JPH0617914B2 - 抗原抗体反応の測定方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、抗原抗体反応の測定方法に関する。

従来、不溶性担体粒子に担持させた抗体又は抗原と抗原
又は抗体あるいはその混合物とを液体媒体中で反応さ
せ、その反応の進行に伴う反応混合物の透過率の減少
（すなわち吸光度の増加）からその抗原抗体反応の速度
を測定し、さらにその速度から被検体中の抗原又は抗体
の濃度を定量する方法が知られている。

そして、この方法によれば、抗原又は抗体の濃度を高い
精度で、迅速に定量しうる。

しかしながら、たとえば抗体を感作した不溶性担体の場
合、抗原分子数が抗体分子数に比して過剰な領域では、
過剰な抗原が本来ならば粒子の凝集に寄与しうる抗体を
ブロックしてしまい、みかけ上、抗原抗体反応の進行が
阻害される、いわゆる抗原過剰域として知られる現象が
みられ（抗体と抗原が入れ替っても同様である）、この
ような場合には、一つの反応速度に対応して複数の濃度
が存在することになる。

臨床検査においては、上記抗原過剰を呈するような抗体
の出現頻度は小さく、またそういう場合には、他の臨床
知見から注意書きが添えられるので、予め検体を希釈し
て検査に供するのが一般であった。しかるに、自動機械
の出現により、短時間に大量の検体を処理するときに
は、出現頻度はきわめて小さいとはいえ、臨床的に重要
なこの種の抗原過剰検体を発見する技術が必要とされ
る。

たとえば、このような場合、正確な測定を行なうために
は、同一検体に対して希釈率を変えて２度以上の測定を
行なう２回希釈法等をいつも行なう必要がある。

そこで、本発明者らは、自動化による多数検体の迅速処
理にさらに好適な測定方法を見出すべく種々検討した結
果、本発明に到達した。

すなわち、本発明の要旨は、不溶性担体粒子に抗体又は
抗原を支持させ、この支持された抗体又は抗原に、抗原
又は抗体あるいはその混合物を液体媒体中で反応させ
て、この反応混合物に反応開始後２以上の時点で光を照
射し、一定時間内におけるその反応混合物の透過率の減
少を測定する方法において、抗原又は抗体の濃度既知の
試料を用いて得られる反応速度と濃度の対応曲線におい
て、一つの反応速度に複数の濃度が対応する場合に、こ
の対応曲線から未知試料中の抗原又は抗体の濃度を決定
するにあたり、i)抗原又は抗体の濃度既知の試料を用い
て透過率の時間的変化を特徴づける曲率の大きさを測定
し、これと上記対応曲線とから、濃度を一義的に決定し
うる濃度測定可能領域の判定基準を設定し、ついでii)
既知試料の透過率の時間的変化を特徴づける曲率の大き
さを測定し、その曲率の大きさからその抗原又は抗体の
濃度が上記濃度測定可能領域に属するか否かを判定し、
iii)属する場合には、その反応速度より未知試料中の抗
原又は抗体の濃度を決定する、ことよりなることを特徴
とする抗原抗体反応の測定方法にある。

以下、本発明を詳細に説明する。

上記のとおり、本発明は不溶性担体粒子に抗体又は抗原
を支持させ、この支持された抗体又は抗原に、抗原又は
抗体あるいはその混合物を液体媒体中で反応させて、こ
の反応混合物に反応開始後２以上の時点で光を照射し、
一定時間内におけるその反応混合物の透過率の減少率を
測定する方法において適用される。すなわち、平均粒径
が1.６μ程度以下、好ましくは0.１〜1.０μの不溶性担
体粒子を用い、これに抗体又は抗原を担持させ（感作
し）、これに被検体中の抗原及び／又は抗体を反応さ
せ、その反応混合物の透過率を、通常0.４〜2.４μ、好
ましくは0.６〜1.４μの範囲の波長の光線で測定してそ
の反応速度を求めることにより、被検体中の抗原及び／
又は抗体の濃度を測定することができる。用いる光線
は、不溶性担体粒子の平均粒径の少なくとも1.１倍の波
長のものが好適である。

不溶性担体粒子としては、測定を行なう時に用いられる
液体媒体に実質的に不溶性で前記平均粒径を有する有機
高分子物質の微粒子、たとえばポリスチレン、スチレン
−ブタジエン共重合体のような乳化重合により得られる
有機高分子のラテックス、あるいはシリカ、シリカ−ア
ルミナ、アルミナのような無機酸化物等が用いられる。

