JPH06197651A - 耐病原体性トランスジェニック生物およびその生物を作製するのに用いるｄｎａ−トランスファベクターならびにその生物を作製する方法 - Google Patents
耐病原体性トランスジェニック生物およびその生物を作製するのに用いるｄｎａ−トランスファベクターならびにその生物を作製する方法Info
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 耐病原体性に優れた生物、特に既知の生物に
比べてその抵抗力が全体的に高められあるいは可能な病
原体の数に関してその抵抗力が拡張された生物を提供す
る。 【構成】 ゲノム中に活性プロモータの制御下の病原体
抑制作用を有する少なくとも２つの異なる遺伝子を含む
耐病原体性トランスジェニック生物。この生物は相乗的
病原体抑制作用により区別される。この作用はこれら生
物の遺伝子がキチナーゼ(ChiS,ChiG) 、グルカナーゼ(G
luG)、タンパク質合成阻害剤(PSI) および抗真菌性タン
パク質(AFP) 遺伝子産物をコードする際、特に明瞭であ
る。
比べてその抵抗力が全体的に高められあるいは可能な病
原体の数に関してその抵抗力が拡張された生物を提供す
る。 【構成】 ゲノム中に活性プロモータの制御下の病原体
抑制作用を有する少なくとも２つの異なる遺伝子を含む
耐病原体性トランスジェニック生物。この生物は相乗的
病原体抑制作用により区別される。この作用はこれら生
物の遺伝子がキチナーゼ(ChiS,ChiG) 、グルカナーゼ(G
luG)、タンパク質合成阻害剤(PSI) および抗真菌性タン
パク質(AFP) 遺伝子産物をコードする際、特に明瞭であ
る。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は耐病原体性生物およびこ
の生物を作製する方法に関する。
の生物を作製する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】病原体による植物の侵襲は連続した異な
る反応を生じさせることが従来知られている。これらに
は、例えば、細胞壁構造の変化、抗菌活性を有するフィ
トアレキシンの合成、いわゆるPRタンパク質（病原関
連）、タンパク質分解酵素阻害剤および加水分解機能を
有する酵素の蓄積が含まれる〔ハールブロック(Hahlbro
ck) およびグリセバッハ(Grisebach) の「アニュ．レ
ビ．プラント．フィジオロ．(Ann.Rev.Plant.Physio
l.)」、第30巻(1979 年) 、 105〜 130頁〕。
る反応を生じさせることが従来知られている。これらに
は、例えば、細胞壁構造の変化、抗菌活性を有するフィ
トアレキシンの合成、いわゆるPRタンパク質（病原関
連）、タンパク質分解酵素阻害剤および加水分解機能を
有する酵素の蓄積が含まれる〔ハールブロック(Hahlbro
ck) およびグリセバッハ(Grisebach) の「アニュ．レ
ビ．プラント．フィジオロ．(Ann.Rev.Plant.Physio
l.)」、第30巻(1979 年) 、 105〜 130頁〕。
【０００３】種々の病原体（真菌および昆虫）はそれら
の細胞壁の構成成分としてキチンを有する。対照的に、
植物はキチンを含まない。またいくつかの場合には植物
において病原体の侵襲後キチナーゼ産生が高められるこ
とが示されている。キチナーゼは加水分解機能を有する
酵素の一種でありこれらはキチン分解に触媒作用を及ぼ
す。現在植物がキチナーゼの産生により病原体に対する
高められた抵抗性を獲得することが示されている。
の細胞壁の構成成分としてキチンを有する。対照的に、
植物はキチンを含まない。またいくつかの場合には植物
において病原体の侵襲後キチナーゼ産生が高められるこ
とが示されている。キチナーゼは加水分解機能を有する
酵素の一種でありこれらはキチン分解に触媒作用を及ぼ
す。現在植物がキチナーゼの産生により病原体に対する
高められた抵抗性を獲得することが示されている。
【０００４】さらに真菌タンパク質合成の阻害剤をコー
ドする遺伝子産物を生じるオオムギ植物からの遺伝子を
用いることが知られている。トランスジェニック植物中
に対応する阻害剤遺伝子を組み込むことにより真菌に対
する改良された抵抗性が与えられる。
ドする遺伝子産物を生じるオオムギ植物からの遺伝子を
用いることが知られている。トランスジェニック植物中
に対応する阻害剤遺伝子を組み込むことにより真菌に対
する改良された抵抗性が与えられる。
【０００５】最後に、アスペルギウスギガンテウス(Asp
ergillus giganteus) からのポリペプチドの使用がその
抗真菌活性により、真菌による侵襲から植物を保護する
ことができることも開示されている。
ergillus giganteus) からのポリペプチドの使用がその
抗真菌活性により、真菌による侵襲から植物を保護する
ことができることも開示されている。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】しかし、この従来の技
術ではなお一層の耐病原体性トランスジェニック生物を
提供する必要がある。さらに、特に望ましい生物は既知
の生物に比べてその抵抗力が全体的に高められるものあ
るいは可能な病原体の数に関してその抵抗力が拡張され
るものである。
術ではなお一層の耐病原体性トランスジェニック生物を
提供する必要がある。さらに、特に望ましい生物は既知
の生物に比べてその抵抗力が全体的に高められるものあ
るいは可能な病原体の数に関してその抵抗力が拡張され
るものである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】この問題はゲノム中に活
性プロモータの制御下の病原体抑制作用を有する少なく
とも２つの異なる遺伝子を含む耐病原体性トランスジェ
ニック生物により解決される。
性プロモータの制御下の病原体抑制作用を有する少なく
とも２つの異なる遺伝子を含む耐病原体性トランスジェ
ニック生物により解決される。
【０００８】本発明は生物のゲノムに病原体抑制作用を
有する少なくとも２つの異なる遺伝子を組み込むことが
その独自の遺伝子のそれぞれの付加的作用をはるかに超
える範囲にまでこの生物が病原体に対抗するのに役立つ
という驚くべき知見に基づいている。
有する少なくとも２つの異なる遺伝子を組み込むことが
その独自の遺伝子のそれぞれの付加的作用をはるかに超
える範囲にまでこの生物が病原体に対抗するのに役立つ
という驚くべき知見に基づいている。
【０００９】次に本発明の他の好適例を示す。
【００１０】これらの遺伝子は真菌の生命力を低下させ
る遺伝子産物をコードすることができる。特に、これら
の遺伝子は真菌、細菌および植物、動物またはウイルス
起源のものでよい。特に、遺伝子産物は真菌に対する抵
抗性を増進する特性を有する。遺伝子産物はキチナーゼ
(ChiS 、ChiG) 、グルカナーゼ(GluG)、タンパク質合成
阻害剤(PSI) および抗真菌性タンパク質(AFP) である。
る遺伝子産物をコードすることができる。特に、これら
の遺伝子は真菌、細菌および植物、動物またはウイルス
起源のものでよい。特に、遺伝子産物は真菌に対する抵
抗性を増進する特性を有する。遺伝子産物はキチナーゼ
(ChiS 、ChiG) 、グルカナーゼ(GluG)、タンパク質合成
阻害剤(PSI) および抗真菌性タンパク質(AFP) である。
【００１１】耐病原体性トランスジェニック生物は植物
でよく、さらにタバコ、ジャガイモ、イチゴ、トウモロ
コシ、セイヨウアブラナまたはトマト植物が好ましい。
でよく、さらにタバコ、ジャガイモ、イチゴ、トウモロ
コシ、セイヨウアブラナまたはトマト植物が好ましい。
【００１２】また本発明はここで詳細に説明するような
挿入DNA 配列を有するDNA-トランスファベクターに関す
る。
挿入DNA 配列を有するDNA-トランスファベクターに関す
る。
【００１３】さらに本発明はここで説明するような耐病
原体性生物の作製方法に関し、病原体抑制作用を有する
少なくとも１つの遺伝子を生物のゲノムにトランスファ
し、(a) この生物と他の生物、随意ではあるがトランス
ジェニックな、病原体抑制作用を有する少なくとも１つ
の他の遺伝子を含む生物とを交配させ、次いで選択する
ことにより、および／または、(b) 病原体抑制作用を有
するこの他の遺伝子でこの生物に形質転換を起こさせる
ことにより耐病原体性生物を得る。この方法にはここに
記載する病原体抑制作用を有する遺伝子に対応する挿入
DNA 配列を含むDNA-トランスファベクターを用いること
ができる。
原体性生物の作製方法に関し、病原体抑制作用を有する
少なくとも１つの遺伝子を生物のゲノムにトランスファ
