JPH0619352B2 - ヒト・プロテインｃの測定方法 - Google Patents
ヒト・プロテインｃの測定方法Info
- Publication number
- JPH0619352B2 JPH0619352B2 JP60124388A JP12438885A JPH0619352B2 JP H0619352 B2 JPH0619352 B2 JP H0619352B2 JP 60124388 A JP60124388 A JP 60124388A JP 12438885 A JP12438885 A JP 12438885A JP H0619352 B2 JPH0619352 B2 JP H0619352B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- protein
- human
- cells
- antibody
- gla
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/36—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against blood coagulation factors
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
- G01N2333/914—Hydrolases (3)
- G01N2333/948—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- G01N2333/95—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99)
- G01N2333/964—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue
- G01N2333/96425—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals
- G01N2333/96427—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals in general
- G01N2333/9643—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals in general with EC number
- G01N2333/96433—Serine endopeptidases (3.4.21)
- G01N2333/96441—Serine endopeptidases (3.4.21) with definite EC number
- G01N2333/96461—Protein C (3.4.21.69)
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Hematology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 a. 産業上の利用分野 本発明は、カルシウムイオン（Ｃａ++）非存在下では、
ヒト・プロテインＣを認識せず、カルシウムイオン（Ｃ
ａ++）存在下では、Ｇｌａドメインに依存した立体的構
造変化を受けたヒト・プロテインＣのみを特異的に認識
するヒト・プロテインＣに対するモノクローナル抗体、
およびこの抗体を用いて、カルシウムイオンとの結合に
より、Ｇｌａドメインに依存した立体的構造変化を受け
得るヒト・プロテインＣを免疫学的に区別して測定する
方法に関する。
ヒト・プロテインＣを認識せず、カルシウムイオン（Ｃ
ａ++）存在下では、Ｇｌａドメインに依存した立体的構
造変化を受けたヒト・プロテインＣのみを特異的に認識
するヒト・プロテインＣに対するモノクローナル抗体、
およびこの抗体を用いて、カルシウムイオンとの結合に
より、Ｇｌａドメインに依存した立体的構造変化を受け
得るヒト・プロテインＣを免疫学的に区別して測定する
方法に関する。
b. 従来技術 凝固・線溶系の制御因子として、近年、着目されている
プロテインＣはビタミンＫ依存性血漿蛋白、すなわちγ
−カルボキシグルタミン酸（Ｇｌａ）含有蛋白の一つで
あり、強力な抗凝固作用，線溶促進作用を示す。〔Kisi
el,et.al.Biochemistry,16:5824〜5831(1977),Comp,P.
C.& Esmon,C.T.:J.Clin.Invest.,68;1221-1228(1981)参
照〕 ヒト・プロテインＣは、肝において１本鎖分子として合
成され、そのアミノ末端近傍のＧｌｕが、ビタミンＫの
存在下γ−カルボキシル化反応を受け、Ｇｌａ（γ−カ
ルボキシルグルタミン酸）に変換された後に血中に分泌
される。血中では大部分が、分子量21000のＬ鎖と分子
量41000のＨ鎖から成る２本鎖として存在し、Ｌ鎖アミ
ノ末端に９個のＧｌａ残基を含むＧｌａドメインを有す
る。
プロテインＣはビタミンＫ依存性血漿蛋白、すなわちγ
−カルボキシグルタミン酸（Ｇｌａ）含有蛋白の一つで
あり、強力な抗凝固作用，線溶促進作用を示す。〔Kisi
el,et.al.Biochemistry,16:5824〜5831(1977),Comp,P.
C.& Esmon,C.T.:J.Clin.Invest.,68;1221-1228(1981)参
照〕 ヒト・プロテインＣは、肝において１本鎖分子として合
成され、そのアミノ末端近傍のＧｌｕが、ビタミンＫの
存在下γ−カルボキシル化反応を受け、Ｇｌａ（γ−カ
ルボキシルグルタミン酸）に変換された後に血中に分泌
される。血中では大部分が、分子量21000のＬ鎖と分子
量41000のＨ鎖から成る２本鎖として存在し、Ｌ鎖アミ
ノ末端に９個のＧｌａ残基を含むＧｌａドメインを有す
る。
Ｇｌａドメインにはカルシウム結合部位が存在し、カル
シウムイオン（Ｃａ++）と結合することにより、プロテ
インＣは立体的構造変化を受け、この変化が、生体内に
おける活性発現において重要であることが知られている
〔Esmon,N.L.et.al:J.Biol.Chem.258:5548-5553((1983)
参照〕。
シウムイオン（Ｃａ++）と結合することにより、プロテ
インＣは立体的構造変化を受け、この変化が、生体内に
おける活性発現において重要であることが知られている
〔Esmon,N.L.et.al:J.Biol.Chem.258:5548-5553((1983)
参照〕。
ビタミンＫの欠乏時、またはビタミンＫの拮抗体（ワー
フアリン，ジクマロールなど）投与時には、γ−カルボ
キシル化反応が進行しないので、Ｇｌａドメインを構成
する筈のＧｌａがＧｌｕのままであるＧｌａ欠損プロテ
インＣ（PIVKA-PC:Protein induced by vitamin K abse
nce or antagonists）が血中に分泌される。このＧｌａ
欠損プロテインＣはカルシウムイオン存在下、Ｇｌａに
依存した立体的構造変化を生じないので、生理的には極
めて活性を発現しにくい。このため異常蛋白質として扱
われるが、従来、このプロテインＣを免疫学的に区別し
て測定することはできなかつた。
フアリン，ジクマロールなど）投与時には、γ−カルボ
キシル化反応が進行しないので、Ｇｌａドメインを構成
する筈のＧｌａがＧｌｕのままであるＧｌａ欠損プロテ
インＣ（PIVKA-PC:Protein induced by vitamin K abse
nce or antagonists）が血中に分泌される。このＧｌａ
欠損プロテインＣはカルシウムイオン存在下、Ｇｌａに
依存した立体的構造変化を生じないので、生理的には極
めて活性を発現しにくい。このため異常蛋白質として扱
われるが、従来、このプロテインＣを免疫学的に区別し
て測定することはできなかつた。
ヒト・プロテインＣは生体内半減期が短いので、ビタミ
ンＫ欠乏、ビタミンＫ拮抗体投与の影響が、早期に現わ
れやすく、また、凝固の進展に働く他のＧｌａ含有凝固
因子（プロトロンビン，FVII，FIX，FX）とは異なり凝
固を阻止する作用があるため、Ｇｌａ欠損プロテインＣ
と正常プロテインＣを区別して測定することは、ビタミ
ンＫの欠乏状態、あるいは抗凝固剤としてのビタミンＫ
拮抗体（ワーフアリン，ジクマロールなど）投与におけ
る効果の判定に、きわめて有用なパラメーターとなり得
る。
ンＫ欠乏、ビタミンＫ拮抗体投与の影響が、早期に現わ
れやすく、また、凝固の進展に働く他のＧｌａ含有凝固
因子（プロトロンビン，FVII，FIX，FX）とは異なり凝
固を阻止する作用があるため、Ｇｌａ欠損プロテインＣ
と正常プロテインＣを区別して測定することは、ビタミ
ンＫの欠乏状態、あるいは抗凝固剤としてのビタミンＫ
拮抗体（ワーフアリン，ジクマロールなど）投与におけ
る効果の判定に、きわめて有用なパラメーターとなり得
る。
本発明者らは、ヒト・プロテインＣに対するモノクロー
ナル抗体を作成し、この中から、Ｇｌａ欠損プロテイン
Ｃを認識しないモノクローナル抗体を見い出し、さらに
この抗体を用いて、Ｇｌａを有するプロテインＣを選択
的に免疫学的測定に従つて測定し得ることを見い出し
て、本発明に到達した。
ナル抗体を作成し、この中から、Ｇｌａ欠損プロテイン
Ｃを認識しないモノクローナル抗体を見い出し、さらに
この抗体を用いて、Ｇｌａを有するプロテインＣを選択
的に免疫学的測定に従つて測定し得ることを見い出し
て、本発明に到達した。
c. 発明の構造 すなわち、本発明はカルシウムイオン（Ｃａ++）の非存
在下ではヒト・プロテインＣを認識せず、かつ、カルシ
ウムイオン（Ｃａ++）の存在下において、Ｇｌａドメイ
ンに依存した立体的構造変化の生じたヒト・プロテイン
Ｃを、特異に認識するヒト・プロテインＣに対するモノ
クローナル抗体を用いて、カルシウムイオン（Ｃａ++）
存在下、Ｇｌａドメインに依存した立体的構造変化を生
じ得るヒト・プロテインＣを免疫学的手法（EIA法，RIA
法など）により、選択的に区別して測定する方法であ
る。更に、Ｇｌａに依存した立体的構造変化に関係のな
い部位を認識するモノクローナル抗体，ポリクローナル
抗体，あるいは抗血清を用いて免疫学的手法（EIA法，R
IA法，Laurell法など）により全体のプロテインＣを測
定すれば、両方の測定結果からＧｌａ欠損プロテインＣ
の量を求めることが可能となる。
在下ではヒト・プロテインＣを認識せず、かつ、カルシ
ウムイオン（Ｃａ++）の存在下において、Ｇｌａドメイ
ンに依存した立体的構造変化の生じたヒト・プロテイン
Ｃを、特異に認識するヒト・プロテインＣに対するモノ
クローナル抗体を用いて、カルシウムイオン（Ｃａ++）
存在下、Ｇｌａドメインに依存した立体的構造変化を生
じ得るヒト・プロテインＣを免疫学的手法（EIA法，RIA
法など）により、選択的に区別して測定する方法であ
る。更に、Ｇｌａに依存した立体的構造変化に関係のな
い部位を認識するモノクローナル抗体，ポリクローナル
抗体，あるいは抗血清を用いて免疫学的手法（EIA法，R
IA法，Laurell法など）により全体のプロテインＣを測
定すれば、両方の測定結果からＧｌａ欠損プロテインＣ
の量を求めることが可能となる。
本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ
細胞はケーラーとミルシユタインの方法〔Ｋhler & M
ilstein,Nature:256 495-497(1975)〕として知られた方
法によつて得られる。すなわち、ヒト・プロテインＣで
マウスを免疫した後、このマウスの脾臓細胞をマウス・
ミエローマ細胞と融合させ、得られたハイブリドーマ細
胞はマイクロタイタープレートに固定されたヒト・プロ
テインＣと反応する抗体に対し、系統的に検査し、選択
される。この際に、カルシウムイオン（Ｃａ++）存在下
に、おける検査と、カルシウムイオン非存在下における
検査を同時に行い前者においてのみ陽性を示すハイブリ
ドーマを選別することにより、目的とする抗体を合成し
分泌するハイブリドーマを単離することができる。
細胞はケーラーとミルシユタインの方法〔Ｋhler & M
ilstein,Nature:256 495-497(1975)〕として知られた方
法によつて得られる。すなわち、ヒト・プロテインＣで
マウスを免疫した後、このマウスの脾臓細胞をマウス・
ミエローマ細胞と融合させ、得られたハイブリドーマ細
胞はマイクロタイタープレートに固定されたヒト・プロ
テインＣと反応する抗体に対し、系統的に検査し、選択
される。この際に、カルシウムイオン（Ｃａ++）存在下
に、おける検査と、カルシウムイオン非存在下における
検査を同時に行い前者においてのみ陽性を示すハイブリ
ドーマを選別することにより、目的とする抗体を合成し
分泌するハイブリドーマを単離することができる。
本発明のモノクローナル抗体はかかる新規なハイブリド
ーマ細胞が産生する産生物から得られ、カルシウムイオ
ン（Ｃａ++）の存在下におけるヒト・プロテインＣ分子
上の特定の抗原決定基に対して単一特異的に作用する。
ーマ細胞が産生する産生物から得られ、カルシウムイオ
ン（Ｃａ++）の存在下におけるヒト・プロテインＣ分子
上の特定の抗原決定基に対して単一特異的に作用する。
次に本発明におけるモノクローナル抗体を産生する具体
的方法について詳細に説明する。
的方法について詳細に説明する。
A. 抗原の単離・精製； 抗原に用いるヒト・プロテインＣは鈴木らの方法〔Suzu
ki.K.et.al,J.Biol.Chem.258:1914-1920(1983)〕により
ヒト・血漿から単離・精製される。
ki.K.et.al,J.Biol.Chem.258:1914-1920(1983)〕により
ヒト・血漿から単離・精製される。
B. ヒト・プロテインＣによるマウスの免疫； 雌Balb/Cマウスを用いることができるが他の系（Strai
n）のマウスを使用してもよい。その際、免疫計画、及
びヒト・プロテインＣの濃度は十分な量の抗原刺戟を受
けた、リンパ球が形成されるよう選ばれるべきである。
例えばマウスに50μｇのヒト・プロテインＣを２週間間
隔で腹腔に３回免疫の後、さらに30μｇを静脈に投与す
る。最終免疫の数日後に融合の為に脾臓細胞をとり出
す。
n）のマウスを使用してもよい。その際、免疫計画、及
びヒト・プロテインＣの濃度は十分な量の抗原刺戟を受
けた、リンパ球が形成されるよう選ばれるべきである。
例えばマウスに50μｇのヒト・プロテインＣを２週間間
隔で腹腔に３回免疫の後、さらに30μｇを静脈に投与す
る。最終免疫の数日後に融合の為に脾臓細胞をとり出
す。
C. 細胞融合； 上記の如く免疫したマウスの脾臓を無菌的に取り出し、
そこから単細胞懸濁液を調製する。それらの脾臓細胞を
適当なラインからのマウス骨髄腫細胞と適当な融合促進
剤の使用により、細胞融合させる。脾臓細胞対、骨髄腫
細胞の好ましい比率は約２０：１〜約２：１の範囲であ
る。約108個の脾臓細胞について0.5〜1.5mlの融合媒体
の使用が適当である。
そこから単細胞懸濁液を調製する。それらの脾臓細胞を
適当なラインからのマウス骨髄腫細胞と適当な融合促進
剤の使用により、細胞融合させる。脾臓細胞対、骨髄腫
細胞の好ましい比率は約２０：１〜約２：１の範囲であ
る。約108個の脾臓細胞について0.5〜1.5mlの融合媒体
の使用が適当である。
細胞融合に用いるマウス骨髄腫細胞は、良く知られてい
るが、本発明では、P3-X63-Ag8-U1細胞（P3-U1）〔Yelt
on,D.E et al,Current.Topics in Microbiology and Im
munology,81 1(1978)参照〕を用いた。
るが、本発明では、P3-X63-Ag8-U1細胞（P3-U1）〔Yelt
on,D.E et al,Current.Topics in Microbiology and Im
munology,81 1(1978)参照〕を用いた。
好ましい融合促進剤としては、例えば、平均分子量1000
〜4000のポリエチレングリコールを有利に使用できる
が、この分野で知られている他の融合促進剤を使用する
こともできる。本発明においては、平均分子量1540のポ
リエチレングリコールを用いた。
〜4000のポリエチレングリコールを有利に使用できる
が、この分野で知られている他の融合促進剤を使用する
こともできる。本発明においては、平均分子量1540のポ
リエチレングリコールを用いた。
D. 融合した細胞の選択； 別の容器内（例えばマイクロタイタープレート）で未融
合の脾臓細胞、未融合のマウス骨髄腫細胞および融合し
たハイブリドーマ細胞の混合物を未融合のマウス骨髄腫
細胞を支持しない選択培地で希釈し、未融合の細胞を死
滅させるのに十分な時間（約１週間）培養する。培地
は、未融合のマウス骨髄腫細胞を支持しないもの、（例
えばHAT培地）が使用される。この選択培地中では、未
融合の骨髄腫細胞は死滅する。この未融合の臓細胞は非
腫瘍性細胞なので、ある一定期間後（１週間後）死滅す
る。これらに対して融合した細胞は、骨髄腫の親細胞の
腫瘍性と、親脾細胞の性質を合わせ持つため、選択培地
中で生存できる。
合の脾臓細胞、未融合のマウス骨髄腫細胞および融合し
たハイブリドーマ細胞の混合物を未融合のマウス骨髄腫
細胞を支持しない選択培地で希釈し、未融合の細胞を死
滅させるのに十分な時間（約１週間）培養する。培地
は、未融合のマウス骨髄腫細胞を支持しないもの、（例
えばHAT培地）が使用される。この選択培地中では、未
融合の骨髄腫細胞は死滅する。この未融合の臓細胞は非
腫瘍性細胞なので、ある一定期間後（１週間後）死滅す
る。これらに対して融合した細胞は、骨髄腫の親細胞の
腫瘍性と、親脾細胞の性質を合わせ持つため、選択培地
中で生存できる。
E. 各容器中のヒト・プロテインＣ抗体の確認； かくして、ハイブリドーマ細胞が検出された後、その培
養上清を採取し、ヒト・プロテインＣに対する抗体につ
いて酵素免疫定量法（Enzyme Linked Immunosobent Ass
ay）によりスクリーニングする。この際、培養上清、酵
素標識抗体溶液および洗浄液に一定濃度のCaCl2を加え
た条件下の測定と、CaCl2を加えない条件下の測定の両
方を行い、前者に対してのみ陽性を示すハイブリドーマ
を選択することにより、カルシウムイオン非存在下で
は、ヒト・プロテインＣを認識せず、カルシウムイオン
存在下で、ヒト・プロテインＣを認識する抗体を産生、
分泌するハイブリドーマを選別することができる。
養上清を採取し、ヒト・プロテインＣに対する抗体につ
いて酵素免疫定量法（Enzyme Linked Immunosobent Ass
ay）によりスクリーニングする。この際、培養上清、酵
素標識抗体溶液および洗浄液に一定濃度のCaCl2を加え
た条件下の測定と、CaCl2を加えない条件下の測定の両
方を行い、前者に対してのみ陽性を示すハイブリドーマ
を選択することにより、カルシウムイオン非存在下で
は、ヒト・プロテインＣを認識せず、カルシウムイオン
存在下で、ヒト・プロテインＣを認識する抗体を産生、
分泌するハイブリドーマを選別することができる。
F. 目的の抗体を産生するハイブリドーマ細胞のクロー
ン化と抗体の産生； 目的の抗体を産生するハイブリドーマ細胞を適当な方法
（例えば限界希釈法）でクローン化すると、抗体は２つ
の異なつた方法で産生される。その第１の方法によれ
ば、ハイブリドーマ細胞を一定時間、適当な培地で培養
することにより、その培養上清からそのハイブリドーマ
細胞の産生するモノクローナル抗体を得ることができ
る。第２の方法によれば、ハイブリドーマ細胞は同質遺
伝子、又は半同質遺伝子を持つマウスの腹腔に注射する
ことができる。一定時間後の宿主動物の血液中および腹
水中より、そのハイブリドーマ細胞の産生するモノクロ
ーナル抗体を得ることができる。
ン化と抗体の産生； 目的の抗体を産生するハイブリドーマ細胞を適当な方法
（例えば限界希釈法）でクローン化すると、抗体は２つ
の異なつた方法で産生される。その第１の方法によれ
ば、ハイブリドーマ細胞を一定時間、適当な培地で培養
することにより、その培養上清からそのハイブリドーマ
細胞の産生するモノクローナル抗体を得ることができ
る。第２の方法によれば、ハイブリドーマ細胞は同質遺
伝子、又は半同質遺伝子を持つマウスの腹腔に注射する
ことができる。一定時間後の宿主動物の血液中および腹
水中より、そのハイブリドーマ細胞の産生するモノクロ
ーナル抗体を得ることができる。
以下実施例を上げ、本発明を詳細に説明する。以下実施
例ではプロテインＣをＰＣと略称することがある。
例ではプロテインＣをＰＣと略称することがある。
実施例１ 精製したヒト・ＰＣを雌のBalb/Cマウス（４週齢）２匹
に対して１４日間隔で４回免疫した。
に対して１４日間隔で４回免疫した。
初回の免疫はPBSに溶解した。50μｇのヒト・ＰＣを等
量のフロイントの完全アジユバント（Complete Freund'
s adjuvant）と混合し、そのエマルジヨンを、腹腔内に
投与した（0.5mg/head）、２回目，３回目は、同じく50
μｇのヒト・ＰＣをフロイントの不完全アジユバント
（Freund's incomplete Adjuvant）と混合し、同じく腹
腔内に投与した、最終免疫は30μｇのヒト・ＰＣをPBS
溶液のまま、マウス尾静脈から投与した。最終免疫の３
日後に免疫したマウスの脾臓細胞を細胞融合に用いた。
量のフロイントの完全アジユバント（Complete Freund'
s adjuvant）と混合し、そのエマルジヨンを、腹腔内に
投与した（0.5mg/head）、２回目，３回目は、同じく50
μｇのヒト・ＰＣをフロイントの不完全アジユバント
（Freund's incomplete Adjuvant）と混合し、同じく腹
腔内に投与した、最終免疫は30μｇのヒト・ＰＣをPBS
溶液のまま、マウス尾静脈から投与した。最終免疫の３
日後に免疫したマウスの脾臓細胞を細胞融合に用いた。
免疫したマウスの脾臓細胞と、同系マウスの骨髄腫細胞
（P3U1）を約２：１〜約１５：１の割合で混合し、５０
％ポリエチレングリコール1540（和光）を融合促進剤と
してKhlerとMilsteinの方法に従い細胞融合を行つ
た。融合後の細胞は、１×106 cell/mlの細胞濃度とな
るように１０％FCS-RPMI-1640培地に懸濁し、96wellsマ
イクロプレート（Coster）に１ウエル当り100μずつ
分注した。
（P3U1）を約２：１〜約１５：１の割合で混合し、５０
％ポリエチレングリコール1540（和光）を融合促進剤と
してKhlerとMilsteinの方法に従い細胞融合を行つ
た。融合後の細胞は、１×106 cell/mlの細胞濃度とな
るように１０％FCS-RPMI-1640培地に懸濁し、96wellsマ
イクロプレート（Coster）に１ウエル当り100μずつ
分注した。
融合細胞は、CO2インキユベーター（５％CO2，3℃）中
で培養し、ヒポキサンチン：アミノプテリン；チミジン
を含む培地（HAT培地）で培養交換を行い、HAT培地中で
増殖させて、脾臓細胞と、骨髄腫細胞から成るハイブリ
ドーマのスクリーニングを行つた。
で培養し、ヒポキサンチン：アミノプテリン；チミジン
を含む培地（HAT培地）で培養交換を行い、HAT培地中で
増殖させて、脾臓細胞と、骨髄腫細胞から成るハイブリ
ドーマのスクリーニングを行つた。
ハイブリドーマの培養上清中の抗体は抗原ヒト・ＰＣを
コーテイングしたマイクロタイタープレートを用いELIS
A法により検出した。第２抗体には、アルカリホスフア
ターゼ標識ウサギ抗マウスIgG抗体を用い、カルシウム
イオン存在下、非存在下におけるヒト・ＰＣとの結合の
違いを見るため、一方の培養上清には５mMCaCl2を添加
したTBS(0.02M Tris/HCl,0.14M NaCl pH7.4）を、また
もう一方にはTBSを加えた。更に第２抗体の希釈液、お
よび洗浄バツフアーには５mMCaCl2添加TBS，0.05% Twee
n20,0.02%NaN3またはTBS，0.05%Tween20,0.02%NaN3を使
用した。
コーテイングしたマイクロタイタープレートを用いELIS
A法により検出した。第２抗体には、アルカリホスフア
ターゼ標識ウサギ抗マウスIgG抗体を用い、カルシウム
イオン存在下、非存在下におけるヒト・ＰＣとの結合の
違いを見るため、一方の培養上清には５mMCaCl2を添加
したTBS(0.02M Tris/HCl,0.14M NaCl pH7.4）を、また
もう一方にはTBSを加えた。更に第２抗体の希釈液、お
よび洗浄バツフアーには５mMCaCl2添加TBS，0.05% Twee
n20,0.02%NaN3またはTBS，0.05%Tween20,0.02%NaN3を使
用した。
融合細胞をまいた合計541のウエルのうち523のウエルに
コロニーの形成が認められ、このうち抗体産生陽性ウエ
ルは下記表−１に示すように44wellであり、カルシウム
イオン存在下でヒト・ＰＣと結合するものは４４，カル
シウムイオン非存在下でヒト・ＰＣと結合するものは３
２であつた。
コロニーの形成が認められ、このうち抗体産生陽性ウエ
ルは下記表−１に示すように44wellであり、カルシウム
イオン存在下でヒト・ＰＣと結合するものは４４，カル
シウムイオン非存在下でヒト・ＰＣと結合するものは３
２であつた。
これらの抗体産生陽性ウエルについて限界希釈法による
クローニングを２回繰り返して行ない、得られたクロー
ンは９０％FCS-10% DMSO中に懸濁させ液体窒素中に保存
した。
クローニングを２回繰り返して行ない、得られたクロー
ンは９０％FCS-10% DMSO中に懸濁させ液体窒素中に保存
した。
各クローンの産生するモノクローナル抗体はクローンを
Balb/Cマウス腹腔内で増殖させ、その腹水からプロテイ
ンA-Sepharose４Ｂカラムを用いて精製した。
Balb/Cマウス腹腔内で増殖させ、その腹水からプロテイ
ンA-Sepharose４Ｂカラムを用いて精製した。
実施例２（製したIgGの性質） マウス腹水から精製した各クローンのIgGについて、サ
ブクラス，ヒト・ＰＣ活性への影響，Ｌ鎖あるいはＨ鎖
への結合性，およびα−キモトリプシンを用いた酵素処
理によりGlaドメインを除去したヒト・ＰＣとの結合性
を調べた。
ブクラス，ヒト・ＰＣ活性への影響，Ｌ鎖あるいはＨ鎖
への結合性，およびα−キモトリプシンを用いた酵素処
理によりGlaドメインを除去したヒト・ＰＣとの結合性
を調べた。
サブクラスは、各クラス特異性の抗マウス抗血清を用い
て、オクタロニー法により決定した。ヒト・ＰＣ活性へ
の影響は、ヒト・ＰＣにIgGをモル比１：５で加えて４
℃で一夜インキユベーシヨンし、トロンビン−トロンボ
モジユリンコンプレツクスによりヒトＰＣを活性化し、
その活性は次合成基質の分解活性を測定することにより
測定した。この合成基質としてはH-Val-Leu-Arg-NH- -N
O2・2HCl〔ここでVelはＤ形の光学活性のバリン，Leuは
