JPH06169772A - 固定化生体触媒及びその製造法 - Google Patents
固定化生体触媒及びその製造法Info
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- JPH06169772A JPH06169772A JP32348792A JP32348792A JPH06169772A JP H06169772 A JPH06169772 A JP H06169772A JP 32348792 A JP32348792 A JP 32348792A JP 32348792 A JP32348792 A JP 32348792A JP H06169772 A JPH06169772 A JP H06169772A
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Landscapes
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 シュードモナス プチダ (Pseudomonas puti
da) MR-2068 株又はエセリキア コリ (Escherichia co
li) MR-2103 株の菌体表面をグルタルアルデヒドなどで
架橋化処理したことを特徴とする固定化生体触媒。 【効果】 酵素活性の低下が見られない。また、微生物
菌体からのタンパク質溶出量も低減できる。このため、
本発明の固定化生体触媒をバイオリアクターによる有用
物質の生産に用いた場合、精製工程における大幅な操作
性の向上が期待できる。
da) MR-2068 株又はエセリキア コリ (Escherichia co
li) MR-2103 株の菌体表面をグルタルアルデヒドなどで
架橋化処理したことを特徴とする固定化生体触媒。 【効果】 酵素活性の低下が見られない。また、微生物
菌体からのタンパク質溶出量も低減できる。このため、
本発明の固定化生体触媒をバイオリアクターによる有用
物質の生産に用いた場合、精製工程における大幅な操作
性の向上が期待できる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、カルボン酸エステルを
不斉加水分解する反応に用いる固定化生体触媒に関す
る。
不斉加水分解する反応に用いる固定化生体触媒に関す
る。
【０００２】
【従来の技術】シュードモナス プチダ (Pseudomonas
putida) MR-2068 株及びエセリキアコリ (Escherichia
coli) MR-2103 株は、カルボン酸エステルを不斉加水分
解し、光学純度の高い光学活性カルボン酸を生成する酵
素を生産する微生物として提案されている (特開平1-22
2798号公報、特願平3-249923号参照) 。これらの微生物
が生産する酵素は耐熱性に優れており、産業上広い範囲
での応用が期待されている。
putida) MR-2068 株及びエセリキアコリ (Escherichia
coli) MR-2103 株は、カルボン酸エステルを不斉加水分
解し、光学純度の高い光学活性カルボン酸を生成する酵
素を生産する微生物として提案されている (特開平1-22
2798号公報、特願平3-249923号参照) 。これらの微生物
が生産する酵素は耐熱性に優れており、産業上広い範囲
での応用が期待されている。
【０００３】一方、固定化生体触媒応用技術は日進月歩
の進歩を遂げており、目的に応じて様々な固定化方法が
可能である。例えば、１) 水不溶性の担体に酵素を結合
させる方法、２) 酵素を２個又はそれ以上の官能基を持
った試薬で架橋する架橋法、３) 酵素を高分子ゲルの微
細な格子の中に包み込むか、半透膜性の高分子の皮膜に
よって被覆する包括法などである。微生物、オルガネラ
などの固定化についても本質的には酵素の固定化方法と
同様である。
の進歩を遂げており、目的に応じて様々な固定化方法が
可能である。例えば、１) 水不溶性の担体に酵素を結合
させる方法、２) 酵素を２個又はそれ以上の官能基を持
った試薬で架橋する架橋法、３) 酵素を高分子ゲルの微
細な格子の中に包み込むか、半透膜性の高分子の皮膜に
よって被覆する包括法などである。微生物、オルガネラ
などの固定化についても本質的には酵素の固定化方法と
同様である。
【０００４】バイオリアクターにより有用物質を生産す
る場合、酵素反応終了液からの有用物質の精製におい
て、溶媒抽出、再結晶、カラムクロマトグラフィーによ
る精製などが通常行われる。これらの工程において菌体
から溶出した変性タンパク質の存在はしばしば問題とな
る。例えば、反応終了液から目的物を溶媒で抽出する
時、エマルジョンが生成し、抽出不能となることが多々
ある。これらの問題点を回避するため、タンパク質の溶
出を防止した固定化生体触媒の使用が有効である場合が
多い。
る場合、酵素反応終了液からの有用物質の精製におい
て、溶媒抽出、再結晶、カラムクロマトグラフィーによ
る精製などが通常行われる。これらの工程において菌体
から溶出した変性タンパク質の存在はしばしば問題とな
る。例えば、反応終了液から目的物を溶媒で抽出する
時、エマルジョンが生成し、抽出不能となることが多々
ある。これらの問題点を回避するため、タンパク質の溶
出を防止した固定化生体触媒の使用が有効である場合が
多い。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、シュードモ
ナス プチダ (Pseudomonas putida) MR-2068 株又はエ
セリキア コリ (Escherichia coli) MR-2103 株を用い
た有用物質の生産に用いる固定化生体触媒及びその製造
法を提供することを目的とする。
ナス プチダ (Pseudomonas putida) MR-2068 株又はエ
セリキア コリ (Escherichia coli) MR-2103 株を用い
た有用物質の生産に用いる固定化生体触媒及びその製造
法を提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明の固定化生体触媒
は、シュードモナス プチダ (Pseudomonas putida)MR-
2068 株又はエセリキア コリ (Escherichia coli) MR-
2103 株の培養菌体を架橋化処理したことを特徴とする
ものである。更に、本発明の固定化生体触媒の製造法
は、シュードモナス プチダ (Pseudomonas putida) MR
-2068 株又はエセリキア コリ (Escherichia coli) MR
-2103株の培養菌体を、グルタルアルデヒドを用いて架
橋化処理することを特徴とするものである。
は、シュードモナス プチダ (Pseudomonas putida)MR-
2068 株又はエセリキア コリ (Escherichia coli) MR-
2103 株の培養菌体を架橋化処理したことを特徴とする
ものである。更に、本発明の固定化生体触媒の製造法
は、シュードモナス プチダ (Pseudomonas putida) MR
-2068 株又はエセリキア コリ (Escherichia coli) MR
-2103株の培養菌体を、グルタルアルデヒドを用いて架
橋化処理することを特徴とするものである。
【０００７】本発明に使用されるシュードモナス プチ
ダ (Pseudomonas putida) MR-2068株及びエセリキア
コリ (Escherichia coli) MR-2103 株は、工業技術院微
生物工業技術研究所に、それぞれ微工研条寄第３８４６
号及び微工研条寄第３８３５号として寄託されている。
本発明に使用されるシュードモナス プチダ (Pseudomo
nas putida) MR-2068株及びエセリキア コリ (Escheri
chia coli) MR-2103 株の培養は、液体培養でも固体培
養でも行うことができる。培地としては、微生物が通常
資化し得る炭素源、窒素源、ビタミン、ミネラルなどの
成分を適宜配合したものが用いられる。培養は、微生物
が生育可能である温度及びpHで行われるが、通常50℃以
下の温度で、pH２〜11の範囲で行われる。微生物の生育
を促進させるため、通気攪拌を行ってもよい。
ダ (Pseudomonas putida) MR-2068株及びエセリキア
コリ (Escherichia coli) MR-2103 株は、工業技術院微
生物工業技術研究所に、それぞれ微工研条寄第３８４６
号及び微工研条寄第３８３５号として寄託されている。
本発明に使用されるシュードモナス プチダ (Pseudomo
nas putida) MR-2068株及びエセリキア コリ (Escheri
chia coli) MR-2103 株の培養は、液体培養でも固体培
養でも行うことができる。培地としては、微生物が通常
資化し得る炭素源、窒素源、ビタミン、ミネラルなどの
成分を適宜配合したものが用いられる。培養は、微生物
が生育可能である温度及びpHで行われるが、通常50℃以
下の温度で、pH２〜11の範囲で行われる。微生物の生育
を促進させるため、通気攪拌を行ってもよい。
【０００８】一方、本発明に使用できる架橋試薬は、特
にその種類が限定されるものではなく、シッフ塩基をつ
くるグルタルアルデヒド、ペプチド結合をするイソシア
ン酸誘導体、Ｎ, Ｎ'-エチレンビスマレイミド、ジアゾ
カップリングをするビスジアゾベンジジン、アルキル化
するＮ, Ｎ'-ポリメチレンビスヨードアセトアミドなど
が使用可能である。
にその種類が限定されるものではなく、シッフ塩基をつ
くるグルタルアルデヒド、ペプチド結合をするイソシア
ン酸誘導体、Ｎ, Ｎ'-エチレンビスマレイミド、ジアゾ
カップリングをするビスジアゾベンジジン、アルキル化
するＮ, Ｎ'-ポリメチレンビスヨードアセトアミドなど
が使用可能である。
【０００９】本発明の固定化生体触媒の製造に用いる生
体触媒の形態は、培養終了液、湿菌体、乾燥菌体（例え
ば凍結乾燥菌体）、噴霧乾燥菌体又は有機溶媒（例えば
アセトン、トルエン等）で処理した菌体を用いることが
できる。製造法としては、通常の方法が適用でき、例え
ば、培養した菌体をpH緩衝液又は生理食塩水に懸濁し、
これに架橋試薬を添加し、架橋化させて固定化生体触媒
とする方法が使用可能である。
体触媒の形態は、培養終了液、湿菌体、乾燥菌体（例え
ば凍結乾燥菌体）、噴霧乾燥菌体又は有機溶媒（例えば
アセトン、トルエン等）で処理した菌体を用いることが
できる。製造法としては、通常の方法が適用でき、例え
ば、培養した菌体をpH緩衝液又は生理食塩水に懸濁し、
これに架橋試薬を添加し、架橋化させて固定化生体触媒
とする方法が使用可能である。
【００１０】架橋試薬としてグルタルアルデヒドを用い
る場合、その添加量は菌体乾燥重量に対して通常0.１〜
10.0％ (重量％) の範囲で添加することができるが、0.
5 〜5.0 ％ (重量％) の範囲で添加することが望まし
い。架橋化処理温度は通常５〜70℃の範囲で可能である
が、60℃以上の温度で処理することにより菌体の同時殺
菌が可能であり、非耐熱酵素を失活させることも可能で
ある。
る場合、その添加量は菌体乾燥重量に対して通常0.１〜
10.0％ (重量％) の範囲で添加することができるが、0.
5 〜5.0 ％ (重量％) の範囲で添加することが望まし
い。架橋化処理温度は通常５〜70℃の範囲で可能である
が、60℃以上の温度で処理することにより菌体の同時殺
菌が可能であり、非耐熱酵素を失活させることも可能で
ある。
【００１１】架橋化処理時間は通常10分から５時間の範
囲で可能であるが、１時間以上処理することが望まし
い。固定化生体触媒は溶液状態又は凍結乾燥などによる
乾燥状態で使用可能である。このように本発明の固体化
生体触媒は調製方法が極めて簡単であり、この固定化生
体触媒をバイオリアクターによる有用物質生産に用いた
場合、反応液中への酵素の流出を最小限に防ぐことがで
きるため、精製工程における操作性の大幅な向上が期待
できる。
囲で可能であるが、１時間以上処理することが望まし
い。固定化生体触媒は溶液状態又は凍結乾燥などによる
乾燥状態で使用可能である。このように本発明の固体化
生体触媒は調製方法が極めて簡単であり、この固定化生
体触媒をバイオリアクターによる有用物質生産に用いた
場合、反応液中への酵素の流出を最小限に防ぐことがで
きるため、精製工程における操作性の大幅な向上が期待
できる。
【００１２】
【実施例】以下、実施例により本発明を更に具体的に説
明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定される
ものではない。
明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定される
ものではない。
【００１３】
【実施例１】 （１）固定化生体触媒の調製 シュードモナス プチダ (Pseudomonas putida) MR-206
8 株 (微工研条寄第３８４６号) を肉エキス0.5 ％、ペ
プトン0.75％、NaCl 0.25 ％、グルコース0.5％、マル
トエキス0.15％からなる液体培地 (pH6.8) 100mlに植菌
し、30℃で１日間振とう培養を行った。培養終了後、培
養液を遠心分離し、得られた菌体の全量をイオン交換水
で洗浄した後、約10mlのＭ／20燐酸緩衝液に懸濁した。
この菌体懸濁液に菌体の乾燥重量に対して０〜5.0 ％各
濃度となるようにグルタルアルデヒド溶液を添加し、60
℃に昇温後、約１時間攪拌した。得られた菌体懸濁液を
固定化菌体溶液とした。 （２）残存活性及びタンパク質溶出濃度の測定 Ｍ／20燐酸緩衝液20mlに固定化菌体16mgを含む固定化菌
体溶液を添加し、カルボン酸エステルの加水分解活性を
測定した。また、上清中の溶出タンパク質濃度を Folin
-Lowry法で測定した。結果を表１に示す。いずれも未処
理のものを100％とした。
8 株 (微工研条寄第３８４６号) を肉エキス0.5 ％、ペ
プトン0.75％、NaCl 0.25 ％、グルコース0.5％、マル
トエキス0.15％からなる液体培地 (pH6.8) 100mlに植菌
し、30℃で１日間振とう培養を行った。培養終了後、培
養液を遠心分離し、得られた菌体の全量をイオン交換水
で洗浄した後、約10mlのＭ／20燐酸緩衝液に懸濁した。
この菌体懸濁液に菌体の乾燥重量に対して０〜5.0 ％各
濃度となるようにグルタルアルデヒド溶液を添加し、60
℃に昇温後、約１時間攪拌した。得られた菌体懸濁液を
固定化菌体溶液とした。 （２）残存活性及びタンパク質溶出濃度の測定 Ｍ／20燐酸緩衝液20mlに固定化菌体16mgを含む固定化菌
体溶液を添加し、カルボン酸エステルの加水分解活性を
測定した。また、上清中の溶出タンパク質濃度を Folin
-Lowry法で測定した。結果を表１に示す。いずれも未処
理のものを100％とした。
【００１４】
【表１】
【００１５】
【実施例２】 （１）固定化生体触媒の調製 エセリキア コリ (Escherichia coli) MR-2103 株 (微
工研条寄第３８３５号) を肉エキス0.5 ％、ペプトン1.
0 ％、NaCl 0.5％を含む液体培地 (pH7.0) 100mlに植菌
し、37℃で１日間振とう培養を行った。培養終了後、培
養液を遠心分離し、得られた菌体の全量をイオン交換水
で洗浄した後、約10mlのＭ／20燐酸緩衝液に懸濁した。
この菌体懸濁液に菌体の乾燥重量に対して０〜5.0 ％各
濃度となるようにグルタルアルデヒド溶液を添加し、60
℃に昇温後、約１時間攪拌した。得られた菌体懸濁液を
固定化菌体溶液とした。 （２）残存活性及びタンパク質溶出濃度の測定 Ｍ／20燐酸緩衝液20mlに固定化菌体16mgを含む固定化菌
体溶液を添加し、カルボン酸エステルの加水分解活性を
測定した。また、上清中の溶出タンパク質濃度を Folin
-Lowry法で測定した。結果を表２に示す。いずれも未処
理のものを100％とした。
工研条寄第３８３５号) を肉エキス0.5 ％、ペプトン1.
0 ％、NaCl 0.5％を含む液体培地 (pH7.0) 100mlに植菌
し、37℃で１日間振とう培養を行った。培養終了後、培
養液を遠心分離し、得られた菌体の全量をイオン交換水
で洗浄した後、約10mlのＭ／20燐酸緩衝液に懸濁した。
この菌体懸濁液に菌体の乾燥重量に対して０〜5.0 ％各
濃度となるようにグルタルアルデヒド溶液を添加し、60
℃に昇温後、約１時間攪拌した。得られた菌体懸濁液を
固定化菌体溶液とした。 （２）残存活性及びタンパク質溶出濃度の測定 Ｍ／20燐酸緩衝液20mlに固定化菌体16mgを含む固定化菌
体溶液を添加し、カルボン酸エステルの加水分解活性を
測定した。また、上清中の溶出タンパク質濃度を Folin
-Lowry法で測定した。結果を表２に示す。いずれも未処
理のものを100％とした。
【００１６】
【表２】
【００１７】
【発明の効果】本発明の固定化生体触媒は、菌体表面を
架橋処理されているため、酵素活性の低下が見られな
い。また、微生物菌体からのタンパク質溶出量も未処理
のものに比較して1/3 以下に低減することが可能であ
る。このため、本発明の固定化生体触媒をバイオリアク
ターによる有用物質の生産に用いた場合、精製工程にお
ける大幅な操作性の向上が期待できる。
架橋処理されているため、酵素活性の低下が見られな
い。また、微生物菌体からのタンパク質溶出量も未処理
のものに比較して1/3 以下に低減することが可能であ
る。このため、本発明の固定化生体触媒をバイオリアク
ターによる有用物質の生産に用いた場合、精製工程にお
ける大幅な操作性の向上が期待できる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 41/00 Ｃ１２Ｒ 1:40） (Ｃ１２Ｐ 41/00 Ｃ１２Ｒ 1:19）
Claims (2)
- 【請求項１】 シュードモナス プチダ (Pseudomonas
putida) MR-2068 株又はエセリキア コリ (Escherichi
a coli) MR-2103 株の培養菌体を架橋化処理したことを
特徴とする固定化生体触媒。 - 【請求項２】 シュードモナス プチダ (Pseudomonas
putida) MR-2068 株又はエセリキア コリ (Escherichi
a coli) MR-2103 株の培養菌体を、グルタルアルデヒド
を用いて架橋化処理することを特徴とする請求項１記載
の固定化生体触媒の製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP32348792A JPH06169772A (ja) | 1992-12-02 | 1992-12-02 | 固定化生体触媒及びその製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP32348792A JPH06169772A (ja) | 1992-12-02 | 1992-12-02 | 固定化生体触媒及びその製造法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06169772A true JPH06169772A (ja) | 1994-06-21 |
Family
ID=18155242
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP32348792A Pending JPH06169772A (ja) | 1992-12-02 | 1992-12-02 | 固定化生体触媒及びその製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH06169772A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6673582B2 (en) | 2000-01-25 | 2004-01-06 | Regents Of The University Of Minnesota | Microbes and methods for remediation |
| US6825001B2 (en) | 1997-01-17 | 2004-11-30 | Regents Of The University Of Minnesota | DNA molecules and protein displaying improved triazine compound degrading ability |
-
1992
- 1992-12-02 JP JP32348792A patent/JPH06169772A/ja active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6825001B2 (en) | 1997-01-17 | 2004-11-30 | Regents Of The University Of Minnesota | DNA molecules and protein displaying improved triazine compound degrading ability |
| US6673582B2 (en) | 2000-01-25 | 2004-01-06 | Regents Of The University Of Minnesota | Microbes and methods for remediation |
| US6919199B2 (en) | 2000-01-25 | 2005-07-19 | Regents Of The University Of Minnesota | Microbes and methods for remediation |
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