JPH06169792A - 非ａ非ｂ型肝炎ウイルス非構造領域ｎｓ３に対するモノクローナル抗体、これを産生するハイブリドーマ並びに該モノクローナル抗体を用いる該ウイルス抗原の測定及び精製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス非構造領域ＮＳ３ポ
リペプチド抗原上のエピトープに特異的に結合するモノ
クローナル抗体、これを産生するハイブリドーマ、並び
にこのモノクローナル抗体を用いる該ウイルス抗原の測
定及び精製方法。 【効果】 ウイルス抗原の検出、定量を、高感度、高精
度かつ高い特異性で実施し得る。また、ウイルス抗原の
精製にも有効に使用し得る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、非Ａ非Ｂ型肝炎ウイル
ス関連抗原に対するモノクローナル抗体、さらに具体的
には、非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス非構造領域ＮＳ−３に対
するモノクローナル抗体に関する。本発明はまた、この
ようなモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマに
関する。本発明はさらに、該モノクローナル抗体を用い
る非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルスの免疫学的測定方法及び精製
方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルスは、Ａ型肝炎ウ
イルス、Ｂ型肝炎ウイルスと異なるウイルスで、このウ
イルスの感染により、一部は慢性肝炎から肝硬変、肝癌
へと移行することが知られており、その生化学的及び生
理学的機能について大きな関心が持たれている。

【０００３】非Ａ非Ｂ型肝炎の診断に関しては、初期に
は、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎及びＤ型肝炎、さらには肝障害
を引き起こす既知のウイルス（例えば、サイトメガロウ
イルスやエプスタイン−バーウイルス）による肝炎か否
かの診断を行った後、これらに該当しない場合に非Ａ非
Ｂ型肝炎と診断する、いわゆる除外診断法が主流であっ
た。その後、診断確度の向上をはかる方法として、非Ａ
非Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子を遺伝子工学的に発現して得
られた蛋白質を抗原とする抗体検出法及び遺伝子増幅法
（ＰＣＲ）やＤＮＡプローブ法による該ウイルス遺伝子
の存在を確認する遺伝子検出法が開発された。

【０００４】非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルスにおいては、患者
体内でのウイルス粒子、従って、ウイルス抗原量が極め
て少なく、かつ、変異を起こし易いために、その正体は
今もって不明であるが、とりわけ上記技術が非Ａ非Ｂ型
肝炎の診断の有効な手段となっている。

【０００５】このような状況の中で、該ウイルスに対す
るポリクローナル又はモノクローナル抗体を用いるウイ
ルス検出も注目されつつある。例えば、国際出願公開第
ＷＯ９２／０７００１号明細書（ＡＢＢＯＴＴ ＬＡＢ
ＯＲＡＴＯＲＩＥＳ）には、非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス抗
原と選択的に結合できる抗体の具体例として、Ｃｈｉｒ
ｏｎ Ｃ−１００タンパク質（ＮＳ４領域；欧州特許出
願公開第０３１８２１６号）に対するモノクローナル抗
体が開示されている。また、同一出願人による国際出願
公開第ＷＯ９２／０８７３８号明細書には、非Ａ非Ｂ型
肝炎ウイルスＣ−１００タンパク質（ＮＳ４領域）、３
３Ｃタンパク質（ＮＳ３領域）又はＣＯＲＥタンパク質
に特異的に結合するモノクローナル抗体が記載されてい
る。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】前述したように、非Ａ
非Ｂ型肝炎ウイルスは、その感染患者体内では、ウイル
ス粒子自体が極めて少ないうえに、ＲＮＡウイルス種で
一般的に観察される高度の変異を起こすことが知られて
いる。そのため、患者血中に含まれる該ウイルス関連抗
原に対する抗体量も少ないと予想され、より高い診断確
度の必要性が望まれていた。

【０００７】このような状況下において、非Ａ非Ｂ型肝
炎ウイルス関連抗原に対する特異抗体、特にモノクロー
ナル抗体が開発されたならば、その高度の特異性のため
に、血中の該ウイルス存在に対する分析信頼度がさらに
向上することが期待される。

【０００８】さらに、一般的に、モノクローナル抗体
は、遺伝子工学技術により発現されたペプチドの精製技
術にも応用することが可能であり、非Ａ非Ｂ型肝炎ウイ
ルス分野においても、発現ペプチドの精製に適用可能な
モノクローナル抗体の開発が望まれていた。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明は、配列番号１に
示されるアミノ酸配列を有する非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス
非構造領域ＮＳ３ポリペプチド抗原上のエピトープに特
異的に結合するモノクローナル抗体を提供する。

【００１０】配列番号１に示されるポリペプチドは、該
ウイルスゲノムの非構造ＮＳ３領域の一部として、本出
願人が決定したアミノ酸配列を有するが（特願平３−１
８９２６８号）、上記のＷＯ９２／０８７３８に開示さ
れるＨＣＶ３３Ｃタンパク質とは明らかに異なるもので
ある。したがって、本発明のモノクローナル抗体は新規
である。

【００１１】本発明のモノクローナル抗体には、配列番
号１に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド抗原
上の任意のエピトープに特異的に結合可能な全ての抗体
が包含される。本発明の実施態様により、そのようなモ
ノクローナル抗体の具体例として、モノクローナル抗体
１Ｈ１０、２Ｆ４、３Ｆ９、１Ｇ６及び３Ｄ３が挙げら
れる。これらの抗体のイソタイプはいずれもＩｇＧ１で
あった。また、本発明抗体は、血清中のＮＳ３抗体とＮ
Ｓ３抗原の反応を阻害することが可能である。

【００１２】本発明のモノクローナル抗体は、配列番号
１に示されるアミノ酸配列の全部又は一部を有するポリ
ペプチドを免疫抗原として免疫した哺乳動物の形質細胞
（免疫細胞）を、哺乳動物の形質細胞腫細胞と融合させ
てハイブリドーマを作製し、これより前記抗原のみを特
異的に認識する抗体を産生するクローンを選択し、この
クローンから得ることができる。

【００１３】ここで、被免疫哺乳動物としては、特に限
定されないが、細胞融合に使用する形質細胞腫細胞との
適合性を考慮して選択することが好ましく、一般にはマ
ウス、ラット等が有利に使用される。また、免疫は、一
般的方法により、例えば、免疫抗原を哺乳動物の腹腔
内、皮下又は静脈内に投与することにより行われる。よ
り具体的には、ポリペプチドを生理的リン酸緩衝液（Ｐ
ＢＳ）又は、生理的食塩水等で適当な濃度に希釈し、こ
れを必要に応じて、通常のアジュバントを併用して動物
に数回投与する。免疫細胞としては、前記、非Ａ非Ｂ型
肝炎ウイルスの非構造領域の一部（ＮＳ−３）のポリペ
プチドの最終投与の約３日後に摘出した脾細胞を使用す
るのが好ましい。免疫細胞と融合される他方の親細胞と
しての哺乳動物の形質細胞腫（細胞）としては、すでに
公知の種々の細胞株、たとえばマウスにおけるＰ３（Ｐ
３／Ｘ６３Ａｇ８）［Ｎａｔｕｒｅ ２５６，４９５−
４９７（１９７５）］、Ｐ３−Ｕ１［Ｃｕｒｒｅｎｔ
Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｇｙ ａｎｄ
Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ８１， １−７（１９８
７）］、ＮＳ−１［Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６，
５１１−５１９（１９７６）］、ＳＰ２／０［Ｎａｔ
ｕｒｅ ２７６， ２６９−２７０（１９８０）］、Ｆ
Ｏ［Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．３５， １−２１
（１９８０）］、Ｘ６３−６、５、３、［Ｊ．Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ．１２３， １５４８−１５５０（１９７
９）］、Ｓ１９４［Ｊ．ＥＸＰ．Ｍｅｄ．１４８， ３
１３−３２３（１９７８）］等、また、ラットにおける
Ｒ２１０［Ｎａｔｕｒｅ ２７７， １３１−１３３
（１９７９）］等の骨髄腫（細胞）が使用される。

【００１４】前記免疫細胞と形質細胞腫との融合反応
は、基本的には公知の方法、例えば、Ｍｉｌｓｔｅｉｎ
らの方法［Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．７３，
３−４６（１９８１）］等に準じて行い得る。

【００１５】具体的には前記融合反応は、たとえば融合
促進剤の存在下に通常の栄養培地中で行われる。融合促
進剤としては通常用いられるもの、たとえばポリエチレ
ングリコール（ＰＥＧ）及びセンダイウイルス（ＨＶ
Ｊ）等が使用され、さらに融合効率を高めるためにジメ
チルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）等の補助剤を添加使用
することもできる。免疫細胞と形質細胞腫細胞との混合
比は、通常の方法と変わりがなく、たとえば、形質細胞
腫細胞に対し、免疫細胞を約１〜１０倍程用いればよ
い。

【００１６】前記融合時の培地としては、たとえば前記
形質細胞腫細胞株の増殖に使用されるＲＰＭＩ−１６４
０培地あるいはＭＥＭ培地など、この種の細胞の培養に
使用される通常の各種培地を利用でき、通常は、牛胎児
血清（ＦＣＳ）等の血清補液を除いておくのがよい。融
合は、前記免疫細胞と形質細胞腫細胞との所定量を前記
培地中でよく混合し、あらかじめ３７℃程度に加温した
ＰＥＧ溶液、たとえば平均分子量１０００〜６０００程
度のものを、通常培地に約３０〜６０％（ｗ／ｖ）の濃
度で加えて混ぜ合わせることにより行われる。以後、適
当な培地を逐次添加して遠心し、上清を除去する操作を
繰り返すことにより、所望のハイブリドーマが形成され
る。

【００１７】ハイブリドーマの分離は、通常の選別用培
地、たとえばヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミ
ジンを含む培地（ＨＡＴ培地）で培養することにより行
われる。該ＨＡＴ培地での培養は、目的とするハイブリ
ドーマ以外の細胞（未融合細胞等）が死滅するのに充分
な時間、通常数日〜数週間行えばよい。

【００１８】かくして得られるハイブリドーマについ
て、通常の限界希釈法に従い、目的とする抗体の産生株
の検索及び単一クローン化が行われる。

【００１９】該産生株の検索は、たとえばＥＬＩＳＡ
法、凝集反応法、オクタロニー法、プラーク法、スポッ
ト法及びラジオイムノアッセイ法等の一般に抗体の検出
に用いられている種々の方法に従って行われる。

【００２０】かくして得られる所望のモノクローナル抗
体を産生するハイブリドーマは、通常の培地で継代培養
でき、また液体窒素中で長期間保存可能である。

【００２１】該ハイブリドーマからの本発明モノクロー
ナル抗体の採取は、該ハイブリドーマを常法に従って培
養し、その培養上清として、あるいはハイブリドーマを
これと適合性のある哺乳動物に投与して増殖させ、その
腹水として得る方法が採用される。さらに、前記により
得られる抗体は、塩析法、ゲル濾過法、アフィニティー
クロマトグラフィー等の通常の精製手段により精製する
こともできる。

【００２２】従って、本発明はまた、配列番号１に示さ
れるアミノ酸配列を有する非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス非構
造領域ＮＳ３ポリペプチド抗原上のエピトープに特異的
に結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドー
マを提供する。

【００２３】ハイブリドーマの具体例として、ハイブリ
ドーマＨＣ７−１Ｈ１０、ＨＣ７−２Ｆ４、ＨＣ７−３
Ｆ９、ＨＣ７−１Ｇ６及びＨＣ７−３Ｄ３を挙げること
ができ、それぞれ、モノクローナル抗体１Ｈ１０、２Ｆ
４、３Ｆ９、１Ｇ６及び３Ｄ３を産生する。これらハイ
ブリドーマは試験例１に示す方法を用いることにより、
配列番号１に示されるアミノ酸配列の一部を特異的に認
識するモノクローナル抗体である。

【００２４】

【表１】 ハイブリドーマ 認識部位 ＨＣ７−１Ｈ１０ ⁹⁴Ｍｅｔ……… ²²¹Ｍｅｔ ＨＣ７−２Ｆ４ ²²¹Ｍｅｔ…… ²⁵³Ｇｌｕ ＨＣ７−３Ｆ９ ⁹⁴Ｍｅｔ……… ²⁵³Ｇｌｕ ＨＣ７−１Ｇ６ ⁹⁴Ｍｅｔ……… ²⁵³Ｇｌｕ ＨＣ７−３Ｄ３ ⁴⁹Ｓｅｒ……… ²²¹Ｍｅｔ 特に、ハイブリドーマＨＣ７−１Ｈ１０、ＨＣ７−２Ｆ
４、ＨＣ７−３Ｆ９及びＨＣ７−３Ｄ３は、平成４年１
２月１日付で微生物工業技術研究所に寄託され、受託番
号として、それぞれ微工研菌寄第１３３１６号、第１３
３１３号、第１３３１５号、及び第１３３１４号が付与
されている。

【００２５】本発明はまた、上記モノクローナル抗体を
用いる非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス関連抗原の免疫学的測定
方法を提供する。

【００２６】具体的には、この方法は、該抗原を含むと
予想される検体（例えば、血液）と上記定義の１種又は
それ以上のモノクローナル抗体とを接触させ、抗原−抗
体複合体を形成した後、該複合体を検出又は定量するこ
とを包含する。検出又は定量は、慣用的手段、例えば、
放射免疫測定法（ＲＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩ
Ａ）、凝集法などで実施し得、固相法及びホモジニアス
法のいずれも使用できる。本発明方法により、高感度、
高精度かつ高い特異性をもって非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス
非構造領域ＮＳ３由来のポリペプチドを、簡易に測定す
ることができる。

【００２７】本発明はさらに、上記定義のモノクローナ
ル抗体を用いる非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス関連抗原の精製
方法を提供する。

【００２８】具体的には、この方法は、該モノクローナ
ル抗体を天然または合成高分子担体に結合してアフィニ
ティカラムを形成し、該カラム中に非Ａ非Ｂ型肝炎ウイ
ルス関連抗原を含有する液体（例えば、血液や培養菌体
抽出液）を通過させて該抗原を該抗体に結合し、その
後、目的の抗原をカラムから溶離することを包含する。
ここで、好適な担体としてアガロースゲル、セファロー
スなどが挙げられ、また、溶離液として酸性グリシン−
塩酸緩衝液、界面活性剤含有ＰＢＳ等を使用し得る。抗
体カラムの作製にあたっては、慣用的なＣＮＢｒ活性化
アガロースゲルの使用が便利である。

【００２９】上記方法により、非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス
非構造領域ＮＳ３ポリペプチド抗原を簡易かつ特異的に
精製可能である。

【００３０】

【実施例】本発明を以下の非限定的実施例を参照してさ
らに具体的に説明する。

【００３１】実施例 １）非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス非構造領域（ＮＳ３）ポリ
ペプチドの作製 目的の組換えペプチドの調製においては、本出願人の特
願平３−１８９２６８号に記載の方法を使用した。即
ち、ベクターｐＢＲ３２２を制限酵素ＨａｅIIで処理し
たｐＡＩ１５３にトリプトファンオペロンプロモータ
ー、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のタンパク質（アントラニル酸合
成酵素）断片をコードする遺伝子及び日本人慢性肝炎患
者血清より抽出されたウイルスｍＲＮＡからランダムプ
ライマー法によりｃＤＮＡを合成し、λｇｔ II ファー
ジでクローニングして非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルスの非構造
タンパク質をコードする目的ｃＤＮＡを順次組み込み、
発現ベクターを構築し、この発現ベクターを、塩化カル
シウムによって感受性を付与した宿主Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ
１２株由来のＣ６００株に導入し、組換え体を得た。そ
の組換え体を培養し、超音波細胞破砕機で菌体破砕し、
抽出したタンパク質をカラムクロマトグラフィー法によ
り精製した。

【００３２】２）ハイブリドーマの製造 前記の方法により得た各非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス非構造
領域ＮＳ３ペプチドを生理食塩水に溶解し、１．０mg／
mlとし、等量のフロインド完全アジュバントと混和し、
懸濁させた。得られた懸濁液の前記非Ａ非Ｂ型肝炎ウイ
ルス非構造領域ＮＳ３ペプチド０．０１〜０．０５mg含
有分を４〜６週令のＢＡＬＢ／ｃ系マウスに腹腔内投与
した。約８週間後、免疫化動物に前記と同じ濃度の非Ａ
非Ｂ型肝炎ウイルス非構造領域ＮＳ３ペプチドの生理的
食塩水溶液０．００５〜０．０３mg含有分を尾静脈内に
投与し、投与３日後、免疫動物より無菌的に脾臓を摘出
した。

【００３３】次に、メッシュを用いて脾臓を個々の細胞
にほぐし、ＲＰＭＩ−１６４０培地で３回洗浄した。８
−アザグアニン存在下で数日間培養し、復帰突然変異体
を完全に除いた対数増殖期のマウス骨髄腫細胞株Ｐ３Ｘ
６３Ａｇ８［Ｎａｔｕｒｅ２５６， ４９５−４９７
（１９７５）］を前記と同様に洗浄後、その１．８×１
０⁷ 個と前記脾臓細胞１．０×１０⁸ 個とを５０ml遠心
管に入れ混合した。２００×ｇ、５分遠心後、上清を除
去し、３７℃に保温したＰＥＧ４０００（Ｍｅｒｃｋ）
５０％を含むＲＰＭＩ−１６４０培地１mlを加えて細胞
融合させた。

【００３４】融合した細胞は、遠心によってＰＥＧを除
いた後、９６ウェルプレートを用いて、ヒポキサンチ
ン、アミノプテリン及びチミジン（以下ＨＡＴと略す）
を含むＲＰＭＩ−１６４０培地中で１〜２週間培養し
て、ハイブリドーマのみを増殖させた。その後ＨＡＴを
含まない培地中で成育させ、約２週間後目的の抗体を産
生するクローンを試験例１に示すＥＬＩＳＡ法により検
索し、所望の反応特異性を有する本発明のモノクローナ
ル抗体を産生するハイブリドーマを得た。

【００３５】得られたハイブリドーマをＨＣ７−１Ｈ１
０、ＨＣ７−２Ｆ４、ＨＣ７−３Ｆ９、ＨＣ７−１Ｇ６
及びＨＣ７−３Ｄ３と命名し、このうちＨＣ７−１Ｇ６
を除く４種のハイブリドーマを微生物工業技術研究所に
平成４年１２月１日付で寄託した。受託番号は、順番
に、微工研菌寄第１３３１６号、第１３３１３号、第１
３３１５号及び第１３３１４号を付与された。

【００３６】ウサギ抗マウスＩｇ各イソタイプ抗体（Ｚ
ｙｍｅｄ社）を用いた二重免疫拡散法により、これらの
ハイブリドーマの産生するモノクローナル抗体（１Ｈ１
０、１Ｇ６、２Ｆ４、３Ｆ９及び３Ｄ３）のイソタイプ
はＩｇＧ１であることが明らかとなった。

【００３７】試験例１．ＥＬＩＳＡ法による抗体の反応
性の検定 免疫抗原として用いた非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス非構造領
域ＮＳ３ポリペプチドを、リン酸緩衝液ｐＨ７．４（Ｐ
ＢＳ）に溶解し、濃度１μｇ／ｍｌとしたものを、９６
穴マイクロプレートの各ウェルに５０μｌずつ分注し、
４℃で一晩吸着させた。吸着後、０．０５％ Ｔｗｅｅ
ｎ−２０含有ＰＢＳ（−）（Ｔ−ＰＢＳ）で３回洗浄
し、３％ゼラチン含有ＰＢＳ（−）を１ウェル２００μ
ｌずつ分注し、室温で１時間処理した。

【００３８】３％ゼラチン含有ＰＢＳ（−）を除き、ハ
イブリドーマ培養上清、また、粗製または精製モノクロ
ーナル抗体等を各々５０μｌずつウェルに加え、室温で
１時間反応させた。反応後、Ｔ−ＰＢＳで３回洗浄し、
２％ポリビニルピロリドン、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２
０含有ＰＢＳ（−）で５，０００倍に希釈した酵素標識
抗マウスＩｇＧ＋Ｍ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ社）を１ウェ
ルにつき５０μｌ加え、室温で１時間反応させた。未反
応抗体をＴ−ＰＢＳで３回洗浄することにより除き、オ
ルトフェニレンジアミン溶液（和光純薬社）を１ウェル
に５０μｌずつ加え反応させ、室温１０〜３０分後２０
％硫酸溶液で反応を停止させ、波長４９２ｎｍにおける
吸光度（Ａ４９２）を測定し、抗体の反応を検定した。

【００３９】結果を図１に示す。モノクローナル抗体１
Ｈ１０、１Ｇ６、２Ｆ４及び３Ｆ９は、抗体濃度約０．
２μｇ／ｍｌで２．５〜２．６（ｍａｘ）の吸光度（４
９２ｎｍ）を与え、また、モノクローナル抗体３Ｄ３は
同じ濃度で約２．０（ｍａｘ）の吸光度を与えた。

【００４０】試験例２．ウェスタン・ブロッティング法
による抗体の反応特異性の証明 非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス非構造領域ＮＳ３ポリペプチド
粗製物を、ドデシル硫酸ナトリウムを用いる電気泳動法
（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法）により電気泳動後、ゲルをポリ
ビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）膜と密着させ、ゲ
ル側を陰極、ＰＶＤＦ膜側を陽極として、トランスファ
ーし、ゲルに泳動されたタンパク質をＰＶＤＦ膜に転写
した。

【００４１】転写されたＰＶＤＦ膜を４％ブロックエー
ス（雪印乳業社）、２％ＢＳＡ含有０．１Ｍリン酸緩衝
液（ｐＨ７．４）に４℃で一晩浸してブロッキングを行
い、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０含有トリス塩酸緩衝液
（ｐＨ７．０）洗浄後、１次抗体として前記２）により
得られたハイブリドーマから調製されたモノクローナル
抗体を室温で１時間反応させた。

【００４２】反応後、膜をＴ−ＴＢＳでよく洗浄し、２
％ポリビニルピロリドン、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０
含ＰＢＳ（−）で５０００倍希釈した酵素標識抗マウス
ＩｇＧ＋Ｍ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ社）を２次抗体とし、
室温で１時間反応させた。ついで、ＰＶＤＦ膜をＴ−Ｔ
ＢＳで洗浄し、０．１％４−クロロ−１−ナフトール溶
液及び０．２％過酸化水素水溶液により発色させた。

【００４３】なお、陽性対照として非Ａ非Ｂ型肝炎患者
血清を用い、また、陰性対照として抗マウスＩｇＧ抗体
に代えて、抗ヒトＩｇＧ抗体を用いた。

【００４４】結果を図２に示す。モノクローナル抗体１
Ｇ６、１Ｈ１０、２Ｆ４、３Ｄ３及び３Ｆ９のいずれも
が、陽性対照と同様に、サイズ３０ｋＤａ付近のバンド
とのみ抗原−抗体複合体を形成することが判明した。陰
性対照は全く発色しなかった。

【００４５】試験例３．抗体による阻害の証明 ヒト非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス非構造領域ＮＳ３ペプチド
を感作したプレートに精製モノクローナル抗体０．１μ
ｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍ
ｌ濃度で各々１００μｌずつウエルに加え、室温で１時
間反応させた後、Ｔ−ＰＢＳで３回洗浄し、イムチェッ
クＨＣＶＡｂキット（国際試薬（株））測定法に準じて
測定を行った。このとき、使用したモノクローナル抗体
は２Ｆ４、３Ｄ３、及び２Ｆ４／３Ｄ３混合物であっ
た。また、抗血清として、非Ａ非Ｂ型肝炎患者血清（Ｎ
ｏ．２７，２８，２９，３０及び３１）を用いた。

【００４６】結果を図３に示す。いずれの抗体を用いて
も、濃度依存的に抗原−抗体複合体レベル（Ａ４９２／
６００）が低下したことから、本モノクローナル抗体は
ＮＳ３ポリペプチド抗原に結合すること、即ち該抗血清
の結合を阻害することが明瞭である。抗体混合物を使用
する場合には、阻害効果はさらに顕著であることが分か
る。

【００４７】試験例４．抗体による非Ａ非Ｂ型肝炎ウイ
ルス非構造領域ＮＳ３ポリペプチドの定量 マイクロプレートに精製したモノクローナル抗体１μｇ
／ｍｌ濃度で５０μｌずつウエルに加え、室温１時間も
しくは４℃１晩反応させた後、Ｔ−ＰＢＳで３回洗浄
し、１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ（−）を、１ウエル２００μ
ｌずつ分注し、室温で１時間処理する。

【００４８】１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ（−）を除き、非Ａ
非Ｂ型肝炎ウイルス非構造領域ＮＳ３ポリペプチド含有
溶液を１ウエル５０μｌ加え、室温で１時間反応させ
た。反応後、Ｔ−ＰＢＳで３回洗浄し、プレートに感作
したモノクローナル抗体と認識部位の異なるモノクロー
ナル抗体にビオチン（ＰＩＥＲＥ社）を結合させたもの
を１ウエル５０μｌ加え、室温で１時間反応させた後、
Ｔ−ＰＢＳで３回洗浄し、２％ポリビニルピロリドン、
０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０含有ＰＢＳ（−）で２００
０倍に希釈したペルオキシダーゼ標識アビジン（Ｖｅｃ
ｔｏｒ社）を１ウエルに５０μｌずつ加え室温で１時間
反応させた。反応後、Ｔ−ＰＢＳで３回洗浄し、オルト
フェニレンジアミン溶液（和光純薬）を１ウエルに５０
μｌずつ加え反応させ、室温１０〜３０分後２０％硫酸
溶液で反応を停止させ、波長４９２ｎｍにおける吸光度
（Ａ４９２）を測定することにより非Ａ非Ｂ型肝炎ウイ
ルス非構造領域ＮＳ３ポリペプチドを測定した。

【００４９】結果を図４に示す。図４から、モノクロー
ナル抗体は、非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス非構造領域ＮＳ３
ポリペプチドと濃度依存的に抗原抗体反応することがわ
かる。このことは、該抗体を該ＮＳ３ポリペプチドの定
量に使用できることを示している。

【００５０】３）モノクローナル抗体の大量調製 前記２）で得られたハイブリドーマからモノクローナル
抗体を大量調製するには次の方法によった。

【００５１】（ｉ）細胞培養による方法 前記２）で得られたクローンをＲＰＭＩ−１６４０培地
にて、５％炭酸ガスインキュベーター中で３７℃、４８
時間培養し、培養液を１５００×ｇ、１０分遠心分離す
ることにより、目的のモノクローナル抗体を含む培養上
清を得る。

【００５２】（ii）マウス腹水による方法 前記２）で得られたクローンから、細胞３×１０⁵ 〜１
×１０⁶ 個を、あらかじめプリスタン（Ａｌｄｒｉｃｈ
Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製）を接種しておいたＢａｌｂ
／ｃ系マウスに腹腔内投与した。１０〜１４日後、蓄積
した腹水を採取し、本発明抗体を含む腹水を得た。

【００５３】４）モノクローナル抗体による非Ａ非Ｂ型
肝炎ウイルス関連抗原の精製 本抗体を、炭酸緩衝液（ｐＨ８．５）に５〜１０μｇ／
ｍｌ溶解したものをＣＮＢｒ活性化アガロースゲル（膨
潤体積１ｍｌ）に加え、４℃で一晩撹拌しながら反応さ
せる。ゲルに結合しなかった抗体を遠心除去し、０．２
Ｍグリシン緩衝液（ｐＨ８．５）をゲル溶液に等量混合
し、室温２時間撹拌しながら反応させる。反応後、炭酸
緩衝液（ｐＨ８．５）で洗浄し、０．２Ｍグリシン緩衝
液（ｐＨ８．５）で洗浄する。同様の操作を２〜３回繰
り返す。

【００５４】このようにして作製した抗体結合カラムに
上記１）の方法等に準じて調製した形質転換体培養物か
らの抽出蛋白質溶液を添加し、０．５％Ｔｗｅｅｎ−８
０含有ＰＢＳ（−）で溶出したピークを、１Ｍトリス塩
酸緩衝液（ｐＨ８．０）で直ちに中和する。

【００５５】これにより、純度９０％以上の非Ａ非Ｂ型
肝炎ウイルス非構造領域ＮＳ３ポリペプチド抗原が精製
された。

【００５６】

【発明の効果】本発明のモノクローナル抗体は、高感
度、高精度かつ高い特異性をもって検体中の非Ａ非Ｂ型
肝炎ウイルス非構造領域ＮＳ３由来のポリペプチド抗原
を検出、定量することができるだけでなく、種々の由来
の該ポリペプチド抗原の有効な精製にも使用できる利点
をもつ。

【００５７】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：２５３ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 Gln Ser Phe Gln Val Ala His Leu His Ala Pro Thr Gly Ser Gly Lys ^{1 5 10 15} Ser Thr Lys Val Pro Ala Ala Tyr Ala Ser Gln Gly Tyr Lys Val Leu ^{20 25 30} Val Leu Asn Pro Ser Val Ala Ala Thr Leu Gly Phe Gly Ala Tyr Met ^{35 40 45} Ser Lys Ala His Gly Thr Asp Pro Asn Ile Arg Thr Gly Val Arg Thr ^{50 55 60} Ile Thr Thr Gly Ala Pro Ile Thr Tyr Ser Thr Tyr Gly Lys Phe Leu ^{65 70 75 80} Ala Asp Gly Gly Cys Ser Gly Gly Ala Tyr Asp Ile Ile Met Cys Asp ^{85 90 95} Glu Cys His Ser Thr Asp Ala Thr Ser Ile Leu Gly Ile Gly Thr Val ^{100 105 110} Leu Asp Gln Ala Glu Thr Ala Gly Ala Arg Leu Val Val Leu Ala Thr ^{115 120 125} Ala Thr Pro Pro Gly Ser Val Thr Val Pro His Pro Asn Ile Glu Glu ^{130 135 140} Val Ala Leu Ser Asn Thr Gly Glu Ile Pro Phe Tyr Gly Lys Gly Ile ^{145 150 155 160} Pro Ile Glu Val Ile Lys Gly Gly Arg His Leu Ile Phe Cys His Ser ^{165 170 175} Lys Lys Lys Cys Asp Glu Leu Ala Ala Lys Leu Ser Gly Leu Gly Ile ^{180 185 190} Asn Ala Val Ala Tyr Tyr Arg Gly Leu Asp Val Ser Val Ile Pro Thr ^{195 200 205} Ser Gly Asp Val Val Val Val Ala Thr Asp Ala Leu Met Thr Gly Tyr ^{210 215 220} Thr Gly Asp Phe Asp Ser Val Ile Asp Cys Asn Thr Cys Val Thr Gln ^{225 230 235 240} Thr Val Asp Phe Ser Leu Asp Pro Thr Phe Thr Ile Glu ^{245 250}

【図面の簡単な説明】

【図１】この図は、モノクローナル抗体１Ｈ１０、１Ｇ
６、２Ｆ４、３Ｆ９及び３Ｄ３の抗体力価を、免疫抗原
として非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス非構造領域ＮＳ３ポリペ
プチドを用い、ＥＬＩＳＡ法で測定した結果を示す。

【図２】この図は、モノクローナル抗体１Ｈ１０、１Ｇ
６、２Ｆ４、３Ｆ９及び３Ｄ３の非Ａ非Ｂ型肝炎ウイル
ス非構造領域ＮＳ３ペプチドとの反応特異性を、ウェス
タン・ブロット法で立証した図である。

【図３】この図は、モノクローナル抗体２Ｆ４、３Ｄ３
及び２Ｆ４／３Ｄ３混合物による、非Ａ非Ｂ型肝炎ウイ
ルス非構造領域ＮＳ３抗原ポリペプチドと非Ａ非Ｂ型肝
炎患者血清との結合阻害を立証した図である。

【図４】この図は、モノクローナル抗体２Ｆ４、３Ｄ３
による、非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス非構造領域ＮＳ３ポリ
ペプチドの定量を立証した図である。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/577 Ｂ 9015−2Ｊ // Ｃ１２Ｎ 15/06 (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 山本 隆幸 兵庫県神戸市西区室谷１丁目１番２ 国際 試薬株式会社研究開発センター内 (72)発明者 森 浩之 兵庫県神戸市西区室谷１丁目１番２ 国際 試薬株式会社研究開発センター内 (72)発明者 太田 陽介 兵庫県神戸市西区室谷１丁目１番２ 国際 試薬株式会社研究開発センター内

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号１に示されるアミノ酸配列を有
   する非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス非構造領域ＮＳ３ポリペプ
   チド抗原上のエピトープに特異的に結合するモノクロー
   ナル抗体。
2. 【請求項２】 モノクローナル抗体ＨＣ７−１Ｈ１０、
   ＨＣ７−２Ｆ４、ＨＣ７−３Ｆ９、ＨＣ７−１Ｇ６及び
   ＨＣ７−３Ｄ３から成る群から選択されるハイブリドー
   マによって分泌される請求項１記載のモノクローナル抗
   体。
3. 【請求項３】 請求項１又は２記載のモノクローナル抗
   体を産生するハイブリドーマ。
4. 【請求項４】 ハイブリドーマがＨＣ７−１Ｈ１０、Ｈ
   Ｃ７−２Ｆ４、ＨＣ７−３Ｆ９、ＨＣ７−１Ｇ６又はＨ
   Ｃ７−３Ｄ３である、請求項３記載のハイブリドーマ。
5. 【請求項５】 非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス関連抗原の免疫
   学的測定方法であって、該抗原を含むと予想される検体
   と請求項１又は２記載の１種又はそれ以上のモノクロー
   ナル抗体とを接触させ、抗原−抗体複合体を形成した
   後、該複合体を検出又は定量する、ことを包含する方
   法。
6. 【請求項６】 請求項１又は２記載のモノクローナル抗
   体を、天然又は合成高分子担体に結合してアフィニティ
   カラムを形成し、該カラム中に非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス
   関連抗原を含有する液体を通過させて該抗原を該抗体に
   結合し、その後、該抗原をカラムから溶離する、ことを
   包含する非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス関連抗原の精製方法。