Ｌ形の光学活性のロイシン，ArgはＬ形の光学活性のア
ルギニンを示す。Kabi Vitrum AB（スウエーデン）社製
のS-2266を用いた〕を使用した。Ｌ鎖，Ｈ鎖への結合性
は、ヒト・ＰＣを還元条件で電気泳動し、ニトロセルロ
ース膜及びHRP標識Goat anti-miuse IgGを用いたイムノ
ブロツテイングを行つて判定した。Glaドメイン除去ヒ
ト・ＰＣはEsmonらの方法〔Esmon,N.L.et al:J.Bio.Che
m.258:5548-5553(1983)参照〕に従つて、α−キモトリ
プシンを用いた限定加水分解により調製し、イムノプロ
ツテイングを行い、抗体の結合性を判定した。
て、オクタロニー法により決定した。ヒト・ＰＣ活性へ
の影響は、ヒト・ＰＣにIgGをモル比１：５で加えて４
℃で一夜インキユベーシヨンし、トロンビン−トロンボ
モジユリンコンプレツクスによりヒトＰＣを活性化し、
その活性は次合成基質の分解活性を測定することにより
測定した。この合成基質としてはH-Val-Leu-Arg-NH- -N
O2・2HCl〔ここでVelはＤ形の光学活性のバリン，Leuは
Ｌ形の光学活性のロイシン，ArgはＬ形の光学活性のア
ルギニンを示す。Kabi Vitrum AB（スウエーデン）社製
のS-2266を用いた〕を使用した。Ｌ鎖，Ｈ鎖への結合性
は、ヒト・ＰＣを還元条件で電気泳動し、ニトロセルロ
ース膜及びHRP標識Goat anti-miuse IgGを用いたイムノ
ブロツテイングを行つて判定した。Glaドメイン除去ヒ
ト・ＰＣはEsmonらの方法〔Esmon,N.L.et al:J.Bio.Che
m.258:5548-5553(1983)参照〕に従つて、α−キモトリ
プシンを用いた限定加水分解により調製し、イムノプロ
ツテイングを行い、抗体の結合性を判定した。
６種のクローンの産生する抗体の性質について、得られ
た結果を下記表−２に示した。カルシウムイオン依存性
抗体はいずれもＬ鎖結合性であり、カルシウムイオン存
在下であつてもGlaドメイン除去ＰＣとは結合しなかつ
た。これらの抗体は、カルシウムイオンと結合しGlaド
メインに依存した立体的構造変化の生じたヒト・ＰＣの
みを認識するものであることが示された。
た結果を下記表−２に示した。カルシウムイオン依存性
抗体はいずれもＬ鎖結合性であり、カルシウムイオン存
在下であつてもGlaドメイン除去ＰＣとは結合しなかつ
た。これらの抗体は、カルシウムイオンと結合しGlaド
メインに依存した立体的構造変化の生じたヒト・ＰＣの
みを認識するものであることが示された。
実施例３（血漿中のヒト・ＰＣの測定） 健常人血漿、プロテインＣ欠損症患者血漿，肝障害患
者、血漿ワーフアリン投与患者血漿について次の２通り
のIRMA(Immuno-radiometric assay）法でＰＣの測定を
行つた。
者、血漿ワーフアリン投与患者血漿について次の２通り
のIRMA(Immuno-radiometric assay）法でＰＣの測定を
行つた。
方法Ａ：ＰＣのＨ鎖結合性の抗体（6C3）をコーテイン
グし、１％BSAでブロツキングしたマイクロタイタープ
レートのwellに、１％BSAを含む0.05Mtris/HCl,pH7.4,
0.15MNACl(TBS)で希釈した健常人血漿，患者血漿および
標準血漿を加えた。３７℃で３時間インキユベーシヨン
した後１％BSA-TBS-0.05% Tween20でwellを洗浄し、5mM
CaCl2添加１％BSA-TBSで希釈した125I−標識カルシウム
依存性抗ＰＣ抗体（7B12）を加えた。３７℃で３時間イ
ンキユベーシヨン後、5mMCaCl2添加１％BSA-TBS-0.05%T
ween20でwellを洗浄し、γ−カウンターでwellをカウン
トした。
グし、１％BSAでブロツキングしたマイクロタイタープ
レートのwellに、１％BSAを含む0.05Mtris/HCl,pH7.4,
0.15MNACl(TBS)で希釈した健常人血漿，患者血漿および
標準血漿を加えた。３７℃で３時間インキユベーシヨン
した後１％BSA-TBS-0.05% Tween20でwellを洗浄し、5mM
CaCl2添加１％BSA-TBSで希釈した125I−標識カルシウム
依存性抗ＰＣ抗体（7B12）を加えた。３７℃で３時間イ
ンキユベーシヨン後、5mMCaCl2添加１％BSA-TBS-0.05%T
ween20でwellを洗浄し、γ−カウンターでwellをカウン
トした。
方法Ｂ：125I−標識第２抗体として125I−標識ウサギ抗
ヒト・ＰＣ抗体を用いて方法Ａと同様の操作を行つた。
ヒト・ＰＣ抗体を用いて方法Ａと同様の操作を行つた。
測定結果を図面に示した。健常人、プロテインＣ欠損
症，肝障害患者血漿においては、Ａ，Ｂ両方法による測
定値はよく一致し、一次回帰で求めた相関係数はγ＝0.
99であつたが、ワーフアリン投与患者の場合は、いずれ
れの血漿もＡによる測定値がＢによる測定値よりも低い
という結果が得られた。これは、カルシウムイオン存在
下であつてもGlaに依存した立体的構造変化を生じないG
la欠損ＰＣが、血中に分泌されていることを示すもので
ある。Gla欠損ＰＣの量は両測定値の差として把握する
ことができる。なお図面中〇は健常人、□は肝障害患
者、△はプロテインＣ欠損症患者、●はワーフアリン投
与患者の測定値を示す。
症，肝障害患者血漿においては、Ａ，Ｂ両方法による測
定値はよく一致し、一次回帰で求めた相関係数はγ＝0.
