JPH06169761A - 動物由来線維芽細胞の無血清培養用培地及び培養方法 - Google Patents
動物由来線維芽細胞の無血清培養用培地及び培養方法Info
- Publication number
- JPH06169761A JPH06169761A JP4351019A JP35101992A JPH06169761A JP H06169761 A JPH06169761 A JP H06169761A JP 4351019 A JP4351019 A JP 4351019A JP 35101992 A JP35101992 A JP 35101992A JP H06169761 A JPH06169761 A JP H06169761A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- medium
- serum
- culture
- added
- animal
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【目的】 無血清条件下において、血清添加時と同程度
の動物由来線維芽細胞の増殖を得るための、無血清培養
用培地及び培養方法を提供する。 【構成】 ＭＣＤＢ１５３培地を基礎培地とし、これに
カルシウムイオンを１．８ｍＭ以上、及びマグネシウム
イオンを０．８〜１．２ｍＭ添加して、無血清培養用培
地とする。この培地を用いて、動物由来線維芽細胞の初
代培養及び継代培養を行うことができる。
の動物由来線維芽細胞の増殖を得るための、無血清培養
用培地及び培養方法を提供する。 【構成】 ＭＣＤＢ１５３培地を基礎培地とし、これに
カルシウムイオンを１．８ｍＭ以上、及びマグネシウム
イオンを０．８〜１．２ｍＭ添加して、無血清培養用培
地とする。この培地を用いて、動物由来線維芽細胞の初
代培養及び継代培養を行うことができる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、動物由来線維芽細胞の
良好な無血清培養用培地及び培養方法に関し、線維芽細
胞に及ぼす種々の因子の影響を的確に解析するのに最適
な培養系を提供するものである。
良好な無血清培養用培地及び培養方法に関し、線維芽細
胞に及ぼす種々の因子の影響を的確に解析するのに最適
な培養系を提供するものである。
【０００２】
【従来の技術】従来、動物由来線維芽細胞の培養は、イ
ーグルのＭＥＭ培地のようにアミノ酸類にビタミン類等
を添加した基礎培地に、ウシ胎児，子ウシ等動物の血清
を添加して行われてきた。
ーグルのＭＥＭ培地のようにアミノ酸類にビタミン類等
を添加した基礎培地に、ウシ胎児，子ウシ等動物の血清
を添加して行われてきた。
【０００３】また最近では、動物の血清を添加せず、そ
の替わりに細胞成長因子，細胞接着因子，担体タンパク
質，抗酸化剤，タンパク分解酵素阻害剤等を添加して培
養を行う試みがなされている。たとえばヒト線維芽細胞
の無血清培養用として、ＲＩＴＣ８０−７，ＭＣＤＢ系
列，ＨａｍＦ−１２・ＤＭＥ１：１混合培地等を基礎培
地とし、細胞成長因子としてインシュリン，ＥＧＦ（Ep
idermal Growth Factor），ＰＤＧＦ（Platelet-Derive
d Growth Factor），ｂＦＧＦ（basic Fibroblast Grow
th Factor）を、担体タンパク質としてトランスフェリ
ン等を、細胞接着因子としてフィブロネクチンを添加し
た培地が開発されている。
の替わりに細胞成長因子，細胞接着因子，担体タンパク
質，抗酸化剤，タンパク分解酵素阻害剤等を添加して培
養を行う試みがなされている。たとえばヒト線維芽細胞
の無血清培養用として、ＲＩＴＣ８０−７，ＭＣＤＢ系
列，ＨａｍＦ−１２・ＤＭＥ１：１混合培地等を基礎培
地とし、細胞成長因子としてインシュリン，ＥＧＦ（Ep
idermal Growth Factor），ＰＤＧＦ（Platelet-Derive
d Growth Factor），ｂＦＧＦ（basic Fibroblast Grow
th Factor）を、担体タンパク質としてトランスフェリ
ン等を、細胞接着因子としてフィブロネクチンを添加し
た培地が開発されている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】しかし、上記の技術の
うち、血清を添加した培地を用いる培養方法では、血清
中に多くの物質が含まれており、それらの作用も複雑多
岐にわたるため、また血清のロット差が激しいため、線
維芽細胞の性状や生理，薬物の影響などについての実験
結果の解析に困難をきたしていた。
うち、血清を添加した培地を用いる培養方法では、血清
中に多くの物質が含まれており、それらの作用も複雑多
岐にわたるため、また血清のロット差が激しいため、線
維芽細胞の性状や生理，薬物の影響などについての実験
結果の解析に困難をきたしていた。
【０００５】また、無血清条件下での培養方法において
