JPS60248625A - 抗緑膿菌モノクロ−ナル抗体、その製法ならびに用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （発明の目的） 本発明は、緑膿菌共通抗原ＰＳ（、Ａに対して特異的な
親和性を示すモノクローナル抗体とその製造法およびそ
の用途、すなわち具体的には緑膿菌感染診断薬および緑
膿菌感染予防治療剤に関する。

緑膿菌（以下、シュードモナス・アエルギノーサという
ことがある）は、今日日和見感染の病原菌の代表菌であ
り、その感染症は種々の基礎疾患の存在下での発病が多
くいったん発病すると容易に全身性に進展し重篤化する
ことが指摘されている。

また、緑膿菌感染症の基礎疾患で頻度の高いものとして
、びまん性汎細気管支炎・気管支拡張症・慢性肺気腫等
の呼吸器疾患の患者、癌患者、熱傷患者あるいは免疫抑
制療法下の患者などが知られている。

こうした中で、抗緑膿菌活性を有する抗生物質などの薬
剤による化学療法は従来に比べれば薬剤の種類も増し抗
菌力も向上したためそれなりに治療成果が上りつつある
が、緑膿菌感染症の多くが上述の基礎疾患などに基づく
高度の免疫不全状態のもとで発病しているだけに強力か
つ適正な薬剤による化学療法のみでは効果を望めぬ症例
がしばしば出現すると（・う問題点も無視出来ないもの
になっている。このように緑膿菌感染症が難治性である
ため、薬剤による化学療法以外に生体側すなわち宿毛側
の緑膿菌処理能力を増強させるという観点から主として
宿毛の免疫学的防御機能を高める研究の試みがいくつか
行われてきている。

その１つの代表例は、緑膿菌由来の感染防御抗原を用い
た感染防御法すなわちワクチン療法であるが、これまで
に比較的高次段階まで研究開発が進んでいるものとして
、１３種以上の緑膿菌の血清型別特異抗原を混合した多
価ワクチン（ＬａｎｃｅｉＩＩ＋９７７．１９７９）や
重量らにより分離された緑膿菌の各血清型苗に共通する
感染防御抗原、すなわち緑膿菌共通抗原ＯＥ　Ｐ　（Ｊ
ｐｎ、　Ｊ、　Ｅｘｐ、Ｍｅｄ；４７．３９３−４０２
．１９７７）、さらにはＯＥＰに緑膿菌由来のグロテア
ーゼトキソイド、エラスターゼトキソイドあるいはエク
ソトキシントキソイドを加えた３種あるいは４種混合ワ
クチン（Ｊｐｎ。

Ｊ、Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、＋　４８　、４１−５１　、１
９７８　、　Ｐｒｏｃ。

１４　ｔｈ　Ｍｅｅｔｉｎｇ　ｏｆ　Ｊｐｎ　Ｐｓｅｕ
ｄｏｒｒｌｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉ−ｎｏｓａ　５ｏｃ
ｉｅｔｙ、　Ｐ、　１４）によるワクチン療法が挙げら
れる。

しかしながら、これらのワクチンは多成分系のため製造
が繁雑であったり、肝腎の感染防御効果や副作用の問題
などもあり未だ実用化される段階に至っていなし・。ま
た、ヒト血清免疫グロブリンの受働免疫による免疫グロ
ブリン療法も静注用製剤の開発に伴なって試みられて来
ているが効果の点で疑問視する向きも多℃・。

現存の免疫グロブリン製剤は多数の健康人から集めたプ
ール血清から分離した１９Ｇを主とする製剤であるため
、一般に緑膿菌に対する抗体価が低いことが知られてお
り、効果発現に要する機序にすし・では多彩な緑膿菌抗
原に対する抗体の種類や治療抗体のレベル等を含めて明
確でなく、これが一定の効果につ℃・て期待出来ない理
由になっている。

さらに、緑膿菌に対する抗体価が特に高い血清から作製
した高度免疫ヒト血清免疫グロブリン（以下、高度免疫
グロブリン）を、免疫グロブリン療法に用いる試みも行
なわれてきているが原料血清の資源量に限りがあるため
、実用化にはまだ相当の道のりがあるといわれている。

１例として国外では、緑膿菌の多価ワクチンを健常人に
投与して得た高度免疫グロブリンを敗血症の危険性のあ
る熱傷患者に投与して有効であったことが報告されてい
る（Ｌａｎｃｅｔ　（８２０７）　１２６３−１２６５
．１９８０）が、これとて未だ研究の域を出るものでは
なく、また多価ワクチンが実用化されていない今日上述
の高度免疫グロブリンの実用化のための量的な確保手段
すら未解決と言える。

一方、前述のような難治性の緑膿菌感染症の治療におい
ては、同菌による感染を迅速かつ適確と診断し早期に治
療にもちこむことが重要とされている。しかしながら、
従来の臨床検査における細菌の同定法は数多くの試薬に
対する反応からなる検査系で行なわれており、近年簡便
にして小型のキットが上布されたとは言え未だかなりの
手数を要するので、迅速かつ適確な診断という点にお（
・て必ずしも最善なものとは言い離い。

かかる折、本発明者らは緑膿菌に対する効果的な感染防
御ワクチンの開発を目標として研究中に、緑膿菌のすべ
ての血清型菌に共通に反応するマウスモノクローナル抗
体（以下Ｃ−Ａｂという）の作成に成功し、該Ｃ−Ａ、
　ｂを固定化したアフィニティ力ラムを用いて（＞Ａｂ
に対応する抗原成分を緑膿菌の各血清型菌から同一物質
として分離・精製することに成功した。また得られた該
抗原成分がその理化学的性質あるいは特性からリポ糖蛋
白からなる従来知られていない全く新規な緑膿菌共通抗
原であることとあわせて動物感染実験にお℃・て各種血
清型の緑膿菌感染に対して強い防御活性すなわちワクチ
ン効果を有することを見い出しこの抗原成分なＰＳＣ−
Ａと命名し特許出願中である。

さらにこの緑膿菌共通抗原ＰＳＣ−Ａの感染防御能を研
究する過程で、該ＰＳＣ−Ａで免疫した動物の牌細胞と
ミエローマ細胞との間に細胞融合によって形成される種
々の）・イブリドーマが産生ずるＰＳＣ−Ａに特異的な
親和性を示すモノクローナル抗体が、緑膿菌のすべての
血清型菌と共通に反応しかつ動物感染実験で緑膿菌の各
種血清型菌の感染に対してすぐれた予防治療効果を示す
こと、また同時に該モノクローナル抗体が臨床検査にお
ける緑膿菌感染症の迅速診断のための試薬に好適である
ことを見い出し、さらに後述する諸種の知見を重ねて本
発明を完成するに至ったものである。

以下、本発明の緑膿菌共通抗原ＰＳＣ−Ａに対して特異
的な親和性を示すモノクローナル抗体を単にＰＳＣ７Ａ
に特異なモノクローナル抗体、抗ｐ　Ｓ、、、ｃ　−Ａ
モノクローナル抗体、本発明のモノクローナル抗体と称
することが多い。

また、緑膿菌共通抗原Ｐｓｃ−Ａを単にＰＳＣ−Ａと称
することが多い。

（発明の構成） 本発明は、前述した緑膿菌感染症の予防・治療および診
断上の問題点に対して１つの解決策を提供することを目
的とし、新たに緑膿菌感染の防御抗原であることを見い
出した緑膿菌共通抗原ＰＳＣ−Ａに対するモノクローナ
ル抗体をつくりそれを使用することによって目的を達成
しようとするものである。

すなわち、本発明は緑膿菌共通抗原１”　Ｓ　Ｃ−Ａに
対して特異的な親和性を示すモノクローナル抗体とその
製造法およびその用途さらに具体的には緑膿菌感染診断
側薬および緑膿菌感染予防治療剤に関するものである。

従って本発明による緑膿菌共通抗原ＰＳＣ−Ａに対する
モノクローナル抗体とはＰＳＣ−Ａに対する抗体を産生
ずる細胞とミエローマ細胞との間に形成されるハイブリ
ドーマある℃・はＰ　Ｓ　Ｃ−Ａに対する抗体産生細胞
にＥＢウィルスを感染させて増殖型開変異させた細胞（
以下ＥＢＶ形質転換細胞ということがある）にそれぞれ
産出させたＰＳＣ−Ａに特異的な親和性を示しかつ緑膿
菌のすべての血清型菌体に共通に反応するものである。

また、本発明のＰＳＣ−Ａに対するモノクローナル抗体
は、本発明に従って、Ｐ　Ｓ　Ｃ−Ａに対する抗体を産
生ずる細胞と抗体産生ノ・イブリドーマの作成に適した
細胞融合用パートナ−細胞例えばミエローマ細胞との間
で細胞融合により形成させたハイプリドーマあるいはＰ
　Ｓ　Ｃ−Ａに対する抗体産生細胞にＥＢウィルスを感
染させて増殖型に変異させた細胞すなわちＥＢＶ形質転
換細胞をそれぞれ増殖させて、それらの増殖細胞が産生
ずるＰＳＣ，−ＡＫ特異的なモノクローナル抗体を取得
することによって製造される。

さらに本発明は、本発明によるＰＳＣ−Ａに特異的なモ
ノクローナル抗体を少なくとも１種含む緑膿菌感染症に
対する診断用の試薬に関するものである。

さらに本発明は、本発明によるＰＳＣ−Ａに特異的なモ
ノクローナル抗体を少なくとも１種含む緑膿菌感染症に
対する予防治療剤あるいは、本発明によるＰＳＣ−Ａに
特異的なモノクローナル抗体の少なくとも１種と抗緑膿
菌活性を有する薬剤との複合体からなる緑膿菌感染症に
対する予防治療剤に関するものである。

かくして本発明のモノクローナル抗体は、グロブリンク
ラスが１ｙＧおよびＩ９Ｍのいずれがであるが、いずれ
の場合も緑膿菌のすべての血清型菌体と共通に反応する
性質を有し、また本発明のモノクローナル抗体の少なく
とも１種のみでも緑膿菌の各種血清型菌の感染に対して
すぐれた予防治療効果を与えるという前述した緑膿菌感
染症の予防・治療」二の問題に対して１つの合理的な解
決策を与えている。

さらに１本発明のモノクローナル抗体は、該抗体の少な
くとも１種のみでもすべての緑膿菌による感染に対して
迅速かつ適確な同定が可能な診断用試薬に随意に組み込
めるという点で画期的なものである。

つぎに本発明について具体的に説明する。

本発明にいう緑膿菌は、血清学的分類法に従って例示す
ると具体的な菌株との関係は第１表の通りである。

緑膿菌の分類同定に関しては議論の多いところであるが
、本発明では緑膿菌の分類を緑膿菌研究会主催の型別検
問委員会の決定（１９７５年）による第１表 ＊　第１表に例示したＡ−Ｍ群に属する緑膿菌の菌株の
うち、ＩＩＤ株は東京大発医科学研究所に保存されてお
り第三者に自由に分譲される。

血清学的分類に従うものとし、この分類に基づくＡ〜Ｍ
群に属する菌株はすべて本発明に述べる緑膿菌の血清型
菌の対象になる。なお、本発明では緑膿菌の分類法とし
て型別検討委員会の決定による血清学的分類を現時点で
の最善のものと判断したが、将来にお（・て新分類基準
が採択されることを考慮した場合本発明の緑膿菌とは、
本発明に述べる新規の緑膿菌共通抗原ＰＳＣ，Ａを菌体
に保持する細菌菌株ずべてがその白話対象になると言え
る。

また本発明に述べる新規の緑膿菌共通抗原ＰＳＣ−Ａは
、上述の第１表に例示した緑膿菌のすべての血清型菌が
共通に菌体に保持しているものであり、したがって該Ｐ
ＳＣ−Ａは例えば本発明者らが作成に成功した緑膿菌の
すべての血清型菌に共通に反応しかつＩ）　Ｓ　Ｃ−Ａ
に特異的な親和性を示すマウスモノクローナル抗体Ｃ−
Ａｂを固定化したアフィニティカラムを用いれば、すべ
ての緑膿菌菌体の破砕抽出による無細胞抽出液から同一
物質として簡便かつ高収率に分離することが可能である
。上述のＰ　Ｓ　Ｃ−Ａに特異的な親和性を示すマウス
モノクローナル抗体Ｃ−Ａ　Ｉ）の作成とその性質なら
びにＰＳＣ−Ａの調製法とその性質を実施例をもって具
体的に説明すると実施例１に例示する通りである。

実、殉例１　マウスモノクローナル抗体０−Ａ、ｂの作
製とその性質ならびにＰＳＯ−Ａの調製とその性質 （１）マウスモノクローナル抗体ｃ−Ａｂの作製モノク
ローナル抗体産生ハイプリドーマの作成はＫｄム４．　
、　Ｍ　Ｌｌｉム威らの公知の方法に準じて行なつ１こ
。丁なわち、シュードモナス、アエルギノーサＴｉＤ　
１１３０　（Ｅ型）の０３チホルマＩＪノ処理菌体をフ
ロイントの不完全アジ−バントでエマルジョンとし、１
週おきに計５回ＢＡ　Ｌ　Ｂ／Ｃ′雌雄マウスの腹腔内
に投与して免疫した後、最終免疫の４口径ツマウスの牌
細胞５Ｘ１０８個とＮ５−１マウスミエローマ細胞５　
Ｘ　１０７個との５０％ポリエチレングリコール存在下
における細胞融合によって得られたハイブリドーマを９
６ウエル平底プレートに分注しＨＡＴ培地（ヒポキサン
チン、アミノプテリンおよびチミジン含有〕を添加した
１０％牛脂児血清加ダルベツコＭＥＭ培地で５％００２
Ｊ在下５７℃で培養した。

ハイフリドーマの増殖を認めたウェルについて培養上清
の抗緑膿菌モノクローナル抗体の存在の有無を酵素免疫
測定法であるドノトイムノバインデイングアノセイ法（
Ａぴ１ｙ力、ｃａＪｐ＋；αＯムルＡムｙ１１９．１４
２−１４７．１９８２．以下ＤＩＢＡ法という）で測定
した。ＤＩＢＡ法は９６穴ウエルＵ底マルチプレート（
フアシヨン〕を用い、１ドツト当り０４μｙの０．３％
ホルマリン処理緑膿菌の全菌体を抗原として固定したメ
ンブランフィルタ−（３，１關角〕と上記の培養上清１
００μ４を室温で６０分、ついでパーオキシダーゼ標識
ウサギ抗マウス、イムノグロブリン抗体（ＤＡＫＯ社製
〕と３０分反応佑クロルナフトールを基質として発色さ
せ抗原を固定したメンブランフィルタ−上に肉眼観察で
発色を認めたものを抗体産生が陽性と判定した。培養上
清にモノクローナル抗体産生が認められたハイブリドー
マはさらに限界希釈法でクローニングを行ない、モノク
ローンになったノ・イブリドーマはフラスコで増殖させ
た後、免疫抑制剤プリスタン（アルドリッチ社）で前処
理ＢＡ、ＬＢ／／Ｃマウスの腹腔内に移植し得られたマ
ウス腹水からプロティンＡ−セファロース（ファルマシ
ア社）のアフイニテイ力ラムを用いてモノクローナル抗
体を精製した。かくして得られ１こ種々の抗緑膿菌モノ
クローナル杭体産生ハイプリドーマの中から、本発明者
らは緑膿菌のすべての血清型苗と共通に反応するモノク
ローナル抗体０−Ａｂを産生する０−ＡＩ）産生ハイブ
リドーマを見い出した。

（２）マウスモノクローナル抗体ｃ−Ａｂの性質この０
−Ａｂのグロブリンクラスは工ｇＧであり、またＩ）Ｉ
ＢＡ法によるＣ−Ａｂの緑１儂菌の血清型苗に対１−る
反応性を例示すると第２表の通りとなり、０−ＡＩ）は
いずれの血清型苗ともはｙ等しい親和性を示したが、緑
膿菌以外の細菌とは反応しなかった。また、Ｃ−Ａｂは
緑Ｉｌａ菌Ｅ型菌由来の内毒素（リボ多糖体、シュード
モナス・アエルギノーサＮ−１０株よりモリノン法によ
り自家調製）およびＯＥＰ　（シュードモナス・アエル
ギノーサＮ−１０株より車間らの方法で自家調製）とも
反応しなかった。

なお、プロティンＡ−セファロースのアフィニテイカラ
ムによる０　−Ａｂ精製品の後述するＰＳＯ−Ａを１光
源と１−る抗体価はＤＩＢＡ法で２５６×１０６／　１
　’ｌ／ｍｌと極めて高いものであった。しまたがって
、このことは本発明に述べるＰＳＣ−Ａが緑１喰菌の内
毒素やＯＥＰとは免疫学的に異なる性質をもつことを示
している。

（３）ＰＳＣ−Ａの調製 グルタミン酸すトリウム　２０９ グ１Ｊセリフ　５ｇ Ｍｇ　Ｓ　Ｏ，・７１１２００１ｇ Ｋｔｌ、、ＰＯ，０，５５ｇ Ｎａ２１−ＩＰＯ，−１２０，，０５，６ｊｊ（至）（
ＮＯ３）２・４１−１２０　１７．２６■Ｆｅ３Ｏ４，
−７１−１，，０５０ｐｊｑ（水を加えて１ｅにし、ｐ
Ｈ７，４にアンモニア水で調整する。） シフ−トモナス・アエルギノーサＡＴＯＯ１０１４５（
（）型うを皆通寒天培地で３７℃１夜培養し、増殖しＴ
こ菌体を生理食塩液に＠濁しそのｏ、ｓｍｇを上記組成
の水量らの合成培地ｉｓｏｍｌを含む坂ロフラスコに接
種し６７℃で１６時間振とう培養した。

培養後板ロフラスコ１本当り１．２　ｍｌのホルマリン
を加えて充分混合し室温に１時間放置した。ついで培養
孜を遠心分離（１２０００Ｘｇ３０分間）して菌体を集
め、さらに生理食塩液と蒸留水で洗浄処理と遠心分離を
繰返し湿菌体２９５ｇを得た。

この湿菌体を２　％　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ　１００および
１０７７１１０７７ｌを含む２０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ｈ
Ｃｊ？緩衝液（ｐＨ８，０）１２１に懸濁した後水冷下
ＤＹＮＯ−ＭＩＬＬ　（ビーズＯ，ｌ　ｍｍφ〕を用い
流速６０ｍ４７分で６分間破砕した。この菌体破砕懸濁
液は静置後止澄液をデカンテーションにより集め、残渣
に上記緩衝液２８１を加えてよく攪拌して静置し再びそ
の上澄液をデカンテーションにより集めた。デカンテー
ションにより集めＴこ上澄液はプールし遠心分離処理（
３９０００Ｘｇ　５０分間うして遠心上清約４４を得た
。

この遠心上清をアフイーゲル−１０（バイオラド社製）
を相体として固定化した上述のモノクローナル抗体０−
　ＡＩ）を詰めたアフイニテイ力ラム（サイズ３ＤＸｉ
［］Ｑ＋＋＋ｍ、アフイゲ＃−１０１ｍ１に対してａ　
−Ａｂ　１５ダ結合）に付し、０５褒Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ
　１００を含む２０　ｍＭ　ＴＩ’ｌＳ　ＨＣ（ｌ緩衝
液（ｐＨ８，０）　５００ｍｌ、２　Ｄ７７ＬＭ　Ｔｒ
ｉｓ−ＨＯＩ緩衝液（ｐｉ−１８，０）　５００　ｍｌ
で順次カラムを洗浄し１、ニ後最終的に５０場イグリシ
ン−Ｈｏｄ緩衝生理食塩液（■用３．０　）　５０　ｏ
ｉｌで溶出させムニ。得られた溶出液は１Ｎ炭酸水素ナ
トリウム水溶液で中和後、蒸留水に対して４℃で２４時
間透析を行ないついで透析内液を凍結乾燥して本発明に
述べるＰＳＯ−Ａ原末を２５〜得た。

（４）１）Ｓｏ−Ａの性質 上記（３）において精製して得られたＰＳＯ−Ａの理化
学的性質を調べた結果を示す。なお他の緑膿菌の＋ｍ清
型閑より得られたＰＳＯ−Ａも同様の性質を示す。

ＰＳＯ−Ａの理化学的性質： （（１）１分子量 １５０００　（５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動による） 但し、下記条件のポリアクリルアミドゲル電気泳動（Ｐ
ＡＧＥ　）においてクマシブリリアントプルー几２５０
で染色される単一バンドを示す。

ＰＡＧＥ条件　結果 ＰＩ−１９，５７係ゲル　ｌ’ｔｆ＝０．８６ｐＨ９５
１０％ゲル　Ｒ，ｆ　＝　０．８　’０ｐＨ９，５１２
％ゲル　Ｒｆ＝０．７８（ｔ２）構成成分 蛋白質計量（（６）：　２７．０　（ローリ−変法、牛
血清アルブミン標準） ２４０（プロテインパインデ イングアノセイ法、牛血清ア ルブミン標準〕 ５５０（加水分解によるニン ヒドリン比色法、牛血清アル ブミン標準〕 糖含量（至））＝３０〜５０（フェノール硫酸法。

グルコース標準） ヘキソサミン含量（ｅＡ：　１．　Ｄ以下（ロンドル・
モルガン法、グルコース標 準） 脂質含量（ｏＡ：　７．０〜１００（プリン・ダイエル
の変法〕 但し、本物質のクロロホルム・メタノール抽出物（プリ
ン・ダイエルの変法）をシリカゲル’Ｉ”ＬＯにより石
油エーテル：エーテル：酢酸（８０：２０：１）で展開
し５０％硫被加熱反応により発色させるとき呈色は原点
に認める。

（（う）性状、溶解性 淡黄色粉末であり、水、生理食塩液およびリン酸緩衝液
に可溶・水に対する溶解度は１〜／ｍｌ　、Ｔ＝Ｊ上で
ある。メタノール、エーテル、ヘキサンおよびクロロホ
ルムにはほとんど溶ケナい。

（（４））呈色反応 ローリ−・フォリン反応、ニンヒドリン反応、フェノー
ル硫ど後反応およびアンスロン硫酸反応は陽性。エルシ
ンモルガン反応は陰性。

（（Ｓ））等電点 ＰＩ＝３．８〜４２（等電点眠気泳動法）（（６））　
′７ｊ一定性 中性の水溶液中で、室温において２４時間以上安定であ
る。

（（力）紫外部吸収スペクトラム 図面に示したとおり、２７２７１１ｍ附近に極大吸収を
示す。

（０）酵素活性 カゼインおよびコラーゲン［対づ−る分角イ活性を示さ
ない。

（９））特性 ｌ）マウス結合繊由来培養細胞株のＬ細胞に対して本物
質１０μ９Ａｎｌで、また正常マウス牌由来培養白血球
細胞に対して本物質２μＩ／ｍｌでそれぞれ２４時間陪
養するとき直接細胞障害作用を示さない。

１１）生理食塩液に溶解した本物質またはフロイントの
不完全アジ−パントあるい（不完全アジュバントに懸濁
した本物・質はいずれもマウスに免疫′するとマウス血
清中に緑ｆ′Ｉ８菌と反応する液性抗体が出現する。

ｉｉｉ　）本物質に対して特異的な親和性を有するマウ
スモノクローナル抗体（本発明のモノクローナル抗体０
−ＡＩ））は公知の緑膿菌共通抗原ＯＥＰおよび緑膿菌
内毒累（リポ多糖体つと反応しない。

つぎに本発明のモノクローナル抗体の基本的な製造方法
について述べる。

本発明によるＰＳＯ−Ａに特異なモノクローナル抗体は
、いわゆる細胞融合法およびＥＢウィルスによる形質転
換法によってそれぞれ製造することかり能である。

＃１胞融会法に、Ｊ：るモノクローナル抗体の作成は用
いる抗原が新規なＰＳＯ−Ａである以外、ＭＬｉＡムｂ
η訃ｕ々らによって明らかＣ（され、その後種々改良さ
れた公知の方法を利用することｈ″−出来る。例えばハ
イブリドーマの作成およびモノクローナル抗体の製造に
ライてはＪ、　工ｔｒｒｙｒｗ、ｎｔＪ、　Ｍ−ｅ、、
ｔＬｄ　５９．２８５−３０８．１９８ＯＫ示された雑
文が最も一般的な解説資料どして利用すること／］″−
出来る。

細胞融合法による本発明のモノクローナル抗体の作成例
はすでに前ボの実施例１に示される如（であるが、さら
に具体的に態様を示せばつぎの通りとなる。

まず細胞融合に用いる抗体産生細胞の調製法は緑１１典
菌の各種血清型閉のホルマリン処理（（よる無毒化菌体
なそのま＼抗原として用いることも可能であるが、効率
的な方法として実施例１で得たＰＳＯ−Ａを抗原として
生理食塩液等に溶解するかまたは市販のフロイントの不
完全アジュバントあるいは完全アジュバントに混じてエ
マルジョンにするかして動物たとえばＢＡＬＢ１０マウ
スの腹腔内または皮下に投与して免疫する。なお、本発
明におけるこのＰＳＯ−Ａ［よる免疫操作は１つの抗原
成分のみで緑膿菌の各種血清型呵に対して共通に反応す
る抗体産生を誘導するという意味で画期的なものである
。ＰＳＯ−Ａを抗原として動物に免疫する場合、投与剤
型にもよるが１回の免疫用量はお＼むね１μｇ〜１０．
０μＩ／頭が適当である。

初回免疫後装すれば１〜２週間程度の間隔で同じＰＳＯ
−Ａ抗原を投与して追加免疫を行なうが、追加免疫の回
数はフロイントの不完全あるいは完全アジュバントでエ
マルジョンにして投与する場合１〜２回で充分である。

また、ＰＳＯ−Ａ生理食塩液等に溶解した水溶液として
投与する場合も３〜４回追加免疫すれば後述のＰＳＯ−
Ａに対する抗体産生細胞を取得するのに充分な免疫状態
に達″ｊる５、最終免疫後３〜４日経過してマウスの肺
臓を摘出して抗体産生細胞を得ることが出来る。この場
合、牌細胞以外にリンパ節や未稍血の白血球細胞も抗体
産生細胞として用いることが可能であるっＰＳＯ−Ａで
免疫した動物から得られた抗体産生細胞（ま、予め培養
しておいたＨＡＴ培地（ヒボキサンチン、アミノプテリ
ン、チミジン含有培地）に感受性のマウス由来のミエロ
ーマ細胞たとえばＰ　３−　ＮＳ　Ｉ／１−Ａ４４．１
　（略号Ｎ５−１）あるいはＰ３−Ｘ６！＝−Ａｇ８．
　Ｕｌ　（略号Ｐ５Ｕ１）と１：１〜１ｏ：１程度の比
率で混合し、さらに適当な細胞融合用培地たとえば５０
チポリエチレングリコールヲ含む市販のダルベツコＭＦ
＋Ｍ培地や４０％ポリエチレングリコールと１５％ジメ
チルスルホキサイドを含む市販のＲＰＭｌｌ　６４０培
地を加えて、公知の方法により両ａｌｌ胞を融合させて
ハイブリドーマを形成させ、ついで培地をハイブリドー
マのみの増殖＆ＧｌｌたＨＡＴ　培地に代えハイブリド
ーマの培養物？得る。ハイブリドーマ培養物は市販の組
織培養用２４ウエルあるいは９６ウエルのプラスチック
マルチプレート等に分注してＨＡＴ培地で１〜２週間培
養する。この際フィーダー細胞として正常マウスｊＩＷ
臓由来の白血球細胞を共存させるとバイブ１７ドーマの
増殖を早めることが出来る。かくしてハイブリドーマの
明瞭な増殖が認められたウェルの培養上清を別のマルチ
プレート中で抗原として固定化したＰＳＯ−Ａあるいは
要すればホルマリン処理無毒化緑膿菌菌体（Ａ〜Ｍ型の
いずれの菌株でもよい）と反応させる。反応後固定化し
プこ該抗原を適当な緩衝液で洗浄しついで市販の酵素標
識抗体たとえばパーオキシダーゼ標識抗マウスグロブリ
ン抗体を用いてエンザイムイムノアッセイ（以下、ＥＸ
Ａ　）を行ない、目的とするＰＳＯ−Ａに特異的な親和
性を示しかつ緑ｌｌ１ｉａ菌菌体とも反応する抗体を産
生じているバイブ１７ドーマをスクＩＪ−ニングする。

この場合に用いるＥ、ＩＡ法の術弐としては実施例１に
記載したように抗原をメンブランフィルタ−にドツトし
て用い、酵素標識抗体による酵素反応の呈色割合を直ち
に肉眼判定出来るドソトイムノバインデイングアツセイ
法（ＤＩＢＡ法）が簡便にして経済的な手段として推奨
される。

−ト述のスクリーニングによって目的とする抗体産生を
認めたハイプリドーマについては、さらに公知の限界希
釈法によりクローニングを行ない、本発明のモノクロー
ナル抗体を産生ずるハイプリドーマクローンを得る。こ
れらの樹立されたハイプリドーマクローンは継代培養す
れば本発明のモノクローナル抗体の製造にそのまま使用
できるが必要に応じて公知の方法による保存用処置を行
ない、−８０℃ディープフリーザーや液体窒素の入った
保存庫内に凍結保存することも可能である。

つぎに樹立されたハイプリドーマクローンヲ用いて本発
明のモノクローナル抗体を製造する場合は、１０％牛脂
児血清加ＲＰＭＩ　１６４０培地あるいはダルベツコＭ
ＥＭ培地や近時市販の無血清培地でハイプリドーマクロ
ーンを大量培委するかあるいはハイプリドーマクローン
をマウスの腹腔内に移植するかして増殖させることによ
って本発明のモノクローナル抗体を製造することが出来
る。特に後者のマウス腹腔内へのノ・イブリド−マクロ
ーンの移植による製造法は高濃度の本発明のモノクロー
ナル抗体を得る方法として推奨される。

すなわち、予め培養して得た細胞数１０６〜１０７個の
ハイプリドーマクローンを免疫抑制剤ブリスタン（アル
ドリッチ社製）で前処理じておいたＢＡＬＢ１０マウス
の腹腔内へ接種する。ついで接種後１〜２週間程度経過
して貯留された腹水を採取するというものである。この
ようにして得られる培養液や腹水中の本発明のモノクロ
ーナル抗体は精製して用いるのが望ましく精製法として
は免疫グロブリンの４１　ｇに採用される任意のものを
適宜選択して用いることが出来る。たとえば硫酸ナトリ
ウムや硫安による塩析法、ＤＥＡＦｊセルロース等によ
るイオン交換クロマトグラフィー、ゲルｆ過法するいは
固定化プロティンＡ等によるアフイニテイクロマトグラ
フイー等が適当であり、これらを適宜組み合わせること
によって高純度の本発明のモノクローナル抗体を・潜る
ことが出来る。

また、本発明のモノクローナル抗体のグロブリンクラス
Ｉ、ｊ９ＧとＩｇＭの同定はゲル沢過法と酵素標識抗体
によるＥＩＡを併用することによって可能である。本発
明者らは本発明のモノクローナル抗体がマウス由来の場
合、セファクリル８３００（ファルマシア製）を用いた
ゲルｆ過法およびツクーオキシダーゼ標識ヤギ抗マウス
エ２Ｇ抗体とパーオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＭ
抗体（カッベル製）を用いたＥＩＡ法を併用し同定して
いる。後述するヒト由来モノクローナル抗体の場合は、
セファクリル５６００のゲル沢過法とパ゛−オキシダー
ゼで標識したヤギ抗ヒトＩ％抗体と同ヤギヒトＩ　ｙＭ
　抗体（カッベル製）によるＥＩＡ法を併用することが
出来る。

なお、本発明の細胞融合法においては、Ｐ２Ｏ−Ａに対
する抗体産生能を持つ細胞として健常人の末梢血、患者
手術時の摘出リンノ（節（たとえば扁桃腺〕や分娩時の
肯帯血から得られるヒ）　Ｂ　ＩＪンノく系細胞を融合
に用い、ヒト由来の本発明のモノクローナル抗体を製造
することも適用可能である。

この場合、用いるヒ）Ｂリンパ系細胞は血清中にｐ　ｓ
　Ｏ−ＡあるいはＡ−Ｍ型のいずれかの緑膿菌菌体に対
−する抗体産生が認められる健洛人あるいは患者由来の
ものが細胞融合による本発明のモノクローナル抗体産生
ハイプリドーマの出現頻度が高いという点で有利である
。すなわち、血清中に該抗体を産生ずる健常人および患
者由来の末梢血、吟帯血あるいはリンパ節から得られる
単列１胞浮遊液を公知のファイコール・コンレイ比重遠
心法等に付し単核細胞バンド部分を採取りこれを抗体産
生ヒ）　Ｂ　ＩＪンパ系細胞源としてａ７抱融合に用い
ることが出来る。

このヒ）　Ｂ　ＩＪンパ系細胞を用いた細胞融合による
ハイブリドーマ作成にはＨＡＴ培地に感受性のヒト由来
ミエローマ細胞あるいはリンパ芽球様細胞を細胞融合の
パートナ−細胞として用いるのが好適であるが、前述の
マウスミエローマ細胞をハードナー細胞とすることも通
用可能である。

また、該ヒ）　Ｂ　ＩＪンパ系細胞は直ちに細胞融合に
付してもよいが、あらかじめ試験管内でｐｓａ−Ａと接
触させて一定時間培養した後、細胞融合に供する方が本
発明のモノクローナル抗体産生ハイプリドーマの取得効
率を一層高めることが出来るという点ですぐれている。

このように細胞融合に先立ってヒトＢリンパ系細胞をＰ
ＳＯ−Ａと接触させて培養することは、取得しようとす
る目的抗体に対応する抗原によるリンパ系細胞の１ｒｎ
ｙｉｒノ、４σ感作を意味しており、本発明においてな
しうる効果的な手段である。

該ヒ）　Ｂ　ＩＪンバ系細胞の細胞融合条件ならびに形
成されたハイブリドーマのスクリーニングサラにはクロ
ーニングに至る過程の基本的術式はハイプリドーマによ
る産生抗体検出ＶｃＥＩＡによる酵素標砿抗体として例
えば市販のパーオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトイムノグロ
ブリン抗体を用いる以外、前述のマウスハイブリドーマ
の場合に準拠シて実施することが出来る。また、得られ
たハイプリドーマクローンによるヒト由来の本発明のモ
ノクローナル抗体の製造は市販の牛胎児血清添加培地あ
るいは無血清培地でハイブリドーマクローンを適宜のス
ケールで培養することにより行なうことが出来る。培養
液からヒト由来の本発明のモノクローナル抗体の精製法
も前述のマウス由来の場合となんらかわりない手法の組
み合わせが適用可能である。

つぎに、本発明のうち、ＰＳＯ−Ａに対する抗体産生能
を持つヒトＢリンパ細胞ＫＥＩ３ウィルス（Ｅｐ−１ム
籏−Ｂ勾ゐウィルス〕を接触・感染させて該Ｂ　ＩＪン
パ系細胞を継代培養可能な増殖型に変異させヒト由来の
本発明のモノクローナル抗体を持続産生するクローンを
選択しそれが産生ずる抗体を取得することからなる製法
、いわゆる、ＥＢウィルス形質転換法による本発明のモ
ノクローナル抗体の製法の実施の態様を述べる。

ＥＢウィルス形質転換法によるヒトモノクローナル抗体
の製造法の基本術式は、小野やＫｈＬｎらのグループの
報告（第４回日本免疫学会総会記録６９９頁、１９７４
．、Ｎαム槌　２６７．５２−５４．１９７７Ｊをはじ
めとして多くの雑文が提出されて来ているので、本発明
で用いる抗原が新規なｐｓｃ−Ａであることを除けば公
知の方法として利用することか出来る。

すなわち、前述の細胞融合の項で示したと同様に健常人
の末梢面、手術時の患者の「ノンパ節あるいは分娩時の
崎帯血から分離されるヒトＢ　ＩＪンパ系細胞を培養に
適した培地例えば２０チ牛脂児血清加几ＰＭ１１６４０
培地で培養した後ＥＢウィルスと混合し接触感染させる
。

この場合、培養したヒ）　Ｂ　ＩＪンパ系細泡に直接Ｅ
Ｂウィルスな接触感染させてもよいが、細胞融合の項に
示したようにあらかじめＰＳＯ’−Ａを抗原として接触
させてｉｒｎ、　ｙＬ）ｌａｐ抗原感作を行なう方がＰ
ＳＯ−Ａに対して特異性を示す抗体産生細胞の出現率の
増加が期待出来るという点ですぐれておりこの操作は本
発明（Ｃおいてなし得る効果的な手段である。

また、用いると）Ｂリンパ系ａ胞は血清中にＰＳＯ−Ａ
あるいは緑膿菌菌体に対する抗体産生が認められる健洛
人あるいは患者由来のものが上述のＬｎ　ｙｒ１４ｖ抗
原感作に類した意義があり好適である。

前述のＦｉＢウィルスを接触感染させたヒトＢリンパ系
細胞は培養液を交換しつつ培養を継続しこの間にＥＢウ
ィルスによって変異し細胞増殖のみられたものを継代培
養に移す。この継代培養液の上清につきＰＳＯ−ｋＫ対
する抗体の有無を細胞融合の項で述べたと同様にＢＩＡ
で測定し該抗体濃度が明瞭に検出される培養物について
後述するクローニングを行ない本発明のモノクローナル
抗体を持続産生するクローンを取得する。

なお、ＤＢウィルスは該ウィルスを持）洸産生して放出
している細胞株たとえばマーモセントリンパ球由来の８
９５−８細胞（ｐｚ、ｃＪＪａｆ、Ａｃａｄ。

８ｃｉ、ＵＳＡ　７０．１９０．１９７３）を２０゛％
牛脂児血清加ＲＰＭＩ　１６４０培地で培養し、該細胞
の増殖ステージが静止期疋近い状態の培養液上清を遠心
分離してＢＢウィルス源として用いるのが好適である。

また、ＥＢウィルス感染価（５０％トランスフォーメー
ション／ｌｎｌ　：　Ｔｎ５ｏ　／ｍｌ　）は健常人の
末梢リンパ球を用いたトランスフォーメーションアッセ
イ（Ｐ４Ａｙｃ、Ｎａｆ、ＡＧｄ、Ｓｃ、ｊＵＳＡ　７
０゜１９０．１９７３）によって測定することが出来る
。

Ｐ　Ｓ　Ｏ−Ａに対１″る抗体産生細胞のクローニング
は、公知の方法に従ってＥＢウィルスによって形質転換
したヒ）　Ｂ　ＩＪンパ系細胞集団を多数の細胞小集団
に細分して培養し、該抗体の産生能の高い細胞集団を選
び出す操作を反復することによって行なうことが出来る
。たとえば、形質転換により該抗体産生能が認められる
細胞集団をマイクロプレート中の各ウェルに細胞数１０
４〜１０５個／ウェル１０１〜０．２　ｍｌの割合で分
注して培養を繰り返すことにより行なうことが可能であ
る。この操作によってＰＳＯ−Ａに対する抗体以外の抗
体産生ａ泡二〇混入率の低い廁、ｌ＠２集団を選別する
ことが出来、究極的に抗体価の高い本発明の目的抗体を
得ることにつながる。

さらに効果的、７クローニング法としてはロゼツト形成
による方、宍を行なうことが出来る。すなわち、ＰＳＯ
−Ａに対−ｊる抗体産生能の高い細胞集団の浮遊液にＰ
ＳＯ−Ａ感作ヒツジ赤血球を加え、Ｐ　Ｓ　Ｏ−Ａに対
する抗体産生細胞とヒツジ赤血球との結合体からなるロ
ゼツトを形成させる。

このロゼツトを密度勾配遠心法により分離し、該ロゼツ
トを常法の低浸透、王溶液か塩化アンモニウム溶液中に
浮遊させヒツジ赤血球を手早く溶血させｆこ後培養液を
添加し遠心分離して抗体産生細胞のみを集めることが出
来る。この操作によりＰＳＯ−ＡＫ対する抗体産生細胞
をきわめて高率に含有する細胞集団を得ることが＝Ｔ能
である。さらに、本発明のモノクローナル抗体を持続産
生するクローンのみを得るには上述のＰＳＯ−Ａに対す
る抗体産生細胞を高率に含有する細５泡集団を適宜に希
釈して軟寒天培地中で培養し生じた単一細胞の集団であ
るコロニーを採取して培養することにより達成できる。

かくして得られる本発明のモノクローナル抗体産生クロ
ーンから得ら−ｈる抗体のグロブリンクラスの同定は前
述のヒ）　Ｂ　ＩＪンパ系細胞二〇細胞融合の項で示し
たと同一方法により実施可能である。

また該抗体産生クローンを要すれば公知の保存用処置を
施すことに１こり凍結保存可能である。

さらに、本発明のモノクローナル抗体は市販の牛胎児血
清添加培地あるいは無血清培地に適宜のスケールで該抗
体産生クローンな培養し、その培養液を遠心分離により
採取することにより製造することが出来る３３ 培養液からの本発明のモノクローナル抗体の精製は、細
胞融合の項（Ｃ示したと同じ諸種の手法な組み合わせて
用いることで実施可能である。

以上のように各種の製造法によって得られる本発明のモ
ノクローナル抗体はいずれも緑Ｉｍ菌の各種血清型閉に
共通に反応するという特筆すべき性質を生かすことによ
り以下の述べる用途に供することが出来る。

まず、本発明のモノクローナル抗体の緑膿菌感染症の診
断用試薬への用途について説明する。

本発明者らは本発明のモノクローナル抗体が前述の実施
Ｉｊ１１１に示すように緑膿菌のＡ〜Ｍ型の各種血ｍ型
閑に共通に反応するが他の細菌類には反応しないという
特性を有するため、該抗体が細菌感染症例あるいはその
疑いのある患者のそれぞハ検査材料につき緑膿菌感染症
有無を迅速かつ適確に診断する上できわめて有用な診１
祈用試薬になり得ることを見い出している。

本発明のモノクローナル抗体を組み込んだ緑膿菌感染症
の診断用薬としてはこの種の診断には鋭敏な感度や精度
とともに簡便さや高い経済性が要求されるところから少
量の患者由来の検査材料で容易に診断出来る螢光抗体法
やＢＩＡ法に基づくものが好適である。

例えば螢光抗体法に基づ（本発明の診１析薬の場合は、
本発明のモノクローナル抗体にフルオレノセンインチオ
シアネート（以−ドＦＩＴＯという）等の螢光色素を直
接結合させた直接法試薬あるいは本発明のモノクローナ
ル抗体といわゆる第２抗体に相当する異種動物由来の本
発明のモノクローナル抗体に対゛する抗体にＦＩＴＯを
結合させたものからなる間１ｄ法試薬が適用し得る。同
様にＥＩＡ法ではたとえばパーオキシダーゼで標識され
た本発明のモノクローナル抗体とパーオキシダーゼの発
色用基質であるクロルナフトールとの組み合わせからな
る直接法試薬あるいは本発明のモノクローナル抗体、パ
ーオキシダーゼ標識第２抗体およびクロルナフトールか
らなる間接性試薬をそれぞれ用いることが出来る。

これらの診断用試薬は、メンブランフィルタ−やスライ
ドグラス上に塗布し固定した患者由来の少量の検査材料
たとえば血液膿汁、尿、喀疾、分泌液、糞便など、要す
ればそれらの培養物に直接適用して反応させ、螢光顕微
鏡、光学顕微鏡、自動測定装置あるいは肉眼観察により
迅速かつ簡便に診断−することが可能である。

かくして緑）聴菌による感染と診断された場合は患者を
早期治療に持ち込めるという利点を強調することが出来
る。

なお、本発明のモノクローナル抗体を緑膿菌感染症の診
断用試薬として用いるにあたっては、本発明のモノクロ
ーナル抗体は精製品に限定するものではなく、本発明に
よって作成された抗体産生細胞・７′）培養液上清ある
いは該細胞を移植したマウスから得られる腹水も適宜使
用することが出来る。

つぎに本発明のモノクローナル抗体の緑膿菌感染症の予
防治療剤への用途について述べる。

本発明者らは本発明のモノクロルナル抗体を適宜選んで
その感染予防ならびに治療効果を緑膿菌感染マウスを用
いて検討したところ、比較的少量の投４景で本発明のモ
ノクローナル抗体が血清型の異なる緑ＩＩｌ菌の感染に
対してはｙ一定の感染予防および治療効果を示すことを
見い出している。

すなわち、本発明のモノクローナル抗体を緑膿菌感染症
の予防治療剤として用いる場合は注射剤の型で用いるの
が好ましく、単独あるいは通常用いられる添加剤、賦烈
剤を加えて液剤あるいは同時溶解型の凍結乾燥製剤とし
て用いることが出来る。実際の感染予防治療にあたって
は本発明のモノクローナル抗体２種以上混合して用いて
もよく、ま１こ本発明のモノクローナル抗体を抗緑膿菌
活性を有する抗生物質と併用することによっても強い感
染予防治療効果を発現させることが出来る。特に後者の
該抗生物質と併用する場合は本発明の七ツクローナル抗
体を該抗生物質と混合した製剤の型で膜力するか、ある
いは２剤を異なる投与ルートおよび投与時期に用いても
併用効果を期待出来る。さら（では人工的に調製可能な
リン脂質、コレステロール等から構成されるリボゾーム
中に該抗生物質な封入し、本発明のモノクローナル抗体
を該リポゾーム膜の外表部分に固着させたいわゆるミサ
イル療法タイプの↓剤でも適用可能である。

なお、本発明のモノクローナル抗体の用量、投与経路は
適宜選択されるが用量は体重〜あたり０．０５ないし５
０ｍｇが好ましく投与経路は皮肉、皮下、筋肉内、静脈
内、腹腔内投与が可能である。

・また、本発明のモノクローナル抗体はマウスに対する
急性毒性がもとより極めて低いことから動物およびヒト
の緑膿菌感染に対して高度免疫グロブリン製剤として受
動免疫療法に好適なものと言える。

以下に本発明のモノクローナル抗体に関する実施例と試
験例を例示する。

実施例２　マウスハイブリドーマによる本発明のモノク
ローナル抗体の製造 実施例１に記載した方法により得ｆこＰ　８０−Ａの生
理食塩液溶層液とフロイントの不完全アジ−バント（ヤ
トロン社〕を等景況ぜ連結注射針を用いて油中水型のエ
マルジョンを作成し免疫用抗原とした。

生後８週令のＢＡＬＢ１０雌性マウスに上記のｐｓａ−
Ａのエマルジョンを１週間間隔で通算６回免疫した（１
回あたりＰＳＯ−Ａ免疫量１０μｇ／マウス腹腔内投与
〕。最終免疫の４日後にマウスの頚部切断にて放血後肺
臓を摘出し曝細胞分散を行ない細胞融合用の牌細胞とし
た。

細胞融合用のパートナ−江胞には１０％牛脂児血清加ダ
ルベツコＭＢＭ培地であらかじめ培養（ナプコ製ＯＯ２
インキュベーター、３７℃、５チＣＯ２順対湿度１００
％）して増殖させたＮ５−１マウスミエローマ細胞を用
いた。

上記の牌細胞５×１０８個とＮ５−１細胞５Ｘ１０７個
とを混合し、これに５０９６ポリエチレングリコール（
Ｍ、Ｗ、＝＝、１０００−６０００平井化学）を含有す
る細胞融合用培地を用いて常法により細胞融合を行なっ
た。

融合細胞は１０係牛脂児血清加ダルベツコＭＥＭ培地で
細胞浮遊液とじ９６ウエルのプラスチック平底マルチプ
レート（ファルコン社）にミエローマ細胞換算で５Ｘ１
０’〜１０５個／ウェル１０１ｍ１になるよう分注し培
養した。この際フィーダ細胞として正常ＢＡＬＢ１０マ
ウスの牌則胞浮遊液を加工５　Ｘ　１０４〜Ｉ　Ｏ”個
／ウェル共存させた。

翌日よりＩＩＡＴを含有する１０係牛ｊ冶児血清加ダル
ベツコＭＥＭ培地で培養液を半針ずつ置換して℃・わゆ
る１４ＡＴセレクシヨンを約２週間にわたって行ない、
ノ・イブリドーマの増殖が認められたウェルの上清な採
取してＤＩＢＡ法によりＰＳＯ−Ａおよび緑膿菌ＩＩＤ
　１１３０株に対する抗体産生の有無をスクリーニング
した。

ＤＩＢＡ法＆１９６ウエルのＵ底マルチプレート（ファ
ルコン社）を用い、１ドツト当り０．１μｇのＰＳＣ−
Ａを抗原として固定した５、　１　ｆｒＬｍ角のメンブ
ランフィルター（ミリボアー４フｍｎ径格子人フィルタ
ー１−ＩＡＷＧＯ４７）にまた緑１県菌ＩＩＤ　１１！
１０株は実施例１と同様のものにハイブリドーマの培養
上清ｉｏｏμｅを加え室温に６０分、ついで上清除去後
パーオキシダーゼ標識ウサギ抗マウスイムノグロブリン
抗体（ＤＡ、ＫＯ社〕の１０００倍希釈液１００μｌを
加えて同様に３０分それぞれ反応させて最後に基質とし
てクロルナフトールを加工て発色させた。抗原を固定し
たメンブランフィルタ−上に肉眼的に発色を認めたもの
を抗体産生陽性と判定した。

このスクリーニングの結果、抗体産生陽性のウェルのハ
イブリドーマはさらに限界稀釈法によりクローニングを
行なった。

すなわち、該抗体産生陽性のハイブリドーマのＨＡＴ含
有培地による浮遊液を副層し、細＠濃度測定して新しい
マイクロプレー１・に最大稀釈でハイブリドーマが０５
個前後／ウェルになるようハイブリドーマの１０倍およ
び２陪稀釈系列を分　して培養した。この時各ウェルに
は正常マウス牌？削胞を１０・５個／ウェル共存させた
。

高希釈のウェルでハイブリドーマの増殖が認められた場
合は抗体産生能の測定と顕微鏡観察を行ないモノクロー
ンであることを確認した上さらに再度同じ操作を繰返し
、抗体持続産生能の高゛す・抗ＰＳＯ−Ａモノクローナ
ル抗体産生クローンを得た。

得られた各クローンは培養スケール徐々に上げ最終的に
５００ｍ１の１０％牛脂児血清加ダルベツコＭＥＭ培地
で培養（スターリングシステム、日本インターメノドフ
しその培養上清につき抗体の性質ケ調べた。

以上の実験操作を前後２回にわたって行なし・、最終的
に！ｆ２５表して示す本発明のモノクローナル抗体産生
クローンを７採得た。

７株の）・イブリド−マクローンの産生ずる本発明のモ
ノクローナル抗体のグロブ１ノンクラスｋ”Ｌノぐｉオ
キシダーゼで標識したヤギ抗マウスエｔＧ抗体およびヤ
ギ抗マウスＩｙＭ抗体（カッベル〕を用い１こＤＩＢＡ
法およびセフアク１ノールＳ３０［］（ファルマシア）
のゲルｆ過法により測定したところ、５株がＩ％、２株
がＩ　２Ｍであった（第６表参ｊ憬〕０ また、第５表に示すように本発明のモノクローナル抗体
はＰＳＯ−Ａｂ−Ｍ７を除きＡ−Ｍ型の緑１１農菌菌体
との明瞭な反応が認められたｂ″−緑膿１宥以外の細菌
１２株とはほとんど反応しな力・・つた。

第５表 ｔ　ｐｓａ−Ａｂ−ＭＩ　Ｉ＃Ｇ＋− ２ＰＳＯ−Ａｂ−Ｍ２Ｉ＠Ｇ　＋、　−５ＰＳＯ−Ａｂ
−Ｍ５’　Ｉ　ＰＧ　止　−４Ｐ　Ｓ　Ｏ−Ａ　ｂ−Ｍ
４　Ｉ　ｙＭ　＋　−５ＰＳＯ−Ａｂ−Ｍ５　Ｘβ　（
＝ ６　ＰＳＯ−Ａｂ−Ｍ６　１ｇＧ　＋−７ＰＳＣ−Ａｂ
−Ｍ７　Ｉ声　止〜十　−※１：第２表の血清型Ａ−Ｍ
型の緑膿菌ＩＩＤ株と０９反応性をＤＩＢＡ法により測
定した。本発明のモノクローナル抗体１）Ｓｏ−Ａｂ−
Ｍ７のみ反応性カー弱ρ）つた。

※２：第２表の緑膿菌（シュードモナス・アエルギノー
サ）以外のａ菌との反応性をＤＩＢＡ法により測定した
。本発明のモノクローナル抗体に′ｉ℃・ずれも陰性で
あった。

さらに、第６表の本発明のモノクローナル抗体のうち、
ＰＳＯ−Ａｂ−Ｈ２（ＩｙＧ　）、ＰＳＯ−Ａｂ−Ｈ４
（ＩｇＭ）およびＰＳＯ−Ａｂ−Ｈ６（ＩｙＧ　’）を
それぞれ産生ずるハイブリドーマクローン屋２．４およ
び６株（てつき１０チ牛脂児血清加ダルベツコＭＥＭ培
地で培養して増殖した細胞をプリスタン（アルドリッチ
）ｏ、５ｍｌ／マウスを投与して前処置したＢＡＬＢ／
Ｃマウスの腹腔内にＩ　Ｘ　１０７個ずつ接種して２−
３週間後に得られた腹水から本発明のモノクローナル抗
体を精製した。

ハイブリドーマクローン屋２および７ｉ１６の腹水はそ
れぞれ下記の如くプロティンＡ固定化アフイニテイカラ
ムによる方法でそれぞれ精製した。すなわち、マウス腹
水をＩ　Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＯ４緩衝液（１）Ｈ８，５）
で中和後腹水と同量の０．２　Ｍ　ＩＪン酸緩衝液（ｐ
Ｈ８，０）を加え１ミクロンのガラスフィルターを通過
させたのちプロティンＡ−セファロース（ファルマシア
〕のアフイニテイカラムに付シ０、２　Ｍ　ＩＪン酸緩
衝液（ｐＨ８，０）で洗浄した。ついで５０　ｙｎＭＮ
ａｃＪ、を含む０．１Ｍクエン酸緩衝液（、ｐＨ３，５
）で溶出させた。

溶出液は上記のＴｒｉｓ−ＨＯ＃緩衝液で中和後冷却し
５０％飽和硫安で塩析して沈澱を集め、これを００５係
アジ化ナトリウムを含ムダルペノコＰＢＳ（−１（＋）
Ｈ７，４）　（白水製薬〕に溶解し、精↓抗体の′保存
液とした。

この精製抗体の保存液は、片時ダルーペツコＰＢＳに）
あるいは生理食塩夜に透析して硫安とアジ化ナトリウム
を除き実験に供した。また、ハイブリドーマクローン黒
４の腹水は下記の方法で精製した。

マウス腹水に等容のｐｎｓ（へ）を加えついで硫安を加
えて３０％飽和硫安濃度とし、これを遠心分離して得ら
れる上清にさらに硫安を加え５０％飽和硫安濃度とした
。

得られた沈澱をＰＢＳ　Ｈに溶解し、これにＴｒｉｓ−
Ｈ（ｌ緩衝液を加えてｐＨ８，０に７整した。ついで七
フアクリル８３００（ファルマシア）によるゲル濾過に
付しＰＢＳ（ハ）で溶出させＩｙＭ画分を回収した。

ＩｙＭ画分は５　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ｈａ（ｌ緩衝液（ｐ
Ｈ７，０）に対して透析を行ない生成した沈澱を集めさ
らに０．２　Ｍ　Ｔｒｉｓ−１−１０（ｌ緩衝液（ｐＨ
８，５）に溶解して０．０５％アジ化ナトリウムを含む
ＰＢＳ（ハ）に対して透析した。得られた溶液を精製抗
体の存存液とした。該保存液は片時ＰＢ８（ハ）に透析
してアジ化ナトリウムを除いて実験に供した。

以上の方法によって精製された６種類の本発明のモノク
ローナル抗体の収量および抗体価は第４表の通りであっ
た。

実施例６　ヒトーマウスハイブリドーマによるヒト由来
の本発明のモノクローナル抗体 の製造 ＤＩＢＡ法による緑膿菌ＩＩＤ　１１３０株（Ｅ型〕に
対する血清中抗体価が１．２８Ｘ１［７’倍の健常人よ
り得たヘパリン加末梢血よりファイコール・コンレイ比
重遠心法により単核細胞のバンド部分を採取しこれを抗
体産生能をもつヒ）　Ｂ　ＩＪタンパ細胞浮遊液として
細、泡輔合に用いた。

細胞融合を行なうに先立ってこのヒ）Ｂリンパ系細胞（
１’Ｘ１０７個／　ｍｌ・１０％牛脂児血清加１’ｔＰ
ＭＩ　１６４０培地〕に実施例１で得１こｐｓａ＝Ａ、
Ｃ２０μｇ／ｍｌ　）　１　ｍｌを加えて混合し４８時
間培養した（ナプコＣＯ２インキュベーター＝６７℃、
５係Ｃ０２／相対湿度１００％）。その後遠心分離によ
り培地で細胞を洗浄し細胞融合に供した。

細胞融合はＰＳＯ−Ａで五９ｂｉ）−α感作な行なった
上記ヒトＢリンパ系細胞とＨＡＴ陪地感受性のＮ５−１
マウスミ工ローマ細胞５Ｘ１０’個を混ぜ実施例２と同
様の条件で行なった。

得られたハイブリドーマは実施例２と同様に正常マウス
牌細胞をフィーダー細胞として共存させ９６ウエルのプ
ラスチック平底マイクロプレート（ファルコン〕中でＨ
ＡＴセレクションを行なった。

ハイブリドーマの増殖ｈ″−認められたウェルの培養上
清につき、ＤＩＢＡ法によりパーオキシダーゼ標識ヤギ
抗ヒトイムノグロブリン抗体（カッペル〕を用いてＰＳ
Ｏ−Ａおよび緑膿菌ＩＩＤ　１１３０床に対゛する抗体
産生の有無をスクリーニングしＡｍ。

抗体産生が認められたウェルのハイブリドーマを実施例
２と同様（（限界希釈法にてクローニングした。この操
作によりモノクローンであることが確認されたハイブリ
ドーマは培養スケールを徐々に上げ、最終的に２５０ｍ
１の１０ヂ牛脂児１血清刀ログルベツコＭＥＭ培地で培
養（スターリングシステム、日本インターメノド）した
ときの培養上清について産生抗体の性質を調べた。以上
の実験操作を前後６回にわたって行ない、最終的に増殖
性の良好な本発明のモノクローナル抗体産生りｏ−ンを
１採得た。

第５表に示すように該抗体産生クローンより得られる本
発明のモノクローナル抗体はＡ　”’−Ｍ型の緑１１ｂ
ａ菌菌体といずれも共通に反応したが、緑膿偵以外の細
菌１２株とはほとんど反応しなかった。

また、バーオキシダーぜ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体およ
び同Ｉ、）ｐＭ抗体（カッベル社）を用いたＩ）ｔＢＡ
法およびゲルｆ過法により本発明のモノクローナル抗体
のグロブリンクラスは１ｚＧと判定すれた。しかしなが
ら、該ハイブリドーマクローンの培養液中における産生
抗体濃度は実施例２のマウスハイプリドーマクローンに
比へ低かっブこ。

第５表 ※１：実施例２と同様に血清型Ａ−Ｍ型の緑膿菌ＩＩＤ
株との反応性をＤＩＢＡ法により測定した。但し第２抗
体にはパーオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトイムノグロブリ
ン抗体（カッベル社）を用いた。

※２：実施例２と同様に測定しブこ。但し第２抗体は上
記と同じものを用いた。

実施例／ｉ　ＥＢウィルス形質転換去５でよるヒト由来
の本発明のモノクローナル抗体の製造 ＤＢウィルスを産生放出しているＢ９５−８細胞＆ＲＰ
ＭＩ　１６４０培地に２０％牛脂児血清（以下ＦＯ８と
いう）を加えた培地で培養（ナプコＣＯ２インキュベー
ター＝３７℃、５係ＣＯ２／相対湿度１．００％）Ｌ、
培養と清を分離してＥＢウィルス源とした。このウィル
ス源の感染価は１０５ＴＤ５０／ｍｌであった。

一方、ＤＩＢＡ法による緑＃繭ＡＴＯＣ１０１４５株（
ｏｑ）ＶＣ対する血清中抗体価が６．４Ｘ１０３倍の健
常人より得たヘパリン加末梢血よりファイコール・コン
レイ比重遠心法により単核細胞のバンド部分を採取しこ
れを抗体産生能を持つヒ）　Ｂ　ＩＪンバ系Ｍ胞として
２０　％　ＦＯ８加ＲＰＭＩ　１６，１１０培地に浮遊
（ＩＸ１０７細胞／ｍｌ）させて用いた。該ヒ）　ＢＩ
Ｊンバ系細胞浮遊液１　ｍｌに実施例１で得たＰ　Ｓ　
Ｏ−Ａを同じ培地に溶解したもの１７ｕ／（２０μＩ／
ｍｌ）を加え３７℃４８時間培養（ナプコＣＯ２インキ
コベーター内）して抗原によるＬｒＬｙＬｉａ、ｅｒ　
感作を行なった。

ついで上記のＥＢウィルス液０．５　ｍｌを加えて接触
感染させ、フィーダー細胞としてマイトマイシンＣで不
活化した健常人末梢面由来白血球を加えプラスチックマ
ルチプレート（ファルコン）に０、０２　ｍｌずつ分注
し６７℃２週間培養した。その後細胞増殖ノＩ）みら才
ｔたものを継代培養に移し３伏縫代したところで培養上
清のＰＳＯ−Ａおよび緑膿ｍＡＴＣ０１０１４５株に対
する抗体産生の有無を実施例６と同撮にＤｉＢＡ法によ
りスクリーニングした。

該抗体産生が認められた培養物Ｃてついてはさらに継代
１−てａ胞増殖させ得られた細胞をＲＰＭ１１６４０培
地（ｐａｓ不含〕に浮遊（１０６個、／　ｍｌ！　）さ
せた。該細胞浮遊液５〜１０ｍ１にあらかじめクロミウ
ムクロライド法により調型したＰＳＯ−Ａ感作ヒツジ赤
血球浮遊液（１０６個／ｒｎｌ　）　１　ｍｌを加そ１
晩４℃に静置してロゼツトを形成させ、さらにこれをフ
ァイコール・コンレイの密度勾配遠心法にまりロゼツト
形成細胞を集めた。

ロゼツト形成細胞は低濃度の塩化アンモニウム溶液中に
短時間（１〜２分間）浮遊させた後、約１０倍量のＲＰ
ＭＩ　１６４０培地を加えて遠心分離を行ないさらに同
培地で遠心洗浄してヒツジ赤血球をほとんど含まない細
胞を集めた。得られた細胞は２０％ＦＯ８加ＲＰＭＩ　
１６４０培地で継代培養を５回繰返し、その培養上清に
ついて再度１）ＴＢＡ法によりＰＳＯ−Ａに対する抗体
濃度を測定した。培養上清に高い抗体濃度が認められた
細胞集団については単細胞分散させ軟寒天培地に加えて
プラスチックシャーレに注入し５７℃２〜３週間培養し
た。かくして培地上に形成されたコロニーを２゜％ＦＣ
！Ｓ７Ｊ［］ＲＰＭＩ　１６４０培地に浮遊させて継代
培養を行ない、抗ＰＳＯ−Ａモノクローナル抗体すなわ
ち本発明のモノクローナル抗体の産生クローンを得た。

以上の実験繰作な通算３回行ない、比較的増殖性のよい
本発明のモノクローナル抗体産生クロー７２株を得た。

本発明のモノクローナル抗体産生クローンハ２０％ＦＯ
８加ＲＩ’Ｍ１１６４０培地で培養後１ｏ％ＦＯ８加Ｒ
ＰＭＩ　Ｌ６４０培地（（馴化させて最終的に５００ｍ
１の同培地で培養（スターリングシステム、日本インタ
ーメノド）し、その培養上清について本発明のモノクロ
ーナル抗体の性質を調べた。結果は第６表に示す通りで
、グロブリンクラスはＩ　ｙ、ＧとＩｇＭであった。ま
た、その他の性質は実施例６および４に記載のものと類
似していた。

第　６　表 Ａ　ｐｓｃ−Ａｂ−＋ｕ　ｒｆＧ＋　−Ｂ　ＰＳＯ−Ａ
ｂ−Ｈ２Ｉ、ｐＭ　＋　’　−※１．※２：実施例乙に
記載の方法と同じ。

さらに、本発明のモノクローナル抗体ＰＳＣ−１−１１
を産生する抗体産生クローンＡＡ株については無面清培
地（ＨＢｌ　０１　ＴＭ培地、富士レビオ）への馴化を
行ない、馴化した該クロー・ンな最終的に約５４スケー
ルでのスターリングシステム（日本インターメツド〕を
用いて６７℃ｃｏ２インキュベーター内で培養し、その
培養上清から本発明のモノクローナル抗体をＮＭした。

精製法は実施例１および２に記載のプロティンＡ−セフ
ァロースのアフイニテイカラムを用いた方法に準拠して
行なった。

得られた鞘型杭体の収量および抗体価は第７表に示す通
りであった。

第７表 ※１．※２：実施例２の第４表の方法に同じ。

実施例５　本発明のモノクローナル抗体を用いた緑膿菌
感染症の診断用試薬（その１） （１）螢光抗体直接法試薬 実施例２で得た本発明のモノクローナル抗体ＰＳＯ−Ａ
ｂ−Ｍ２精製保存液を０９％食塩水に対して十分透析後
蛋白濃度を１０ｑ／ｍｌに調整した。この１　ｍｌの抗
体溶液にｏｌｒｕｌの０．１　Ｍ炭酸緩衝液（ｐ■−＋
　’９．　ｏ　）を加え４℃に冷却後１ダ／ｍ１９度と
なるようにＩＪＩ嘴液に溶解したフルオレツセンインチ
オシアネートアイソマ−１（シグマ〕溶７１ｇ、　ｏ、
　１　ｍｌを攪ｊ２１′滴下した。

室温で１時間ゆっくり攪拌した後直径１ｃｍ長さ１２ｃ
ｍのセファデックスＧ−５０（ファルマシア）カラムに
添加し００５係アジ化ナトリウムを含むダルベツコＰＢ
Ｓ　（→（田水製薬）溶液にて溶出した。

螢光ラベルされた抗体を含む両分を集め４℃に保存した
。以上の操作で得られた螢光抗体のフルオレノセンイン
チオシアネート（以下ＦＩＴＯ）／抗体のモル比は２．
５７であった。

上記の螢光抗体を組み込んだ下記の２種類の溶液からな
る緑膿菌診断用の試薬キットを作製した。

溶液１　螢光抗体液：　ＦＩＴＯ標識Ｐ　Ｓｏ−Ａ＝Ａ
ｂ−Ｍ２（上記の方法で得た螢光抗体ｆｉ　）　１　ｍ
ｌ溶液２　洗浄液：生理食塩＠ｓｏｏｍｌ（２）螢光抗
体量接法試薬 実施例ろで得たハイプリドーマクロー／　Ａ　Ｉを無血
清培地（ＨＢ１０１ＴＭ培地、富士レビオ〕で培養し細
胞増殖が静止期にな・つた時に得られた培養上清のＰ　
Ｓ　Ｏ−Ａ、　ｂ−Ｈ１を用い下記の３種類の溶液から
なる緑、ｌ！Ｍ菌診断用の試薬キットを作製したｇ溶液
１．　第１抗体液：上記で得られた培養上清（Ｐ　Ｓ　
Ｏ−Ａ、ｂ　−Ｈ１）の原液１　ｍｌ溶液２　第２抗体
Ｍ　：　ＦＩＴＯ標識ヤギ抗ヒトイムノグロブリン抗体
（カッペル社）の ＰＢＳ←）ニヨる１００倍希釈液１　ｍｌ溶液ろ　洗浄
液：生理食塩液ｓｏｏｍｌ実施例６　本発明のモノクロ
ーナル抗体を用いた緑膿菌感染症の診断用試薬（その２
） （１）酵素抗体直接法試薬 実施例２で得た本発明のモノクローナル抗体ＰＳＯ−Ａ
ｂ−Ｍ６の精製保存液を０．０５　Ｍリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７，０）に対して十分に透１斤後蛋白で震度を１０ダ
／ｍｌに調整した。

この抗体溶′ｇ！Ｌ１　ｍｌにホースラデノシーパーオ
キシダーゼ（シグマＴｙｐｅｖＩ）の同緩衝液イ容解液
（Ｉ　Ｄ　Ｍ９７ｍｌ　）　１　ｍｌを加え混合しつい
でスターラーで攪Ｆ１′シながら１％ゲルタールアルデ
ヒド（和光純楽）溶液を０．１　ｍｌ徐々に滴下しさら
に室温で２時間攪拌を続げた。

その後、この溶液を生理食塩液に対して４℃で１夜透析
し、透析内液を４℃で２００’ＯＤｒｐｍ３０分間遠心
分離し上清を採取した。かくして得られたパーオキシダ
ーゼ標識抗体を４℃に保存した。

上記の操作で得たパーオキシダーゼ標識抗体を組み込ん
だ下記の６種類の溶液と反応用フィルターからなる緑膿
菌診断用の試薬キットを作製した。

溶液１　酵素標識抗体ｏ、：バーオキシダーゼ標識ＰＳ
Ｏ−Ａｂ−Ｍ６　（上記の方法で得た酵素標識抗体液）
２ｒｎｌ 溶液２　洗浄液：　２００ｍＭＮａ０ｊｌ＋含有ｓｏｍ
ＭＴ　ｒ　ｉ　ｓ−Ｈ０１１緩衝液（ｐＨ７，４）００
ｍ１ 溶液３　反応防御液＝Ａ液　馬血清ｔ５ｒｎｌＢ液　０
０２５チアジ化ナト リウムを含む上記洗 浄液１ｏｍｌ （Ａ液１　ｒｎｌとＢ液９ｍｌを片時混合する〕 溶液４　酵素反応基買液：Ｉ液３りの４−クロル−１−
ナフトールの１ ｍｌメタノール溶解液 ■液１係過酸化水素１Ｎ （Ｉ液１ＴｒＬｌと■液６０　ｐｇおよび上記洗浄敵５
ｍｌを片時混合する９ 反応用フィルタｍ：ミリポアー４７ｍｍ径格子人フィル
ター（４ｕｗｏ　０４７）２枚 （２）酵素抗体量接法試薬 実施例２で得た本発明のモノクローナル抗体Ｐ　Ｓ　Ｏ
−Ａ　ｂ−Ｍ　４の精製保存液をＰＢｓ（→に対して十
分透析して抗体液とし下記の種類の溶液と反応用フィル
ターからなる診断用の試薬キットを作製した。

溶液１　第１抗体＃　：　ＰＳＯ−Ａｂ−Ｍ４　（７）
　ＰＢＳ（−）溶液ｍｌ 溶液２　第２抗体液：パーオキシダーゼ標識ウサギ抗マ
ウスイムノグロブリン抗体（ＤＡＫＯ）のＰＢＳ（ハ）
による１００倍希釈液１　ｒｒｔｌ溶液６　洗浄液：上
記（１）の直接法試薬に同じ。

溶液４　反応防御１夜＝Ａ液、Ｂ液いずれも（１）の直
接法試薬と同じ。

溶液５　酵素反応基質液：Ｉ液、■液いずれも（１）の
直接法試薬と同じ。

反応用フィルター二ミリポア４７ｍｍ径格子入りフィル
ター（ＨＡＷＧ　０４７　）２枚 実施例７　本発明のモノクローナル抗体を用いた緑膿菌
感染症の予防治療剤 （１）ｆＬ、削 実施例１で得た本発明のモノクローナル抗体Ｃ−ｈｂ、
実施例２で得た同ｐｓａ−Ａｂ−Ｍ２、ＰＳＯ−Ａｂ−
Ｍ４、ＰＳＯ−Ａｂ−Ｍ６および実施例４で得７ＣＰ　
Ｓ　０−Ａｂ−Ｈｌのそれぞれ精製保存液をそのままあ
るいは濃縮してダルベツコＰＢＳ（へ）（日水製剰〕に
対して透析後さらに該抗体の蛋白ａ度を１ｑ／ｍｌにな
るようにＰＢＳ（ハ）を加えて調整した。

該抗体溶液をニークリポアーＮ０２０（ヌクリボアー社
〕を用いてそれぞれ個別に無菌）濾過した。

得られたｒ液を１　ａｔｅずつバイアル瓶に無菌的に分
注して本発明のモノクローナル抗体の液剤を得た。

（２）凍結乾燥製剤 実施例２で得た本発明のモノクローナル抗体ｐｓａ−Ａ
ｂ−Ｍ６の精製保存液を注射用蒸留水に対して透析後景
白濃度を１Ｍｆ／ｍｌに調製した。これにマンニトール
を５　ｏ　ｑ／ｍｌ濃度に溶解しニュクＩＪ　、ｌ−”
ア−ＮＯ２Ｏを用いて無菌沢過した。

得られたＦ液を１　ｍｌずつ無菌的にバイアル瓶に分注
した後凍結乾燥して凍結乾燥製剤を得た。

（３）抗生物質との混合製剤 実施例２で得た本発明のモノクローナル抗体ＰＳＯ−Ａ
ｂ−Ｍ６の上記（２）の注射用蒸留水溶解１夜（蛋白濃
度４００μ＆／ｍｌ）とゲンタマイシンの注射用蒸留水
溶解液（濃度１２　Ｗ／ｍｌ）との等容混合液にマンニ
トールを５０ｓｙ／ｍｌ濃度に溶解しニュークリポアー
ＮＯ２Ｏを用いて無繭ｉ濾過した。

得られたＰｅ、を２ｍｌずつ無菌的にバイアル瓶に分注
した後凍結乾燥して混合製剤を得た。

試験例１　本発明のモノクローナル抗体による緑膿菌の
診断同定（その１） トリプトソーヤ寒天平板培地（日永製薬）に接−挿し６
７℃１６時間培養して増殖した第１表のＡ〜Ｍ型のシュ
ードモナス・アエルギノーサＩＩＤ全株とＡＴＯＣｌ　
０１４５株（Ｇ型）、ニスセリσ・コリに１２株、バチ
ラス・ズブチリスＡＴＯＯ６（Ｓ３３株、シュードモナ
ス・プチダＩＦ０１２９９６株、クレブシェラ・ニュー
モニアエＡＴＯＯ１００３１株およびセラシア・マーセ
ラセンスｌＩＤ６２０株の各集落を生理食塩液に懸濁さ
せ波長５４０　ｒｂｍの吸光度が０２前後になる様に菌
液を調、製した。

５０μｌの各菌液と実施例５の（１）螢光抗体直接法試
薬で作製した試薬キットの溶液１の螢光抗体９５０μｅ
を小試験管内で混合し室温で１時間反応後各繭液を２ｍ
ｌの生理食塩液で合計６回瞳心洗浄［、た。少音の蒸留
水に懸濁した菌体なスライドグラスに塗布し）虱乾・封
入後無螢光イマージョンオイル（オリンパス光学）を１
滴たらしＵＶ励起系フィルターを装着した落射螢光頑做
鏡（オリンパス光学、ＢＨ２−ＲＦＬ型）を用い螢光を
観察した。

その結果該螢光抗体液を反応させたシー−トモナス・ア
エルギノーサの全供試菌株にはいずれも菌体表層に強い
緑色の螢光が観察されたが、螢光抗体液を反応させなか
った菌体には螢光発色がみられなかった。また、緑膿菌
以外のエスセリヒア・コリに１２、バチラス・ズブチリ
スＡＴＯＯ６６５６、シュードモナス・プチダＩＦＯ１
２９９６、クレブシェラ・ニューモニアエＡＴＯＯ１０
０３１の各法では螢光抗体液と反応させたにもかかわら
ず菌体表層に螢光発色がみられなかった。

なお、実施例５の（２）螢光抗体量接法試薬の試薬キッ
トで行なった場合も上記と全く同じ結果であった。

試験例２　本発明のモノクローナル抗体による緑膿菌の
診断同定（その２） ａ朶菌液は上記試験例１で用いた菌株のものをすべて蒸
留水で２倍希釈して使用した。

実施例６ＶＣ示した（１）ｍ素抗体直接法試薬の試薬キ
ットな同定に用いた。まず反応用フィルターを格子サイ
ズ（３１闘角）ＶｒＣ眼科眼科用便ミで切りとり、各格
子に各細菌菌液をマイクロシリンジで０５μβずつドツ
トし７０℃、６０分間加熱して固定した。

細閑を固定した各格子は９６ウエルのＵ底マイクロプレ
ート（フアシヨン〕の各ウェルに入れ、ついで溶液乙の
反応防御液（Ａ、Ｂ混合液）を１５０μＥずつ分注しマ
イクロプレートを室温で１５分間幅とつに各ウェル内の
液を吸引除去した。

つぎに溶液１の酵素標識抗体液ｉｏｏμ４／ウェルを加
え室温３０分間幅とうし吸引、除去した。その後者ウェ
ルに１００μ４の溶′ｌＩ！ｉ、２の洗浄液を分注し室
温で２−３分間振とう後内容液を吸引除去した。この洗
浄液による操作をさらに２回、繰返した後者ウェルに酵
素反応基質液（１液と■液混合）１００μｌを分注し室
温で１５分間儒とうし、内容液を吸引除去した。各ウェ
ル内の格子を菌液をドツトした側に向は格子上の発色度
合を判定した。

その結果、シュードモナス・アエルギノーサの全供試菌
床をドツトした格子上に（・まいずれも肉眼的に強い発
色が認められた７）″−１緑膿閑以外の細閑Ｉｎをドツ
トした格子上には、はとんど発色がなかった。

なお、実施例乙の（２）酵素抗体間接試薬の試薬キット
でテストした場合も上記と全く同じ結果であった。

試験例６　本発明のモノクローナル抗体の緑膿菌感染予
防治療効果（その１） 実施例７に示したマウス由来の本発明のモノクローナル
抗体０−Ａｂ、　ＰＳＯ−Ａｂ　−Ｍ　２、ＰＳＯ−Ａ
ｂ　−Ｍ４およびＰＳＯ−Ａｂ−Ｍ６のそれぞれ液剤を
用いてマウスにおげろ緑膿菌感染の予防および治療効果
を検討し１こ。予防効果に関−する実験（・ま、生後１
０週令のＢ　Ａ　ｒ、Ｂ／ａ雌性マウス１群５匹を用い
、上記の各本発明のモノクローナル抗体（膜力量：蛋白
換ＩＦテ０．１μｇ〜１０００μｇ／マウス）を膜力量
が１ｍｌ／マウスになるよう生理食塩液で適官希釈し７
て緑膿菌感染の２時間前に１回のみ腹腔内投与した。

治療効果に関する実験は上記予防効果の実験と同様の投
与量で緑１１１１菌感染２時間後に１回のみ腹腔内に投
与した。対照群は生理食塩液のみ投与した。感染実験に
用いた緑膿菌菌株は第１表に示したＰＡ１０３（Ｅ型）
とＰ２８（Ｑ型）の２株で、ハートインツー−ジョン寒
天培地（栄研化学）にて−夜培養後集菌し生理食塩液で
希釈した後５％ムチンを加えそれぞれマウス−匹あたり
ｌＸ１０６０ＦＵを腹腔内へ接種した。

感染後７日間観察を行ない、その生存率から本発明のモ
ノクローナル抗体の５０％有効投与量（ＥＤ　５０）の
水準をめた。結果は第８表の通りであった。

第８表 ※：なお、対照群はいずれの場合も感染後２４時間以内
に死亡した。

試験例４　本発明のモノクローナル抗体の緑膿菌感染予
防治療効果（その２） 実施例７に示したヒト由来の本発明のモノクローナル流
体Ｐ　Ｓ　Ｏ−Ａ　ｂ　−Ｈ１の液剤を用いてマウスに
おける緑膿菌感染の予防・治療効果を検討した。

生後１２週令のＢＡＬＢ１０雌性マウス１群５匹への抗
体の投与量、投与時期、感染緑膿菌の種類および感染菌
の接種量は試験例乙に示す通りに行なった。

感染後７日間観察によりマウスの生存率からＢＤｗ直の
水檗求めた。結果は第９表の通りでもつな 第９表 ×：対照群のマウスはすべて感染後２４時間以内に死亡
し１こ。

試験例５　本発明のモノクローナル抗体と抗生物質混合
剤の緑膿菌治療効果 実施例８に示したマウス由来の本発明のモノクローナル
抗体ＰＳＯ−Ａｂ−Ｍ６とゲンタマイシン（以下ＧＭ）
の混合製剤を用いてマウスにおける感染治療効果を検討
した。

マウスは生後１０週令のＢＡｒ、Ｂ／ａ雌！マウス１群
１０匹を用いた。実施例８の混合製剤に１製剤当り２ｍ
ｌの注射用蒸留水を加えた溶解液（１罰当りＰＳＯ−Ａ
ｂ−Ｍ６を２０［］μｇとＧＭを６〜含有）および生理
食塩液による該溶解柳）０倍希釈液（１ｍｌ当りＰ　Ｓ
　Ｃ１−Ａ１１−Ｍ　６を２　Ｃ１ｐ９とＧＭ　６００
μｇ含有〕と１００倍希釈液（１ｒｎｌｊ３すＰＳＯ−
Ａｂ−Ｍ６を２μＩとＧＭ６０μｇ含有〕をそれぞれマ
ウス１匹当り０５罰ずつ緑ｊ儂菌感染の２時間後に１回
のみ腹腔内投与した。また比較群としてＰＳＯ−Ａｂ−
Ｍ６のみの１０μｇ、３０μｇおよびｉｏｏμｇ投与群
とＧＭのみ３００μｇと１２岬投与群も設けた。なお、
対照群は生理食塩液のみ投与しブこ。

感染緑膿菌はＰＡ１０３株（Ｅ型〕を用い試験勿１６と
同様に調、製してマウス１匹当りＩ　Ｘ　１００ＦＵを
腹腔内接様して感染させた。

感染後７日間観堅し、マウス生存数を算定して各膜力群
の有効水準をめた。結果はＪ１ｏ表の通りであった。

第１ｎ表

【図面の簡単な説明】

図面は本発明に用いられる緑膿菌共通抗原ＰＳＣ−Ａの
紫外部吸収スペクトラムを示す。 特許出願人　三井東圧化学株式会社

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、下記の理化学的性質を有する緑膿菌共通抗原である ＰＳＣ−Ａに対し特異的な親和性を示すモノクローナル
   抗体。 該ＰＳＣ−Ａの理化学的性質 （１）分子量 １５．０００ （２）構成成分 蛋白質含量（至）：２４〜５５ 糖含量％：３．０〜５．０ ヘキソサミン含量（至）：１．０以下 脂質含量（へ）＝７．０〜１０．０ （３）性状、溶解性 淡黄色粉末であり、水、生理食塩液およびリン酸緩衝液
   に可溶、水に対する溶解度はんど溶けない。 （４）呈色反応 ローリ−・フォリン反応、ニンヒドリン反応、フェノー
   ル硫酸反応、およびアンスロン硫酸反応は陽性。エルン
   ンモルガン反応は陰性。 （５）等電点 ＰＩ−’３．８〜４，２（等電点電気泳動法）（６）安
   定性 中性の水溶液中で、室温において２４時間以上安定であ
   る。 （７）紫外部吸収スペクトラム ２７２ｎｍ附近に極大吸収を示す。 （８）酵素活性 カゼインおよびコラーゲンに対する分解活性を示さない
   。 （９）特性 １）マウス結合繊由来培養細胞株のＬ細胞に対して本物
   質１０μ９／、ｌで、また正常マウス牌由来培養白血球
   細胞に対して本物質２μｙ／−でそれぞれ２４時間培養
   するとき直接細胞障害作用を示さない。 ｌｉ　）生理食塩液に溶解した本物質またはフロイント
   の不完全アジュバントあるいは完全アジ−パントに懸濁
   した本物質は、いずれもマウスに免疫するとマウス血清
   中に緑膿菌と反応する液性抗体が出現する。 １１］）本物質に対して特異的な親和性を有する、マウ
   スモノクローナル抗体（本文に詳述するモノクローナル
   抗体Ｃ−Ａｔ）は公知の緑膿菌共通抗体ＯＥＰおよび緑
   膿菌内毒素（リポ多糖体）と反応しない。 ２．１９Ｍグロブリン又は１ｇＧグロブリンからなる群
   から選ばれたグロブリンから主としてなる特許請求の範
   囲第１項記載のモノクローナル抗体。 ３．１９Ｍグロブリンから主としてなる特許請求の範囲
   第２項記載のモノクローナル抗体。 ４、ＩＦＧグロブリンから主としてなる特許請求の範囲
   第２項記載のモノクローナル抗体。 ５、特許請求の範囲第１項記載のモノクローナル抗体を
   少なくとも１種含む緑膿菌感染症診断用の試薬。 ６、特許請求の範囲第１項記載のモノクローナル抗体を
   少なくとも１種含む緑膿菌感染症に対する予防治療剤。 ７、特許請求の範囲第１項記載のモノクローナル抗体の
   少なくとも１種と抗緑膿菌活性を有する薬剤との複合体
   からなる緑膿菌感染症に対する予防治療剤。 ８モノクローナル抗体が１９Ｍグロブリン又はＩｆＧグ
   ロブリンからなる群から選ばれたグの予防治療剤。 ９モノクローナル抗体がＩｇＭグロブリンから主として
   なる特許請求の範囲第５項記載の試１０、モノクローナ
   ル抗体がＩｇＧグロブリンから主としてなる特許請求の
   範囲第５項記載の試↓ｒ＝田 薬又は第６項耕妾替第７項記載の予防治療剤。 １１緑膿菌共通抗原ＰＳＣ−Ａに対する抗体産生能を持
   つ細胞とミエローマ細胞との間に細胞融合によりハイブ
   リドーマを形成させ、該ハイブリドーマをクローン化し
   最終的に該ＰＳＣ−Ａに対して特異性を示す抗体を産生
   する・・イブリド−マクローンを選択しそれが産生ずる
   モノクローナル抗体を取得することからａｈ特許請求の
   範囲第１項記載のモノクローナル抗体の製造法。 １２緑膿菌共通抗原ＰＳＣ−Ａに対する抗体産生能を持
   つ細胞を該ＰＳＣ−Ａで免疫して動物の肺細胞リンパ節
   および未稍血白血球からなる群から選択して用いること
   からなる特許請求の範囲第１１項記載のモノクローナル
   抗体の製ｊ告法。 １３、緑膿菌共通抗原ＰＳＣ−Ａに対する抗体産生能を
   持つ細胞がヒトＢリンパ系細胞である特許請求の範囲第
   １１項記載のモノクローナル抗体の製造法。 １４、緑膿菌共通抗原Ｐ　Ｓ　Ｃ−Ａに対する抗体産生
   能を持つ細胞およびミエローマ細胞が共にマウス由来で
   ある。特許請求の範囲第１１項記載のモノクローナル抗
   体製造法。 １５、緑膿菌共通抗原ＰＳＣ−Ａに対する抗体産生能を
   持つヒトＢリンパ系細胞にＥＢウィルスを感染させて継
   代培養可能な増殖型に変異させ、該ＰＳＣ−Ａに対して
   特異性を示す抗体を持続産生ずるクローンを選択し、そ
   れが産生ずるモノクローナル抗体を取得することからな
   る特許請求の範囲第１項記載のモノクローナル抗体の製
   造法。