JPH06181793A - シュードモナス アエルギノーザと反応するモノクロナール抗体 - Google Patents
シュードモナス アエルギノーザと反応するモノクロナール抗体Info
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- JPH06181793A JPH06181793A JP4228988A JP22898892A JPH06181793A JP H06181793 A JPH06181793 A JP H06181793A JP 4228988 A JP4228988 A JP 4228988A JP 22898892 A JP22898892 A JP 22898892A JP H06181793 A JPH06181793 A JP H06181793A
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- monoclonal antibody
- pseudomonas aeruginosa
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/12—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria
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- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【目的】 シュードモナス アエルギノーザと反応する
モノクロナール抗体。 【構成】 シュードモナス アエルギノーザ(Pseudomon
as aeruginosa)の菌株と反応し、シュードモナスの菌株
並びに他のグラム- 陰性- 又はグラム- 陽性菌と反応し
ないモノクロナール抗体。
モノクロナール抗体。 【構成】 シュードモナス アエルギノーザ(Pseudomon
as aeruginosa)の菌株と反応し、シュードモナスの菌株
並びに他のグラム- 陰性- 又はグラム- 陽性菌と反応し
ないモノクロナール抗体。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、シュードモナス アエ
ルギョーザと反応するモノクロナール抗体、これをシュ
ードモナスアエルギノーザの検出に使用すること、これ
を含有する検定キット及びこれを産生するハイブリドー
マに関する。
ルギョーザと反応するモノクロナール抗体、これをシュ
ードモナスアエルギノーザの検出に使用すること、これ
を含有する検定キット及びこれを産生するハイブリドー
マに関する。
【０００２】
【従来の技術】シュードモナス アエルギノーザは、弱
った患者、たとえばやけど、白血病性貧血患者又はのう
胞性線維症の患者に於て、感染の最も一般的病原体の１
つである。適する、普遍的に適用できかつ容易に扱うこ
とができ、これを確実に検出するための剤は、従来全く
開示されていない。
った患者、たとえばやけど、白血病性貧血患者又はのう
胞性線維症の患者に於て、感染の最も一般的病原体の１
つである。適する、普遍的に適用できかつ容易に扱うこ
とができ、これを確実に検出するための剤は、従来全く
開示されていない。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】それ故に本発明の目的
は、このような剤を提供することにある。
は、このような剤を提供することにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者は、シュードモ
ナス アエルギノーザの菌株と反応し、シュードモナス
の他の菌株及び他のグラム- 陰性- 又はグラム陽性菌と
反応しないことを特徴とするモノクロナール抗体によっ
てこの目的が達成されることを見い出した。
ナス アエルギノーザの菌株と反応し、シュードモナス
の他の菌株及び他のグラム- 陰性- 又はグラム陽性菌と
反応しないことを特徴とするモノクロナール抗体によっ
てこの目的が達成されることを見い出した。
【０００５】本発明によるモノクロナール抗体は、Ｉｇ
Ｍ、ＩｇＧ及びＩｇＡクラスに属するのが好ましい。こ
れらは特にＩｇＧ1 クラスに属するのが好ましい。特に
好ましい本発明によるモノクロナール抗体は、６０ＫＤ
ａ熱- ショックたん白上で種- 特異性エピトープを認め
る抗体である。このたん白は、シュードモナス アエル
ギノーザから単離することができる“通常の抗原”と呼
ばれる。
Ｍ、ＩｇＧ及びＩｇＡクラスに属するのが好ましい。こ
れらは特にＩｇＧ1 クラスに属するのが好ましい。特に
好ましい本発明によるモノクロナール抗体は、６０ＫＤ
ａ熱- ショックたん白上で種- 特異性エピトープを認め
る抗体である。このたん白は、シュードモナス アエル
ギノーザから単離することができる“通常の抗原”と呼
ばれる。
【０００６】上記熱- ショックたん白の種- 特異性エピ
トープは、Ｇｌｎ- Ａｌａ- Ａｓｐ- Ｉｌｅ- Ｇｌｕ-
Ａｌａ- Ａｒｇ- Ｖａｌ- Ｌｅｕ- Ｇｌｎ配列を有す
る。極めて、特に好ましい本発明によるモノクロナール
抗体は、上記配列が認められるものである。この様な特
に好ましいモノクロナール抗体の１つの例は、ポートン
ダウン、サリスベリー、ウィルシャイアー、ＳＰ４ＯＪ
Ｇ、イギリスのアニマルセルカルチャーのヨーロッパコ
レクションで１９９１年７月２４日に寄託番号第９１０
７２４０１号として寄託されたハイブリドーマによって
産生されるものである。
トープは、Ｇｌｎ- Ａｌａ- Ａｓｐ- Ｉｌｅ- Ｇｌｕ-
Ａｌａ- Ａｒｇ- Ｖａｌ- Ｌｅｕ- Ｇｌｎ配列を有す
る。極めて、特に好ましい本発明によるモノクロナール
抗体は、上記配列が認められるものである。この様な特
に好ましいモノクロナール抗体の１つの例は、ポートン
ダウン、サリスベリー、ウィルシャイアー、ＳＰ４ＯＪ
Ｇ、イギリスのアニマルセルカルチャーのヨーロッパコ
レクションで１９９１年７月２４日に寄託番号第９１０
７２４０１号として寄託されたハイブリドーマによって
産生されるものである。
【０００７】上記寄託されたハイブリドーマによって産
生されたモノクロナール抗体は、アメリカンタイプカル
チャーコレクション（ＡＴＣＣ）中にある１７個のシュ
ードモナスアエルギノーザ血清群すべてが認められた
が、以下に特定化された他のシュードモナドス(Pesudom
onads)又は他のグラム- 陰性- 又はグラム- 陽性菌は認
められない： アシネトバクター(Acinetobacter) バクテリオデスフラギリス(Bacteroides fragilis) ボーデテラパーチュスイス(Bordetella pertussis) カンピロバクタージエジュニ(Campylobacter jejuni) シトロバクターフロインジイ(Citrobacter freundii) エントロバクター(Enterobacter) エシエリシアコリー(Escherichia coli) ハエモフィリスインフルエンザ(Haemophilus influenza
e)タイプＢ クレブシエラ(Klebsiella) レギオネラプネウモフィラ(Legionella pneumophila)血
清群１ プロテウスブルガリス(Proteus vulgaris) シュードモナスセパシア(Pseudomonas cepacia) シュードモナスフルオレセンス(Pseudomonas fluoresce
ns) シュードモナスマルトフィリア(Pseudomonas maltophil
ia) シュードモナスピケトチイ(Pseudomonas pickettii) シュードモナススチュトツエリ(Pseudomonas stutzeri) サルモネラタイフィムリウム(Salmonella typhimurium) セラチアリクエフアシエンス(Serratia liquefaciens) シゲラフレックスネリ(Shigella flexneri) イエルシニアエントロコリチカ(Yersinia enterocoliti
ca) スタフィロコッカスアウレウス(Staphylococcus aureu
s) ストレプトコクシ(Streptococci)タイプＢ 上記細菌は、単にテストされた代表的な選択を示すにす
ぎない。上記モノクロナール抗体との反応性は、ここで
特定化されていない細菌でも予想されない。
生されたモノクロナール抗体は、アメリカンタイプカル
チャーコレクション（ＡＴＣＣ）中にある１７個のシュ
ードモナスアエルギノーザ血清群すべてが認められた
が、以下に特定化された他のシュードモナドス(Pesudom
onads)又は他のグラム- 陰性- 又はグラム- 陽性菌は認
められない： アシネトバクター(Acinetobacter) バクテリオデスフラギリス(Bacteroides fragilis) ボーデテラパーチュスイス(Bordetella pertussis) カンピロバクタージエジュニ(Campylobacter jejuni) シトロバクターフロインジイ(Citrobacter freundii) エントロバクター(Enterobacter) エシエリシアコリー(Escherichia coli) ハエモフィリスインフルエンザ(Haemophilus influenza
e)タイプＢ クレブシエラ(Klebsiella) レギオネラプネウモフィラ(Legionella pneumophila)血
清群１ プロテウスブルガリス(Proteus vulgaris) シュードモナスセパシア(Pseudomonas cepacia) シュードモナスフルオレセンス(Pseudomonas fluoresce
ns) シュードモナスマルトフィリア(Pseudomonas maltophil
ia) シュードモナスピケトチイ(Pseudomonas pickettii) シュードモナススチュトツエリ(Pseudomonas stutzeri) サルモネラタイフィムリウム(Salmonella typhimurium) セラチアリクエフアシエンス(Serratia liquefaciens) シゲラフレックスネリ(Shigella flexneri) イエルシニアエントロコリチカ(Yersinia enterocoliti
ca) スタフィロコッカスアウレウス(Staphylococcus aureu
s) ストレプトコクシ(Streptococci)タイプＢ 上記細菌は、単にテストされた代表的な選択を示すにす
ぎない。上記モノクロナール抗体との反応性は、ここで
特定化されていない細菌でも予想されない。
【０００８】本発明の対象は、本発明によるモノクロナ
ール抗体を産生するハイブリドーマでもある。ホートン
ダウン、サリスベリー、ウィルトシャイアー、ＰＳ４
ＯＪＧ、イギリスのアニマルセルカルチャーのヨーロッ
パコレクションで１９９１年７月２４日に寄託番号第９
１０７２４０１号として寄託されたハイブリドーマが特
に好ましい。
ール抗体を産生するハイブリドーマでもある。ホートン
ダウン、サリスベリー、ウィルトシャイアー、ＰＳ４
ＯＪＧ、イギリスのアニマルセルカルチャーのヨーロッ
パコレクションで１９９１年７月２４日に寄託番号第９
１０７２４０１号として寄託されたハイブリドーマが特
に好ましい。
【０００９】モノクロナール抗体を産生するハイブリド
ーマの製造は、それ自体公知であるが、ケーラー及びミ
ルスタインの研究に戻る（ネイチャー２５６，４９５−