も、血清添加時と同レベルの増殖を得ることはなかなか
困難であり、増殖を良くするためには基礎培地に種々の
成分を添加する必要があり、薬物等の作用を解析するに
はやはり支障となっていた。
も、血清添加時と同レベルの増殖を得ることはなかなか
困難であり、増殖を良くするためには基礎培地に種々の
成分を添加する必要があり、薬物等の作用を解析するに
はやはり支障となっていた。
【０００６】
【課題を解決するための手段】そこで、われわれは、基
礎培地に対して添加成分の種類及び量をなるべく少なく
した動物由来線維芽細胞の培養系を確立することを検討
した。その結果、基礎培地として高アミノ酸培地である
ＭＣＤＢ１５３培地を用い、これに１．８ｍＭ以上のカ
ルシウムイオンと、０．８〜１．２ｍＭのマグネシウム
イオンといった単純な無機イオンを添加した系で、良好
な線維芽細胞の増殖が得られることを見い出し、本発明
を完成するに至った。
礎培地に対して添加成分の種類及び量をなるべく少なく
した動物由来線維芽細胞の培養系を確立することを検討
した。その結果、基礎培地として高アミノ酸培地である
ＭＣＤＢ１５３培地を用い、これに１．８ｍＭ以上のカ
ルシウムイオンと、０．８〜１．２ｍＭのマグネシウム
イオンといった単純な無機イオンを添加した系で、良好
な線維芽細胞の増殖が得られることを見い出し、本発明
を完成するに至った。
【０００７】添加するカルシウムイオンの量としては、
１．８ｍＭ以上が適当である。図１に、基本培地ＭＣＤ
Ｂ１５３培地に対し、マグネシウムイオン添加量を１．
０ｍＭとし、カルシウムイオンの添加量を０．１ｍＭ〜
１．８ｍＭの範囲で添加した場合のヒト線維芽細胞の増
殖のようすを示した。この図から、血清添加時と同レベ
ルの増殖を得るには、カルシウムイオンは１．８ｍＭ添
加する必要があることが認められる。
１．８ｍＭ以上が適当である。図１に、基本培地ＭＣＤ
Ｂ１５３培地に対し、マグネシウムイオン添加量を１．
０ｍＭとし、カルシウムイオンの添加量を０．１ｍＭ〜
１．８ｍＭの範囲で添加した場合のヒト線維芽細胞の増
殖のようすを示した。この図から、血清添加時と同レベ
ルの増殖を得るには、カルシウムイオンは１．８ｍＭ添
加する必要があることが認められる。
【０００８】一方、マグネシウムイオンの添加量は０．
８〜１．２ｍＭが適当である。図２に、ＭＣＤＢ１５３
培地に対し、カルシウムイオン添加量を１．８ｍＭと
し、マグネシウムイオンの添加量を０．５〜１．５ｍＭ
の範囲で添加した場合のヒト線維芽細胞の増殖のようす
を示した。この図から明らかなように、０．８ｍＭ未満
のマグネシウムイオン添加では十分な増殖が得られず、
１．２ｍＭ以上の添加ではかえって線維芽細胞の増殖を
阻害するため、好ましくない。
８〜１．２ｍＭが適当である。図２に、ＭＣＤＢ１５３
培地に対し、カルシウムイオン添加量を１．８ｍＭと
し、マグネシウムイオンの添加量を０．５〜１．５ｍＭ
の範囲で添加した場合のヒト線維芽細胞の増殖のようす
を示した。この図から明らかなように、０．８ｍＭ未満
のマグネシウムイオン添加では十分な増殖が得られず、
１．２ｍＭ以上の添加ではかえって線維芽細胞の増殖を
阻害するため、好ましくない。
【０００９】なお、本発明に係る培地に、ＥＧＦやイン
シュリンを添加すると、一層細胞の増殖を促進すること
ができる。
シュリンを添加すると、一層細胞の増殖を促進すること
ができる。
【００１０】
【作用】以上のように、ＭＣＤＢ１５３培地を基礎培地
とし、カルシウムイオンを１．８ｍＭ以上、及びマグネ
シウムイオンを０．８〜１．２ｍＭ添加した培地におい
て、ヒトをはじめ動物の各組織由来の線維芽細胞を無血
清条件下で培養すると、図１に示すように、血清添加時
と同程度の増殖を得ることができる。ヒト皮膚線維芽細
胞の培養の場合、培養２日後から細胞数は急増し、血清
添加時とほとんど同様の増殖曲線が得られる。
とし、カルシウムイオンを１．８ｍＭ以上、及びマグネ
シウムイオンを０．８〜１．２ｍＭ添加した培地におい
て、ヒトをはじめ動物の各組織由来の線維芽細胞を無血
清条件下で培養すると、図１に示すように、血清添加時
と同程度の増殖を得ることができる。ヒト皮膚線維芽細
胞の培養の場合、培養２日後から細胞数は急増し、血清
添加時とほとんど同様の増殖曲線が得られる。
【００１１】なお、本発明に係る培地及び培養方法は、
線維芽細胞の初代培養，継代培養のいずれにおいても用
いることができ、良好な結果が得られる。
線維芽細胞の初代培養，継代培養のいずれにおいても用
いることができ、良好な結果が得られる。
【００１２】
【実施例】さらに本発明について、実施例により詳細に
説明する。
説明する。
【００１３】まず本発明の実施例として、ヒト皮膚線維
芽細胞の無血清培養用培地の組成を表１に示す。この培
地のカルシウムイオン添加量は１．８ｍＭ、マグネシウ
ムイオン添加量は０．９８ｍＭである。
芽細胞の無血清培養用培地の組成を表１に示す。この培