99であつたが、ワーフアリン投与患者の場合は、いずれ
れの血漿もＡによる測定値がＢによる測定値よりも低い
という結果が得られた。これは、カルシウムイオン存在
下であつてもGlaに依存した立体的構造変化を生じないG
la欠損ＰＣが、血中に分泌されていることを示すもので
ある。Gla欠損ＰＣの量は両測定値の差として把握する
ことができる。なお図面中〇は健常人、□は肝障害患
者、△はプロテインＣ欠損症患者、●はワーフアリン投
与患者の測定値を示す。
実施例４（ワーフアリン投与前後におけるＰＣ抗原量の
測定） 実施例３と同様にＡ，Ｂ２通りの測定方法を用いて、ワ
ーフアリン投与前後において採血した血漿中のプロテイ
ンＣを測定した。
測定） 実施例３と同様にＡ，Ｂ２通りの測定方法を用いて、ワ
ーフアリン投与前後において採血した血漿中のプロテイ
ンＣを測定した。
表−３に２例の測定結果を示した。２例ともワーフアリ
ン投与前のプロテインＣは正常範囲であり、Ａ，Ｂ両方
法による測定値はよく一致していたが、ワーフアリン投
与後にはプロテインＣレベルは明らかに低下していた。
また、ワーフアリン投与後のＡによる測定値は、Ｂによ
る測定値の２分の１，またはそれ以下と低く、ワーフア
リン投与により血中に分泌されるプロテインＣの量が減
少し、Gla欠損プロテインＣが分泌されることが示され
た。
ン投与前のプロテインＣは正常範囲であり、Ａ，Ｂ両方
法による測定値はよく一致していたが、ワーフアリン投
与後にはプロテインＣレベルは明らかに低下していた。
また、ワーフアリン投与後のＡによる測定値は、Ｂによ
る測定値の２分の１，またはそれ以下と低く、ワーフア
リン投与により血中に分泌されるプロテインＣの量が減
少し、Gla欠損プロテインＣが分泌されることが示され
た。
表−３ ワーフアリン投与前後におけるＰＣ抗原量
図面は本発明の実施例において測定されたＰＣ抗原量に
ついて、方法Ａと方法Ｂとの相関性を調べるためにそれ
らの値をプロツトしたものである。
ついて、方法Ａと方法Ｂとの相関性を調べるためにそれ
らの値をプロツトしたものである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 三室 淳 栃木県宇都宮市今泉町3009―１ (72)発明者 青木 延雄 東京都文京区本郷４−20―２―304 (56)参考文献 特公 平３−1959（ＪＰ，Ｂ２) 特公 平２−60267（ＪＰ，Ｂ２) 血液と脈管，15（２），171−174 （1984)
Claims (1)
- 【請求項１】カルシウムイオン（Ｃａ++）非存在下で
は、ヒト・プロテインＣを認識せず、カルシウムイオン
（Ｃａ++）存在下ではＧｌａドメインに依存した立体的
構造変化を受けたヒト・プロテインＣに対するモノクロ
ーナル抗体を用いてカルシウムイオンとの結合により、
Ｇｌａドメインに依存した立体的構造変化を受け得るヒ
ト・プロテインＣを免疫学的に区別して測定する方法。
Priority Applications (7)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60124388A JPH0619352B2 (ja) | 1985-06-10 | 1985-06-10 | ヒト・プロテインｃの測定方法 |
| US06/804,255 US4902614A (en) | 1984-12-03 | 1985-12-03 | Monoclonal antibody to human protein C |
| DE19863687542 DE3687542T2 (de) | 1985-06-10 | 1986-05-28 | Monoklonaler antikoerper gegen humanes protein c. |
| EP19860107297 EP0205046B1 (en) | 1985-06-10 | 1986-05-28 | Monoclonal antibody to human protein c |
| NO862289A NO171170C (no) | 1985-06-10 | 1986-06-09 | Humant protein-c antistoff |
| DK270386A DK171836B1 (da) | 1985-06-10 | 1986-06-09 | Monoklonalt antistof mod protein C, hybridom, der producerer antistoffet, fremgangsmåde til måling af humant protein C med et Gla-område samt fremgangsmåde til udvinding af humant protein C med et Gla-område |
| NO922569A NO173340C (no) | 1985-06-10 | 1992-06-29 | Humant protein C antistoff |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60124388A JPH0619352B2 (ja) | 1985-06-10 | 1985-06-10 | ヒト・プロテインｃの測定方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61283868A JPS61283868A (ja) | 1986-12-13 |
| JPH0619352B2 true JPH0619352B2 (ja) | 1994-03-16 |
Family
ID=14884176
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60124388A Expired - Fee Related JPH0619352B2 (ja) | 1984-12-03 | 1985-06-10 | ヒト・プロテインｃの測定方法 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0205046B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0619352B2 (ja) |
| DE (1) | DE3687542T2 (ja) |
| DK (1) | DK171836B1 (ja) |
| NO (1) | NO171170C (ja) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0287028B1 (en) * | 1987-04-17 | 1993-07-21 | Teijin Limited | Method of separating activated human protein c |
| JPS6485091A (en) * | 1987-04-17 | 1989-03-30 | Teijin Ltd | Isolation and purification of activated human protein c using antibody |
| USH1148H (en) | 1987-04-17 | 1993-03-02 | Method of separating activated human protein C | |
| EP0598108A1 (en) * | 1992-06-05 | 1994-05-25 | Dade Produktions AG | Rabbit single domain antibody and use thereof |
| JP4782249B2 (ja) * | 2009-07-21 | 2011-09-28 | 積水メディカル株式会社 | インスリン測定方法 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3485711D1 (de) * | 1983-03-04 | 1992-06-17 | Scripps Clinic Res | Immunoadsorbens und verfahren zur zurueckgewinnung von vitamin-k-abhaengigen proteinen mittels dieses adsorbens. |
| GB8327860D0 (en) * | 1983-10-18 | 1983-11-16 | Fujisawa Pharmaceutical Co | Monoclonal antiprotein c antibody |
| EP0162078B1 (en) * | 1983-10-28 | 1994-09-14 | New England Medical Center Hospitals, Inc. | Method for isolating a protein from a mixture containing said protein and a conformation specific antibody useful therein |
| JPH031959A (ja) * | 1989-05-30 | 1991-01-08 | Matsushita Electric Ind Co Ltd | 厚膜サーマルヘッドの製造方法 |
-
1985
- 1985-06-10 JP JP60124388A patent/JPH0619352B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1986
- 1986-05-28 DE DE19863687542 patent/DE3687542T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1986-05-28 EP EP19860107297 patent/EP0205046B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1986-06-09 NO NO862289A patent/NO171170C/no not_active IP Right Cessation
- 1986-06-09 DK DK270386A patent/DK171836B1/da not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 血液と脈管，１５（２），１７１−１７４（１９８４） |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| NO171170B (no) | 1992-10-26 |
| EP0205046A2 (en) | 1986-12-17 |
| DK171836B1 (da) | 1997-06-23 |
| DK270386D0 (da) | 1986-06-09 |
| NO862289L (no) | 1986-12-11 |
| DE3687542D1 (de) | 1993-03-04 |
| EP0205046A3 (en) | 1989-02-22 |
| JPS61283868A (ja) | 1986-12-13 |
| DK270386A (da) | 1986-12-11 |
| EP0205046B1 (en) | 1993-01-20 |
| NO862289D0 (no) | 1986-06-09 |
| NO171170C (no) | 1993-02-03 |
| DE3687542T2 (de) | 1993-06-09 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US4902614A (en) | Monoclonal antibody to human protein C | |
| JPH0616717B2 (ja) | モノクロナ−ル抗体 | |
| JPH0636741B2 (ja) | ヒト・プロテインｃの分離方法 | |
| TW201802120A (zh) | 抗凝血因子ｘｉ抗體 | |
| Lewis et al. | Conformation-specific monoclonal antibodies directed against the calcium-stabilized structure of human prothrombin | |
| JP2916252B2 (ja) | 血液凝固ＸＩＩａ因子βモノクローナル抗体およびイムノアッセイ | |
| US6541275B1 (en) | Immunoassay for F1.2 prothrombin fragment | |
| EP0271810B1 (en) | Immunological determination of free human protein s and c4bp-protein s complex | |
| EP0315447A2 (en) | Method of immunological measurement of human protein S and reagent and kit therefor | |
| US5187067A (en) | Immunological determination of free human protein S and C4bp-protein S complex | |
| JPH07238099A (ja) | モノクローナル抗体及びこれを用いる免疫学的測定法 | |
| EP0205046B1 (en) | Monoclonal antibody to human protein c | |
| EP4353748A1 (en) | Novel antithrombotic antibody | |
| JPH0717680B2 (ja) | ヒト▲膵▼ホスホリパ−ゼａ▲下２▼に対するモノクロ−ナル抗体、その製造法、該モノクロ−ナル抗体産生ハイブリド−マおよび該モノクロ−ナル抗体を用いたヒト▲膵▼ホスホリパ−ゼａ▲下２▼の測定方法 | |
| AU2006213411B2 (en) | Antibody for assay of ADAMTS13 activity and method of activity assay | |
| JP4533995B2 (ja) | 抗ａｄａｍｔｓ１３モノクローナル抗体 | |
| JPH0753757B2 (ja) | モノクローナル抗体及びその使用方法 | |
| EP0646244A1 (en) | Immunoassay and test kit for thrombin-antithrombin iii complex | |
| JP4451518B2 (ja) | ハイブリッド細胞、モノクローナル抗体、製造方法および測定方法 | |
| JP2610808B2 (ja) | 人正常細胞由来の組織型プラスミノーゲンアクチベーターに対するモノクロナル抗体を用いる免疫学的測定試薬 | |
| JPH0656382B2 (ja) | 活性型ヒト血液凝固第▲ｘｉ▼因子の免疫学的定量法 | |
| WO2011080322A1 (en) | Method of prognosing the outcome of acquired hemophilia and of treatment of hemophilia | |
| JPWO1998059047A1 (ja) | 抗ヒトフィブリンモノマー特異的モノクローナル抗体、該モノクローナル抗体の製造方法、ハイブリドーマ及び免疫学的測定方法 | |
| JPH0789116B2 (ja) | モノクローナル抗体を用いた免疫学的測定方法およびそのためのキット | |
| JP2673619B2 (ja) | 抗ヒトセルロプラスミンモノクローナル抗体、それを用いたヒトセルロプラスミンの検出方法及びそれを産生するハイブリドーマ |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |