工業的に極めて有利な方法である。
出 願 人 三菱化成工業株式会社
代 理 人 弁理士 長谷用 −ほか／名
Claims (1)
- （１）少くとも、外来遺伝子を導入された微生物の産生
する該外来遺伝子由来の蛋白質部分を有する融合蛋白質
を含む粗蛋白質を、蔗糖脂肪酸エステル含有蛋白質可溶
化剤で処理し、該可溶化剤で可溶化される蛋白質を分離
して該融合蛋白質を得ることを特徴とする融合蛋白質の
精製方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60172096A JPH0616715B2 (ja) | 1985-08-05 | 1985-08-05 | 融合蛋白質の精製方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60172096A JPH0616715B2 (ja) | 1985-08-05 | 1985-08-05 | 融合蛋白質の精製方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6232897A true JPS6232897A (ja) | 1987-02-12 |
| JPH0616715B2 JPH0616715B2 (ja) | 1994-03-09 |
Family
ID=15935464
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60172096A Expired - Fee Related JPH0616715B2 (ja) | 1985-08-05 | 1985-08-05 | 融合蛋白質の精製方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0616715B2 (ja) |
-
1985
- 1985-08-05 JP JP60172096A patent/JPH0616715B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0616715B2 (ja) | 1994-03-09 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |