JPS6121227B2 - - Google Patents
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- JPS6121227B2 JPS6121227B2 JP53024066A JP2406678A JPS6121227B2 JP S6121227 B2 JPS6121227 B2 JP S6121227B2 JP 53024066 A JP53024066 A JP 53024066A JP 2406678 A JP2406678 A JP 2406678A JP S6121227 B2 JPS6121227 B2 JP S6121227B2
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
- C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
- C12N11/06—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier attached to the carrier via a bridging agent
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
- C07D213/00—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
- C07D213/02—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
- C07D213/04—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having no bond between the ring nitrogen atom and a non-ring member or having only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom
- C07D213/60—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having no bond between the ring nitrogen atom and a non-ring member or having only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
- C07D213/62—Oxygen or sulfur atoms
- C07D213/70—Sulfur atoms
- C07D213/71—Sulfur atoms to which a second hetero atom is attached
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54353—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals with ligand attached to the carrier via a chemical coupling agent
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Description
本発明は新規なピリジン化合物に関する。本発
明による新規な化合物は二官能性カツプリング剤
およびチオール化剤として特に有用である。 そのうちの少くとも一方が蛋白質またはポリペ
プチドからなる２種の物質の接合体（コンジユゲ
ート）の製造において接合体の各成分を共有結合
でカツプリングさせるために二官能性剤を使用す
ることは知られており、通常は接合分子中のアミ
ノ基が接合反応のために使用されている。これに
関するよく知られた剤はグルタルジアルデヒドで
ある。しかしながら、蛋白質またはポリペプチド
は１個以上のアミノ基を含有しており、他方接合
体の第２成分を構成する物質もまた１個以上のア
ミノ基を含有している。グルタルジアルデヒドお
よび接合分子中のアミノ基を用いる他の二官能性
剤をカツプリングさせる場合には、所定組成の接
合体（たとえば各成分の単一分子のみを含有する
二分子接合体）を生成するため、さらにまた蛋白
質またはポリペプチド中に分子内交叉結合をもた
らすかまたは同一種類の成分の２個の分子または
分子の一方あるいは両方の種類の３個またはそれ
以上の分子を有する接合体の生成をもたらしそし
てある場合にはまた接合体とほぼ同じ大きさであ
りうる凝集体を生成するようなカツプリング剤の
重合（たとえばグルタルジアルデヒドが使用され
る場合）をもたらす副反応も得られる。すなわ
ち、もつとも不均質な生成物混合物が得られるの
である。特定の反応条件を使用しそして反応混合
物をたとえばアフイニテイクロマトグラフイーお
よびゲル過のような種類の分離方法で精製する
ことによりはじめて充分な単一性および純度を有
する接合体を得ることが可能であるが、しかしこ
れらの分離方法は多くの労力を要ししかもかなり
時間がかかる。しかも、収量はしばしば非常に低
い。 本発明にしたがえば、既知の剤の場合における
ような副反応を起すことなしに穏和な条件下で比
較的単一性の二分子性またはオリゴマー性のホモ
およびヘテロの両接合体を製造するための二官能
性剤として使用できる新しい群の化合物が発見さ
れた。この新規なカツプリング剤を使用する場合
にはより高い収量で所望の接合体が得られる。 また、新規な化合物はアミノ基含有物質をチオ
ール化するためのチオール化剤としても使用され
うる。これはアミノ基を含有しそして水性液体中
に可溶性である巨大分子状物質特にアミノ基を含
有するバイオポリマーおよびそれの誘導体主とし
て蛋白質、ポリペプチドおよびポリサツカライド
またはアミノ基を含有するそれらの誘導体に関し
て特に好ましい。 本発明による化合物は、式 R1−Ｓ−Ｓ−Ａ−Ｚ （） 〔式中、R1は２−ピリジル、５−ニトロ−２
−ピリジルまたは４−ピリジルであり、Ａは１〜
６個の炭素原子を有する炭化水素残基でありそし
てＺは基
明による新規な化合物は二官能性カツプリング剤
およびチオール化剤として特に有用である。 そのうちの少くとも一方が蛋白質またはポリペ
プチドからなる２種の物質の接合体（コンジユゲ
ート）の製造において接合体の各成分を共有結合
でカツプリングさせるために二官能性剤を使用す
ることは知られており、通常は接合分子中のアミ
ノ基が接合反応のために使用されている。これに
関するよく知られた剤はグルタルジアルデヒドで
ある。しかしながら、蛋白質またはポリペプチド
は１個以上のアミノ基を含有しており、他方接合
体の第２成分を構成する物質もまた１個以上のア
ミノ基を含有している。グルタルジアルデヒドお
よび接合分子中のアミノ基を用いる他の二官能性
剤をカツプリングさせる場合には、所定組成の接
合体（たとえば各成分の単一分子のみを含有する
二分子接合体）を生成するため、さらにまた蛋白
質またはポリペプチド中に分子内交叉結合をもた
らすかまたは同一種類の成分の２個の分子または
分子の一方あるいは両方の種類の３個またはそれ
以上の分子を有する接合体の生成をもたらしそし
てある場合にはまた接合体とほぼ同じ大きさであ
りうる凝集体を生成するようなカツプリング剤の
重合（たとえばグルタルジアルデヒドが使用され
る場合）をもたらす副反応も得られる。すなわ
ち、もつとも不均質な生成物混合物が得られるの
である。特定の反応条件を使用しそして反応混合
物をたとえばアフイニテイクロマトグラフイーお
よびゲル過のような種類の分離方法で精製する
ことによりはじめて充分な単一性および純度を有
する接合体を得ることが可能であるが、しかしこ
れらの分離方法は多くの労力を要ししかもかなり
時間がかかる。しかも、収量はしばしば非常に低
い。 本発明にしたがえば、既知の剤の場合における
ような副反応を起すことなしに穏和な条件下で比
較的単一性の二分子性またはオリゴマー性のホモ
およびヘテロの両接合体を製造するための二官能
性剤として使用できる新しい群の化合物が発見さ
れた。この新規なカツプリング剤を使用する場合
にはより高い収量で所望の接合体が得られる。 また、新規な化合物はアミノ基含有物質をチオ
ール化するためのチオール化剤としても使用され
うる。これはアミノ基を含有しそして水性液体中
に可溶性である巨大分子状物質特にアミノ基を含
有するバイオポリマーおよびそれの誘導体主とし
て蛋白質、ポリペプチドおよびポリサツカライド
またはアミノ基を含有するそれらの誘導体に関し
て特に好ましい。 本発明による化合物は、式 R1−Ｓ−Ｓ−Ａ−Ｚ （） 〔式中、R1は２−ピリジル、５−ニトロ−２
−ピリジルまたは４−ピリジルであり、Ａは１〜
６個の炭素原子を有する炭化水素残基でありそし
てＺは基
【式】または
【式】
（式中ｎは２または３であり、R1は前記R1と
同じ定義を有しそしてそれに等しくそしてR2は
メチルまたはエチルである）であるかまたは最後
に述べた基の酸付加塩である〕を有する点に特徴
がある。 炭化水素残基Ａは脂肪族残基であるのが好まし
いが、また芳香族残基であつてもよい。Ａはたと
えば直鎖状または分枝鎖状のアルキレン残基たと
えば−（CH2）n−（式中ｍは整数１〜10好ましくは
１〜６である）たとえば−CH2−CH2−である。 式で表わされる化合物は多数の異なる方法に
より製造されうる。現在好適とされている方法は
以下のとおりである。 式においてＺが基 である化合物は、縮合剤の存在下で式 R1−Ｓ−Ｓ−Ａ−COOH （） （式中R1およびＡは共に前述の定義を有す
る）で表わされるジスルフイドをｎが２である場
合のＮ−ヒドロキシスクシンイミド（またはｎが
３である化合物を所望する場合にはｎが３である
類縁化合物）と反応させることにより製造され
る。 この反応は10〜30℃の温度で有機溶媒中におい
て行われる。適当な溶媒の例としてはたとえばメ
チレンクロライド、エチレンアセテートおよびジ
オキサンがあげられる。反応時間は反応成分およ
び反応温度の選択により変わる。 使用される縮合剤はエステル化反応で一般的な
剤たとえばＮ，Ｎ−ジシクロヘキシルカルボジイ
ミドであることができる。 式で表わされる出発化合物は、式 HS−Ａ−COOH （） で表わされるメルカプトアルキルカルボン酸を式 R1−Ｓ−Ｓ−R1 （） （式中ＡおよびR1は前述の定義を有する）で
表わされるジピリジルジスルフイドと反応させる
ことにより製造されうる。 この反応は10〜30℃の温度で有機溶媒中におい
て行われる。適当な溶媒の例としてはたとえばエ
タノール、酢酸エチルおよびジオキサンがあげら
れる。反応時間は反応成分および反応温度の選択
により変化する。 式においてＺが基 である化合物は、前記式のジスルフイドを対応
するチオピリドンと有機溶媒中において縮合剤の
存在下で最初は低温たとえば−20℃で約１〜２時
間ついで周囲温度（約＋20℃）で反応させること
により製造される。ここでの適当な溶媒はたとえ
ばメチレンクロライド、酢酸エチルおよびジオキ
サンである。使用する縮合剤はＮ，Ｎ−ジシクロ
ヘキシルカルボジイミドであるのが好ましい。 使用される出発物質は式で表わされる化合物
を式で表わされる化合物と反応させることによ
り得られる混合物であるのが好ましい。 式においてＺが
同じ定義を有しそしてそれに等しくそしてR2は
メチルまたはエチルである）であるかまたは最後
に述べた基の酸付加塩である〕を有する点に特徴
がある。 炭化水素残基Ａは脂肪族残基であるのが好まし
いが、また芳香族残基であつてもよい。Ａはたと
えば直鎖状または分枝鎖状のアルキレン残基たと
えば−（CH2）n−（式中ｍは整数１〜10好ましくは
１〜６である）たとえば−CH2−CH2−である。 式で表わされる化合物は多数の異なる方法に
より製造されうる。現在好適とされている方法は
以下のとおりである。 式においてＺが基 である化合物は、縮合剤の存在下で式 R1−Ｓ−Ｓ−Ａ−COOH （） （式中R1およびＡは共に前述の定義を有す
る）で表わされるジスルフイドをｎが２である場
合のＮ−ヒドロキシスクシンイミド（またはｎが
３である化合物を所望する場合にはｎが３である
類縁化合物）と反応させることにより製造され
る。 この反応は10〜30℃の温度で有機溶媒中におい
て行われる。適当な溶媒の例としてはたとえばメ
チレンクロライド、エチレンアセテートおよびジ
オキサンがあげられる。反応時間は反応成分およ
び反応温度の選択により変わる。 使用される縮合剤はエステル化反応で一般的な
剤たとえばＮ，Ｎ−ジシクロヘキシルカルボジイ
ミドであることができる。 式で表わされる出発化合物は、式 HS−Ａ−COOH （） で表わされるメルカプトアルキルカルボン酸を式 R1−Ｓ−Ｓ−R1 （） （式中ＡおよびR1は前述の定義を有する）で
表わされるジピリジルジスルフイドと反応させる
ことにより製造されうる。 この反応は10〜30℃の温度で有機溶媒中におい
て行われる。適当な溶媒の例としてはたとえばエ
タノール、酢酸エチルおよびジオキサンがあげら
れる。反応時間は反応成分および反応温度の選択
により変化する。 式においてＺが基 である化合物は、前記式のジスルフイドを対応
するチオピリドンと有機溶媒中において縮合剤の
存在下で最初は低温たとえば−20℃で約１〜２時
間ついで周囲温度（約＋20℃）で反応させること
により製造される。ここでの適当な溶媒はたとえ
ばメチレンクロライド、酢酸エチルおよびジオキ
サンである。使用する縮合剤はＮ，Ｎ−ジシクロ
ヘキシルカルボジイミドであるのが好ましい。 使用される出発物質は式で表わされる化合物
を式で表わされる化合物と反応させることによ
り得られる混合物であるのが好ましい。 式においてＺが
【式】である化
合物は、有機溶媒中において式
（式中R2およびＡは前述の定義を有する）で
表わされるチオールイミデートを式R1−Ｓ−Ｓ
−R1（式中R1は前述の定義を有する）で表わさ
れるピリジルジスルフイドと反応させることによ
り製造される。溶媒はたとえば約10％の氷酢酸を
含有するメタノールであることができる。 本発明による化合物を二官能性カツプリング剤
として使用する場合には次の方法が適用される。
例示のために本発明にしたがつてＮ−スクシンイ
ミジル−３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオネ
ート のたすけをかりてカツプリングさせるために２種
の物質〔各々が少くとも１個のアミノ基を反応に
提供しうるものであり（たとえば蛋白質およびペ
プチド）、一般的にB1−NH2およびB2−NH2とし
て示す）が選択された。 こられの物質は最初にそれぞれ以下のように補
助剤と反応する。 および これら生成物の一方たとえば工程ｂからの生成
物はついで次式にしたがつて酸媒体中でたとえば
ジチオトレイトール（DTT）で還元される。 ついでこうして得られたチオールは次式にした
がつてこの場合には工程ａからのジスルフイドと
反応する。 工程ａおよびｂは通常20〜25℃の温度で５〜８
のPHを有しそして１〜10容量％のメタールまたは
エタノールを含有する水溶液中において実施され
る。 工程ｃは通常20〜25℃の温度でPH３〜５におけ
る水性媒体中において実施されうる。変性された
分子B2が本来的なジスルフイド結合を有してい
ない場合には還元はまた別の還元剤を用いそして
より高いPH値たとえばPH８〜8.5までで実施され
うる。 工程ｄは通常20〜25℃でPH４〜８における水性
媒体中で実施される。 前記物質の一方がすでに反応に関与しうる反応
性チオール基（たとえば脂肪族チオール基）を有
する場合には前記工程のｂおよびｃは省略でき
る。 二分子ヘテロ接合体が所望される場合には２種
の物質はおよそモノ置換より以上に置換されるべ
きではない。所望ならば２分子よりも大きい接合
体は２種物質を１分子当たり１個より多い置換基
で置換することにより製造されうる。ここでは当
然これら物質が反応にあずかる相当する数のアミ
ノ基を含有するということが必要である。オリゴ
接合体（たとえばトリ接合体およびテトラ接合
体）の合成においてはこれら物質の一つは一般に
およそモノ置換以上に置換されるべきではない。
また、前述と同じ方法でホモ接合体（すなわち
B1＝B2）を製造することも可能である。 本発明の化合物のチオール化剤としての有用性
は前記工程のｂおよびｃから明らかである。これ
に関しては導入されるチオール基がピリジルジス
ルフイド形態で閉塞されているということが特に
好ましい。このようにして導入されたチオール基
とその物質（たとえばその物質がジスルフイド橋
を含有する蛋白質またはポリペプチドである場
合）中に存在するジスルフイド橋との望ましくな
いチオールジスルフイド交換反応が変性工程の間
そして変性物質たとえば変性蛋白質を貯蔵する場
合に避けられる。物質（たとえば蛋白質）中に導
入されたR1−Ｓ−Ｓ−基をチオール基（HS−）
に変換したい場合には、これは同時に物質中に存
在しうる本来のジスルフイド橋を還元することな
しに選択還元により実施されうる。これはR1−
Ｓ−Ｓ−基とたとえば蛋白質中の本来の脂肪族ジ
スルフイド橋との間の化学反応性の相異により可
能である。 すなわち本発明はまた水性液体中に溶解する変
性巨大分子状物質、特にアミノ基を含有するバイ
オポリマー（biopolymer）およびそれの誘導
体、好ましくはアミノ基を含有する蛋白質、ポリ
ペプチドおよびポリサツカライドまたはそれらの
誘導体をも包含する。これらの変性巨大分子状物
質はその中の１個またはそれ以上のアミノ基（−
NH2）が式
表わされるチオールイミデートを式R1−Ｓ−Ｓ
−R1（式中R1は前述の定義を有する）で表わさ
れるピリジルジスルフイドと反応させることによ
り製造される。溶媒はたとえば約10％の氷酢酸を
含有するメタノールであることができる。 本発明による化合物を二官能性カツプリング剤
として使用する場合には次の方法が適用される。
例示のために本発明にしたがつてＮ−スクシンイ
ミジル−３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオネ
ート のたすけをかりてカツプリングさせるために２種
の物質〔各々が少くとも１個のアミノ基を反応に
提供しうるものであり（たとえば蛋白質およびペ
プチド）、一般的にB1−NH2およびB2−NH2とし
て示す）が選択された。 こられの物質は最初にそれぞれ以下のように補
助剤と反応する。 および これら生成物の一方たとえば工程ｂからの生成
物はついで次式にしたがつて酸媒体中でたとえば
ジチオトレイトール（DTT）で還元される。 ついでこうして得られたチオールは次式にした
がつてこの場合には工程ａからのジスルフイドと
反応する。 工程ａおよびｂは通常20〜25℃の温度で５〜８
のPHを有しそして１〜10容量％のメタールまたは
エタノールを含有する水溶液中において実施され
る。 工程ｃは通常20〜25℃の温度でPH３〜５におけ
る水性媒体中において実施されうる。変性された
分子B2が本来的なジスルフイド結合を有してい
ない場合には還元はまた別の還元剤を用いそして
より高いPH値たとえばPH８〜8.5までで実施され
うる。 工程ｄは通常20〜25℃でPH４〜８における水性
媒体中で実施される。 前記物質の一方がすでに反応に関与しうる反応
性チオール基（たとえば脂肪族チオール基）を有
する場合には前記工程のｂおよびｃは省略でき
る。 二分子ヘテロ接合体が所望される場合には２種
の物質はおよそモノ置換より以上に置換されるべ
きではない。所望ならば２分子よりも大きい接合
体は２種物質を１分子当たり１個より多い置換基
で置換することにより製造されうる。ここでは当
然これら物質が反応にあずかる相当する数のアミ
ノ基を含有するということが必要である。オリゴ
接合体（たとえばトリ接合体およびテトラ接合
体）の合成においてはこれら物質の一つは一般に
およそモノ置換以上に置換されるべきではない。
また、前述と同じ方法でホモ接合体（すなわち
B1＝B2）を製造することも可能である。 本発明の化合物のチオール化剤としての有用性
は前記工程のｂおよびｃから明らかである。これ
に関しては導入されるチオール基がピリジルジス
ルフイド形態で閉塞されているということが特に
好ましい。このようにして導入されたチオール基
とその物質（たとえばその物質がジスルフイド橋
を含有する蛋白質またはポリペプチドである場
合）中に存在するジスルフイド橋との望ましくな
いチオールジスルフイド交換反応が変性工程の間
そして変性物質たとえば変性蛋白質を貯蔵する場
合に避けられる。物質（たとえば蛋白質）中に導
入されたR1−Ｓ−Ｓ−基をチオール基（HS−）
に変換したい場合には、これは同時に物質中に存
在しうる本来のジスルフイド橋を還元することな
しに選択還元により実施されうる。これはR1−
Ｓ−Ｓ−基とたとえば蛋白質中の本来の脂肪族ジ
スルフイド橋との間の化学反応性の相異により可
能である。 すなわち本発明はまた水性液体中に溶解する変
性巨大分子状物質、特にアミノ基を含有するバイ
オポリマー（biopolymer）およびそれの誘導
体、好ましくはアミノ基を含有する蛋白質、ポリ
ペプチドおよびポリサツカライドまたはそれらの
誘導体をも包含する。これらの変性巨大分子状物
質はその中の１個またはそれ以上のアミノ基（−
NH2）が式
【式】（式中Ａ
およびR1は共に前述の定義を有しそしてＸはＯ
またはNH、好ましくはＯである）で表わされる
基に変換された点に特徴がある。これらの基は式 （式中R1は前述の定義を有する）で表わされる基
から選択されるのが好ましく、２−ピリジルが好
ましい。 工程ｃおよびｄによるチオールジスルフイド交
換反応は、式で表わされる化合物中の基R1が
還元的に分裂されて化合物R1−SHになることが
できついでこれが対応する化合物HR1＝Ｓに互変
異性されることを必要とする。２−ピリジル基お
よび４−ピリジル基によりみたされる外に、その
条件はまたチオール−チオン互変異性が破壊され
ないような位置でかかる型の置換基で置換される
対応する基によつてもみたされる。５−ニトロ−
２−ピリジルがこの置換ピリジル基に属すること
が見出された。 次に本発明による化合物の製法およびこれら化
合物の使用を説明する多くの実施例でさらに本発
明を説明する。 実施例 １ Ｎ−スクシンイミジル−３（２−ピリジルジチ
オ）プロピオネート 1.9g（8.6ミリモル）の２，２−ジピリジルジ
スルフイドを10mlの酢酸エチル中に溶解した。10
mlの酢酸エチル中における0.9g（8.6ミリモル）
の３−メルカプトプロピオン酸溶液を撹拌しなが
ら同時に0.1ml（２滴）のボロントリフルオライ
ドエーテラートを反応混合物に加えながら15分間
に滴加した。ついで振盪させながら室温で20時間
保持し、反応混合物を蒸発させ（Ｂｕ¨chi
Rotavaporによる、＜40℃）そして固体の黄色残
留物を10mlの冷酢酸エチル（＋４℃）でスラリー
にしついで過した。こうして約90％の２−チオ
ピリドン（融点124〜126℃、文献値128〜130℃）
が回収された。２−カルボキシエチル（２−ピリ
ジル）ジスルフイドの収率は約60％であつた。
1H−NMRδ（CDCl3）2.7−3.3（4H，ｍ，−
CH2CH2−）、6.90−8.5（4H，ｍ，
またはNH、好ましくはＯである）で表わされる
基に変換された点に特徴がある。これらの基は式 （式中R1は前述の定義を有する）で表わされる基
から選択されるのが好ましく、２−ピリジルが好
ましい。 工程ｃおよびｄによるチオールジスルフイド交
換反応は、式で表わされる化合物中の基R1が
還元的に分裂されて化合物R1−SHになることが
できついでこれが対応する化合物HR1＝Ｓに互変
異性されることを必要とする。２−ピリジル基お
よび４−ピリジル基によりみたされる外に、その
条件はまたチオール−チオン互変異性が破壊され
ないような位置でかかる型の置換基で置換される
対応する基によつてもみたされる。５−ニトロ−
２−ピリジルがこの置換ピリジル基に属すること
が見出された。 次に本発明による化合物の製法およびこれら化
合物の使用を説明する多くの実施例でさらに本発
明を説明する。 実施例 １ Ｎ−スクシンイミジル−３（２−ピリジルジチ
オ）プロピオネート 1.9g（8.6ミリモル）の２，２−ジピリジルジ
スルフイドを10mlの酢酸エチル中に溶解した。10
mlの酢酸エチル中における0.9g（8.6ミリモル）
の３−メルカプトプロピオン酸溶液を撹拌しなが
ら同時に0.1ml（２滴）のボロントリフルオライ
ドエーテラートを反応混合物に加えながら15分間
に滴加した。ついで振盪させながら室温で20時間
保持し、反応混合物を蒸発させ（Ｂｕ¨chi
Rotavaporによる、＜40℃）そして固体の黄色残
留物を10mlの冷酢酸エチル（＋４℃）でスラリー
にしついで過した。こうして約90％の２−チオ
ピリドン（融点124〜126℃、文献値128〜130℃）
が回収された。２−カルボキシエチル（２−ピリ
ジル）ジスルフイドの収率は約60％であつた。
1H−NMRδ（CDCl3）2.7−3.3（4H，ｍ，−
CH2CH2−）、6.90−8.5（4H，ｍ，
【式】）、12.5（1H，Ｓ，−
COOH）。
ついで0.68g（５ミリモル）のＮ−ヒドロキシ
スクシンイミドを溶液に加え、その後10mlの乾燥
酢酸エチル中に溶解された1.03g（５ミリモル）
のジシクロヘキシルカルボジイミドを室温で振盪
させながら15分間で滴加した。反応を室温で５時
間振盪下で継続させ、ついで反応混合物を＋４℃
に冷却しそして沈殿したジシクロヘキシルカルボ
ジイミドを過した。わずかに黄色の溶液を蒸発
させそして油状物をエタノール中に溶解しついで
−20℃で晶出させた。収率は45％であつた。融点
は78.5〜80.5℃であつた。 C12H12N2O4S2としての元素分析は次のとおり
である。 計算値：Ｃ 46.14，Ｈ 3.83，Ｎ 8.97， Ｓ 20.53％ 実測値：Ｃ 46.19，Ｈ 3.88，Ｎ 8.96， Ｓ 20.02％ 1H−NMRδ（CDCl3）2.83（4H，ｓ，
スクシンイミドを溶液に加え、その後10mlの乾燥
酢酸エチル中に溶解された1.03g（５ミリモル）
のジシクロヘキシルカルボジイミドを室温で振盪
させながら15分間で滴加した。反応を室温で５時
間振盪下で継続させ、ついで反応混合物を＋４℃
に冷却しそして沈殿したジシクロヘキシルカルボ
ジイミドを過した。わずかに黄色の溶液を蒸発
させそして油状物をエタノール中に溶解しついで
−20℃で晶出させた。収率は45％であつた。融点
は78.5〜80.5℃であつた。 C12H12N2O4S2としての元素分析は次のとおり
である。 計算値：Ｃ 46.14，Ｈ 3.83，Ｎ 8.97， Ｓ 20.53％ 実測値：Ｃ 46.19，Ｈ 3.88，Ｎ 8.96， Ｓ 20.02％ 1H−NMRδ（CDCl3）2.83（4H，ｓ，
【式】）、3.12（4H，ｓ広い、−CH2−
CH2）、6.90−8.82（4H，ｍ，
【式】）
実施例 ２
２−チオピリジル−３−（２−ピリジルジチ
オ）プロピオネート 1.9g（8.6ミリモル）の２，２−ジピリジルジ
スルフイドを65mlの酢酸エチル中に溶解した。10
mlの酢酸エチル中における0.9g（8.6ミリモル）
の３−メルカプトプロピオン酸の溶液を振盪させ
ながら15分間で滴加し、同時に0.1ml（２滴）の
ボロントリフルオライドエーテラートを反応混合
物に加えた。室温で20時間放置後溶液を−20℃に
冷却した。その後1.03g（５ミリモル）のジシク
ロヘキシルカルボジイミドを15mlの酢酸エチル中
に溶解し、これを溶液に強く撹拌しながら15分間
滴加した。反応を１時間−20℃で継続させついで
室温（約20℃）で一夜続けさせた。生成するジシ
クロヘキシルカルバミドを去し、溶液を蒸発さ
せた（Ｂｕ¨chi Rotavaporによる、＜40℃）。つい
で10mlの冷酢酸エチル（＋４℃）を加え、混合物
を再び過してそれによりすべてのジシクロヘキ
シルカルバミドを除去できた。生成物は1.5gであ
つた。純度は約90％であつた。 1H−NMR、δ（CDCl3）3.15（4H，ｓ広い、−
CH2−CH2）、6.90−8.8（8H，ｍ，
オ）プロピオネート 1.9g（8.6ミリモル）の２，２−ジピリジルジ
スルフイドを65mlの酢酸エチル中に溶解した。10
mlの酢酸エチル中における0.9g（8.6ミリモル）
の３−メルカプトプロピオン酸の溶液を振盪させ
ながら15分間で滴加し、同時に0.1ml（２滴）の
ボロントリフルオライドエーテラートを反応混合
物に加えた。室温で20時間放置後溶液を−20℃に
冷却した。その後1.03g（５ミリモル）のジシク
ロヘキシルカルボジイミドを15mlの酢酸エチル中
に溶解し、これを溶液に強く撹拌しながら15分間
滴加した。反応を１時間−20℃で継続させついで
室温（約20℃）で一夜続けさせた。生成するジシ
クロヘキシルカルバミドを去し、溶液を蒸発さ
せた（Ｂｕ¨chi Rotavaporによる、＜40℃）。つい
で10mlの冷酢酸エチル（＋４℃）を加え、混合物
を再び過してそれによりすべてのジシクロヘキ
シルカルバミドを除去できた。生成物は1.5gであ
つた。純度は約90％であつた。 1H−NMR、δ（CDCl3）3.15（4H，ｓ広い、−
CH2−CH2）、6.90−8.8（8H，ｍ，
【式】）
実施例 ３
メチル−４（２−ピリジルジチオ）ブチルイミ
デート 20mg（0.12ミリモル）のメチル−４−メルカプ
トブチルイミデート塩酸塩、26mg（0.12ミリモ
ル）の２，2′−ジピリジルジスルフイドおよび
0.5mlの氷酢酸を５mlのメタノール中に溶解し
た。反応を1H−NMRで行ないそしてすべてのイ
ミデートが反応した時に（約12時間）混合物を蒸
発乾固させた。1H−NMR（CD3OD）を用いて反
応混合物を分析したところメチル−４−メルカプ
トブチルイミデートに基づいて約20％の収率を示
した。 実施例 ４ Ｎ−スクシンイミジル−２（２−ピリジルジチ
オ）プロピオネート この化合物は３−メルカプトプロピオン酸が２
−メルカプトプロピオン酸に置き換えられる以外
は実施例１に記載のＮ−スクシンイミジル−３
（２−ピリジルジチオ）プロピオネートと同じ方
法で製造された。さらに、合成は約1/10スケール
で実施された。生成物は1H−NMRで分析され
た。 実施例 ５ Ｎ−スクシンイミジル−３（４−ピリジルジチ
オ）プロピオネート この化合物は２，2′−ジピリジルジスルフイド
が４，4′−ジピリジルジスルフイドにより置き換
えられる以外は実施例１に記載のＮ−スクシンイ
ミジル−３（２−ピリジルジチオ）−プロピオネ
ートと同じ方法で製造された。さらに合成は1/10
スケールで実施された。生成物は1H−NMRで分
析された。 実施例 ６ Ｎ−スクシンイミジル−３（５−ニトロ−２−
ピリジルジチオ）プロピオネート この化合物は２，2′−ジピリジルジスルフイド
がビス（５−ニトロ−２−ピリジル）ジスルフイ
ドにより置き換えられる以外は実施例１に記載の
Ｎ−スクシンイミジル−３（２−ピリジルジチ
オ）プロピオネートと同じ方法で製造された。さ
らに合成は1/10スケールで実施された。生成物は
1H−NMRで分析された。 実施例 ７ α−アミラーゼのチオール化 ５mgのα−アミラーゼをPH7.5の0.5mlの0.1Mり
ん酸ナトリウムバツフアー中に溶解し、これに75
μのＮ−スクシンイミジル−３（２−ピリジル
ジチオ）プロピオネート（99.5％EtOH中におけ
る34mM）を加えた。混合物を激しく振盪させた
後反応を＋23℃で40分間継続させた。反応混合物
をセフアデツクスＧ−25（登録商標）
（Pharmacia Fine Chemicals AB社製、エピクロ
ロヒドリンで交叉結合されたデキストランのビー
ズ）上でゲル過した（使用した媒体はPH7.5の
0.3Mりん酸ナトリウムバツフアーであつた）。つ
いでこうして得られたα−アミラーゼピリジルジ
スルフイド誘導体はゲル過から得られた物質
（1.5ml）に50μの50mMジチオトレイトール
（dithiothreitol）を加えることにより還元され
た。還元は＋23℃で20分間継続させた。過剰のジ
チオトレイトールおよび他の低分子量成分はセフ
アデツクスＧ−25上でのゲル過により除去され
た（使用媒体は0.3MNaClであつた）。このような
チオール化されたα−アミラーゼは0.75モル
SH／モル蛋白質を含有することが見出された。 実施例 ８ ヒツジ−抗ウサギ−IgG抗体−α−アミラーゼ
接合体の製法 ａ チオール化α−アミラーゼ チオール化α−アミラーゼは前記実施例７に
したがつて製造された。 ｂ ２−ピリジルジスルフイド基を含有するヒツ
ジ−抗ラビツト−IgG−抗体 1.2mgのヒツジ−抗ウサギ−IgG−抗体（免疫
吸着精製によりヒツジの超免疫血清から調製さ
れた）をPH7.5の0.5mlの0.1Mりん酸ナトリウム
バツフアー中に溶解し、これに15μＮ−スク
シンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）−プ
ロピオネート（EtOH中における5.9mM）を加
えた。溶液を激しく振盪させた後反応を＋23℃
で40分間行なわしめた。過剰の試薬および他の
望ましくない低分子成分をセフアデツクスＧ−
25上でのゲル過により除去した（媒体は
0.3MNaCl）。 こうして変性されたヒツジ−抗ウサギ−IgG
−抗体は蛋白質１モル当り２モルの２−ピリジ
ルジスルフイド基を含有していることが見出さ
れた。 ｃ ヒツジ−抗ウサギ−IgG−抗体−α−アミラ
ーゼ接合体 １mlの0.3MNaCl中における1.2mgのヒツジ−
抗ウサギ−IgG−抗体−２−ピリジルジスルフ
イド（17ナノモルの２−ピリジルジスルフイド
基を含有する８ミリモルの蛋白質）（前記ｂか
らのもの）を２mlの0.3MNaCl中における５mg
のチオール化α−アミラーゼ（75ナノモルの
SH−基を含有する100ナノモル）（前記ａ）か
らのもの）と混合させた。PH7.5である0.1mlの
0.1Mりん酸Naバツフアーを加えそして＋４℃
で18時間反応を行なわしめた。 反応混合物をセフアデツクスＧ−200上でゲ
ル過しついで各フラクシヨンを分析したとこ
ろ使用抗体の80％が接合されたことを示した。
こうして生成された接合体は実質的に２分子で
あつた。また少量の３分子および４分子の物質
も観察できた。接合体は酵素作用および免疫作
用の両方を示した。接合体を含有する各フラク
シヨンを一緒にしそして290μｇ（接合抗
体）／mlに濃縮しついで＋４℃で0.3MNaCl中
に保存した。 実施例 ９ ２−ピリジルジスルフイド基を含有するアルカ
リ性りん酸分解酵素 ４mgのアルカリ性りん酸酵分解素（ホスフアタ
ーゼ）（子牛の腸からのもの、Boehringer
Mannheim AG社製品）をPH7.5である２mlの
0.1mりん酸ナトリウムバツフアー中に溶解し、
これに150μのＮ−スクシンイミジル−３（２
−ピリジルジチオ）プロピオネート（99.5％エタ
ノール中における1.7ミリモル）を加えた。反応
混合物を激しく振盪させた後＋23℃で40分間反応
を継続させた。ついで反応混合物をセフアデツク
スＧ−25上でゲル過した（使用媒体は前述と同
じりん酸塩バツフアーであつた）。 こうして変性されたアルカリ性りん酸分解酵素
は蛋白質１モル当たり１モルのピリジルジスルフ
イド構造を含有した。 実施例 10 ヒツジ−抗ウサギ−IgG−抗体のチオール化 2.5mgのヒツジ−抗ウサギ−IgG−抗体
（Na2SO4沈殿によりヒツジの血清から製造され
た）をPH7.5である0.5mlの0.1Mりん酸Naバツフ
アー中に溶解し、これに40μのＮ−スクシンイ
ミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネ
ート（99.5％エタノール中における1.7ミリモ
ル）を加えた。混合物を激しく振盪させた後＋23
℃で40分間反応を継続させた。過剰の反応成分お
よび他の望ましくない低分子量成分をセフアデツ
クスＧ−25上でのゲル過により除去した（使用
媒体はPH５である0.1M酢酸ナトリウムであつ
た）。ついでこうして得られたヒツジ−抗ウサギ
−IgG−抗体−ピリジルジスルフイド誘導体は50
μの50ミリモルジチオトレイトールをゲル過
からのポイド物質（約1.5ml）に加えることによ
り還元された。この還元は＋23℃で30分間続けら
れた。過剰のジチオトレイトールおよび他の低分
子量成分はセフアデツクスＧ−25上でのゲル過
により除去された（使用媒体は0.3MNaClであつ
た）。こうしてチオール化されたヒツジ−抗ウサ
ギ−IgG−抗体は蛋白質１モル当たり２モルの
SHを含有していた。 実施例 11 ２−ピリジルジスルフイド基含有アルブミン PH7.5である１mlの0.1Mりん酸ナトリウムバツ
フアー中における８mgの人の血清アルブミンを12
μのＮ−スクシンイミジル−３（２−ピリジル
ジチオ）プロピオネート（99.5％エタノール中40
ミリモル）と混合させた。＋23℃で40分間反応さ
せた後反応混合物をセフアデツクスＧ−25上でゲ
ル過した（使用媒体は前記と同じりん酸塩バツ
フアーであつた）。このボイド物質約２mlはアル
ブミン−２−ピリジルジスルフイド誘導体を含有
していた。誘導体の還元後に単離された２−チオ
ピリドンの量を分光光度計で測定したところ置換
割合は2.5モルチオール／モルアルブミンであつ
た。
デート 20mg（0.12ミリモル）のメチル−４−メルカプ
トブチルイミデート塩酸塩、26mg（0.12ミリモ
ル）の２，2′−ジピリジルジスルフイドおよび
0.5mlの氷酢酸を５mlのメタノール中に溶解し
た。反応を1H−NMRで行ないそしてすべてのイ
ミデートが反応した時に（約12時間）混合物を蒸
発乾固させた。1H−NMR（CD3OD）を用いて反
応混合物を分析したところメチル−４−メルカプ
トブチルイミデートに基づいて約20％の収率を示
した。 実施例 ４ Ｎ−スクシンイミジル−２（２−ピリジルジチ
オ）プロピオネート この化合物は３−メルカプトプロピオン酸が２
−メルカプトプロピオン酸に置き換えられる以外
は実施例１に記載のＮ−スクシンイミジル−３
（２−ピリジルジチオ）プロピオネートと同じ方
法で製造された。さらに、合成は約1/10スケール
で実施された。生成物は1H−NMRで分析され
た。 実施例 ５ Ｎ−スクシンイミジル−３（４−ピリジルジチ
オ）プロピオネート この化合物は２，2′−ジピリジルジスルフイド
が４，4′−ジピリジルジスルフイドにより置き換
えられる以外は実施例１に記載のＮ−スクシンイ
ミジル−３（２−ピリジルジチオ）−プロピオネ
ートと同じ方法で製造された。さらに合成は1/10
スケールで実施された。生成物は1H−NMRで分
析された。 実施例 ６ Ｎ−スクシンイミジル−３（５−ニトロ−２−
ピリジルジチオ）プロピオネート この化合物は２，2′−ジピリジルジスルフイド
がビス（５−ニトロ−２−ピリジル）ジスルフイ
ドにより置き換えられる以外は実施例１に記載の
Ｎ−スクシンイミジル−３（２−ピリジルジチ
オ）プロピオネートと同じ方法で製造された。さ
らに合成は1/10スケールで実施された。生成物は
1H−NMRで分析された。 実施例 ７ α−アミラーゼのチオール化 ５mgのα−アミラーゼをPH7.5の0.5mlの0.1Mり
ん酸ナトリウムバツフアー中に溶解し、これに75
μのＮ−スクシンイミジル−３（２−ピリジル
ジチオ）プロピオネート（99.5％EtOH中におけ
る34mM）を加えた。混合物を激しく振盪させた
後反応を＋23℃で40分間継続させた。反応混合物
をセフアデツクスＧ−25（登録商標）
（Pharmacia Fine Chemicals AB社製、エピクロ
ロヒドリンで交叉結合されたデキストランのビー
ズ）上でゲル過した（使用した媒体はPH7.5の
0.3Mりん酸ナトリウムバツフアーであつた）。つ
いでこうして得られたα−アミラーゼピリジルジ
スルフイド誘導体はゲル過から得られた物質
（1.5ml）に50μの50mMジチオトレイトール
（dithiothreitol）を加えることにより還元され
た。還元は＋23℃で20分間継続させた。過剰のジ
チオトレイトールおよび他の低分子量成分はセフ
アデツクスＧ−25上でのゲル過により除去され
た（使用媒体は0.3MNaClであつた）。このような
チオール化されたα−アミラーゼは0.75モル
SH／モル蛋白質を含有することが見出された。 実施例 ８ ヒツジ−抗ウサギ−IgG抗体−α−アミラーゼ
接合体の製法 ａ チオール化α−アミラーゼ チオール化α−アミラーゼは前記実施例７に
したがつて製造された。 ｂ ２−ピリジルジスルフイド基を含有するヒツ
ジ−抗ラビツト−IgG−抗体 1.2mgのヒツジ−抗ウサギ−IgG−抗体（免疫
吸着精製によりヒツジの超免疫血清から調製さ
れた）をPH7.5の0.5mlの0.1Mりん酸ナトリウム
バツフアー中に溶解し、これに15μＮ−スク
シンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）−プ
ロピオネート（EtOH中における5.9mM）を加
えた。溶液を激しく振盪させた後反応を＋23℃
で40分間行なわしめた。過剰の試薬および他の
望ましくない低分子成分をセフアデツクスＧ−
25上でのゲル過により除去した（媒体は
0.3MNaCl）。 こうして変性されたヒツジ−抗ウサギ−IgG
−抗体は蛋白質１モル当り２モルの２−ピリジ
ルジスルフイド基を含有していることが見出さ
れた。 ｃ ヒツジ−抗ウサギ−IgG−抗体−α−アミラ
ーゼ接合体 １mlの0.3MNaCl中における1.2mgのヒツジ−
抗ウサギ−IgG−抗体−２−ピリジルジスルフ
イド（17ナノモルの２−ピリジルジスルフイド
基を含有する８ミリモルの蛋白質）（前記ｂか
らのもの）を２mlの0.3MNaCl中における５mg
のチオール化α−アミラーゼ（75ナノモルの
SH−基を含有する100ナノモル）（前記ａ）か
らのもの）と混合させた。PH7.5である0.1mlの
0.1Mりん酸Naバツフアーを加えそして＋４℃
で18時間反応を行なわしめた。 反応混合物をセフアデツクスＧ−200上でゲ
ル過しついで各フラクシヨンを分析したとこ
ろ使用抗体の80％が接合されたことを示した。
こうして生成された接合体は実質的に２分子で
あつた。また少量の３分子および４分子の物質
も観察できた。接合体は酵素作用および免疫作
用の両方を示した。接合体を含有する各フラク
シヨンを一緒にしそして290μｇ（接合抗
体）／mlに濃縮しついで＋４℃で0.3MNaCl中
に保存した。 実施例 ９ ２−ピリジルジスルフイド基を含有するアルカ
リ性りん酸分解酵素 ４mgのアルカリ性りん酸酵分解素（ホスフアタ
ーゼ）（子牛の腸からのもの、Boehringer
Mannheim AG社製品）をPH7.5である２mlの
0.1mりん酸ナトリウムバツフアー中に溶解し、
これに150μのＮ−スクシンイミジル−３（２
−ピリジルジチオ）プロピオネート（99.5％エタ
ノール中における1.7ミリモル）を加えた。反応
混合物を激しく振盪させた後＋23℃で40分間反応
を継続させた。ついで反応混合物をセフアデツク
スＧ−25上でゲル過した（使用媒体は前述と同
じりん酸塩バツフアーであつた）。 こうして変性されたアルカリ性りん酸分解酵素
は蛋白質１モル当たり１モルのピリジルジスルフ
イド構造を含有した。 実施例 10 ヒツジ−抗ウサギ−IgG−抗体のチオール化 2.5mgのヒツジ−抗ウサギ−IgG−抗体
（Na2SO4沈殿によりヒツジの血清から製造され
た）をPH7.5である0.5mlの0.1Mりん酸Naバツフ
アー中に溶解し、これに40μのＮ−スクシンイ
ミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネ
ート（99.5％エタノール中における1.7ミリモ
ル）を加えた。混合物を激しく振盪させた後＋23
℃で40分間反応を継続させた。過剰の反応成分お
よび他の望ましくない低分子量成分をセフアデツ
クスＧ−25上でのゲル過により除去した（使用
媒体はPH５である0.1M酢酸ナトリウムであつ
た）。ついでこうして得られたヒツジ−抗ウサギ
−IgG−抗体−ピリジルジスルフイド誘導体は50
μの50ミリモルジチオトレイトールをゲル過
からのポイド物質（約1.5ml）に加えることによ
り還元された。この還元は＋23℃で30分間続けら
れた。過剰のジチオトレイトールおよび他の低分
子量成分はセフアデツクスＧ−25上でのゲル過
により除去された（使用媒体は0.3MNaClであつ
た）。こうしてチオール化されたヒツジ−抗ウサ
ギ−IgG−抗体は蛋白質１モル当たり２モルの
SHを含有していた。 実施例 11 ２−ピリジルジスルフイド基含有アルブミン PH7.5である１mlの0.1Mりん酸ナトリウムバツ
フアー中における８mgの人の血清アルブミンを12
μのＮ−スクシンイミジル−３（２−ピリジル
ジチオ）プロピオネート（99.5％エタノール中40
ミリモル）と混合させた。＋23℃で40分間反応さ
せた後反応混合物をセフアデツクスＧ−25上でゲ
ル過した（使用媒体は前記と同じりん酸塩バツ
フアーであつた）。このボイド物質約２mlはアル
ブミン−２−ピリジルジスルフイド誘導体を含有
していた。誘導体の還元後に単離された２−チオ
ピリドンの量を分光光度計で測定したところ置換
割合は2.5モルチオール／モルアルブミンであつ
た。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 式 R1−Ｓ−Ｓ−Ａ−Ｚ （） 〔式中、R1は２−ピリジル、５−ニトロ−２
−ピリジルまたは４−ピリジルであり、Ａは１〜
６個の炭素原子を有する炭化水素残基でありそし
てＺは基 【式】または 【式】 （式中ｎは２または３であり、R1は前記R1と
同じ定義を有しそしてそれに等しく、R2はメチ
ルまたはエチルである）であるかまたは上記最後
の基の酸付加塩である〕を有する新規なピリジン
化合物。 ２ 式中R1が２−ピリジルであり、Ａが−CH2−
CH2−でありそしてＺが基 である前記第１項による化合物。 ３ 式中R1が２−ピリジルであり、Ａが−CH2−
CH2−でありそしてＺが基 である前記第１項による化合物。
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| SE7702462A SE430062B (sv) | 1977-03-04 | 1977-03-04 | Kopplings- eller tioleringsreagens |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS53130674A JPS53130674A (en) | 1978-11-14 |
| JPS6121227B2 true JPS6121227B2 (ja) | 1986-05-26 |
Family
ID=20330623
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2406678A Granted JPS53130674A (en) | 1977-03-04 | 1978-03-04 | Novel pyridine compound |
| JP60290918A Granted JPS61191675A (ja) | 1977-03-04 | 1985-12-25 | 巨大分子物質 |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60290918A Granted JPS61191675A (ja) | 1977-03-04 | 1985-12-25 | 巨大分子物質 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4149003A (ja) |
| JP (2) | JPS53130674A (ja) |
| DE (1) | DE2808523A1 (ja) |
| FR (1) | FR2382450A1 (ja) |
| GB (1) | GB1597756A (ja) |
| SE (1) | SE430062B (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US11555240B2 (en) | 2019-12-20 | 2023-01-17 | Posco Holdings Inc. | Black plated steel sheet and manufacturing method thereof |
Families Citing this family (51)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2430943A1 (fr) * | 1978-07-13 | 1980-02-08 | Toyo Jozo Kk | Nouveaux derives disulfures |
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