し、(a) この生物と他の生物、随意ではあるがトランス
ジェニックな、病原体抑制作用を有する少なくとも１つ
の他の遺伝子を含む生物とを交配させ、次いで選択する
ことにより、および／または、(b) 病原体抑制作用を有
するこの他の遺伝子でこの生物に形質転換を起こさせる
ことにより耐病原体性生物を得る。この方法にはここに
記載する病原体抑制作用を有する遺伝子に対応する挿入
DNA 配列を含むDNA-トランスファベクターを用いること
ができる。
【００１４】最後に、本発明は耐病原体性生物を作製す
る方法に関し、病原体抑制作用を有する１つ以上の遺伝
子を含むベクターが生物のゲノムに形質転換を起こすの
に使用される。
る方法に関し、病原体抑制作用を有する１つ以上の遺伝
子を含むベクターが生物のゲノムに形質転換を起こすの
に使用される。
【００１５】また本発明は使用する生物が前記記載のい
ずれかの耐病原体性トランスジェニック生物またはゲノ
ムにここで示した説明に従う少なくとも１つの遺伝子を
含む生物であり、この生物により発現されないがここに
示す説明に従う任意の他の１つの遺伝子産物に対応する
少なくとも１つの物質をこの生物に適用することを特徴
とする、病原体に対する生物の抵抗性を確実にする方法
に関する。
ずれかの耐病原体性トランスジェニック生物またはゲノ
ムにここで示した説明に従う少なくとも１つの遺伝子を
含む生物であり、この生物により発現されないがここに
示す説明に従う任意の他の１つの遺伝子産物に対応する
少なくとも１つの物質をこの生物に適用することを特徴
とする、病原体に対する生物の抵抗性を確実にする方法
に関する。
【００１６】添付した配列表Ａ〜Ｅのタンパク質をコー
ドする、または配列表に対応する遺伝子配列を、トラン
スファあるいはトランスフェクションした耐病原体性ト
ランスジェニック生物を用いて著しく特に相乗的効果を
達成することができる。
ドする、または配列表に対応する遺伝子配列を、トラン
スファあるいはトランスフェクションした耐病原体性ト
ランスジェニック生物を用いて著しく特に相乗的効果を
達成することができる。
【００１７】ChiS:ChiSと称するキチナーゼをコードす
る、1.8Kb のサイズのDNA フラグメントを土壌細菌セラ
チアマルセスセンス(Serratia marcescence)から単離し
た。精製ChiSタンパク質を用いたインビトロ研究はこれ
が低濃度であっても、真菌の増殖を効果的に阻害するこ
とができることを示した。阻害の原理はChiSタンパク質
が真菌の菌糸の先端に損傷を与えることができるキチナ
ーゼ活性を有することである。これにより真菌はさらに
増殖することができず抑制される。
る、1.8Kb のサイズのDNA フラグメントを土壌細菌セラ
チアマルセスセンス(Serratia marcescence)から単離し
た。精製ChiSタンパク質を用いたインビトロ研究はこれ
が低濃度であっても、真菌の増殖を効果的に阻害するこ
とができることを示した。阻害の原理はChiSタンパク質
が真菌の菌糸の先端に損傷を与えることができるキチナ
ーゼ活性を有することである。これにより真菌はさらに
増殖することができず抑制される。
【００１８】PSI:PSI 遺伝子はオオムギに由来し真菌に
よるタンパク質合成を阻害するタンパク質をコードす
る。インビトロにおける試験は低濃度のPSI でさえも、
例えば、リゾクトニアソラニ(Rhizoctonia solani)のよ
うな種々の真菌を抑制するのに十分であることを示す。
よるタンパク質合成を阻害するタンパク質をコードす
る。インビトロにおける試験は低濃度のPSI でさえも、
例えば、リゾクトニアソラニ(Rhizoctonia solani)のよ
うな種々の真菌を抑制するのに十分であることを示す。
【００１９】AFP:抗真菌活性を有するポリペプチドをア
スペルギルスギガンテウスの発酵ブイヨン(fermentatio
n broth)から単離し配列決定することが可能である。こ
のポリペプチドは抗真菌剤、例えば噴霧剤としてならび
に工業製品およびヒト用食品さらに動物用食品のための
保存料として適切である。さらに農薬活性を有する他の
物質、肥料または成長調節剤と組み合わせることができ
る。真菌に対する阻害活性は特に種々のアスペルギル
ス、フザリア(Fusaria) 、フィトフソラ(Phytophthora)
およびトリコフィトン(Trichophyton)種に対して検出で
きた。
スペルギルスギガンテウスの発酵ブイヨン(fermentatio
n broth)から単離し配列決定することが可能である。こ
のポリペプチドは抗真菌剤、例えば噴霧剤としてならび
に工業製品およびヒト用食品さらに動物用食品のための
保存料として適切である。さらに農薬活性を有する他の
物質、肥料または成長調節剤と組み合わせることができ
る。真菌に対する阻害活性は特に種々のアスペルギル
ス、フザリア(Fusaria) 、フィトフソラ(Phytophthora)
およびトリコフィトン(Trichophyton)種に対して検出で
きた。
【００２０】ChiGおよびGluG:キチナーゼ(ChiG)および
グルカナーゼ(GluG)をそれぞれコードする２つの遺伝子
は特定の種類のオオムギから単離することができる。精
製ChiGタンパク質またはGluGタンパク質はインビトロに
おいて種々の植物病原体性真菌を抑制する（特にリゾク
トニアソラニ）〔アール．レアー(R.Leah)等の、「ジャ
ーナル オブバイオロジカル ケミストリ(Journal of
Biological Chemistry) 」、第 266巻、第３号（1991
年）、1564〜1573頁参照〕。
グルカナーゼ(GluG)をそれぞれコードする２つの遺伝子
は特定の種類のオオムギから単離することができる。精
製ChiGタンパク質またはGluGタンパク質はインビトロに
おいて種々の植物病原体性真菌を抑制する（特にリゾク
トニアソラニ）〔アール．レアー(R.Leah)等の、「ジャ
ーナル オブバイオロジカル ケミストリ(Journal of
Biological Chemistry) 」、第 266巻、第３号（1991
年）、1564〜1573頁参照〕。
【００２１】本発明者らは次に、全く驚くべきことに、
PSI 、AFP 、ChiS、ChiGまたはGluGの発現の少なくとも
２つの組み合わせがトランスジェニック植物における真
菌に対して要求される抵抗力に関し相乗的効果を起こす
ことを見出した。特に、組み合わせにおける個々の物質
の効果は著しく限度を超えて広がる。これらには真菌リ
ゾクトニアソラニ、スクレロチニア(Sclerotinia) 侵
襲、ボトリティス(Botrytis)侵襲、等に対する抵抗性が
含まれる。
PSI 、AFP 、ChiS、ChiGまたはGluGの発現の少なくとも
２つの組み合わせがトランスジェニック植物における真
菌に対して要求される抵抗力に関し相乗的効果を起こす
ことを見出した。特に、組み合わせにおける個々の物質
の効果は著しく限度を超えて広がる。これらには真菌リ
ゾクトニアソラニ、スクレロチニア(Sclerotinia) 侵
襲、ボトリティス(Botrytis)侵襲、等に対する抵抗性が
含まれる。
【００２２】本発明の組み合わせは（ DNAおよび／また
はポリペプチド）である： （２つの組み合わせ）ChiS、GluG；ChiS、PSI ；ChiS、
ChiG；ChiS、AFP ；GluG、PSI ；GluG、ChiG；GluG、AF
P ；PSI 、ChiG；PSI 、AFP ； （３つの組み合わせ）ChiS、GluG、PSI ；ChiS、GluG、
ChiG；ChiS、GluG、AFP ；GluG、PSI 、ChiG；CluG、PS
I 、AFP ；PSI 、ChiG、AFP ；ChiG、AFP 、GluG； （４つの組み合わせ）ChiS、GluG、PSI 、AFP ；ChiS、
GluG、PSI 、ChiG； （５つの組み合わせ）ChiS、GluG、PSI 、AFP 、ChiG
はポリペプチド）である： （２つの組み合わせ）ChiS、GluG；ChiS、PSI ；ChiS、
ChiG；ChiS、AFP ；GluG、PSI ；GluG、ChiG；GluG、AF
P ；PSI 、ChiG；PSI 、AFP ； （３つの組み合わせ）ChiS、GluG、PSI ；ChiS、GluG、
ChiG；ChiS、GluG、AFP ；GluG、PSI 、ChiG；CluG、PS
I 、AFP ；PSI 、ChiG、AFP ；ChiG、AFP 、GluG； （４つの組み合わせ）ChiS、GluG、PSI 、AFP ；ChiS、
GluG、PSI 、ChiG； （５つの組み合わせ）ChiS、GluG、PSI 、AFP 、ChiG
【００２３】さらに本発明は病原体抑制作用を有するタ
ンパク質、好ましくは病原体に対する、ChiS、PSI 、AF
P 、ChiGおよびGluGを組み合わせて使用することに関す
る。また組み合わせ使用はこのような関係においては少
なくとも１つの第１病原体抑制物質が生物により発現さ
れさらに病原体抑制作用を有する少なくとも１つの第２
物質が外界から生物に適用されることを意味する。
ンパク質、好ましくは病原体に対する、ChiS、PSI 、AF
P 、ChiGおよびGluGを組み合わせて使用することに関す
る。また組み合わせ使用はこのような関係においては少
なくとも１つの第１病原体抑制物質が生物により発現さ
れさらに病原体抑制作用を有する少なくとも１つの第２
物質が外界から生物に適用されることを意味する。
【００２４】また本発明の薬剤には少なくとも２つの組
み合わせで上記タンパク質を有するものが含まれる。本
発明の薬剤はこれらのタンパク質以外の他の活性物質を
含む場合がある。他の活性物質は農薬、肥料および／ま
たは成長調節剤でよく、さらに本発明の薬剤は種々の組
成物、例えば濃縮物、エマルジョン、粉末、担体上の組
成物、他の活性物質との混合物、等として調製すること
ができる。ChiS／PSIおよびAFP ／PSI の組み合わせが
特に好ましい。これらのタンパク質は、特にタバコ作物
において、リゾクトニアソラニの増殖を抑制するのに特
に効果的に用いることができる。
み合わせで上記タンパク質を有するものが含まれる。本
発明の薬剤はこれらのタンパク質以外の他の活性物質を
含む場合がある。他の活性物質は農薬、肥料および／ま
たは成長調節剤でよく、さらに本発明の薬剤は種々の組
成物、例えば濃縮物、エマルジョン、粉末、担体上の組
成物、他の活性物質との混合物、等として調製すること
ができる。ChiS／PSIおよびAFP ／PSI の組み合わせが
特に好ましい。これらのタンパク質は、特にタバコ作物
において、リゾクトニアソラニの増殖を抑制するのに特
に効果的に用いることができる。
【００２５】また本発明は配列Ａ〜Ｅのポリペプチドを
少なくともコードするDNA 配列を本発明の方法で用いる
こと、または耐病原体性生物に関し、この生物のゲノム
は病原体抑制作用を有する活性プロモータの制御下に少
なくとも２つの異なる遺伝子を含み、これらの遺伝子は
それぞれの場合に、配列Ａ〜Ｅの群から選択される。さ
らに本発明はアミノ酸配列Ａ〜Ｅのポリペプチドをコー
ドするDNA 配列とハイブリダイゼーションするDNA 配列
を含み、これらのDNA 配列は自然合成 sic または半合
成起源のものであり突然変異、ヌクレオチド置換、ヌク
レオチド欠失、ヌクレオチド挿入およびヌクレオチド配
列の逆転による前述したDNA 配列に関し、病原性活性を
有するポリペプチドをコードする。さらに本発明は前述
の記載に一致する少なくとも１つのDNA 配列を含む組換
えDNA に関し、このDNA 分子はクローニングベクターま
たは発現ベクターの形態でよい。
少なくともコードするDNA 配列を本発明の方法で用いる
こと、または耐病原体性生物に関し、この生物のゲノム
は病原体抑制作用を有する活性プロモータの制御下に少
なくとも２つの異なる遺伝子を含み、これらの遺伝子は
それぞれの場合に、配列Ａ〜Ｅの群から選択される。さ
らに本発明はアミノ酸配列Ａ〜Ｅのポリペプチドをコー
ドするDNA 配列とハイブリダイゼーションするDNA 配列
を含み、これらのDNA 配列は自然合成 sic または半合
成起源のものであり突然変異、ヌクレオチド置換、ヌク
レオチド欠失、ヌクレオチド挿入およびヌクレオチド配
列の逆転による前述したDNA 配列に関し、病原性活性を
有するポリペプチドをコードする。さらに本発明は前述
の記載に一致する少なくとも１つのDNA 配列を含む組換
えDNA に関し、このDNA 分子はクローニングベクターま
たは発現ベクターの形態でよい。
【００２６】本発明は前述の記載に一致する組換えDNA
分子で形質転換する適当な宿主生物および中間宿主に関
する。耐病原体性トランスジェニック生物の作製におい
て好ましい中間宿主はバケリア(bakeria) 株、特にいわ
ゆるアグロバケリア(Agrobakeria) 株である。
分子で形質転換する適当な宿主生物および中間宿主に関
する。耐病原体性トランスジェニック生物の作製におい
て好ましい中間宿主はバケリア(bakeria) 株、特にいわ
ゆるアグロバケリア(Agrobakeria) 株である。
【００２７】さらに本発明は本発明の方法により得た耐
病原体性トランスジェニック生物、特にタバコ、ジャガ
イモ、トウモロコシ、エンドウ、セイヨウアブラナおよ
びトマト植物に関する。
病原体性トランスジェニック生物、特にタバコ、ジャガ
イモ、トウモロコシ、エンドウ、セイヨウアブラナおよ
びトマト植物に関する。
【００２８】本発明に用いるDNA 配列は、規定どうり
に、プロモータと共にトランスファする。プロモータの
配列は植物の転写装置により認識されこれにより植物中
でそれらと関連する遺伝子の本質的な発現が起こる。し
かし、このプロモータはまた、病原体誘導および／また
は傷誘導(WUN1)および／または組織特異的および／また
は発生特異的でよい。
に、プロモータと共にトランスファする。プロモータの
配列は植物の転写装置により認識されこれにより植物中
でそれらと関連する遺伝子の本質的な発現が起こる。し
かし、このプロモータはまた、病原体誘導および／また
は傷誘導(WUN1)および／または組織特異的および／また
は発生特異的でよい。
【００２９】本発明の実施に必要な遺伝学的マニピュレ
ーション操作は、特に植物における遺伝子の発現に対し
て、一般に知られている。例えばマニアティス(Maniati
s)等の刊行物「モレキュラー クローニング :ア ラボ
ラトリー マニュアル(Molecular cloning: A laborato
ry manual)」、コールド スプリング ハーバー(Cold
Spring Harbor)(1982 年) を参照。
ーション操作は、特に植物における遺伝子の発現に対し
て、一般に知られている。例えばマニアティス(Maniati
s)等の刊行物「モレキュラー クローニング :ア ラボ
ラトリー マニュアル(Molecular cloning: A laborato
ry manual)」、コールド スプリング ハーバー(Cold
Spring Harbor)(1982 年) を参照。
【００３０】
【実施例】実施例により本発明を詳細に説明する。
【００３１】マニアティス等の「モレキュラー クロー
ニング :ア ラボラトリー マニュアル」、コールド
スプリング ハーバー(1982 年) に記載されたものに示
されていない場合、すべて分子生物学の標準的方法を実
施した。
ニング :ア ラボラトリー マニュアル」、コールド
スプリング ハーバー(1982 年) に記載されたものに示
されていない場合、すべて分子生物学の標準的方法を実
施した。
【００３２】アミノ酸配列Ａ〜ＥをコードするDNA を最
初に既知の方法でクローニングし次いでエー．ツメファ
シエンス(A.Tumefaciens)LBA 4404 に結合させることに
よりトランスファした〔エー．ホーケマ(A.Hoekema) 等
の、「ネイチァー」、第 303巻、 179〜 180頁〕。これ
はファン ホイテ(Van Haute) 等の「イーエムビーオー
ジャーナル(EMBO J.) 」、第２巻、 411〜 418頁（19
83年）に記載された方法により行った。
初に既知の方法でクローニングし次いでエー．ツメファ
シエンス(A.Tumefaciens)LBA 4404 に結合させることに
よりトランスファした〔エー．ホーケマ(A.Hoekema) 等
の、「ネイチァー」、第 303巻、 179〜 180頁〕。これ
はファン ホイテ(Van Haute) 等の「イーエムビーオー
ジャーナル(EMBO J.) 」、第２巻、 411〜 418頁（19
83年）に記載された方法により行った。
【００３３】そのアグロバクリウム(Agrobacterium) へ
のDNA のトランスファはエバート(Ebert) 等の「プロシ
ーディング オブ ナショナル アカデミー オブ サ
イエンス オブ ユーエスエー(Proc.Natl.Acad.Sci.US
A)」、第84巻、5745〜5749頁（1987年）に記載された方
法によりアグロバクリウムDNA を単離することで確認し
た。このDNA の制限切断、ハイボンド-N(Hybond-N)膜
（アマシャム社）へのトランスファおよび放射性同位元
素で標識したDNA プローブでのハイブリダイゼーション
はアグロバクリウムへの良好なDNA トランスファについ
ての情報を提供する。
のDNA のトランスファはエバート(Ebert) 等の「プロシ
ーディング オブ ナショナル アカデミー オブ サ
イエンス オブ ユーエスエー(Proc.Natl.Acad.Sci.US
A)」、第84巻、5745〜5749頁（1987年）に記載された方
法によりアグロバクリウムDNA を単離することで確認し
た。このDNA の制限切断、ハイボンド-N(Hybond-N)膜
（アマシャム社）へのトランスファおよび放射性同位元
素で標識したDNA プローブでのハイブリダイゼーション
はアグロバクリウムへの良好なDNA トランスファについ
ての情報を提供する。
【００３４】次いで形質転換アグロバクテリウムをタバ
コ、セイヨウアブラナ、イチゴ、トマトおよびジャガイ
モ植物を形質転換するために用いた。
コ、セイヨウアブラナ、イチゴ、トマトおよびジャガイ
モ植物を形質転換するために用いた。
【００３５】感染に必要なLBA4404 アグロバクテリアを
最初に選択的抗生物質培地中で培養し〔ピー．ザムブリ
スキー(P.Zambrisky) 等の「EMBO J. 」、第１巻、 147
〜 152頁（1983年）〕、遠心分離機により沈降させ抗生
物質を含まないYEB 培地〔YEB=0.5 ％肉エキス(meat ex
tract);0.2％酵母エキス;0.5％ペプトン;0.5％ショ糖;
２mM MgSO4〕中で洗浄した。沈降分離を繰り返し MgSO4
中で溶解した後これを感染のために細菌に使用すること
ができた。
最初に選択的抗生物質培地中で培養し〔ピー．ザムブリ
スキー(P.Zambrisky) 等の「EMBO J. 」、第１巻、 147
〜 152頁（1983年）〕、遠心分離機により沈降させ抗生
物質を含まないYEB 培地〔YEB=0.5 ％肉エキス(meat ex
tract);0.2％酵母エキス;0.5％ペプトン;0.5％ショ糖;
２mM MgSO4〕中で洗浄した。沈降分離を繰り返し MgSO4
中で溶解した後これを感染のために細菌に使用すること
ができた。
【００３６】いわゆるリーフディスク法を感染のために
用いた。
用いた。
【００３７】滅菌葉をリーフディスク感染のために用い
た。約１cmの寸法の葉片を上述のアグロバクテリア懸濁
液中に浸し次いで3MS 培地〔ティー．ムラシゲ(T.Muras
hige) およびエフ．スコッグ(F.Scoog) により「フィジ
オロジア プランタラム(Physiol.Plant.)」、第15巻、
473〜 497頁（1962年）に記載された培地；３MS = MS
+ ３％ショ糖〕にトランスファした。25〜27℃で16時間
光を当て２日間インキュベーションした後この葉片をMS
C16 培地〔ティー．ムラシゲ（上記参照）により；MSC1
6 = MS＋ 0.5μg/mlのBAP ＋0.1 μg/mlのNAA ＋ 100μ
g/mlのカナマイシン硫酸＋ 500μg/mlのクラフォラン(C
laforan)〕に移した。４〜６週間後に現れる苗条を切断
しMSC15 培地〔ムラシゲ（上記参照）により；MSC15 =
MS＋２％ショ糖、 500μg/mlのクラフォラン＋ 100μg/
mlのカナマイシン硫酸〕に移植した。根を形成した苗条
をさらに分析した。
た。約１cmの寸法の葉片を上述のアグロバクテリア懸濁
液中に浸し次いで3MS 培地〔ティー．ムラシゲ(T.Muras
hige) およびエフ．スコッグ(F.Scoog) により「フィジ
オロジア プランタラム(Physiol.Plant.)」、第15巻、
473〜 497頁（1962年）に記載された培地；３MS = MS
+ ３％ショ糖〕にトランスファした。25〜27℃で16時間
光を当て２日間インキュベーションした後この葉片をMS
C16 培地〔ティー．ムラシゲ（上記参照）により；MSC1
6 = MS＋ 0.5μg/mlのBAP ＋0.1 μg/mlのNAA ＋ 100μ
g/mlのカナマイシン硫酸＋ 500μg/mlのクラフォラン(C
laforan)〕に移した。４〜６週間後に現れる苗条を切断
しMSC15 培地〔ムラシゲ（上記参照）により；MSC15 =
MS＋２％ショ糖、 500μg/mlのクラフォラン＋ 100μg/
mlのカナマイシン硫酸〕に移植した。根を形成した苗条
をさらに分析した。
【００３８】単子葉植物（トウモロコシを含む）だけで
なく、いくつかの双子葉植物もプロトプラストに直接遺
伝子をトランスファすることにより形質転換した。次い
でこれらのプロトプラストを無傷の植物に再生させた
〔例えば、「ジェー．ポトリカス(J.Potrykus)の「バイ
オテクノロジー(Biotechnology) 」第８巻(1990 年) 、
535頁〕。
なく、いくつかの双子葉植物もプロトプラストに直接遺
伝子をトランスファすることにより形質転換した。次い
でこれらのプロトプラストを無傷の植物に再生させた
〔例えば、「ジェー．ポトリカス(J.Potrykus)の「バイ
オテクノロジー(Biotechnology) 」第８巻(1990 年) 、
535頁〕。
【００３９】得られたトランスジェニック植物を試験す
る目的で真菌リゾクトニアソラニに感染させた。この目
的のため、真菌培養物を増殖させ標準土壌中でよくかき
混ぜた。次にこの土壌をディッシュ中で分散させ試験す
べき植物を植えた。
る目的で真菌リゾクトニアソラニに感染させた。この目
的のため、真菌培養物を増殖させ標準土壌中でよくかき
混ぜた。次にこの土壌をディッシュ中で分散させ試験す
べき植物を植えた。
【００４０】評価のために、ディッシュ上の各植物を０
〜３の値で表した。これから各植物ラインのためにこの
値の合計から得られる指数を計算することができた。分
類を以下に示す： ０＝症状なし（健全）。 １＝わずかに寸法が減少（未感染対照と比較）；侵襲が
ないかまたはわずかに認識できる。 ２＝増殖の著しい減少；侵襲の著しい症状。 ３＝死。
〜３の値で表した。これから各植物ラインのためにこの
値の合計から得られる指数を計算することができた。分
類を以下に示す： ０＝症状なし（健全）。 １＝わずかに寸法が減少（未感染対照と比較）；侵襲が
ないかまたはわずかに認識できる。 ２＝増殖の著しい減少；侵襲の著しい症状。 ３＝死。
【００４１】一連の試験を開始した後評価は各場合に14
日で行う。
日で行う。
【００４２】実施例１ 組み合わせタンパク質を用いる真菌抑制試験 まず本発明の目的はここで用いるタンパク質がそれらの
組み合わせにおいて相乗的効果を有することを示すこと
であった。インビトロでの真菌の増殖試験をこの目的の
ために行った。
組み合わせにおいて相乗的効果を有することを示すこと
であった。インビトロでの真菌の増殖試験をこの目的の
ために行った。
【００４３】これらの試験は所定の量のリゾクトニアソ
ラニの真菌菌糸体を 100μl のジャガイモデキストロー
ス溶液と混合し25℃のマイクロタイタープレートでイン
キュベーションすることを必要とした。この試験におい
て真菌の増殖と 405nmの光学密度の増加との間に直線関
係が得られた。タンパク質の阻害作用は光学密度の一層
少ない増加により検出することができる。
ラニの真菌菌糸体を 100μl のジャガイモデキストロー
ス溶液と混合し25℃のマイクロタイタープレートでイン
キュベーションすることを必要とした。この試験におい
て真菌の増殖と 405nmの光学密度の増加との間に直線関
係が得られた。タンパク質の阻害作用は光学密度の一層
少ない増加により検出することができる。
【００４４】２〜３個の菌糸体ボールをアール．ソラニ
(R.solani)の液体培養物から採取し、エッペンドルフ容
器中で 100μl のKGB 培地と混合しガラス乳鉢を用いて
注意深くホモジナイズした。次にこの懸濁液を10mlのKG
B 培地と混合し滅菌 100μmスクリーンに通した。この
菌糸体フラグメント懸濁液（ 100μl のアリコート）の
光学密度を培地を添加することにより 405nmで0.06〜0.
07の値に調整した。 100μl の試料をマイクロタイター
プレート上に配置し試験すべきタンパク質と混合した。
混合物当たり７つの相似するもの(parallel)を測定し
た。対応する量の緩衝液と混合した混合物を対照として
用いた。このプレートを25℃の暗所で48時間インキュベ
ーションし、培養物の光学密度を規則的な間隔で測定し
た。
(R.solani)の液体培養物から採取し、エッペンドルフ容
器中で 100μl のKGB 培地と混合しガラス乳鉢を用いて
注意深くホモジナイズした。次にこの懸濁液を10mlのKG
B 培地と混合し滅菌 100μmスクリーンに通した。この
菌糸体フラグメント懸濁液（ 100μl のアリコート）の
光学密度を培地を添加することにより 405nmで0.06〜0.
07の値に調整した。 100μl の試料をマイクロタイター
プレート上に配置し試験すべきタンパク質と混合した。
混合物当たり７つの相似するもの(parallel)を測定し
た。対応する量の緩衝液と混合した混合物を対照として
用いた。このプレートを25℃の暗所で48時間インキュベ
ーションし、培養物の光学密度を規則的な間隔で測定し
た。
【００４５】２つのタンパク質が相互に真菌増殖の抑制
において付加的な相乗的な様式あるいは拮抗的な様式で
作用するかどうかの推定は以下に記載する一般的に用い
られるコルビー式(Colby formula) による測定データか
ら可能である〔エス．アール．コルビー(S.R.Colby) の
「ウイーズ(Wheeds)」、第15巻(1967 年) 、20〜22
頁〕。
において付加的な相乗的な様式あるいは拮抗的な様式で
作用するかどうかの推定は以下に記載する一般的に用い
られるコルビー式(Colby formula) による測定データか
ら可能である〔エス．アール．コルビー(S.R.Colby) の
「ウイーズ(Wheeds)」、第15巻(1967 年) 、20〜22
頁〕。
【００４６】この推定を行うためにまず付加的作用によ
り理論的に予測されるべき増殖阻害Ｅを推定すること
（予測された効力）が必要である。これは次式により与
えられる： Ｅ＝W1 ＋ W2 −((W1×W2)/100) 式中W1およびW2は個々のタンパク質の効力を示し、これ
は未処理対照からの増殖プロットの割合偏差（タンパク
質の存在下の）として定義される。タンパク質に対する
効力（増殖プロットの規定時間での）は次式で与えられ
る： W1＝（OD(K) − OD(P)）/ OD(K) ×100 (割合) 式中、OD(K) は未処理対照の光学密度でありOD(P) はこ
のタンパク質で処理した光学密度である。
り理論的に予測されるべき増殖阻害Ｅを推定すること
（予測された効力）が必要である。これは次式により与
えられる： Ｅ＝W1 ＋ W2 −((W1×W2)/100) 式中W1およびW2は個々のタンパク質の効力を示し、これ
は未処理対照からの増殖プロットの割合偏差（タンパク
質の存在下の）として定義される。タンパク質に対する
効力（増殖プロットの規定時間での）は次式で与えられ
る： W1＝（OD(K) − OD(P)）/ OD(K) ×100 (割合) 式中、OD(K) は未処理対照の光学密度でありOD(P) はこ
のタンパク質で処理した光学密度である。
【００４７】このようにして、２つのタンパク質を組み
合わせて使用する際、次の説明が可能であった：実験で
測定された効力Ｇが予測値Ｅに一致する場合、作用は付
加的である。一方、ＧがＥより大きい場合、作用は相乗
的である。
合わせて使用する際、次の説明が可能であった：実験で
測定された効力Ｇが予測値Ｅに一致する場合、作用は付
加的である。一方、ＧがＥより大きい場合、作用は相乗
的である。
【００４８】この試験モデルを用いると、驚くべきこと
に実施例で用いたタンパク質ChiS、PSI 、AFP 、ChiGお
よびGluGが種々の真菌に相乗的効果を有することが明ら
かになり、さらにこれらの効果は２種のタンパク質の組
み合わせおよび上述のタンパク質の多数の組み合わせに
より達成された。
に実施例で用いたタンパク質ChiS、PSI 、AFP 、ChiGお
よびGluGが種々の真菌に相乗的効果を有することが明ら
かになり、さらにこれらの効果は２種のタンパク質の組
み合わせおよび上述のタンパク質の多数の組み合わせに
より達成された。
【００４９】例えば、次の値を真菌リゾクトニアソラニ
におけるChiSおよびPSI タンパク質の組み合わせからな
らびにAFP タンパク質およびPSI タンパク質の組み合わ
せから（各場合において一定のPSI 濃度を用いる２つの
異なるChiSおよびAFP 濃度）決定した：
におけるChiSおよびPSI タンパク質の組み合わせからな
らびにAFP タンパク質およびPSI タンパク質の組み合わ
せから（各場合において一定のPSI 濃度を用いる２つの
異なるChiSおよびAFP 濃度）決定した：
【００５０】ChiS＋PSI ： 予測値：E1 = 29.9 ％およびE2 = 44.5 ％ 測定値：G1 = 60.4 ％およびG2 = 64.1 ％ 従ってタンパク質ChiSおよびPSI は共にアール．ソラニ
の増殖阻害において相乗的様式で作用する。
の増殖阻害において相乗的様式で作用する。
【００５１】図１はタンパク質の組み合わせおよび個々
の物質を用いて得られた結果を示す。図に示すように、
種々のChiS濃度（ 0.5μg/mlおよび0.05μg/ml）をPSI
タンパク質（ 1.0μg/ml）と組み合わせる。
の物質を用いて得られた結果を示す。図に示すように、
種々のChiS濃度（ 0.5μg/mlおよび0.05μg/ml）をPSI
タンパク質（ 1.0μg/ml）と組み合わせる。
【００５２】AFP ＋PSI ： 予測値：E1 = 39.9 ％およびE2 = 41.9 ％ 測定値：G1 = 57.7 ％およびG2 = 65.4 ％ これと一致するAFP およびPSI はまた真菌アール．ソラ
ニの増殖を相乗的に阻害することを示す。図２はPSI タ
ンパク質（ 1.0μg/ml）と組み合わせた種々のAFP 濃度
（ 0.4μg/mlおよび0.04μg/ml）を用いた試験結果を示
す。
ニの増殖を相乗的に阻害することを示す。図２はPSI タ
ンパク質（ 1.0μg/ml）と組み合わせた種々のAFP 濃度
（ 0.4μg/mlおよび0.04μg/ml）を用いた試験結果を示
す。
【００５３】実施例２ トランスジェニック植物 相互に相乗的に作用するDNA 配列を有する本発明の生物
を得るために、まず相互に相乗的に作用する少なくとも
１つの遺伝子を含むトランスジェニック植物を作製し
た。
を得るために、まず相互に相乗的に作用する少なくとも
１つの遺伝子を含むトランスジェニック植物を作製し
た。
【００５４】トランスジェニック植物中のChiS 最初にChiS遺伝子を植物調節配列に融合させた。
【００５５】1.8Kb のサイズのChiS遺伝子をサンガー等
のデオキシシークエンシング法「Proc.Natl.Acad.Sci.U
SA」、第74巻（1977年）、5463〜5467頁の合成オリゴヌ
クレオチドを用いて配列決定した。
のデオキシシークエンシング法「Proc.Natl.Acad.Sci.U
SA」、第74巻（1977年）、5463〜5467頁の合成オリゴヌ
クレオチドを用いて配列決定した。
【００５６】カリフラワーモザイクウイルス(CamV)〔 4
00bp テップァー(Topfer)等の、「ヌクレイック アシ
ッド リサーチ(Nucl.Acid.Res.)」第15巻(1987 年) 、
5890頁による 〕からの35S プロモータをChiS遺伝子に
転写融合(transcriptional fusion)させた。0.2Kb のサ
イズの、CamVの35S 遺伝子の、停止信号は、双子葉植物
においてその相関関係が知られており、ChiS遺伝子から
の３′を用いた。キメラ遺伝子35S-ChiSをタバコおよび
ジャガイモ植物においてアグロバクテリウムツメファシ
エンス(Agrobacterium tumefaciens) 形質転換系を用い
てpLS034ベクター中にクローニングし、さらにカナマイ
シン耐性植物を再生した。
00bp テップァー(Topfer)等の、「ヌクレイック アシ
ッド リサーチ(Nucl.Acid.Res.)」第15巻(1987 年) 、
5890頁による 〕からの35S プロモータをChiS遺伝子に
転写融合(transcriptional fusion)させた。0.2Kb のサ
イズの、CamVの35S 遺伝子の、停止信号は、双子葉植物
においてその相関関係が知られており、ChiS遺伝子から
の３′を用いた。キメラ遺伝子35S-ChiSをタバコおよび
ジャガイモ植物においてアグロバクテリウムツメファシ
エンス(Agrobacterium tumefaciens) 形質転換系を用い
てpLS034ベクター中にクローニングし、さらにカナマイ
シン耐性植物を再生した。
【００５７】ChiS遺伝子および対応するmRNAならびに得
られた植物中の遺伝子産物タンパク質を検出することが
可能であった。
られた植物中の遺伝子産物タンパク質を検出することが
可能であった。
【００５８】トランスジェニック植物中のPSI まずポリＡ+- RNAを熟成したオオムギ種子〔ホーデウム
ブルガー エル．シーブイ．ピギー(Hordeum vulgare
L.cv.Piggy)〕から単離しλ−gt−11−ファージ中のcDN
A遺伝子バンクに配置した。方法の詳細はアール．リー
の「プラント．バイオロ．(Plant.Biol.) 」、第12巻(1
989 年) 、 673〜682 頁に記載されている。次いで単一
特異的なPSI 抗体を用いてcDNAクローンを確認した。
ブルガー エル．シーブイ．ピギー(Hordeum vulgare
L.cv.Piggy)〕から単離しλ−gt−11−ファージ中のcDN
A遺伝子バンクに配置した。方法の詳細はアール．リー
の「プラント．バイオロ．(Plant.Biol.) 」、第12巻(1
989 年) 、 673〜682 頁に記載されている。次いで単一
特異的なPSI 抗体を用いてcDNAクローンを確認した。
【００５９】次に、PSI-陽性λ−gt−11−ファージを単
離し、さらにクローニングして前述のサンガー等のジデ
オキシシークエンス法により配列決定した。次いでエシ
ェリキア コリ(E.coli)中にクローニングしたDNA をア
グロバクテリウムLBA4404 中に接合させることにより前
述の方法でトランスファした。
離し、さらにクローニングして前述のサンガー等のジデ
オキシシークエンス法により配列決定した。次いでエシ
ェリキア コリ(E.coli)中にクローニングしたDNA をア
グロバクテリウムLBA4404 中に接合させることにより前
述の方法でトランスファした。
【００６０】トランスファした遺伝子およびmRNAならび
に遺伝子産物は対応するタバコ、ジャガイモ、セイヨウ
アブラナ、イチゴおよびトマトのトランスジェニック植
物で検出できた。
に遺伝子産物は対応するタバコ、ジャガイモ、セイヨウ
アブラナ、イチゴおよびトマトのトランスジェニック植
物で検出できた。
【００６１】トランスジェニック植物中のAFP ベクター中でのクローニングのために、抗真菌ペプチド
のcDNA配列にBamH1 およびSal1制限切断部位に連結する
ことができる末端を設ける。用いたクローニングベクタ
ーはpDH51 〔ピートロザック(Pietrzak)等の、「Nucl.A
cids Res. 」、第14巻(1986 年) 、5857頁〕であった。
ベクターpDH51 は制限酵素BamH1 およびSal1を用いてプ
ロモータとターミネータとの間を開裂させた。ベクター
pDH51 はカリフラワーモザイクウイルスからの35S 転写
物のプロモータおよびターミネータ配列を含むpUC18 誘
導体である。これらの配列は植物の転写装置により認識
され植物中のこれらに関連する遺伝子の強力な本質的発
現を導く。次に抗真菌ペプチドのDNA をベクター中にBa
mH1 およびSal1切断部位を介してクローニングする。最
後に、転写単位−プロモータ、遺伝子およびターミネー
タ−を制限酵素EcoRI を用いてベクターから切り出し植
物形質転換ベクター中にクローニングする。次のベクタ
ーおよびそれらの誘導体は、例えば、植物形質転換ベク
ターとして用いることができる：
のcDNA配列にBamH1 およびSal1制限切断部位に連結する
ことができる末端を設ける。用いたクローニングベクタ
ーはpDH51 〔ピートロザック(Pietrzak)等の、「Nucl.A
cids Res. 」、第14巻(1986 年) 、5857頁〕であった。
ベクターpDH51 は制限酵素BamH1 およびSal1を用いてプ
ロモータとターミネータとの間を開裂させた。ベクター
pDH51 はカリフラワーモザイクウイルスからの35S 転写
物のプロモータおよびターミネータ配列を含むpUC18 誘
導体である。これらの配列は植物の転写装置により認識
され植物中のこれらに関連する遺伝子の強力な本質的発
現を導く。次に抗真菌ペプチドのDNA をベクター中にBa
mH1 およびSal1切断部位を介してクローニングする。最
後に、転写単位−プロモータ、遺伝子およびターミネー
タ−を制限酵素EcoRI を用いてベクターから切り出し植
物形質転換ベクター中にクローニングする。次のベクタ
ーおよびそれらの誘導体は、例えば、植物形質転換ベク
ターとして用いることができる：
【００６２】pOCA18〔オルスゼウスキ(Olszewski) 等
の、「Nucl.Acids Res. 」、第16巻(1988 年) 、10765
頁〕、pPCV310 〔コンクツ(Koncz) およびシェル(Shel
l) の、「エムジージー(MGG) 」、第 204巻(1986 年)
、 383頁〕およびpBin19〔ベバン(Bevan) 等の、「Nuc
l.Acids Res. 」、第12巻(1984 年) 、8711頁〕。
の、「Nucl.Acids Res. 」、第16巻(1988 年) 、10765
頁〕、pPCV310 〔コンクツ(Koncz) およびシェル(Shel
l) の、「エムジージー(MGG) 」、第 204巻(1986 年)
、 383頁〕およびpBin19〔ベバン(Bevan) 等の、「Nuc
l.Acids Res. 」、第12巻(1984 年) 、8711頁〕。
【００６３】転写単位およびベクターをEcoRI 切断部位
を介して連結した後、構成物をアグロバクテリウム株MP
90RK〔コンクツおよびシェル（前記参照）〕またはIHA1
01〔フード(Hood)等の、「ジャーナル オブ バクテリ
オロジー(J.Bacteriol.)」、第 168巻(1986 年) 、1291
頁〕中に接合させた。
を介して連結した後、構成物をアグロバクテリウム株MP
90RK〔コンクツおよびシェル（前記参照）〕またはIHA1
01〔フード(Hood)等の、「ジャーナル オブ バクテリ
オロジー(J.Bacteriol.)」、第 168巻(1986 年) 、1291
頁〕中に接合させた。
【００６４】次いでタバコ、ジャガイモ、イチゴ、セイ
ヨウアブラナおよびトマトのトランスジェニック植物を
前述の方法により形質転換した。形質転換苗条を抗生物
質カナマイシンに対する共形質転換耐性を基に選択す
る。形質転換穀物植物中での抗真菌タンパク質の発現を
調べDNA 分析（サザンブロッティング）、RNA 分析（ノ
ザンブロッティング）および特異的抗体を用いたタンパ
ク質分析（ウエスタンブロッティング）により確認し
た。
ヨウアブラナおよびトマトのトランスジェニック植物を
前述の方法により形質転換した。形質転換苗条を抗生物
質カナマイシンに対する共形質転換耐性を基に選択す
る。形質転換穀物植物中での抗真菌タンパク質の発現を
調べDNA 分析（サザンブロッティング）、RNA 分析（ノ
ザンブロッティング）および特異的抗体を用いたタンパ
ク質分析（ウエスタンブロッティング）により確認し
た。
【００６５】 トランスジェニック植物中のChiGおよびGluG サザン−、ノザン−およびウエスタンブロッティングで
陽性のChiG−およびGluG−トランスジェニック植物を前
述の植物に類似させて得ることができた。
陽性のChiG−およびGluG−トランスジェニック植物を前
述の植物に類似させて得ることができた。
【００６６】トランスジェニック単子葉植物中のChiS、
PSI 、AFP 、ChiGおよびGluG 上述の遺伝子を例えば、トウモロコシのような単子葉植
物のゲノム中に組み込むことは直接遺伝子トランスファ
により可能であった。これによりサザン−、ノザン−お
よびウエスタンブロッティングで陽性のトランスジェニ
ック植物を得ることができた。
PSI 、AFP 、ChiGおよびGluG 上述の遺伝子を例えば、トウモロコシのような単子葉植
物のゲノム中に組み込むことは直接遺伝子トランスファ
により可能であった。これによりサザン−、ノザン−お
よびウエスタンブロッティングで陽性のトランスジェニ
ック植物を得ることができた。
【００６７】トランスジェニック植物中での種々の耐真
菌性遺伝子の組み合わせ 以前得られたタバコ、トウモロコシ、セイヨウアブラ
ナ、イチゴ、ジャガイモおよびトマト植物を相互に交配
させ両親の耐真菌性遺伝子をそれぞれ含む植物を選択し
た。さらに、トランスジェニック植物はまずそれらを１
つの次いで１つ以上の他の遺伝子を用いて形質転換する
ことにより得られた。最後に、さらに植物を種々の耐性
遺伝子を含むベクターを用いて形質転換した。耐真菌性
試験をこの植物材料を用いて行った。驚くべきことに、
すべての場合、真菌抵抗性に関して、まさに付加的効果
でなく、相乗的効果が観察された。
菌性遺伝子の組み合わせ 以前得られたタバコ、トウモロコシ、セイヨウアブラ
ナ、イチゴ、ジャガイモおよびトマト植物を相互に交配
させ両親の耐真菌性遺伝子をそれぞれ含む植物を選択し
た。さらに、トランスジェニック植物はまずそれらを１
つの次いで１つ以上の他の遺伝子を用いて形質転換する
ことにより得られた。最後に、さらに植物を種々の耐性
遺伝子を含むベクターを用いて形質転換した。耐真菌性
試験をこの植物材料を用いて行った。驚くべきことに、
すべての場合、真菌抵抗性に関して、まさに付加的効果
でなく、相乗的効果が観察された。
【００６８】例えば、ChiSおよびPSI を発現するタバコ
植物はChiSもしくはPSI を発現するにすぎない植物また
は付加的抵抗性から生じる植物よりもリゾクトニア侵襲
に対してかなり大きな抵抗性を示す。
植物はChiSもしくはPSI を発現するにすぎない植物また
は付加的抵抗性から生じる植物よりもリゾクトニア侵襲
に対してかなり大きな抵抗性を示す。
【００６９】またリゾクトニアソラニを用いた侵襲にお
ける相乗的阻害効果はPSI-およびAFP-トランスジェニッ
クタバコの組み合わせ発現から生じる。また広範な種類
のトランスジェニック植物における２つ以上の異なる遺
伝子(ChiS 、PSI 、AFP 、ChiGおよびGluG) の組み合わ
せは種々の真菌に相乗的抑制効果を導く。
ける相乗的阻害効果はPSI-およびAFP-トランスジェニッ
クタバコの組み合わせ発現から生じる。また広範な種類
のトランスジェニック植物における２つ以上の異なる遺
伝子(ChiS 、PSI 、AFP 、ChiGおよびGluG) の組み合わ
せは種々の真菌に相乗的抑制効果を導く。
【００７０】野性型植物は20個の苗木における試験で38
〜46の指数値を有するが、本発明のトランスジェニック
タバコを用いると苗木が真菌リゾクトニアソラニの存在
下にリゾクトニアを含まない土壌で培養した対照植物
（指数値10〜12）が示すような良好な増殖を示すことが
明らかになる。
〜46の指数値を有するが、本発明のトランスジェニック
タバコを用いると苗木が真菌リゾクトニアソラニの存在
下にリゾクトニアを含まない土壌で培養した対照植物
（指数値10〜12）が示すような良好な増殖を示すことが
明らかになる。
【００７１】配列表ＡおよびＡ′(AFP) ： 配列の番号 ：１(A) 配列の型：読み取り枠、活性タンパク質(A′) により暗
号化される範囲までの完全なヌクレオチド配列と対応す
るタンパク質。 配列の長さ：51個のアミノ酸(A′) 鎖の数：単鎖 トポロジー：直線 分子の型：cDNA 最初の供給源：アスペルギルスギガンテウス発酵ブイヨ
ン 名称：抗真菌ペプチド(AFP) 特徴(A) ：177個のヌクレオチドの読み取り枠、活性タ
ンパク質のN-末端アミノ酸に *を付す。 特性：抗真菌剤、特にリゾクトニアソラニ、種々のアス
ペルギルス、フザリアおよびトリコフィトン種。
号化される範囲までの完全なヌクレオチド配列と対応す
るタンパク質。 配列の長さ：51個のアミノ酸(A′) 鎖の数：単鎖 トポロジー：直線 分子の型：cDNA 最初の供給源：アスペルギルスギガンテウス発酵ブイヨ
ン 名称：抗真菌ペプチド(AFP) 特徴(A) ：177個のヌクレオチドの読み取り枠、活性タ
ンパク質のN-末端アミノ酸に *を付す。 特性：抗真菌剤、特にリゾクトニアソラニ、種々のアス
ペルギルス、フザリアおよびトリコフィトン種。
【００７２】
【表１】
【表２】
【００７３】配列表ＢおよびＢ′(PSI) ： 配列の番号 ：２ 配列の型：ヌクレオチドと対応するタンパク質。 配列の長さ：1078個の塩基対(B′= 不完全PSI cDNAクロ
ーン) 鎖の数：単鎖 トポロジー：直線 分子の型：相補的DNA 最初の供給源：オオムギ種子（ホーデウムバルガエ エ
ル．シーブイ．ピギー） 直接的実験供給源：λ−gt−11ファージのcDNA遺伝子バ
ンク 名称：タンパク質合成阻害剤 特徴：42個の塩基対の長さの５′−非翻訳領域 843 個の塩基対の読み取り枠（停止コドンにアスタリス
クを付す） 193 個の塩基対の長さの３′−非翻訳末端、可能なポリ
アデニレーション信号に下線を付す。 特性：抗真菌活性、特にトリコデルマレッシイ(Trichod
erma reesii)およびフザリウムスポロトリコイデス(Fus
arium sporotrichoides)の胞子ならびにリゾクトニアソ
ラニにおいて。
ーン) 鎖の数：単鎖 トポロジー：直線 分子の型：相補的DNA 最初の供給源：オオムギ種子（ホーデウムバルガエ エ
ル．シーブイ．ピギー） 直接的実験供給源：λ−gt−11ファージのcDNA遺伝子バ
ンク 名称：タンパク質合成阻害剤 特徴：42個の塩基対の長さの５′−非翻訳領域 843 個の塩基対の読み取り枠（停止コドンにアスタリス
クを付す） 193 個の塩基対の長さの３′−非翻訳末端、可能なポリ
アデニレーション信号に下線を付す。 特性：抗真菌活性、特にトリコデルマレッシイ(Trichod
erma reesii)およびフザリウムスポロトリコイデス(Fus
arium sporotrichoides)の胞子ならびにリゾクトニアソ
ラニにおいて。
【００７４】
【表３】
【表４】
【表５】
【００７５】配列表Ｃ(ChiS)： 配列の番号 ：３ 配列の型：ヌクレオチド 鎖の数：単鎖（活性鎖は二本鎖） トポロジー：直線 分子の型：cDNA 直接的実験供給源：E.coli株 A 5187 からのプラスミド
pLChiS 最初の供給源：セラチアマルセセンスからのコスミドバ
ンク 名称：ChiSタンパク質（キチナーゼ） 特徴：エキソキチナーゼ
pLChiS 最初の供給源：セラチアマルセセンスからのコスミドバ
ンク 名称：ChiSタンパク質（キチナーゼ） 特徴：エキソキチナーゼ
【００７６】
【表６】
【表７】
【００７７】配列表Ｄ(ChiG)： 配列の番号 ：４ 配列の型：ヌクレオチド 配列の長さ：1013個のヌクレオチド 分子の型：cDNA 最初の供給源：オオムギ種子（ホーデウムバルガエ エ
ル．） 名称：ChiG（キチナーゼＧ） 特徴：63個の塩基対の長さの５′−非翻訳開始領域、 7
98個の塩基対の読み取り枠、152 個の塩基対の長さの
３′−非翻訳末端、リーディング停止コドンにアスタリ
スクを付し、可能なシグナルペプチド配列に下線を付
し、 266個のアミノ酸を有する26kDのキチナーゼプレタ
ンパク質のアミノ酸配列をヌクレオチド配列の下に示
し、下線を付した 905位置のATリッチな配列はおそらく
ポリアデニレーション信号である。 特性：抗真菌活性、特にトリコデルマレッシイおよびフ
ザリウムスポロトリコイデスならびにリゾクトニアソラ
ニおよびボトリティスシネレア(Botrytis cinerea)にお
いて。
ル．） 名称：ChiG（キチナーゼＧ） 特徴：63個の塩基対の長さの５′−非翻訳開始領域、 7
98個の塩基対の読み取り枠、152 個の塩基対の長さの
３′−非翻訳末端、リーディング停止コドンにアスタリ
スクを付し、可能なシグナルペプチド配列に下線を付
し、 266個のアミノ酸を有する26kDのキチナーゼプレタ
ンパク質のアミノ酸配列をヌクレオチド配列の下に示
し、下線を付した 905位置のATリッチな配列はおそらく
ポリアデニレーション信号である。 特性：抗真菌活性、特にトリコデルマレッシイおよびフ
ザリウムスポロトリコイデスならびにリゾクトニアソラ
ニおよびボトリティスシネレア(Botrytis cinerea)にお
いて。
【００７８】
【表８】
【表９】
【００７９】配列表Ｅ(GluG)： 配列の番号 ：５ 配列の型：ヌクレオチドと対応するタンパク質。 配列の長さ：1249個のヌクレオチド 分子の型：cDNA 最初の供給源：オオムギ種子（ホーデウムバルガエ エ
ル．） 名称：GluG（グルカナーゼ） 特徴：48個の塩基対の長さの５′−非翻訳開始領域 1002個の塩基対の読み取り枠 199 個の塩基対の長さの３′−非翻訳末端、下線を付し
た1083および1210位置のATリッチな配列はおそらくポリ
アデニレーション信号であり、334 個のアミノ酸の暗号
化プレタンパク質の誘導アミノ酸配列をヌクレオチド配
列の下に示す。
ル．） 名称：GluG（グルカナーゼ） 特徴：48個の塩基対の長さの５′−非翻訳開始領域 1002個の塩基対の読み取り枠 199 個の塩基対の長さの３′−非翻訳末端、下線を付し
た1083および1210位置のATリッチな配列はおそらくポリ
アデニレーション信号であり、334 個のアミノ酸の暗号
化プレタンパク質の誘導アミノ酸配列をヌクレオチド配
列の下に示す。
【００８０】
【表１０】
【表１１】
【図１】真菌リゾクトニアソラニにおけるChiSとPSI タ
ンパク質の真菌増殖阻害作用を示すグラフである。
ンパク質の真菌増殖阻害作用を示すグラフである。
【図２】真菌リゾクトニアソラニにおけるAFP タンパク
質とPSI タンパク質の真菌増殖阻害作用を示すグラフで
ある。
質とPSI タンパク質の真菌増殖阻害作用を示すグラフで
ある。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ユルゲン ローゲマン オランダ国 ラーフェンデルトゥイン エ ヌベー ライデン 2317 (72)発明者 ギド イアッハ ドイツ連邦共和国 50678 ケルン マタ ーヌスシュトラーセ 22 (72)発明者 ビルギット ゲルンハルット ドイツ連邦共和国 51145 ケルン アオ フ デム クネップ 28 (72)発明者 ジョン マンディ デンマーク国 1760 ファオ コペンハー ゲン エヌ イプシロン カールスベルク ヴェイ ６ フィーアー (72)発明者 イェフ シェル ドイツ連邦共和国 50829 ケルン カー ル−フォン−リンネ−ヴェーク 10 (72)発明者 ペーター エッケ ドイツ連邦共和国 65779 ケルクハイム （タオヌス） アム フラヒスラント 18 (72)発明者 イラン チェット イスラエル国 シクン エツラチ ネス チオナ 70400
Claims (12)
- 【請求項１】 ゲノム中に活性プロモータの制御下の病
原体抑制作用を有する少なくとも２つの異なる遺伝子を
含むことを特徴とする耐病原体性トランスジェニック生
物。 - 【請求項２】 前記遺伝子が真菌の生命力を低下させる
遺伝子産物をコードすることを特徴とする請求項１に記
載の耐病原体性トランスジェニック生物。 - 【請求項３】 前記遺伝子が真菌、細菌、植物、動物ま
たはウイルス起源のものであることを特徴とする請求項
１または２に記載の耐病原体性トランスジェニック生
物。 - 【請求項４】 前記遺伝子産物が真菌に対する抵抗性を
増進する特性を有することを特徴とする請求項２または
３に記載の耐病原体性トランスジェニック生物。 - 【請求項５】 前記遺伝子産物がキチナーゼ(ChiS 、Ch
iG) 、グルカナーゼ(GluG)、タンパク質合成阻害剤(PS
I) および抗真菌性タンパク質(AFP) であることを特徴
とする請求項４に記載の耐病原体性トランスジェニック
生物。 - 【請求項６】 生物が植物であることを特徴とする請求
項１〜５のいずれか１項に記載の耐病原体性トランスジ
ェニック生物。 - 【請求項７】 生物がタバコ、ジャガイモ、イチゴ、ト
ウモロコシ、セイヨウアブラナまたはトマト植物である
ことを特徴とする請求項６に記載の耐病原体性トランス
ジェニック生物。 - 【請求項８】 請求項１〜７に記載の１種以上の耐病原
体性トランスジェニック生物に用いる挿入DNA 配列を有
するDNA-トランスファベクター。 - 【請求項９】 病原体抑制作用を有する少なくとも１つ
の遺伝子を生物のゲノムにトランスファし、(a) この生
物と他の生物、随意ではあるがトランスジェニックな、
病原体抑制作用を有する少なくとも１つの他の遺伝子を
含む生物とを交配させ、次いで選択することにより、お
よび／または、(b) 病原体抑制作用を有する少なくとも
１つの他の遺伝子でこの生物に形質転換を起こさせるこ
とにより耐病原体性生物を得ることを特徴とする請求項
１〜７のいずれか１項に記載の耐病原体性生物を作製す
る方法。 - 【請求項１０】請求項１〜５のいずれか１項に記載され
た病原体抑制作用を有する遺伝子に対応する挿入DNA 配
列を含むDNA-トランスファベクターを用いることを特徴
とする請求項９に記載の方法。 - 【請求項１１】病原体抑制作用を有する１つ以上の遺伝
子を含むベクターを生物のゲノムに形質転換を起こさせ
るのに使用することを特徴とする請求項１〜７のいずれ
か１項に記載された耐病原体性生物を産生させる方法。 - 【請求項１２】使用する生物が請求項１〜７のいずれか
１項に記載された耐病原体性トランスジェニック生物ま
たはゲノムに請求項１〜７の定義に従う少なくとも１つ
の遺伝子を含む生物であり、この生物により発現されな
いが請求項１〜７に従う任意の他の１つの遺伝子産物に
対応する少なくとも１つの物質をこの生物に適用するこ
とを特徴とする病原体に対する生物の抵抗性を確実にす
る方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE4234131:0 | 1992-10-09 | ||
| DE4234131A DE4234131C2 (de) | 1992-10-09 | 1992-10-09 | Transgener pathogen-resistenter Organismus |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06197651A true JPH06197651A (ja) | 1994-07-19 |
Family
ID=6470118
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5253197A Pending JPH06197651A (ja) | 1992-10-09 | 1993-10-08 | 耐病原体性トランスジェニック生物およびその生物を作製するのに用いるｄｎａ−トランスファベクターならびにその生物を作製する方法 |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| US (4) | US5689045A (ja) |
| EP (1) | EP0616035B1 (ja) |
| JP (1) | JPH06197651A (ja) |
| AT (1) | ATE243258T1 (ja) |
| AU (1) | AU671669B2 (ja) |
| CA (1) | CA2108112A1 (ja) |
| DE (2) | DE4234131C2 (ja) |
| ES (1) | ES2201053T3 (ja) |
| HU (1) | HU219268B (ja) |
| MX (1) | MX9306300A (ja) |
| ZA (1) | ZA937202B (ja) |
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| US6414222B1 (en) * | 1993-02-05 | 2002-07-02 | Regents Of The University Of Minnesota | Gene combinations for herbicide tolerance in corn |
| US6222099B1 (en) | 1993-02-05 | 2001-04-24 | Regents Of The University Of Minnesota | Transgenic plants expressing maize acetyl COA carboxylase gene and method of altering oil content |
| US5530187A (en) * | 1993-07-16 | 1996-06-25 | The Salk Institute For Biological Studies | Transgenic plants containing multiple disease resistance genes |
| DE4423022C1 (de) * | 1994-06-30 | 1995-05-24 | Lutz Prof Dr Heide | Transgene Pflanzen mit erhöhtem Gehalt an Sekundärstoffen |
| EP0910651A1 (de) * | 1996-06-25 | 1999-04-28 | GSF-Forschungszentrum für Umwelt und Gesundheit GmbH | Ozon-induzierte genexpression in pflanzen |
| CN1231673B (zh) | 1996-07-29 | 2012-05-02 | 基根奈公司 | 在植物中调节防御反应的多核苷酸及其用途 |
| US6121436A (en) | 1996-12-13 | 2000-09-19 | Monsanto Company | Antifungal polypeptide and methods for controlling plant pathogenic fungi |
| US7087420B1 (en) | 1997-07-17 | 2006-08-08 | Cambia | Microbial β-glucuronidase genes, gene products and uses thereof |
| GB9827152D0 (en) * | 1998-07-03 | 1999-02-03 | Devgen Nv | Characterisation of gene function using double stranded rna inhibition |
| CN1125179C (zh) * | 1999-01-28 | 2003-10-22 | 中国农业科学院生物技术研究所 | 胞内或胞外协同表达两种抗真菌病基因培育抗病作物 |
| US6521435B1 (en) * | 1999-08-30 | 2003-02-18 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture | Nucleic acid sequences encoding cell wall-degrading enzymes and use to engineer resistance to Fusarium and other pathogens |
| JP2003527833A (ja) | 1999-10-14 | 2003-09-24 | クロンテック・ラボラトリーズ・インコーポレーテッド | 花虫類に由来する発色団／蛍光体、およびそれらの使用法 |
| TWI265974B (en) * | 2001-11-20 | 2006-11-11 | Univ Hong Kong | Genetically modified plants with enhanced resistance to fungal diseases and a method of production thereof |
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