JPH0732706B2 - 毛母細胞培養法 - Google Patents
毛母細胞培養法Info
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- JPH0732706B2 JPH0732706B2 JP2214181A JP21418190A JPH0732706B2 JP H0732706 B2 JPH0732706 B2 JP H0732706B2 JP 2214181 A JP2214181 A JP 2214181A JP 21418190 A JP21418190 A JP 21418190A JP H0732706 B2 JPH0732706 B2 JP H0732706B2
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、毛母細胞培養法、詳しくは、生理的な状態の
増殖・分化能力を有した毛母細胞を定常的に培養し得る
毛母細胞培養法に関する。
増殖・分化能力を有した毛母細胞を定常的に培養し得る
毛母細胞培養法に関する。
毛母細胞は毛の成長を支える基となる細胞であることか
ら、男性型脱毛症いわゆる若禿をはじめ種々の脱毛症の
改善を目的に、毛母細胞増殖促進物質の探索が広く行わ
れているが、本発明はこの探索に利用し得る。
ら、男性型脱毛症いわゆる若禿をはじめ種々の脱毛症の
改善を目的に、毛母細胞増殖促進物質の探索が広く行わ
れているが、本発明はこの探索に利用し得る。
従来、毛包組織中で毛母細胞は分裂速度が著しく高いこ
とから、毛母細胞の培養法としては、毛包組織を培養す
ることによって毛母細胞を培養する方法（器官培養法）
が用いられている。このような器官培養法としては、例
えば、Buhl,A,E,等の方法（J.Invest,Dermatol,92,315,
1989）などが知られている。
とから、毛母細胞の培養法としては、毛包組織を培養す
ることによって毛母細胞を培養する方法（器官培養法）
が用いられている。このような器官培養法としては、例
えば、Buhl,A,E,等の方法（J.Invest,Dermatol,92,315,
1989）などが知られている。
また、毛母細胞を単離培養する方法も従来より試みられ
ている。かかる方法としては、例えば、適当な方法によ
って単離した毛母細胞を、適当な塩類溶液（培養液）中
で培養する方法が知られている。また、この方法では成
育が悪いため、培養液中に牛胎児血清又は脳下垂体抽出
物などを添加して培養を行う方法が提案されている（特
開昭63−301785号公報）。
ている。かかる方法としては、例えば、適当な方法によ
って単離した毛母細胞を、適当な塩類溶液（培養液）中
で培養する方法が知られている。また、この方法では成
育が悪いため、培養液中に牛胎児血清又は脳下垂体抽出
物などを添加して培養を行う方法が提案されている（特
開昭63−301785号公報）。
しかしながら、上記器官培養法は、得られる細胞の量が
少ない、個体間の差が大きい、長期的に培養できないな
どの欠点があった。
少ない、個体間の差が大きい、長期的に培養できないな
どの欠点があった。
また、上記公報に記載された毛母細胞の単離培養方法
は、一定条件下で定常的に毛母細胞を培養し得るが、そ
の増殖率は低く、毛の成長を生理的に正しく反映したも
のとは言い難い。即ち、この方法は、毛包組織中の微小
環境の影響を複雑に受けつつ増殖する毛母細胞を、その
毛包組織から切り離しているため、生理的な状態の毛母
細胞の増殖が行えない欠点があった。
は、一定条件下で定常的に毛母細胞を培養し得るが、そ
の増殖率は低く、毛の成長を生理的に正しく反映したも
のとは言い難い。即ち、この方法は、毛包組織中の微小
環境の影響を複雑に受けつつ増殖する毛母細胞を、その
毛包組織から切り離しているため、生理的な状態の毛母
細胞の増殖が行えない欠点があった。
従って、本発明の目的は、生理的な状態の増殖・分化能
力を有した毛母細胞を定常的に培養し得る毛母細胞培養
法を提供することにある。
力を有した毛母細胞を定常的に培養し得る毛母細胞培養
法を提供することにある。
本発明は、上記目的を、毛母細胞を、毛乳頭細胞、毛乳
頭細胞を含有する細胞画分、又は毛乳頭細胞膜画分の存
在下に培養することを特徴とする毛母細胞培養法を提供
することにより達成したものである。
頭細胞を含有する細胞画分、又は毛乳頭細胞膜画分の存
在下に培養することを特徴とする毛母細胞培養法を提供
することにより達成したものである。
以下、本発明の毛母細胞培養法について詳述する。
本発明の培養対象である毛母細胞としては、その由来に
制限されるものではなく、ヒトに限らず毛髪を有する種
の毛母細胞であれば良く、またその部位、雌雄、齢、毛
髪の発育状態を問わず用いることができるが、好ましく
は齧類動物の新生児体毛から採取した毛母細胞を用い
る。材料からの毛母細胞調製法としては、外科的手法
（Jones,L.,N.,et al,J Invest Dermatol,90,58,198
8）、酸素処理を用いた手法（Rogers.G.,et al,J Inves
t Dermatol,89,369,1987;Green,M.,R.,et al,J Inuest
Dermatol,87,768,1986）等があるが、本発明においては
いずれの手法を用いても良い。
制限されるものではなく、ヒトに限らず毛髪を有する種
の毛母細胞であれば良く、またその部位、雌雄、齢、毛
髪の発育状態を問わず用いることができるが、好ましく
は齧類動物の新生児体毛から採取した毛母細胞を用い
る。材料からの毛母細胞調製法としては、外科的手法
（Jones,L.,N.,et al,J Invest Dermatol,90,58,198
8）、酸素処理を用いた手法（Rogers.G.,et al,J Inves
t Dermatol,89,369,1987;Green,M.,R.,et al,J Inuest
Dermatol,87,768,1986）等があるが、本発明においては
いずれの手法を用いても良い。
本発明の培養対象である毛母細胞は、例えば、次のよう
にして調製することができる。
にして調製することができる。
皮下組織等を取り除き、約3mm幅の短冊状に裁断した皮
膚をリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で洗浄した後、トリ
プシンなど蛋白質分解酵素溶液による化学的処理方法や
ピンセットなどによる物理的方法を組合せて表皮を剥離
除去し、真皮組織を得る。得られた真皮組織をコラゲナ
ーゼ溶液や核酸分解酵素で処理し、さらに物理的な方法
により細組織断片とし、濾過法により残存組織片を除去
した組織懸濁液を培地で洗浄する。
膚をリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で洗浄した後、トリ
プシンなど蛋白質分解酵素溶液による化学的処理方法や
ピンセットなどによる物理的方法を組合せて表皮を剥離
除去し、真皮組織を得る。得られた真皮組織をコラゲナ
ーゼ溶液や核酸分解酵素で処理し、さらに物理的な方法
により細組織断片とし、濾過法により残存組織片を除去
した組織懸濁液を培地で洗浄する。
この組織懸濁液をフィコール（Ficoll）やパーコール
（Percoll）等による密度勾配による遠心分離を行う。
この方法により、より下層に得られた細胞を毛母細胞と
して用いる。得られた細胞をさらに上記密度勾配遠心分
離機を繰り返し、より純度を高めることもできる。
（Percoll）等による密度勾配による遠心分離を行う。
この方法により、より下層に得られた細胞を毛母細胞と
して用いる。得られた細胞をさらに上記密度勾配遠心分
離機を繰り返し、より純度を高めることもできる。
また、本発明で用いられる毛乳頭細胞としては、毛母細
胞の場合と同様にその由来に制限されるものではなく、
種々の種属の毛乳頭細胞を用いることができ、また毛母
細胞と組織の由来を同一にする必要はなく、異なる種
間、部位であっても良い。上記毛乳頭細胞の調製法とし
ては、専ら外科的手法（Jahoda,C.,et al,Br J Dermato
l,105,623,1981:Katsuoka,K.,Arch Dermatol Res,279,2
0,1986）が用いられるが、真皮組織のコラゲナーゼ処理
等を用いた上記毛母細胞の調製と同様な手法によっても
代用できる。
胞の場合と同様にその由来に制限されるものではなく、
種々の種属の毛乳頭細胞を用いることができ、また毛母
細胞と組織の由来を同一にする必要はなく、異なる種
間、部位であっても良い。上記毛乳頭細胞の調製法とし
ては、専ら外科的手法（Jahoda,C.,et al,Br J Dermato
l,105,623,1981:Katsuoka,K.,Arch Dermatol Res,279,2
0,1986）が用いられるが、真皮組織のコラゲナーゼ処理
等を用いた上記毛母細胞の調製と同様な手法によっても
代用できる。
即ち、上記毛母細胞の調製における場合と同様にして調
製した組織懸濁液をフィコール（Ficoll）やパーコール
（Percoll）等による密度勾配による遠心分離を行うこ
とにより、より上層に得られた細胞を毛乳頭細胞又は該
細胞を含有する細胞画分として用いることができる。得
られた細胞をさらに上記密度勾配遠心分離を繰り返し、
より純度を高めることもできる。さらに、このようにし
て得られた細胞から一般的に用いられている細胞膜画分
調製法により得られた試料、即ち毛乳頭細胞膜画分も、
上記の毛乳頭細胞又は該細胞を含有する細胞画分と同じ
ように用いることができる。
製した組織懸濁液をフィコール（Ficoll）やパーコール
（Percoll）等による密度勾配による遠心分離を行うこ
とにより、より上層に得られた細胞を毛乳頭細胞又は該
細胞を含有する細胞画分として用いることができる。得
られた細胞をさらに上記密度勾配遠心分離を繰り返し、
より純度を高めることもできる。さらに、このようにし
て得られた細胞から一般的に用いられている細胞膜画分
調製法により得られた試料、即ち毛乳頭細胞膜画分も、
上記の毛乳頭細胞又は該細胞を含有する細胞画分と同じ
ように用いることができる。
而して本発明を実施するには、上記毛母細胞と、上記毛
乳頭細胞、上記毛乳頭細胞を含有する細胞画分、又は、
上記毛乳頭細胞膜画分とを、細胞数、蛋白質量又はDNA
量の比が好ましくは1:99〜99:1、より好ましくは、1:9
〜9:1の範囲で混合し培養する。培養は、いずれか一方
の細胞をあらかじめ培養し、他方を後から加えても良
く、またあらかじめ両者を混合しておき、同時に培養し
ても良い。
乳頭細胞、上記毛乳頭細胞を含有する細胞画分、又は、
上記毛乳頭細胞膜画分とを、細胞数、蛋白質量又はDNA
量の比が好ましくは1:99〜99:1、より好ましくは、1:9
〜9:1の範囲で混合し培養する。培養は、いずれか一方
の細胞をあらかじめ培養し、他方を後から加えても良
く、またあらかじめ両者を混合しておき、同時に培養し
ても良い。
培養方法としては、浮遊培養法、付着培養法、及び包埋
培養包等の通常の培養法を用いることができるが、コラ
ーゲン、寒天などの支持体を用いた包埋培養法が好まし
い。また、その培養条件としては、20〜38℃、０〜10％
CO2及び０〜95％O2含有気相下が好ましい。
培養包等の通常の培養法を用いることができるが、コラ
ーゲン、寒天などの支持体を用いた包埋培養法が好まし
い。また、その培養条件としては、20〜38℃、０〜10％
CO2及び０〜95％O2含有気相下が好ましい。
本発明の毛母細胞培養法によれば、生理的な状態の増殖
・分化能力を有した毛母細胞が定常的に培養される。
・分化能力を有した毛母細胞が定常的に培養される。
以下に実施例を挙げ、本発明をさらに詳しく説明する。
実施例１ 〔毛母細胞、毛乳頭細胞を得る方法〕 新生マウスを氷冷麻酔し、70％エタノールで皮膚を消毒
した。皮膚を採取し、皮下組織等を取り除いた後、約3m
m幅の短冊状に裁断した。この皮膚をPBSで洗浄した後、
0.125％のトリプシン溶液を用い、４℃下で一昼夜消化
した。トリプシン処理後、ピンセットで丁寧に表皮を剥
離除去して真皮組織を得た。得られた真皮組織をPBSで
洗浄した後、37℃下で0.25％コラゲナーゼ溶液で攪拌し
ながら処理した。さらに、DNaseI（5000単位）加え、ナ
イロン網（150M/S）に濾過することで残存組織片を除去
した組織懸濁液を液体培地（Medium199）で洗浄した。
した。皮膚を採取し、皮下組織等を取り除いた後、約3m
m幅の短冊状に裁断した。この皮膚をPBSで洗浄した後、
0.125％のトリプシン溶液を用い、４℃下で一昼夜消化
した。トリプシン処理後、ピンセットで丁寧に表皮を剥
離除去して真皮組織を得た。得られた真皮組織をPBSで
洗浄した後、37℃下で0.25％コラゲナーゼ溶液で攪拌し
ながら処理した。さらに、DNaseI（5000単位）加え、ナ
イロン網（150M/S）に濾過することで残存組織片を除去
した組織懸濁液を液体培地（Medium199）で洗浄した。
この組織懸濁液を10％（w/v）Ficoll 400での密度勾配
による遠心分離を行った。これにより、10％Ficoll上層
には毛乳頭細胞が、下層（沈澱物）には毛母細胞が、そ
れぞれ分離された。得られた沈澱物をさらに上記密度勾
配遠心分離を繰り返し、遠心処理（50g,4分）で二回洗
浄し、毛母細胞懸濁液を得た。一方、上層より回収され
た細胞は、洗浄した後、ステンレス網（200M/S）で濾過
し、毛乳頭細胞懸濁液を得た。
による遠心分離を行った。これにより、10％Ficoll上層
には毛乳頭細胞が、下層（沈澱物）には毛母細胞が、そ
れぞれ分離された。得られた沈澱物をさらに上記密度勾
配遠心分離を繰り返し、遠心処理（50g,4分）で二回洗
浄し、毛母細胞懸濁液を得た。一方、上層より回収され
た細胞は、洗浄した後、ステンレス網（200M/S）で濾過
し、毛乳頭細胞懸濁液を得た。
コラーゲン・ゲル溶液（Medium199で平衡化したもの）
２容に対し、上記毛母細胞懸濁液２容及び上記毛乳頭細
胞懸濁液１容を加えてよく攪拌し、マイクロ・ウエル・
プレートに植え込み、ゲルの硬化が観察されたところで
ゲルと同量のMedium199を添加した。これを５％CO2イン
キュベター内（37℃）で培養し、3H−チミジン取り込み
等による細胞増殖能の検討を行ったところ、各々組織単
独培養時に比べて、混合培養時の方が著しく高揚してい
た。
２容に対し、上記毛母細胞懸濁液２容及び上記毛乳頭細
胞懸濁液１容を加えてよく攪拌し、マイクロ・ウエル・
プレートに植え込み、ゲルの硬化が観察されたところで
ゲルと同量のMedium199を添加した。これを５％CO2イン
キュベター内（37℃）で培養し、3H−チミジン取り込み
等による細胞増殖能の検討を行ったところ、各々組織単
独培養時に比べて、混合培養時の方が著しく高揚してい
た。
実施例２ 〔混合比の検討〕 実施例１の混合培養法における毛母細胞と毛乳頭細胞と
の混合比を変えてコラーゲン・ゲル包埋培養を行った。
各細胞混合比での相対的細胞増殖能を下記第１表に示
す。
の混合比を変えてコラーゲン・ゲル包埋培養を行った。
各細胞混合比での相対的細胞増殖能を下記第１表に示
す。
上記第１表に示す結果から判るように、本発明の培養方
法は、毛母細胞と毛乳頭細胞との混合比を変化させるこ
とにより、培養下における毛母細胞の増殖促進率を調節
し得る。
法は、毛母細胞と毛乳頭細胞との混合比を変化させるこ
とにより、培養下における毛母細胞の増殖促進率を調節
し得る。
実施例３〔異種間混合培養〕 ラット真皮より毛乳頭細胞を、マウス真皮より毛母細胞
を調製し、これらの細胞を実施例１と同様にして混合培
養した。この場合のマウス由来の毛母細胞の増殖能を、
毛母細胞（マウス）を単独培養した場合の細胞増殖能を
基準とした増殖比により下記第２表に示す。また、下記
第２表には、毛母細胞及び毛乳頭細胞のいずれもマウス
由来のものを用いた場合の増殖比も併せて示す。
を調製し、これらの細胞を実施例１と同様にして混合培
養した。この場合のマウス由来の毛母細胞の増殖能を、
毛母細胞（マウス）を単独培養した場合の細胞増殖能を
基準とした増殖比により下記第２表に示す。また、下記
第２表には、毛母細胞及び毛乳頭細胞のいずれもマウス
由来のものを用いた場合の増殖比も併せて示す。
上記第２表に示す結果から判るように、本発明の培養法
は、種を隔てて活用できる。
は、種を隔てて活用できる。
実施例４〔毛乳頭細胞膜画分の利用〕 毛乳頭細胞膜懸濁液の代わりに３×104cellsの毛乳頭細
胞から得られた毛乳頭細胞膜画分を用いた以外は、実施
例１と同様にして混合培養した。この場合の細胞増殖能
（増殖比）を、毛乳頭細胞（３×104cells）を用いた場
合の増殖能と共に下記第３表に示す。
胞から得られた毛乳頭細胞膜画分を用いた以外は、実施
例１と同様にして混合培養した。この場合の細胞増殖能
（増殖比）を、毛乳頭細胞（３×104cells）を用いた場
合の増殖能と共に下記第３表に示す。
上記第３表に示す結果から判るように、本発明の培養方
法は、生きた毛乳頭細胞のみならず、該細胞より調製し
た膜画分を用いることもできる。
法は、生きた毛乳頭細胞のみならず、該細胞より調製し
た膜画分を用いることもできる。
本発明の毛母細胞培養法は、生理的な状態の増殖・分化
能力を有した毛母細胞を定常的に培養し得るため、育毛
剤開発研究や、毛包組織細胞相互作用など多方面にわた
る毛の基礎研究に利用され、毛の発生に関与し得る因子
をとらえ、永年未解決であった脱毛の機構の解明の手立
てとなる。
能力を有した毛母細胞を定常的に培養し得るため、育毛
剤開発研究や、毛包組織細胞相互作用など多方面にわた
る毛の基礎研究に利用され、毛の発生に関与し得る因子
をとらえ、永年未解決であった脱毛の機構の解明の手立
てとなる。
Claims (1)
- 【請求項１】毛母細胞を、毛乳頭細胞、毛乳頭細胞を含
有する細胞画分、又は毛乳頭細胞膜画分の存在下に培養
することを特徴とする毛母細胞培養法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2214181A JPH0732706B2 (ja) | 1990-08-13 | 1990-08-13 | 毛母細胞培養法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2214181A JPH0732706B2 (ja) | 1990-08-13 | 1990-08-13 | 毛母細胞培養法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0499482A JPH0499482A (ja) | 1992-03-31 |
| JPH0732706B2 true JPH0732706B2 (ja) | 1995-04-12 |
Family
ID=16651583
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2214181A Expired - Fee Related JPH0732706B2 (ja) | 1990-08-13 | 1990-08-13 | 毛母細胞培養法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0732706B2 (ja) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| USH1610H (en) * | 1993-12-03 | 1996-11-05 | The Procter & Gamble Company | Methods for culturing hair follicle epithelial matrix cells |
| FR2730744B1 (fr) * | 1995-02-17 | 1997-03-21 | Oreal | Test de matieres actives sur cheveux epiles |
| JP5164439B2 (ja) * | 2007-06-12 | 2013-03-21 | 株式会社 資生堂 | 毛乳頭細胞培養方法 |
| CN114891724A (zh) * | 2022-07-01 | 2022-08-12 | 南方医科大学南方医院 | 一种小鼠被毛毛囊毛乳头细胞提取方法 |
-
1990
- 1990-08-13 JP JP2214181A patent/JPH0732706B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0499482A (ja) | 1992-03-31 |
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