本発明方法においてはこのような不溶性担体粒子（たと
えばラテックス粒子）に、測定しようとする被検体中の
抗原及び／又は抗体と反応しうる抗体又は抗原を担持さ
せる（感作する。）この場合、担体に対し抗体又は抗原
を物理的に吸着させてもよいし、化学的に吸着させても
よい。抗体は蛋白質で構成されており、一方抗原はたと
えば蛋白質、ポリペプチド、ステロイド、多糖類、資
質、花粉粉種々のものからなる。不溶性担体粒子にこの
ような抗体又は抗原を担持させる方法はすでに多くの方
法が提案されている。不溶性担体にたとえばハプテンの
ような不完全抗原を担持させる場合は、その担体をたと
えばカップリング剤により化学的に変性して、その抗原
を化学的に吸着させるのが有利である。

上記抗体又は抗原を感作した不溶性担体粒子（たとえば
ラテックス粒子）の濃度が通常0.０１重量％以上の懸濁
液、好ましくは0.１−１重量％程度の懸濁液を用いる。

前記感作担体を液体媒体中において、抗原又は抗体ある
いはその混合物と実質的に一定条件下で反応させ、反応
開始後の一定時間後の反応混合物の単位時間当りの透過
率の減少率を測定することにより抗原抗体反応を定量的
に測定しうる。この減少率の測定は、反応混合物の構成
成分である感作担体と被検液中の抗原又は抗体あるいは
その混合物（又はそれらの反応生成物）との反応開始
後、抗原抗体反応の進行が少なくとも安定した時点以後
において行うのが望ましい。

このためには、感作担体と、抗原又は抗体を含む被検液
とを、好ましくは攪拌下に混合し、好ましくは混合後た
とえば２〜３秒以後の反応混合物について、その透過率
を測定するのが好適である。

このような抗原抗体反応の測定方法は、たとえば以下の
ようにして実施しうる。

まず、ある一定の平均粒径を有する不溶性担体にある一
定の抗原又は抗体を感作して感作担体を調製する。他
方、実際に測定しようとする被検液中に含有される抗体
又は抗原あるいはその混合物と同一の抗体又は抗原を用
いて、それを種々の既知濃度で被検液の媒体と同一又は
ほぼ同一の液体媒体中に含有する種々の濃度の標準被検
液を調製する。

次に、上記感作担体と上記標準被検液とを用いて、両者
を混合させ、両者の抗原抗体反応の進行状態が安定した
段階で、経時的に上記反応混合物の透過率を測定する。

たとえば、反応混合物の透過率が定常的に減少する段階
において、前記各種濃度の被検液について、その各反応
混合物の単位時間当りの透過率の減少率を測定する。

次に、この減少率を、たとえば、標準被検液中の抗原又
は抗体濃度を横軸とし、たとえば減少率を縦軸としたグ
ラフにプロットすると、標準被検液中の抗原又は抗体濃
度と、反応混合物の透過率の単位時間当りの減少率（反
応速度）との対応曲線が得られる。

そこで、特定の抗原又は抗体について、予め上記のよう
な対応曲線を作成しておき、それと同一の抗体又は抗原
を含有する濃度未知の被検液について、前記と同様の反
応速度を測定し、これを前記対応曲線と対比することに
より、被検液中に含有させる抗体又は抗原の濃度を定量
的に測定しうる。

本発明は、上記の測定法において、既知濃度の試料を用
いて、得られる反応速度と濃度の対応曲線において、一
つの反応速度に複数の濃度が対応する場合に、この対応
曲線から未知試料の濃度を測定するのに有用である。

すなわち、抗原濃度未知の試料の反応速度を測定して、
濃度を決定するためには、 1)予め既知試料の測定によって、抗原濃度と反応速度の
対応曲線が求められていること、 2)未知試料の反応速度と、この対応曲線から、濃度が一
義的に求まること、 が必要であるが、2)は一般的には成立しない。すなわ
ち、抗原濃度の増加とともにはじめは反応速度も増加す
るが、途中から反応速度の増加の度合いが低下する領域
が出現し、さらに抗原濃度が増大すると、むしろ反応速
度が減少する領域が現われる（第４図、第７図の破線
部）。

また、減少してから再度増加、減少する場合もある（第
１図の破線部）。

このような場合には、一つの反応速度に複数の濃度が対
応するため、未知試料の濃度が一義的に定まらない。

この現象は、たとえば次のような原因によると考えられ
る。

ラテックス試薬が凝集するには、１つの抗原分子に対し
て、異なったラテックス粒子表面に吸着している抗体分
子が結合することが必要である。ところが、抗体分子数
に比して大過剰の抗原分子が存在すると、それぞれの抗
体分子が単独に一分子ずつの抗原と結合して、粒子間の
結合が成立しない状態となるため、抗原は増加するにも
かかわらず、むしろ反応速度は低下するという結果にな
る。

同様の現象は、多価抗原と抗体との、凝集物（抗原抗体
複合物）の生成量と抗原濃度との関係において広く知ら
れており、こうした現象のおこる抗原濃度域は、抗原過
剰域とよばれている。

このような現象がおこる領域においては、存在する抗原
量に見合ったラテックス凝集反応が期待できないか、又
は、抗原料に見合った透過率変化が期待できないわけで
あるから、未知試料の濃度測定には不適当な領域ともい
える。

したがって、未知試料の濃度測定に際しては、その抗原
濃度が、濃度測定可能領域にあるかどうかをまず、判定
する必要がある。判定の結果、その領域内であることが
わかれば、反応速度と対応曲線から濃度を一義的に定め
ることができる。濃度測定不能の領域であることがわか
れば、試料を希釈して測定可能領域になるようにして測
定することができる。

そこで、本発明の測定方法についてさらに説明するに、
まず、既知濃度の試料を用いて透過率の時間的変化を特
徴づける曲線の大きさを測定する。この曲率は透過率が
反応の進行とともに減少する程度及びその時間に対する
依存性から定量的に導出される値であって、この定量化
は、反応曲線の時間的変化を表わす種々のパラメーター
（たとえば、特定時間内での平均変化速度、その一次及
び二次差分値、特定時刻での透過率、あるいはその特定
時刻での一次または二次の微分値、又は上記パラメータ
ーの加減乗除による組み合せ）によって適宜決定するこ
とができる。

透過率の時間的変化速度が抗原抗体反応の進行とともに
減少する割合、及びその時間依存性から反応曲線の曲率
を求め、濃度測定可能領域を判定するための具体的な手
順はたとえば以下のとおりである。

(1)一定間隔Δｔで（ｎ−１）個に区切られたある時間
区間〔t₁，t₂，……t_n〕（t_i−t_i-1＝Δｔ）において、
各時刻t_iにおける透過率の値をx_i（ｉ＝１、２、……、
ｎ）としたとき、ｎ個の（t_i，x_i）の組を使って透過率
(x)を時間(t)の２次式で最小２乗近似した近似式 ｘ＝at²＋bt＋ｃ（ａ、ｂ、ｃは定数）を求める。この
とき、反応曲線の曲率は係数ａの大きさによって表わさ
れるので、濃度測定可能領域の判定基準として測定され
た反応曲線に対する近似式の係数ａが ａ＜ｋ（ｋは定数） のとき得られる反応曲線は測定可能領域に属する。

なお、ここでｋは、濃度既知の試料を同一測定条件下で
反応させた時の反応速度と濃度との対応曲線及び上記手
順で求められる近似２次式の係数ａとから予め定められ
る定数である。

また反応速度とは、ｎ個の（t_i，x_i）の組を使って常法
に従い求められた透過率の時間変化速度であって、最も
簡単にはＶ＝(x_n-x₁)/(t_n-t₁)として平均値を求めても
よく、あるいは、ｎ個の(t_i,x_i)からｘ＝αｔ＋βの形
の一次近似式を最小２乗法によって求めてもよく、その
他、通常考えられる一般に知られた如何なる手順によっ
て定めてもよい。

(2)(1)と同様に定められた時間区間〔t₁，ｔ₂，……
t_n〕（ｉ＝１，……，ｎ，t_i-t_i-1＝Δｔ）において、
時刻〔t_i,t_i-1〕（ｉ＝２，……，ｎ）における透過率
の平均変化率をV_i（ｉ＝２，……，ｎ）とするとき、 v_k＞v_k-1（２≦ｋ≦ｎを満たす定数） が成り立つならば、得られた反応曲線は濃度測定可能領
域に属する。

なお、ここでｋは濃度既知の試料を同一測定条件下で反
応させたときの反応速度と濃度との対応曲線及び上記手
順で定められる平均変化率v_iから定められる定数であ
る。

(3)(2)において v₂−v_n＞α が成り立つならば、得られた反応曲線は測定可能領域に
属する。

ここでαは濃度既知の試料を同一測定条件下で反応させ
た時の反応速度と濃度との反応曲線及び上記手順で定め
られる平均変化率（v₂，v_n）の各組（測定した濃度既知
の試料の数だけ得られる）から定められる定数である。

(4)(2)において （t_n-t₁)v₂-x_n＞β が成り立つならば、得られた反応曲線は測定可能領域に
属する。

ここでβは濃度既知の試料を同一測定条件で反応させた
時の反応速度と濃度との対応曲線及び上記手順で定めら
れる平均変化率（v₁,x_n）の各組（測定した濃度既知の
試料の数だけ得られる）から定められる定数である。

(5)(1)において透過率x_i（ｉ＝１，……，ｎ）の中から
一連のｍ個のx_iによって定められる移動平均y_i y_i＝（x_i+x_i-1＋……＋x_i-m+1）／ｍ（ｉ＝ｍ，……，
ｎ） を求めて不規則ノイズによるバラツキを除去した後、
（ｎ−ｍ＋１）個の（t_i,y_i）の組を得る。ついで、あ
る時間区間〔t_s，……，t_f〕（１≦ｓ＜ｆ≦ｎ）に対応
する（t_i,y_i）の組について透過率ｙを時間ｔの２次式
で最小２乗近似した近似式 ｙ＝at²＋bt＋ｃ（ａ，ｂ，ｃは定数） を求める。係数ａが ａ＜ｋ（ｋは定数） のとき、得られた反応曲線は測定可能領域に属する。

ここでｋは、濃度既知の試料を同一測定条件下で反応さ
せた時の反応速度と濃度との対応曲線及び上記手順で求
められる近似２次式の係数ａとから予め定められる定数
である。

(6)(5)に述べた手順で求められた係数ａと(1)に述べた
手順で求められた反応速度Ｖとから、新たな曲率の指標
として Ｒ＝−ａ／Ｖを求める。

指標Ｒが Ｒ＞ｋ（ｋは定数） のとき、得られた反応曲線は測定可能領域に属する。

ここでｋは濃度既知の試料を同一測定条件下で反応させ
たときの反応速度と濃度との対応曲線及び上記手順で得
られた指標Ｒとから定められる定数である。

(7)(1)と同様にして定められた時間区間〔t₁，……，
t_n〕において、各時刻t_iにおける透過率の値をx_i（ｉ＝
１，……，ｎ）としたとき、一連のｍ個のx_iによって定
められる移動平均y_iを y_i＝（x_i+x_i-1＋……＋x_i-m+1)/m （ｉ＝ｍ，……，ｎ） として定める。次にy_iの差分D⁽¹⁾ _iを D⁽¹⁾ _i＝y_i-y_i-1（ｉ＝m+1，……，ｎ） 及びD⁽¹⁾ _iの差分D⁽²⁾ _iを D⁽²⁾ _i＝D⁽¹⁾ _i−D⁽¹⁾ _i-1（ｉ＝m+2，……，ｎ） として求め、D⁽²⁾ _iの最大値Ｍを求める。

Ｍ＝max｛D⁽²⁾ _i｝（ｉ＝m+2，……，ｎ） この最大値Ｍに対して Ｍ＜ｋ（ｋは定数） のとき、得られた反応曲線は測定可能領域に属する。

ここでｋは濃度既知の試料を同一測定条件下で反応させ
たときの反応速度と濃度との対応曲線及び上記手順で得
られた最大値Ｍとから定められる定数である。

以上のように、本発明方法においては、既知濃度の試料
を用いて曲率の大きさを測定し、反応測定と濃度との対
応曲線とより、濃度測定可能領域の判定基準が設定され
る。

ついで本発明方法においては、未知試料について上記曲
率の大きさを測定し、上記判定基準により、未知試料の
濃度が測定可能領域に属するか否かを判定することがで
きる。属する場合にはその反応速度より濃度を一義的に
決定することができる。一方、属さない場合には、試料
を希釈して測定可能領域に属するようにして測定後、濃
度を決定することができる。

本発明に係る抗原抗体反応の測定方法は、上記のとお
り、短時間に大量の検体を処理する場合に特に有用であ
る。

以下、実施例によりさらに本発明を詳細に説明する。

実施例１ (1)抗α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）抗体感作ラテッ
クス試薬の調製 ＡＦＰに対する抗体をラテックス粒子（粒径0.２２０μ
ｍ、ダウケミカル社製品）当り８００〜１５００個相当
量となるように0.２Ｍトリス緩衝液に溶解し、等量のラ
テックス−トリス緩衝液と室温で攪拌下に混合し、充分
感作させる。遠心分離後上清を除去し、適当量の牛血清
アルブミンで処理し、感作ラテックス試薬を得る。

(2)測定方法 測定は免疫血清検査装置“ＬＰＩＡ”システム（三菱化
成工業社製）を用いて行なった。

アクリル樹脂製角セル（光路長７mm）に種々の抗原濃度
の試料溶液５０μをとり、0.１％牛血清アルブミンを
含む0.２Ｍトリス緩衝液２００ｍを加え混合する。こ
れをセルホルダーに装着して、測定装置にセットする。
また、装置側には、(1)で調製したラテックス試薬と上
記トリス緩衝液をセットしておく。

測定を開始すると、装置は自動的にラテックス試薬５０
μと緩衝液２００μをセルに注入し攪拌（１０００
ｒｐｍ）し、測光を開始する。

測光データは、２秒おきに６００ｍｓｅｃ間の透過率に
対応する電圧の積算値(A)として得られる。測定は１分
間行なうので、３０点のデータ（Ａ(1)〜Ａ(30)）が得
られる。

(3)データ処理 （反応速度Ｖの計算） Ａ(i)と時間ｔ(i)との間にＡ(i)＝ｐ・ｔ(i)＋ｑなる形
の回帰式を仮定し、ｔ＝３０〜６０秒に対応するＡ(15)
〜Ａ(30)の値から最小２乗法によりp,qの値を決定し、
次式 Ｖ＝−Ｐ／Ａ(15)×１０^４ (i) から、反応速度を計算する。

（曲率ａ′値の計算） Ａ(i)と時間ｔとの間に Ａ(i)＝ａ・ｔ(i)²＋ｂ・ｔ(i)＋ｃ なる形の回帰式を仮定し、ｔ＝３０〜６０秒に対応する
Ａ(15)〜Ａ(30)の値から係数ａ、ｂ、ｃを求め次式 ａ′＝−ａ／Ａ(15)×１０^５ (ii) からａ′値を計算する。

(4)結果 ＡＦＰ濃度２９ng／ｍ〜213,000ng/mの濃度既知試
料を用いて、反応速度と濃度との反応曲線を求めた結果
を第１図に示す。この結果よりＡＦＰ濃度９００ng/m
まではＡＦＰの濃度の増加とともに反応速度(V)は単調
に増加しているが、1600ng/m以上では反応速度はほゞ
一定値に停滞している。このことは、９００ng/mまで
は、試料中の抗原ＡＦＰとラテックス上の抗体との反応
に伴ない、ラテックス担体の凝集が進行するが、ＡＦＰ
3,000ng/m以上では、抗体分子数に比して、大過剰の
抗原分子が存在するので、それぞれの抗体分子は単独に
一分子ずつの抗原と結合する結果、ラテックスの凝集が
進行し得なくなっていることを示している。

一方、上記試料により測定された曲率ａ′値は、第２図
にみられるように反応速度がＡＦＰ濃度とともに単調に
増加している範囲では全域にわたってａ′＞−３×１０
^-5であり、逆に不能領域ではａ≦−３×１０^-5であっ
た。この結果より、ａ′＞−３×１０^-5が成立すること
を、試料濃度が濃度測定可能領域に属するか否かの判定
基準とした。

また、濃度測定可能領域の反応速度ＶとＡＦＰ濃度Ｃと
の関係は、近似的に logV＝0.2809(logC)²-0.1016logC-0.2010 (iii) （ただし、５≦Ｃ≦１４００） で表わされる。

次に、第３図のフローチャートに従って未知試料を測定
し、データ処理を行なったところ、ａ′＝−0.６１×１
０^-5となったので、濃度測定可能領域と判定した。Ｖ＝
25.361を(iii)式に代入して、試料の濃度Ｃ＝３７９ng/
mを得た。

実施例２ (1)抗Ｃ反応性蛋白（ＣＲＰ）抗体感作ラテックス試薬
の調製 抗体として抗ＣＲＰ抗体を用いた以外は、実施例１と同
様に調製した。

(2)測定方法 実施例１に同じ (3)データ処理 （反応速度Ｖの計算） 実施例１と同様である。

（曲率Ｍ値の計算） Ａ(4)〜Ａ(30)の２７点のデータ（Ａ(1)〜Ａ(3)は反応
初期の不均一性がデータに反映されているので除く）を
３つ毎に平均値をとって、ｙ(1)〜ｙ(9)とする。すなわ
ち、 次に、ｙ(1)〜ｙ(9)の２次差分値Ｄ⁽²⁾(3)〜Ｄ⁽²⁾(9)を
求める。

すなわち、 D⁽¹⁾(j)＝ｙ(j)−ｙ(j-1) （ｊ＝２〜９） D⁽²⁾(j)＝D⁽¹⁾(j)−D⁽¹⁾(j-1) （ｊ＝３〜９）
(v) さらに、このD⁽²⁾(3)〜D⁽²⁾(9)値のうち、最大のものを
Ｍ値とする。

(4)結果 ＣＲＰ６2.５ng〜229,000ng/mの濃度既知試料を用い
て、反応速度と濃度との対応曲線を求めた結果を第４図
に示す。

一方、曲率Ｍ値と濃度との対応曲線は、第５図のように
なる。第４と第５図を比較して、判定基準をＭ＜５０が
成立することとすると、濃度測定可能領域を、不能領域
と区別できることを見出した。

濃度測定可能領域における反応速度ＶとＣＲＰ濃度Ｃと
の関係は近似的に次式で表わされる。

logV＝0.0486(logC)²+0.8513logC-1.666 (vi) （４８≦Ｃ≦５５００） 続いて未知試料を第６図のフローチャートに従って測
定、データ処理を行なったところＭ＝５７５となり、濃
度測定不能領域であった。そこで試料を２０倍希釈し、
再測定したところＭ＝１８と測定可能領域に入ったの
で、反応速度Ｖを計算し、Ｖ＝6.７７５となった。この
結果と(vi)式よりＣＲＰ濃度はＣ＝363×２０＝7260ng/
mと計算される。

実施例３ (1)抗β_２−ミクログロブリン抗体感作ラテックス試薬
の調製 抗体として抗β_２−ミクログロブリン抗体を用いた以外
は実施例１と同様にして調製した。

(2)測定方法も実施例１と同様である。

(3)データ処理 （反応速度Ｖの計算） 実施例１と同様である。

（曲率Ｒの計算） Ａ(4)〜Ａ(30)の３項の移動平均ｙ(i)を求め、ｙ(26)〜
ｙ(30)の反応終期のデータと時間ｔ(i)との間に ｙ(i)＝at(i)²＋bt(i)＋ｃ なる回帰式を仮定し最小２乗法によって２次の係数ａ値
を求める。

(4)結果 β_２−ミクログロブリン３1.３ng/m〜157,000ng/m
の濃度既知試料を用いて、反応速度と濃度との対応曲線
を求めた結果を第７図に示す。曲率ａ値と抗原濃度との
対応曲線は第８図のようになる。第７、８図からａ＞０
を濃度測定可能領域の判定基準と定めた。

濃度測定可能領域における反応速度Ｖと抗原濃度Ｃとの
間には、次式が近似的に成立した。

logV＝0.000529(logC)²+1.107logC-1.440 (vii) （２０≦Ｃ≦１９００） ３つの未知試料Ａ、Ｂ、Ｃを第９図のフローチャートに
従って測定し、濃度を求めた結果を次に示す。

実施例４ (1)ラテックス試薬、測定試料、データ及び得られた反
応速度は実施例３と同様である。

(2)曲率Ｒの計算 Ａ(4)〜A(30)の３項の移動平均ｙ(i)と時間ｔ(i)との間
に ｙ(i)＝at(i)²＋bt(i)＋ｃ なる回帰式を仮定し、ｉ＝６〜１０の反応初期データか
ら最小２乗法により２次の係数ａを求め、さらに反応速
度Ｖとから Ｒ＝−ａ／Ｖ×１０^３ (viii) を求める。

(3)結果 第１０図に、試料中の抗原濃度と曲率Ｒの対応曲線を示
した。濃度測定可能領域にはＲ＞１５が対応することが
見出されたので、これを判定基準とした。

実施例３で測定した未知試料Ａ、Ｂ、Ｃを曲率Ｒを用い
て、第１１図のフローチャートに従って判定した結果
は、下記のように実施例３と一致した。

試料名 Ｒ値 Ａ １3.７ 濃度測定不能領域 Ａ２０倍希釈 ３5.０ 濃度測定可能領域 Ｂ ６9.４ 〃 Ｃ ２1.４ 〃

【図面の簡単な説明】

第１図は抗ＡＦＰ抗体感作ラテックス試薬による試料中
の抗原濃度と、反応速度との対応曲線を示したものであ
る。図中の実線部は、濃度測定可能領域に、破線部は濃
度測定不能領域に対応している。 第２図は抗ＡＦＰ抗体感作ラテックス試薬による試料中
抗原濃度と、実施例１で定義した曲率ａ′値との対応曲
線である。図中の実線部、破線部の対応は第１図と同様
である。 第３図は抗ＡＦＰ抗体感作ラテックス試薬を用いて未知
試料の濃度を求める手順を示したフローチャートであ
る。 第４図は抗ＣＲＰ抗体感作ラテックス試薬による試料中
の抗原濃度と、反応速度との対応曲線を示す（図中の実
線部、破線部の対応は第１図と同様。）。 第５図は、同試薬による抗原濃度と実施例２で定義した
曲率Ｍ値との対応曲線である（実線部、破線部は前記と
同様。）。 第６図は、同試薬を用いて未知試料中のＣＲＰ濃度を求
める手順を示したフローチャートである。 第７図は抗β_２−ミクログロブリン抗体感作ラテックス
試薬による対応曲線であり（実線部、破線部の対応は前
記と同様）、第８図は抗原濃度と曲率ａ値との対応曲線
である。 第９図は、同試薬を用いて未知試料中のβ_２−ミクログ
ロブリン濃度を、実施例３に従って求める手順を示した
フローチャートである。 第１０図は第７、８図と同一のデータから実施例４に従
って求めた曲率Ｒと試料中抗原濃度との対応曲線である
（実線部、破線部の対応は前記と同様）。 第１１図は実施例４に従って、未知試料中のβ_２−ミク
ログロブリン濃度を求める手順を示したフローチャート
である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 松本 紳一郎 神奈川県横浜市緑区鴨志田町1000番地 三 菱化成工業株式会社総合研究所内 (56)参考文献 特開 昭53−13492（ＪＰ，Ａ) 臨床病理 臨時増刊 特集第53号 臨床 検査のためのイムノアッセイ−技術と応用 −（1983．２．28）日本臨床病理学会Ｐ. 71−81 ＣＬＩＮＩＣＡＬ ＣＨＥＭＩＳＴＲ Ｙ，Ｖｏｌ．23，Ｎｏ．８（1977）Ｐ. 1456−1464

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】不溶性担体粒子に抗体又は抗原を支持さ
   せ、この支持された抗体又は抗原に、抗原又は抗体ある
   いはその混合物を液体媒体中で反応させて、この反応混
   合物に反応開始後２以上の時点で光を照射し、一定時間
   内におけるその反応混合物の透過率の減少を測定する方
   法において、抗原又は抗体の濃度既知の試料を用いて得
   られる反応速度と濃度の対応曲線において、一つの反応
   速度に複数の濃度が対応する場合に、この対応曲線から
   未知試料中の抗原又は抗体の濃度を決定するにあたり、 i)抗原又は抗体の濃度既知の試料を用いて透過率の時間
   的変化を特徴づける曲率の大きさを測定し、これと上記
   対応曲線とから、濃度を一義的に決定しうる濃度測定可
   能領域の判定基準を設定し、 ついでii)未知試料の透過率の時間的変化を特徴づける
   曲率の大きさを測定し、その曲率の大きさからその抗原
   又は抗体の濃度が上記濃度測定可能領域に属するか否か
   を判定し、 iii)属する場合にはその反応速度より未知試料中の抗原
   又は抗体の濃度を決定する、 ことよりなることを特徴とする抗原抗体反応の測定方
   法。