地のカルシウムイオン添加量は１．８ｍＭ、マグネシウ
ムイオン添加量は０．９８ｍＭである。
【表１】
【００１４】上記培地を用い、ヒト線維芽細胞の初代培
養を行った。方法は以下の通りである。
養を行った。方法は以下の通りである。
【００１５】採取したヒト皮膚組織をリン酸緩衝塩類溶
液（ＰＢＳ(-)）で洗浄後、ＰＢＳ(-)液中で細かく切断
する。次いで数回ＰＢＳ(-)で洗い、細切片とし、０．
１ｍｇ／ｍｌトリプシン，０．０２％ＥＤＴＡ液で３０
分間処理し、ろ過後ろ液を１０００ｒｐｍ，５分間遠心
して、細胞ペレットを得、２〜３度遠心分離を繰り返し
てトリプシンを除去する。ついで細胞ペレットを培養液
に懸濁する。
液（ＰＢＳ(-)）で洗浄後、ＰＢＳ(-)液中で細かく切断
する。次いで数回ＰＢＳ(-)で洗い、細切片とし、０．
１ｍｇ／ｍｌトリプシン，０．０２％ＥＤＴＡ液で３０
分間処理し、ろ過後ろ液を１０００ｒｐｍ，５分間遠心
して、細胞ペレットを得、２〜３度遠心分離を繰り返し
てトリプシンを除去する。ついで細胞ペレットを培養液
に懸濁する。
【００１６】一方、フィブロネクチンをＰＢＳ(-)で１
０μｇ／ｍｌとなるように希釈し、シャーレに重層す
る。３７℃で３０分間静置し、フィブロネクチン液を吸
引除去し、ＰＢＳ(-)で２回洗浄する。本発明に係る培
地を添加した後約１００万個の上記分離細胞を添加し、
炭酸ガス培養器にて２〜３時間培養し、非接着細胞と組
織の残さを吸引除去する。続いて新たに培地を加え、酸
素-炭酸ガス培養器に移し、さらに培養を続けた。
０μｇ／ｍｌとなるように希釈し、シャーレに重層す
る。３７℃で３０分間静置し、フィブロネクチン液を吸
引除去し、ＰＢＳ(-)で２回洗浄する。本発明に係る培
地を添加した後約１００万個の上記分離細胞を添加し、
炭酸ガス培養器にて２〜３時間培養し、非接着細胞と組
織の残さを吸引除去する。続いて新たに培地を加え、酸
素-炭酸ガス培養器に移し、さらに培養を続けた。
【００１７】この際、培養用培地として、ＤＭＥＭ培地
に１０％子ウシ血清を加えたものを用いて同様に培養し
た場合を比較例１、ＭＣＤＢ１５３培地に０．１ｍＭカ
ルシウムイオン及び０．１ｍＭマグネシウムイオンを加
えたものを用いて、同様に培養した場合を比較例２とし
た。
に１０％子ウシ血清を加えたものを用いて同様に培養し
た場合を比較例１、ＭＣＤＢ１５３培地に０．１ｍＭカ
ルシウムイオン及び０．１ｍＭマグネシウムイオンを加
えたものを用いて、同様に培養した場合を比較例２とし
た。
【００１８】本実施例における線維芽細胞の増殖のよう
すを図３に示す。培養開始後、接着性の線維芽細胞は２
万個程度であったが、２日後には約３万個となり、その
後急激に増殖して６日後には１２万個に達し、血清を添
加した比較例１と同程度の増殖が認められた。一方、カ
ルシウムイオン，マグネシウムイオンの濃度が低い比較
例２では、８日間培養してもほとんど線維芽細胞の増殖
は認められなかった。
すを図３に示す。培養開始後、接着性の線維芽細胞は２
万個程度であったが、２日後には約３万個となり、その
後急激に増殖して６日後には１２万個に達し、血清を添
加した比較例１と同程度の増殖が認められた。一方、カ
ルシウムイオン，マグネシウムイオンの濃度が低い比較
例２では、８日間培養してもほとんど線維芽細胞の増殖
は認められなかった。
【００１９】
【発明の効果】以上のように、本発明により、無血清条
件下、なるべく添加成分の種類と添加量を少なくして、
動物由来の線維芽細胞を特異的且つ効率良く培養するこ
とが可能となった。
件下、なるべく添加成分の種類と添加量を少なくして、
動物由来の線維芽細胞を特異的且つ効率良く培養するこ
とが可能となった。
【図１】線維芽細胞の無血清培養において、カルシウム
イオンの影響を示す図である。
イオンの影響を示す図である。
【図２】線維芽細胞の無血清培養において、マグネシウ
ムイオンの影響を示す図である。
ムイオンの影響を示す図である。
【図３】本発明の実施例及び比較例１，２の増殖の違い
を示す図である。
を示す図である。
１ ＤＭＥＭ培地に１０％子ウシ血清を添加した場合 ２ ＭＣＤＢ１５３培地に、１．８ｍＭカルシウムイオ
ン及び１．０ｍＭマグネシウムイオンを添加した場合 ３ ＭＣＤＢ１５３培地に、１．０ｍＭカルシウムイオ
ン及び１．０ｍＭマグネシウムイオンを添加した場合 ４ ＭＣＤＢ１５３培地に、０．１ｍＭカルシウムイオ
ン及び１．０ｍＭマグネシウムイオンを添加した場合 ５ 実施例１ ６ 比較例１ ７ 比較例２
ン及び１．０ｍＭマグネシウムイオンを添加した場合 ３ ＭＣＤＢ１５３培地に、１．０ｍＭカルシウムイオ
ン及び１．０ｍＭマグネシウムイオンを添加した場合 ４ ＭＣＤＢ１５３培地に、０．１ｍＭカルシウムイオ
ン及び１．０ｍＭマグネシウムイオンを添加した場合 ５ 実施例１ ６ 比較例１ ７ 比較例２
Claims (2)
- 【請求項１】 ＭＣＤＢ１５３培地を基礎培地とし、カ
ルシウムイオンを１．８ｍＭ以上、及びマグネシウムイ
オンを０．８〜１．２ｍＭ添加して成る、動物由来線維
芽細胞の無血清培養用培地。 - 【請求項２】 ＭＣＤＢ１５３培地に、カルシウムイオ
ンを１．８ｍＭ以上と、マグネシウムイオンを０．８〜
１．２ｍＭとを添加して、無血清条件下で培養すること
を特徴とする、動物由来線維芽細胞の無血清培養方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4351019A JPH06169761A (ja) | 1992-12-04 | 1992-12-04 | 動物由来線維芽細胞の無血清培養用培地及び培養方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4351019A JPH06169761A (ja) | 1992-12-04 | 1992-12-04 | 動物由来線維芽細胞の無血清培養用培地及び培養方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06169761A true JPH06169761A (ja) | 1994-06-21 |
Family
ID=18414491
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4351019A Pending JPH06169761A (ja) | 1992-12-04 | 1992-12-04 | 動物由来線維芽細胞の無血清培養用培地及び培養方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH06169761A (ja) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5916809A (en) * | 1996-03-22 | 1999-06-29 | Nec Corporation | Medium for culturing normal human epidermal melanocytes |
| EP0845963A4 (en) * | 1995-07-28 | 2000-11-02 | Isolagen Technologies Inc | USE OF AUTOLOGOUS DERMAL FIBROBLASTS FOR THE REPAIR OF SKIN AND LIGHT SKIN DEFECTS |
| WO2015098111A1 (ja) * | 2013-12-26 | 2015-07-02 | 国立大学法人広島大学 | ｉＰＳ細胞の樹立方法および幹細胞の長期維持方法 |
| JP2015123079A (ja) * | 2013-12-26 | 2015-07-06 | 国立大学法人広島大学 | ｉＰＳ細胞の樹立方法および幹細胞の長期維持方法 |
| CN116396928A (zh) * | 2023-05-12 | 2023-07-07 | 细新(上海)医疗科技有限公司 | 一种原代成纤维细胞的培养体系、培养方法和应用 |
-
1992
- 1992-12-04 JP JP4351019A patent/JPH06169761A/ja active Pending
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0845963A4 (en) * | 1995-07-28 | 2000-11-02 | Isolagen Technologies Inc | USE OF AUTOLOGOUS DERMAL FIBROBLASTS FOR THE REPAIR OF SKIN AND LIGHT SKIN DEFECTS |
| EP1358857A1 (en) * | 1995-07-28 | 2003-11-05 | Isolagen International S.A. | The use of autologous dermal fibroblasts for the repair of skin and soft tissue defects |
| CN100349556C (zh) * | 1995-07-28 | 2007-11-21 | 埃索拉根技术有限公司 | 利用自身真皮成纤维细胞修补皮肤和软组织缺损 |
| US5916809A (en) * | 1996-03-22 | 1999-06-29 | Nec Corporation | Medium for culturing normal human epidermal melanocytes |
| WO2015098111A1 (ja) * | 2013-12-26 | 2015-07-02 | 国立大学法人広島大学 | ｉＰＳ細胞の樹立方法および幹細胞の長期維持方法 |
| JP2015123079A (ja) * | 2013-12-26 | 2015-07-06 | 国立大学法人広島大学 | ｉＰＳ細胞の樹立方法および幹細胞の長期維持方法 |