９７，１９７５）。
ーマの製造は、それ自体公知であるが、ケーラー及びミ
ルスタインの研究に戻る（ネイチャー２５６，４９５−
９７，１９７５）。
【００１０】その際本発明の範囲内で、次の処理工程を
実施する： ａ）マウスを、シュードモナスウエルギノーザの生菌で
静脈内注射して免疫し、 ｂ）免疫後、脾臓細胞を除去し、 ｃ）脾臓細胞とマウスミエローマ細胞Ｄ３−Ｘ６３−Ａ
ｇ８．６５３を融合し、 ｄ）ハイブリドーマ細胞を選択し、 ｅ）ハイブリドーマをクローニングし、培養し、 ｆ）ハイブリドーマを試験し、選択し、 ｇ）選択されたハイブリドーマを培養する。
実施する： ａ）マウスを、シュードモナスウエルギノーザの生菌で
静脈内注射して免疫し、 ｂ）免疫後、脾臓細胞を除去し、 ｃ）脾臓細胞とマウスミエローマ細胞Ｄ３−Ｘ６３−Ａ
ｇ８．６５３を融合し、 ｄ）ハイブリドーマ細胞を選択し、 ｅ）ハイブリドーマをクローニングし、培養し、 ｆ）ハイブリドーマを試験し、選択し、 ｇ）選択されたハイブリドーマを培養する。
【００１１】次いでモノクロナール抗体を、腹水マウス
中で適切なハイブリドーマの膨張によって又は細胞培養
液中でのハンブリドーマの増殖、次いで腹水液体又は細
胞培養液上澄液からの精製によって得られる。
中で適切なハイブリドーマの膨張によって又は細胞培養
液中でのハンブリドーマの増殖、次いで腹水液体又は細
胞培養液上澄液からの精製によって得られる。
【００１２】本発明によるモノクロナール抗体は、シュ
ードモナス アエルギノーザの免疫検出に著しく適す
る。この好ましいこの検出法は、ラジオイムノアッセイ
（ＲＩＡ）、酵素- カップ検定法（ＥＬＩＳＡ）、特に
サンドウィッチＥＬＩＳＡ及びキモルミネッセンス検定
法である。上記方法は当業者に公知であり、専門文献中
に記載されている。
ードモナス アエルギノーザの免疫検出に著しく適す
る。この好ましいこの検出法は、ラジオイムノアッセイ
（ＲＩＡ）、酵素- カップ検定法（ＥＬＩＳＡ）、特に
サンドウィッチＥＬＩＳＡ及びキモルミネッセンス検定
法である。上記方法は当業者に公知であり、専門文献中
に記載されている。
【００１３】特にシュードモナス アエルギノーザの免
疫検出に関する利点は、使用するために準備された検定
キットであり、一般に使用される試剤の他に、キャリヤ
ー材料及び本発明によるクロナール抗体少なくとも１個
の免疫試剤としての他の添加物を含有する。
疫検出に関する利点は、使用するために準備された検定
キットであり、一般に使用される試剤の他に、キャリヤ
ー材料及び本発明によるクロナール抗体少なくとも１個
の免疫試剤としての他の添加物を含有する。
【００１４】
【実施例】次の例中で下記試剤又は方法を使用する： ──心臓- 脳ブイヨン 水１ｌ中に脳- 心臓注入液（オキソイド社）３７ｇ ──ＰＢＳ＝リン酸塩緩衝された生理食塩水 １０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．６；０．９
％ＮａＣｌ ──ＤＭＥＭ＝ダルベコの変性イーガル（Ｅａｇｌｅ） 培地（フロー研究所、メケンハイム） ──標準培地 ２ｍＭグルタミン（ギブコ、ペイスリースコットラン
ド）、５０Ｉ．Ｕ．／ｍｌペリシリン（ギブコ、ペイス
リースコットランド）、５０μｇ／ｍｌストレプトマイ
シン（ギブコ、ペイスリースコットランド）を有するＤ
ＭＥＭ。 ──ＨＡＴ選択培地 １００μＭ ハイポキサンチン、１６μＭ チミジ
ン、０．４μＭ アミノプテリン、５０Ｕ／ｍｌ イン
ターロイキン６（ベーリンガーマンハイム）を有する標
準培地 ──ＰＤＬ- 被覆されたミクロ滴定プレートポリスチレ
ンミクロ滴定プレート（グライナー社、ニュートリンゲ
ン）、くぼみにつき５０μｌ ＰＤＬ溶液（緩衝液Ａ中
に２５μｇ／ｍｌポリー（ＤＬ)-リジン（ジグマ、ミユ
ンヘン））で被覆し、１時間、室温で温置し、緩衝液Ａ
で３回洗滌する。 ──グルタルアルデヒド溶液 緩衝液Ａ中に０．０５％グルタルアルデヒド（トルク
社、ダルムシユタット） ──緩衝液Ａ １０ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ６．０ ──緩衝液Ａ−ＢＳＡ 緩衝液Ａ；１％（重量バーセント） 子ウシ血清アルブミン（ベーリンガーマンハイム） ──緩衝液Ｂ １０ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ６．０ ──パーオキシダーゼ基質溶液 ２．７％２，２'-アジノジ（３- エチルベンゾチアゾリ
ンスルホン酸）（シグマ社、ミユンヘン）；緩衝液Ｂ中
に０．００２５％Ｈ2 Ｏ2 ──５％羊の血液（ベクトン- ディキンソン社）でコロ
ンビア寒天プレート、 ──ＳＤＳ ＰＡＧＥサンプル緩衝液（ＳＤＳ ＰＡＧ
Ｅ＝ナトリウムドデシンスルフアートポリアクリルアミ
ドゲルー電気泳動）。
％ＮａＣｌ ──ＤＭＥＭ＝ダルベコの変性イーガル（Ｅａｇｌｅ） 培地（フロー研究所、メケンハイム） ──標準培地 ２ｍＭグルタミン（ギブコ、ペイスリースコットラン
ド）、５０Ｉ．Ｕ．／ｍｌペリシリン（ギブコ、ペイス
リースコットランド）、５０μｇ／ｍｌストレプトマイ
シン（ギブコ、ペイスリースコットランド）を有するＤ
ＭＥＭ。 ──ＨＡＴ選択培地 １００μＭ ハイポキサンチン、１６μＭ チミジ
ン、０．４μＭ アミノプテリン、５０Ｕ／ｍｌ イン
ターロイキン６（ベーリンガーマンハイム）を有する標
準培地 ──ＰＤＬ- 被覆されたミクロ滴定プレートポリスチレ
ンミクロ滴定プレート（グライナー社、ニュートリンゲ
ン）、くぼみにつき５０μｌ ＰＤＬ溶液（緩衝液Ａ中
に２５μｇ／ｍｌポリー（ＤＬ)-リジン（ジグマ、ミユ
ンヘン））で被覆し、１時間、室温で温置し、緩衝液Ａ
で３回洗滌する。 ──グルタルアルデヒド溶液 緩衝液Ａ中に０．０５％グルタルアルデヒド（トルク
社、ダルムシユタット） ──緩衝液Ａ １０ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ６．０ ──緩衝液Ａ−ＢＳＡ 緩衝液Ａ；１％（重量バーセント） 子ウシ血清アルブミン（ベーリンガーマンハイム） ──緩衝液Ｂ １０ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ６．０ ──パーオキシダーゼ基質溶液 ２．７％２，２'-アジノジ（３- エチルベンゾチアゾリ
ンスルホン酸）（シグマ社、ミユンヘン）；緩衝液Ｂ中
に０．００２５％Ｈ2 Ｏ2 ──５％羊の血液（ベクトン- ディキンソン社）でコロ
ンビア寒天プレート、 ──ＳＤＳ ＰＡＧＥサンプル緩衝液（ＳＤＳ ＰＡＧ
Ｅ＝ナトリウムドデシンスルフアートポリアクリルアミ
ドゲルー電気泳動）。
【００１５】６２．５ｍＭトリス-(ヒドロキシメチル）
アミノメタン−ＨＣｌ、ＰＨ６．８ ５％２- メルカプトエタノール ２％ＳＤＳ（ナトリウムデシルスルフアート、メルク
社）、１２．５％グリセロール。 ──コロニーハイブリッド化 ニトロセルロースフィルターを寒天プレート上に置き、
取り出し、１０分間３７℃で乾燥し、フィルターを次の
化合物で湿らす：０．５Ｍ ＮａＯＨ、室温で２分間、
１．５Ｍ ＮａＣｌ、０．５Ｍトリス（ヒドロキシメチ
ル）アミノメタン−ＨＣｌ ｐＨ７．５：２×２分Ｒ
Ｔ、１８０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ Ｎａ2 ＨＰＯ4 、
５ｍＭ ＮａＨ2 ＰＯ4：１ｍＭ ＥＤＴＡ、２×２分
ＲＴ、７０％エタノール、１０分間３７℃で乾燥フィル
ター、イムノブロットの様にフィルターを抗体で処理
し、展開する。
アミノメタン−ＨＣｌ、ＰＨ６．８ ５％２- メルカプトエタノール ２％ＳＤＳ（ナトリウムデシルスルフアート、メルク
社）、１２．５％グリセロール。 ──コロニーハイブリッド化 ニトロセルロースフィルターを寒天プレート上に置き、
取り出し、１０分間３７℃で乾燥し、フィルターを次の
化合物で湿らす：０．５Ｍ ＮａＯＨ、室温で２分間、
１．５Ｍ ＮａＣｌ、０．５Ｍトリス（ヒドロキシメチ
ル）アミノメタン−ＨＣｌ ｐＨ７．５：２×２分Ｒ
Ｔ、１８０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ Ｎａ2 ＨＰＯ4 、
５ｍＭ ＮａＨ2 ＰＯ4：１ｍＭ ＥＤＴＡ、２×２分
ＲＴ、７０％エタノール、１０分間３７℃で乾燥フィル
ター、イムノブロットの様にフィルターを抗体で処理
し、展開する。
【００１６】〔例１〕 ハイブリドーマの製造 ａ）免疫化 菌株シュードモナスアエルギノーザＤＳＭ１７０７を心
臓- 脳ブイヨンで培養する。細菌を集菌し、２回洗滌
し、ＰＢＳ中に懸濁する。免疫化のために、生まれて６
−８週目のＢＡＣＢ／Ｃマウスに、次に示す様に何週間
かかけてＤＳＭ１７０７の懸濁液を腹腔内注射する： 周 ＤＳＭ １７０７ 投与 （腹腔内） １ １×１０6 生菌 完全なフロイントアジュバント ２ ５×１０6 生菌 不完全なフロイントアジュバント ３ ２５×１０6 生菌 ０．９％ ＮａＣｌ ４ １２５×１０6 生菌 ０．９％ ＮａＣｌ ５ ６２５×１０6 生菌 ０．９％ ＮａＣｌ ６ ３．１３×１０9 生菌 ０．９％ ＮａＣｌ ｂ）ハイブリドーマを製造するための体細胞融合 免疫化されたマウスの脾臓を、最後の二次免疫注射３−
４日後無菌条件下で取り出す。脾臓細胞を、組織集合器
からステンレス鋼スクリーン（孔幅１００μｍ）上で注
意深く研磨して単離し、ＤＭＥＭ１ｍｌ中に取る。次い
で細胞懸濁液をＤＭＥＭ５ｍｌ（１２００ｒｐｍで遠心
分離、７分間）で１回洗滌し、ＤＭＥＭ５ｍｌ中で懸濁
する。ミエローマ細胞（セルラインＰ３−Ｘ６３−Ａｇ
８．６５３）を、１％ＦＣＳを含有する標準培地中で培
養し、３回洗滌し、ＤＭＥＭ中に懸濁する。５×１０7
脾臓細胞を、ＤＭＥＭ中に５×１０7 ミエローマ細胞で
混合し、１０分間８００ｒｐｍで遠心分離する。上澄液
を、吸引除去し、沈降物を水浴（３７℃）中に入れ、３
７℃に温められた無菌の１００％純粋ポリエチレングリ
コール溶液（ＰＥＧ１５００、ベーリンガーマンハイ
ム）８００μｌを、細胞集団の融合開始のために加え
る。１分後、ポリエチレングリコールをＤＭＥＭの添加
で希釈し、遠心分離（１２００ｒｐｍ、５分）後の沈降
物を、ＨＡＴ選択培地中にｍｌにつき１×１０6 細胞の
細胞密度で取る。
臓- 脳ブイヨンで培養する。細菌を集菌し、２回洗滌
し、ＰＢＳ中に懸濁する。免疫化のために、生まれて６
−８週目のＢＡＣＢ／Ｃマウスに、次に示す様に何週間
かかけてＤＳＭ１７０７の懸濁液を腹腔内注射する： 周 ＤＳＭ １７０７ 投与 （腹腔内） １ １×１０6 生菌 完全なフロイントアジュバント ２ ５×１０6 生菌 不完全なフロイントアジュバント ３ ２５×１０6 生菌 ０．９％ ＮａＣｌ ４ １２５×１０6 生菌 ０．９％ ＮａＣｌ ５ ６２５×１０6 生菌 ０．９％ ＮａＣｌ ６ ３．１３×１０9 生菌 ０．９％ ＮａＣｌ ｂ）ハイブリドーマを製造するための体細胞融合 免疫化されたマウスの脾臓を、最後の二次免疫注射３−
４日後無菌条件下で取り出す。脾臓細胞を、組織集合器
からステンレス鋼スクリーン（孔幅１００μｍ）上で注
意深く研磨して単離し、ＤＭＥＭ１ｍｌ中に取る。次い
で細胞懸濁液をＤＭＥＭ５ｍｌ（１２００ｒｐｍで遠心
分離、７分間）で１回洗滌し、ＤＭＥＭ５ｍｌ中で懸濁
する。ミエローマ細胞（セルラインＰ３−Ｘ６３−Ａｇ
８．６５３）を、１％ＦＣＳを含有する標準培地中で培
養し、３回洗滌し、ＤＭＥＭ中に懸濁する。５×１０7
脾臓細胞を、ＤＭＥＭ中に５×１０7 ミエローマ細胞で
混合し、１０分間８００ｒｐｍで遠心分離する。上澄液
を、吸引除去し、沈降物を水浴（３７℃）中に入れ、３
７℃に温められた無菌の１００％純粋ポリエチレングリ
コール溶液（ＰＥＧ１５００、ベーリンガーマンハイ
ム）８００μｌを、細胞集団の融合開始のために加え
る。１分後、ポリエチレングリコールをＤＭＥＭの添加
で希釈し、遠心分離（１２００ｒｐｍ、５分）後の沈降
物を、ＨＡＴ選択培地中にｍｌにつき１×１０6 細胞の
細胞密度で取る。
【００１７】融合された細胞だけが、この選択培地中に
生存するが、同様に懸濁液中に存在する非融合脾臓細胞
及びマウスミエローマ細胞Ｐ３−Ｘ６３−ＡＧ８．６５
３は生存しない。次いで細胞懸濁液を、９６−くぼみ組
織培養プレート（コスター社、フエヴアルト）中の夫々
のくぼみに２００μｌづつ分配する。ハイブリドーマ培
養液を、３７℃及び７．５％ＣＯ2 でインキュベーター
中で培養する。 ｃ）ハイブリドーマスクリーニング（ＥＬＩＳＡ） 下記ＥＬＩＳＡを使用して、ハイブリドーマ培養液の培
養上澄液を検定する。ＤＳＭ１７０７を、血液プレート
上で培養し、生理食塩水中で洗滌し、ｍｌにつき２×１
０8 生菌に調整する。この懸濁液２０μｌを、ＰＤＬ-
被覆されたミクロ滴定プレートの各くぼみにピペットで
入れる。１時間室温で培養後、グルタルアルデヒド溶液
１０μｌをピペットで加える。１０分後、プレートを緩
衝液Ａで２回洗滌する。まだ自由である結合部位を室温
で３０分間緩衝液Ａ- ＢＳＡで飽和する。洗滌されたプ
レートを、室温で２時間くぼみにつきハイブリドーマ培
養液上澄液２０μｌで培養する。結合された抗体を、パ
ーオキシターゼ標識された抗- マウス免疫グロブリン
（ベーリンガーマンハイム）１０μｌを用いて室温で３
０分間検出する。ミクロ滴定プレートを洗滌した後（２
回緩衝液Ａ、１回緩衝液Ｂ）、くぼみにつき基質溶液２
０μｌを加え、室温で培養し、４０５ｎｍで吸収の変化
を調べて、酵素活性を測定する。ＤＳＭ１７０７に結合
する抗体を分泌するハイブリドーマ細胞を、細胞がハイ
ブリット細胞クローンからのみ由来する、すなわちモノ
クロナールであることを証明するために、制限希釈培養
法によってクローン化する。
生存するが、同様に懸濁液中に存在する非融合脾臓細胞
及びマウスミエローマ細胞Ｐ３−Ｘ６３−ＡＧ８．６５
３は生存しない。次いで細胞懸濁液を、９６−くぼみ組
織培養プレート（コスター社、フエヴアルト）中の夫々
のくぼみに２００μｌづつ分配する。ハイブリドーマ培
養液を、３７℃及び７．５％ＣＯ2 でインキュベーター
中で培養する。 ｃ）ハイブリドーマスクリーニング（ＥＬＩＳＡ） 下記ＥＬＩＳＡを使用して、ハイブリドーマ培養液の培
養上澄液を検定する。ＤＳＭ１７０７を、血液プレート
上で培養し、生理食塩水中で洗滌し、ｍｌにつき２×１
０8 生菌に調整する。この懸濁液２０μｌを、ＰＤＬ-
被覆されたミクロ滴定プレートの各くぼみにピペットで
入れる。１時間室温で培養後、グルタルアルデヒド溶液
１０μｌをピペットで加える。１０分後、プレートを緩
衝液Ａで２回洗滌する。まだ自由である結合部位を室温
で３０分間緩衝液Ａ- ＢＳＡで飽和する。洗滌されたプ
レートを、室温で２時間くぼみにつきハイブリドーマ培
養液上澄液２０μｌで培養する。結合された抗体を、パ
ーオキシターゼ標識された抗- マウス免疫グロブリン
（ベーリンガーマンハイム）１０μｌを用いて室温で３
０分間検出する。ミクロ滴定プレートを洗滌した後（２
回緩衝液Ａ、１回緩衝液Ｂ）、くぼみにつき基質溶液２
０μｌを加え、室温で培養し、４０５ｎｍで吸収の変化
を調べて、酵素活性を測定する。ＤＳＭ１７０７に結合
する抗体を分泌するハイブリドーマ細胞を、細胞がハイ
ブリット細胞クローンからのみ由来する、すなわちモノ
クロナールであることを証明するために、制限希釈培養
法によってクローン化する。
【００１８】〔例２〕 寄託されたハイブリドーマによって製造された抗体を収
得及び評価 ａ）腹水マウス中で膨張（生体内） 菌株ＢＡＬＢ／Ｃのマウスに、プリスタン１２，６，１
０，１４- テトラメチルペンタデカン０．５ｍｌ、アル
ドリッチ化学、スタインハイム）を、腹膜を調整するた
めに腹腔内に入れる。３〜１０日後、この方法で前処理
された動物をＰＢＳ中に例１ｃ）からの５×１０5 −１
×１０6 ハイブリドーマを有する懸濁液を腹腔内注射す
る。１０〜２０日後、腹膜をカニューレで穴をあけ、腹
水液体を集める。細胞成分を遠心分離（１０，０００ｒ
ｐｍ、５分）で除去し、モノクロナール抗体も含有する
上澄液を除き、−７０℃で保存する。 ｂ）交差- 反応性 先ず例２ａ）に於ける様に製造されたモノクロナール抗
体のサブクラスを決定する。パーオキシダーゼ標識され
た抗- マウス免疫グロブリンの代りにＥＬＩＳＡ（例１
ｃ参照）でこのためにサブクラス- 特異的パーオキシタ
ーゼ接合体（ベーリンガーマンハイム）を使用する。腹
水液体中に含有されるモノクロナール抗体は、プロティ
ンＡ- 又はプロティンＧ- セフアロース（フアルマシ
ア、フライブルグ）上でそのサブクラスに適する親和精
製によって得られる。
得及び評価 ａ）腹水マウス中で膨張（生体内） 菌株ＢＡＬＢ／Ｃのマウスに、プリスタン１２，６，１
０，１４- テトラメチルペンタデカン０．５ｍｌ、アル
ドリッチ化学、スタインハイム）を、腹膜を調整するた
めに腹腔内に入れる。３〜１０日後、この方法で前処理
された動物をＰＢＳ中に例１ｃ）からの５×１０5 −１
×１０6 ハイブリドーマを有する懸濁液を腹腔内注射す
る。１０〜２０日後、腹膜をカニューレで穴をあけ、腹
水液体を集める。細胞成分を遠心分離（１０，０００ｒ
ｐｍ、５分）で除去し、モノクロナール抗体も含有する
上澄液を除き、−７０℃で保存する。 ｂ）交差- 反応性 先ず例２ａ）に於ける様に製造されたモノクロナール抗
体のサブクラスを決定する。パーオキシダーゼ標識され
た抗- マウス免疫グロブリンの代りにＥＬＩＳＡ（例１
ｃ参照）でこのためにサブクラス- 特異的パーオキシタ
ーゼ接合体（ベーリンガーマンハイム）を使用する。腹
水液体中に含有されるモノクロナール抗体は、プロティ
ンＡ- 又はプロティンＧ- セフアロース（フアルマシ
ア、フライブルグ）上でそのサブクラスに適する親和精
製によって得られる。
【００１９】抗体特異性を決定するために、無傷の細菌
をＥＬＩＳＡ中に使用する。抗原の分子量を、ＳＤＳ
ＰＡＧＥ及びイムノプロッティングによって決定する又
は局所集中させる。このために、コロンビア血液- 寒天
プレート上に培養された細菌を、２回ＰＢＳ中で洗滌
し、遠心分離する。ｍｌにつき２×１０9 細菌をＳＤＳ
ＰＡＧＥサンプル緩衝液１ｍｌ中に懸濁し、４×１５秒
間超音波（ブランソン超音波マイクロチップ）で崩壊す
る。１００℃で１０分後、溶液２０μｌをＳＤＳＰＡＧ
Ｅ（１２％ポリアクリルアミド）によって分画し、タウ
ビン(Towbin)Ｈ．スタヘリン(Staehelin) Ｔ．及びゴー
ドン(Gordon)Ｊ．（１９７９）、Proc.Natl. Acad. Sc
i.ＵＳＡ７６，４３５０−４３５４に記載されている様
に、ニトロセルロース膜に移行させ、抗体を用いて検出
する。
をＥＬＩＳＡ中に使用する。抗原の分子量を、ＳＤＳ
ＰＡＧＥ及びイムノプロッティングによって決定する又
は局所集中させる。このために、コロンビア血液- 寒天
プレート上に培養された細菌を、２回ＰＢＳ中で洗滌
し、遠心分離する。ｍｌにつき２×１０9 細菌をＳＤＳ
ＰＡＧＥサンプル緩衝液１ｍｌ中に懸濁し、４×１５秒
間超音波（ブランソン超音波マイクロチップ）で崩壊す
る。１００℃で１０分後、溶液２０μｌをＳＤＳＰＡＧ
Ｅ（１２％ポリアクリルアミド）によって分画し、タウ
ビン(Towbin)Ｈ．スタヘリン(Staehelin) Ｔ．及びゴー
ドン(Gordon)Ｊ．（１９７９）、Proc.Natl. Acad. Sc
i.ＵＳＡ７６，４３５０−４３５４に記載されている様
に、ニトロセルロース膜に移行させ、抗体を用いて検出
する。
【００２０】モルクロナール抗体は、免疫反応性の点で
ＥＬＩＳＡとイムノブロッティングに差を示さない。例
の様に選択された細菌株とのその免疫反応性は、すでに
本文中に記載した。冒頭で記載した課題を、シュードモ
ナス アエルギノーザ検出剤を使用することで成しとげ
る。というのはシュードモナス アエルギノーザの種々
の血清群並びにシュードモナス アエルギノーザの任意
に選択された患者単離体（ＣＦ患者から２０粘液分泌単
離体、２０非- 粘液分泌創傷単離体、並びにＣＦ患者か
らの単離体から由来する５つの研究所菌株）が認められ
るからである。すべてこれらの場合、抗体は６０ＫＤａ
たん白が認められる。細菌及び他のシュードモナスの代
表的なグラム陰性及びグラム陽性菌株は認められない。 ｃ）エピトープ評価 たん白化学の方法の他に、エピトープ評価に、遺伝子光
学法及びＤＮＡ配列分析が適する。前提条件は、構造遺
伝子又はその一部の同定である。変性する条件下でさえ
もたん白エピトープが認められるモノクロナール抗体
は、コロニーハイブリット化によって遺伝子バンクから
関連のある構造遺伝子を単離することを可能にする。ク
ローン化の後に、確認されたエピトロープをエキソヌク
レアーゼで部分的に分解して局所集中させることができ
る；ペプチド配列の決定はＤＮＡ配列分析によって容易
に可能である。
ＥＬＩＳＡとイムノブロッティングに差を示さない。例
の様に選択された細菌株とのその免疫反応性は、すでに
本文中に記載した。冒頭で記載した課題を、シュードモ
ナス アエルギノーザ検出剤を使用することで成しとげ
る。というのはシュードモナス アエルギノーザの種々
の血清群並びにシュードモナス アエルギノーザの任意
に選択された患者単離体（ＣＦ患者から２０粘液分泌単
離体、２０非- 粘液分泌創傷単離体、並びにＣＦ患者か
らの単離体から由来する５つの研究所菌株）が認められ
るからである。すべてこれらの場合、抗体は６０ＫＤａ
たん白が認められる。細菌及び他のシュードモナスの代
表的なグラム陰性及びグラム陽性菌株は認められない。 ｃ）エピトープ評価 たん白化学の方法の他に、エピトープ評価に、遺伝子光
学法及びＤＮＡ配列分析が適する。前提条件は、構造遺
伝子又はその一部の同定である。変性する条件下でさえ
もたん白エピトープが認められるモノクロナール抗体
は、コロニーハイブリット化によって遺伝子バンクから
関連のある構造遺伝子を単離することを可能にする。ク
ローン化の後に、確認されたエピトロープをエキソヌク
レアーゼで部分的に分解して局所集中させることができ
る；ペプチド配列の決定はＤＮＡ配列分析によって容易
に可能である。
【００２１】エピトープのより多くの正確な局所集中
は、合成オリゴヌクレオチド（ジーンアゼンブラープラ
スオリゴヌクレオチドジンテタイザー、フアルマシア、
フライブルグ）及び（たとえばｐＧＥＸ- ３Ｘ；フアル
マシア、フライブルグ）を用いる融合たん白としてのそ
の発現（グルタチオンＳ- トランスフエラーゼ）を介し
て可能である。たとえば２ａ及び２ｂ）に記載されたモ
ノクロナール抗体によって確認されたエピトープを局所
集中させる。上記計画によって可能である。シュードモ
ナスアエルギノーザのＧｒｏＥＬたん白のアミノ酸Ｎ
ｏ．３３９〜３４８に対応するデカペプチド -Ｇｌｎ-
Ａｌａ- Ａｓｐ- Ｉｌｅ- Ｇｌｕ- Ａｌａ-Ａｒｇ- Ｖ
ａｌ- Ｌｅｕ- Ｇｌｕ- が認められる。
は、合成オリゴヌクレオチド（ジーンアゼンブラープラ
スオリゴヌクレオチドジンテタイザー、フアルマシア、
フライブルグ）及び（たとえばｐＧＥＸ- ３Ｘ；フアル
マシア、フライブルグ）を用いる融合たん白としてのそ
の発現（グルタチオンＳ- トランスフエラーゼ）を介し
て可能である。たとえば２ａ及び２ｂ）に記載されたモ
ノクロナール抗体によって確認されたエピトープを局所
集中させる。上記計画によって可能である。シュードモ
ナスアエルギノーザのＧｒｏＥＬたん白のアミノ酸Ｎ
ｏ．３３９〜３４８に対応するデカペプチド -Ｇｌｎ-
Ａｌａ- Ａｓｐ- Ｉｌｅ- Ｇｌｕ- Ａｌａ-Ａｒｇ- Ｖ
ａｌ- Ｌｅｕ- Ｇｌｕ- が認められる。
【００２２】〔例３〕 水サンプル中でシュードモナス アエルギノーザの検出 無菌条件下に取り出された水サンプル１００ｍｌを膜-
濾過し（０．２μｍ、ＭＥ２４／２１、シューライヒヤ
ー＆シユル）、３６ １℃でＤＥＶ- 乳糖- ペプトンブ
イヨン１０ｍｌ中で培養する。２０時間の培養後、１ｍ
ｌアリコートを取り出し、４×１５秒間超音波にかける
（ブランソン ソニフアイヤー、ミクロチップ）。シュ
ードモナスアエルギノーザを検出するＥＬＩＳＡを、室
温で実施する。ミクロ滴定プレート（ポリスチレン、グ
ライナー）を、くぼみにつき抗体溶液１２５μｌで被覆
し（ＰＢＳｍｌにつき抗体たん白２０μｇ）（１２０分
ＲＴ又は４℃一晩）、緩衝液Ａで２回洗滌する。飽和
（緩衝液Ａ- ＢＳＡ２５０μｌ、３０分ＲＴ）及び緩衝
液Ａで２回洗滌後、調製されたサンプル１００μｌを各
くぼみに加える。室温で２時間及び緩衝液Ａでの３回洗
滌後、例２からの酵素標識されたモノクロナール抗体溶
液を、各くぼみにピペットで入れる。室温で１時間及び
緩衝液Ａでの３回洗滌後、適する酵素基質溶液１２５μ
ｌを上部上にピペットで入れ、プレートを適する培養時
間の後に光学的に又は蛍光分析的に測定する。配列記録 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１ １０アミノ酸から成るアミノ酸配列。 シュードモナスアエルギノーザのＧｒｏＥＬ- たん白の
アミノ酸Ｎｏ．３３９〜３４８に相当する線状ペプチ
ド。 Ｇｌｎ Ａｌａ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ｇｌｎ Ａｌａ Ａｒｇ Ｖａｌ Ｌｅｕ １ ５ Ｇｌｎ １０
濾過し（０．２μｍ、ＭＥ２４／２１、シューライヒヤ
ー＆シユル）、３６ １℃でＤＥＶ- 乳糖- ペプトンブ
イヨン１０ｍｌ中で培養する。２０時間の培養後、１ｍ
ｌアリコートを取り出し、４×１５秒間超音波にかける
（ブランソン ソニフアイヤー、ミクロチップ）。シュ
ードモナスアエルギノーザを検出するＥＬＩＳＡを、室
温で実施する。ミクロ滴定プレート（ポリスチレン、グ
ライナー）を、くぼみにつき抗体溶液１２５μｌで被覆
し（ＰＢＳｍｌにつき抗体たん白２０μｇ）（１２０分
ＲＴ又は４℃一晩）、緩衝液Ａで２回洗滌する。飽和
（緩衝液Ａ- ＢＳＡ２５０μｌ、３０分ＲＴ）及び緩衝
液Ａで２回洗滌後、調製されたサンプル１００μｌを各
くぼみに加える。室温で２時間及び緩衝液Ａでの３回洗
滌後、例２からの酵素標識されたモノクロナール抗体溶
液を、各くぼみにピペットで入れる。室温で１時間及び
緩衝液Ａでの３回洗滌後、適する酵素基質溶液１２５μ
ｌを上部上にピペットで入れ、プレートを適する培養時
間の後に光学的に又は蛍光分析的に測定する。配列記録 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１ １０アミノ酸から成るアミノ酸配列。 シュードモナスアエルギノーザのＧｒｏＥＬ- たん白の
アミノ酸Ｎｏ．３３９〜３４８に相当する線状ペプチ
ド。 Ｇｌｎ Ａｌａ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ｇｌｎ Ａｌａ Ａｒｇ Ｖａｌ Ｌｅｕ １ ５ Ｇｌｎ １０
【００２３】
【発明の効果】本発明によるモノクロナール抗体は、シ
ュードモナス アエルギノーザの検出に極めて有効であ
る。
ュードモナス アエルギノーザの検出に極めて有効であ
る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 5/20 15/06 //(Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:385）
Claims (10)
- 【請求項１】 シュードモナス アエルギノーザ(Pseud
omonas aeruginosa)の菌株と反応し、シュードモナスの
菌株並びに他のグラム- 陰性- 又はグラム-陽性菌と反
応しないモノクロナール抗体。 - 【請求項２】 クラスＩｇＧ1 から成る、請求項１記載
のモノクロナール抗体。 - 【請求項３】 種- 特異性エピトープをシュードモナス
アエルギノーザの６０ＫＤａ熱- ショックたん白で認
める、請求項１又は２記載のモノクロナール抗体。 - 【請求項４】 たん白配列Ｇｌｎ- Ａｌａ- Ａｓｐ- Ｉ
ｌｅ- Ｇｌｕ- Ａｌａ- Ａｒｇ- Ｖａｌ- Ｌｅｕ- Ｇｌ
ｎ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）が認められる、請求項１
ないし３のいずれかに記載のモノクロナール抗体。 - 【請求項５】 ポートンダウン、サリスベリー、ウィル
トシャイアー、ＳＰ４ＯＪＧ、イギリスのアニマルセル
カルチヤーのヨーロッパコレクションで１９９１年７月
２４日に寄託番号第９１０７２４０１号として寄託され
たハイブリドーマによって製造する、請求項１ないし４
のいずれかに記載のモノクロナール抗体。 - 【請求項６】 請求項１記載のモノクロナール抗体を産
生することを特徴とするハイブリドーマ。 - 【請求項７】 ポートンダウン、サリスベリー、ウィル
トシャイアー、ＳＰ４ＯＪＧ、イギリスのアニマルセル
カルチヤーのヨーロッパコレクションで１９９１年７月
２４日に寄託番号第９１０７２４０１号として寄託され
たハイブリドーマ。 - 【請求項８】 次の製造工程を実施する： ａ）マウスを、シュードモナス アエルギノーザの生菌
で静脈内注射して免疫し、 ｂ）免疫後、脾臓細胞を除去し、 ｃ）脾臓細胞とマウスミエローマ細胞Ｄ３−Ｘ６３−Ａ
ｇ８．６５３を融合し、 ｄ）ハイブリドーマ細胞を選択し、 ｅ）ハイブリドーマをクローニングし、培養し、 ｆ）ハイブリドーマを試験し、選択し、 ｇ）選択されたハイブリドーマを培養することを特徴と
する、請求項６又は７記載のハイブリドーマの製造方
法。 - 【請求項９】 シュードモナス アエルギノーザの免疫
検出に、請求項１記載のモノクロナール抗体を使用する
方法。 - 【請求項１０】 一般に使用される試剤の他に、キャリ
ヤー材料及び少なくとも１個のモノクロナール抗体の免
疫試剤として他の添加物を含有することを特徴とするシ
ュードモナス アエルギノーザの免疫検出のための検定
キット。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19914128454 DE4128454A1 (de) | 1991-08-28 | 1991-08-28 | Monoklonaler antikoerper, der mit pseudomonas aeruginosa reagiert |
| DE4128454:2 | 1991-08-28 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06181793A true JPH06181793A (ja) | 1994-07-05 |
Family
ID=6439262
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4228988A Withdrawn JPH06181793A (ja) | 1991-08-28 | 1992-08-27 | シュードモナス アエルギノーザと反応するモノクロナール抗体 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0543091A3 (ja) |
| JP (1) | JPH06181793A (ja) |
| DE (1) | DE4128454A1 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP5219057B2 (ja) * | 1998-07-31 | 2013-06-26 | 旭化成株式会社 | 微生物検出用抗体 |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB9915419D0 (en) * | 1999-07-01 | 1999-09-01 | Cortecs Uk Ltd | Antigens |
| DE202008007524U1 (de) | 2008-06-05 | 2008-10-16 | Maba Spezialmaschinen Gmbh | Gießeinheit zum Auftragen von dünnen Flüssigkeitsschichten |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS60248625A (ja) * | 1984-05-25 | 1985-12-09 | Mitsui Toatsu Chem Inc | 抗緑膿菌モノクロ−ナル抗体、その製法ならびに用途 |
| JPH01193300A (ja) * | 1988-01-27 | 1989-08-03 | Sumitomo Chem Co Ltd | ヒトモノクローナル抗体およびその製法 |
-
1991
- 1991-08-28 DE DE19914128454 patent/DE4128454A1/de active Granted
-
1992
- 1992-08-15 EP EP19920113938 patent/EP0543091A3/de not_active Withdrawn
- 1992-08-27 JP JP4228988A patent/JPH06181793A/ja not_active Withdrawn
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP5219057B2 (ja) * | 1998-07-31 | 2013-06-26 | 旭化成株式会社 | 微生物検出用抗体 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE4128454A1 (de) | 1993-03-04 |
| EP0543091A3 (en) | 1993-09-29 |
| EP0543091A2 (de) | 1993-05-26 |
| DE4128454C2 (ja) | 1993-09-23 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A300 | Withdrawal of application because of no request for examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A300 Effective date: 19991102 |