| CN116396928A (zh) * | 2023-05-12 | 2023-07-07 | 细新(上海)医疗科技有限公司 | 一种原代成纤维细胞的培养体系、培养方法和应用 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Peehl et al. | Growth and differentiation of human keratinocytes without a feeder layer or conditioned medium | |
| US5888816A (en) | Cell cultures of and cell culturing method for nontransformed pancreatic, thyroid, and parathyroid cells | |
| US4940666A (en) | Process and defined medium for growth of human epidermal keratinocyte cells | |
| US5866167A (en) | Non-viable total keratinocyte lysate for promoting wound healing | |
| US20060110825A1 (en) | Process for the preparation of stem cells from human muscle tissue and adipose tissue, and stem cell obtainable by this process | |
| EP2368974A1 (en) | Methods for isolating mesenchymal stem cells from embryos of human or animals and extracting secretion substances thereof | |
| JP2002529071A (ja) | 軟骨細胞様細胞のための無血清培地 | |
| US7037721B1 (en) | Protein-free defined media for the growth of normal human keratinocytes | |
| CN105267243B (zh) | 一种消除皮肤妊娠纹的干细胞提取物 | |
| EP0953633A1 (en) | Cell culturing method and medium for producing proliferated, normal, differentiated human liver cells | |
| Mattei et al. | Validated methods for isolation and qualification of mesenchymal stromal/stem cells from different sources | |
| WO2006005977A1 (en) | Novel method for culturing keratinocytes, melanocytes and fibroblasts for skin grafting | |
| CN114752554A (zh) | 一种含有天然化合物的无血清成肌分化培养基及应用 | |
| JPH06169761A (ja) | 動物由来線維芽細胞の無血清培養用培地及び培養方法 | |
| CN117625519B (zh) | 促肌肉干细胞体外存活和增殖的无胎牛血清培养基及其应用 | |
| CN111956668A (zh) | 一种皮肤再生修复细胞组合物及制备方法 | |
| JP7526405B2 (ja) | 頭皮組織由来の毛乳頭細胞の分離及び大量増殖方法 | |
| EP0350887A2 (en) | Serum-free medium and process for cultivating mammalian cells | |
| EP1337624B1 (de) | Zellkonstrukte erhältlich aus mesenchymalen stammzellen und davon ableitbaren zellen und ihre verwendung | |
| US6008047A (en) | Cell culturing method and medium | |
| CN114480272A (zh) | 一种用于脐带间充质干细胞培养的添加剂、培养基及其制备方法 | |
| JPH0732706B2 (ja) | 毛母細胞培養法 | |
| CN114276986A (zh) | 一种分离纯化水牛原代成肌细胞的方法及其应用 | |
| JPS63304978A (ja) | 上皮細胞の増殖法 | |
| JP2022140224A (ja) | 幹細胞凍結乾燥粉末の製造方法 |